Quelques conseils pratiques: Préparation des biopsies Conditionnement pour l’envoi des...

Quelques conseils pratiques:Préparation des biopsies

Conditionnement pour l’envoi des échantillons

Nathalie Quellard, Sihem Kaaki, Corinne Lacombe, Julie Godet

Service d’Anatomie et Cytologie PathologiquesUnité de Pathologie Ultrastructurale,CHU Poitiers

Paris, 16 janvier 2015

Centre de référence Amylose AL et autres maladies par dépôts d’Ig monoclonales

Interprétation fiable et rigoureuse

Diagnostic assuré

Mise en place d’un traitement

Techniques coûteuses

Intérêt d’une bonne préparation

Réalisation des biopsies

• Prélèvement au lit du patient

- Microscopie optique: Duboscq Brazil

- Immunofluorescence: Azote liquide

- Microscopie électronique

Glutaraldéhyde

Plonger le plus rapidement possible les fragments biopsiques dans les liquides de conservation

Microscopie photoniqueService AnaPath

Rouge congo5µm

Lumière polarisée

HES3µm

• Fixation

- Duboscq Brazil (éthanol, ac.acétique, formol, ac.picrique)

- 6-8H à 20°C ou 24H à 4°C

- Conservation formol tamponné 10%

Topographie générale des dépôts Détection des dépôts amyloïdes

• Coloration

• Mauvais rendement sur bloc paraffinéPrélèvement congelé

Typage des dépôts: Immunofluorescence

Système révélateur

Anticorps primaire

Antigène

Echantillon

Epitope

Vaste gamme d’anticorps:IgG, IgA, IgM, kappa, lambda, ss-classes IgG,TTR, SAA…

Plonger rapidement dans l’azote liquide

Cryotube + support carton Support de congélation + cryocolle

Biopsie de graisse sous cutanée

• Rappels:

- Possibilité de transport en sérum physiologique à 4 °C

- Si rouge Congo réalisé au labo:

Coupes de 7 µm d’épaisseur ( Rouge Congo et IF)

Ne jamais fixer les prélèvements en acétone

Microscopie électronique(Unité de Pathologie Ultrastructurale et Expérimentale

Service Anatomie et Cytologie pathologiques )

• Localisation précise

• Organisation

• Diamètre et structure des fibrilles (amyloïdes ou microtubulaires)

• 2 possibilités:

Prélèvement Fixation

InclusionPrélèvement Fixation

Bonne qualité de l’échantillon Fiabilité de l’interprétation

Vide pousséImpact électronique Nécessité d’une bonne fixation

• Morphologie et structure préservées

• Pas de destruction irréversible

• Processus enzymatiques immobilisés

Autolyse dès 1ères sec après exérèse

La fixation doit être réalisée rapidement après exérèse

Fixation

• Fixation physique: Cryofixation

- Congélation rapide dans l’azote liquide

Comment fixer?

Conservation à -80°C jusqu’à l’envoi en carboglace

• Fixation chimique : glutaraldéhyde 2-4%

- Réticulation du gel protéique

- Inhibition de l’autolyse

Immersion rapide dans le fixateur

Découpe dans le fixateur

Fragment < 2 mm3

Conservation dans le fixateur à 4°C et min 1H

Comment fixer?

Fixateur utilisé en ME

Il est très important d'utiliser un glutaraldéhyde "EM grade"Composé uniquement de monomères, les seuls de taille suffisamment réduite pour pénétrer rapidement le tissu (les autres formules sont destinées à tanner le cuir !)

• Glutaraldéhyde: COH(CH2)3COH

- 2 aldéhydes libres autour d'une chaîne carbonée aliphatique

- Ponts méthylène entre fonction amine des protéines et aldéhyde

- Fixation rapide mais pénétration lente (1mm/h)

- Fixation +++protéines, chromatine, acides nucléiques

Préparation du fixateur

• Protocole de préparation sur le site du CR: www.cr.amylose-al.fr

- Respect du milieu intérieur cellulaire:

Composition de la solution contenant le fixateur:

-Osmolarité (saccharose, NaCl)

-pH ( tamp. phosphate, tamp.cacodylate)

- Concentration : entre 2 et 4%

- Quantité: 10 fois le volume des pièces à traiter

- Volume des pièces à fixer : 1 à 2 mm3

- Température de fixation : 4°C 1H minimum

- Qualité du fixateur : date de péremptionRapidité de la fixation

Délai entre l’exérèse et la fixation < 30 secondes

La solution fixatrice doit être osmotiquement équilibrée par rapport au milieu cellulaire du tissu étudié

Effet de la pression osmotique dans le tampon de préparation des fixateurs

Solution hypertonique

Solution hypotonique

Bonne fixation Fixation tardive

Mauvaise congélation

MO

Pb osmolarité

Séjour prolongé dans le tampon

mitochondrie

noyau

Fixation tardive

8nm

• Conservation une quinzaine de jours à 4°C dans le glutaraldéhyde

Sans altérations ultrastructurales (pas de surfixation)

Envoi du fixateur possible par courrier avant biopsie

Disposition de la biopsie dans le moule

Biopsie perpendiculaire à l’axe de coupe

Axe de coupe

Inclusion

• Permet la confection de coupes ultrafines (50-80nm)

Faible pouvoir de pénétration des électrons dans la matière

• Evite toute évolution du tissu sous l’action des électrons

• Biopsie fixée au glutaraldéhyde:

-Envoi dans cryotube rempli de fixateur envoi à 4°C

• Biopsie congelée:

- Envoi en carboglace

Conditionnement des biopsies pour l’envoi

Mettre suffisamment de carboglace

Eviter le week-end

Eviter le colissimo

www.cr.amylose-al.fr