Structure et propriétés des enzymes Objectifs de la leçon 1- Définir les termes enzymes,...

Structure et propriétés des enzymesStructure et propriétés des enzymes

Objectifs de la leçon1- Définir les termes enzymes, substrat,

produits2- Établir l’équation de Michaélis- Menten3- Représenter graphiquement l’équation de

Michaélis- Menten4- Déterminer 3 méthodes de linéarisation de

l’équation de Michaélis- Menten

I-GénéralitésI-Généralités

Définition des enzymes :- Composés protéiques- Biocatalyseurs spécifiques : modulateurs des

réactions chimiques - L’activité enzymatique est intimement liée à la

structure tridimensionnelle- Perte d’activité par dénaturation protéique

I- GénéralitésI- Généralités

Propriétés générales des enzymes- Elles ne créent pas les réactions - Elles accélèrent la vitesse des réactions

chimiques- Elles abaissent l’énergie d’activation et

augmentent la concentration des substrats à l’état activé

- Elles ne se perdent pas dans la réaction- Elles n’interviennent pas dans l’équilibre des

réactions chimiques réversibles

I- GénéralitésI- Généralités

Propriétés générales des enzymes (suite)

- Les enzymes agissent à de très faibles concentrations

Activité moléculaire spécifique (AMS) :

103<AMS<106

I- GénéralitésI- Généralités

Propriétés générales des enzymes (suite)Les enzymes sont spécifiques :

Spécificité de fonction

Spécificité de substrat

Spécificité optique

Spécificité d’organe : exemple aminotransférases du foie et du

coeur

II- Nomenclature des enzymesII- Nomenclature des enzymes

Conceptions anciennes- Rajout du suffixe " ase "  au nom du substrat Exemple substrat= urée ; Uréase = enzyme transformant l’urée

en ammoniac + CO2

- Rajout du suffixe " ase "  au type de réaction catalysée par l’enzyme

Exemple : urée + H2O ammoniac +CO2 (hydrolase)

- Noms communs consacrés par l’usage : Exemple : pepsine, trypsine, chymotrypsine

….etc.

II- Nomenclature des enzymesII- Nomenclature des enzymes Conceptions actuellesNuméro d’ordre - Recommandation de l’union internationale de

Biochimie (UIB) : enzyme dénommée par 4 chiffres séparés par des points

Exemple : 1.1.1.1. = alcool déshydrogénaseNom systématiqueNom commun recommandé (appellation

consacrée par l’usage)

II- Nomenclature des enzymesII- Nomenclature des enzymes Les 4 chiffres recommandés par l’UIB- Premier chiffre(le plus important) = classe

de l’enzyme- Deuxième chiffre = sous-classe de l’enzyme

(type de fonction du substrat participant à la réaction)

- Troisième chiffre = sous-sous-classe de l’enzyme (nature de l’accepteur)

- Quatrième chiffre = place de l’enzyme particulière à nommer dans la sous-sous-classe.

II-1 Nomenclature des enzymes II-1 Nomenclature des enzymes selon le numéro d’ordre de l’UIBselon le numéro d’ordre de l’UIB

Les 6 classes principales d’enzymes (Premiers chiffres selon UIB):

- 1. Classe des oxydo-réductases- 2. Classe des transférases- 3. Classe des hydrolases (OTHLIL)- 4. Classe des lyases- 5. Classe des isomérases- 6. Classe des ligases

II-2 Autre nomenclature des enzymesII-2 Autre nomenclature des enzymes ( noms systématique et ( noms systématique et recommandé)recommandé) Nom systématique : 3 éléments de référence du nom systématique :- Nature du donneur- Nature de l’accepteur- Type de réaction catalyséeNom recommandé :Appellation consacrée par l’usage, comme dans

le cas des conceptions anciennes

II-3.Application de la nomenclature II-3.Application de la nomenclature des enzymesdes enzymes

Exemple : phosphorylation du glucoseα-D-glucose + ATP α-D-glucose-6-phosphate +

ADP- Numéro d’ordre = 2.7.1.1.- Nom systématique = ATP- α-D-glucose - 6-

phosphate transférase- Nom recommandé = Glucokinase

III-Grandes fonctions enzymatiquesIII-Grandes fonctions enzymatiques

III-1. Les réactions d’oxydo-réduction- Transfert d’électrons avec ou non transfert de

protons- Support du transfert : corps donneur et corps

accepteur- Exemple : CH3-CH2OH + NAD CH3-CHO + NADH2

Ethanol Acétaldéhyde- Faits marquants : transfert d’hydrogènes et

d’électrons

III-Grandes fonctions enzymatiquesIII-Grandes fonctions enzymatiques

III-2. Les réactions de transfertExemple :phosphorylation du glucoseGlucose + ATP Glucose-6 P + ADPEnzymes de catalyses = transférases

III-Grandes fonctions enzymatiquesIII-Grandes fonctions enzymatiques

III-3. Réactions d’hydrolyse- réactions réversibles- Enzymes de catalyse : hydrolases- Exemple :CH3-CO-O-CH2-CH2-N

+(CH3)3 cH3-COOH + OH-CH2-CH2- N+(CH3)3

Acétylcholine Acide acétique + Choline

III-Grandes fonctions enzymatiquesIII-Grandes fonctions enzymatiques

III-4.Réactions catalysées par les lyases

- Addition ou retrait de groupements à des carbones impliqués dans des liaisons

- Création ou saturation de doubles liaison

III-Grandes fonctions enzymatiquesIII-Grandes fonctions enzymatiquesIII-5. Réactions d’isomérisation- Réarrangements intramoléculaires- Enzymes de catalyse : isomérases- Catégories d’isomérases Racémases :(série D Série L)Mutases : transfert interne de radical

(exemple : Glucose-6-phosphate Glucose-1-phosphate)

Epimérase ( exemple: Galactose glucose)Cis trans-isomérase (exemple : Fumarate

Malate)

IV- Cinétique enzymatiqueIV- Cinétique enzymatiqueComplexe enzyme-substrat (complexe ES)- fixation du Substrat sur le site actif de

l’enzyme

S + E ES P + E

Remarque : - S= substrat; E = Enzyme; P = Produit- Disparition de S se traduit par l’apparition de P

IV- Cinétique enzymatiqueIV- Cinétique enzymatiqueVitesse de la réaction (V)-Nombre de molécules de substrat (S)

transformées en produit (P) par unité de temps. V = ‑ d[S] = d[P] dt dt- Ordre de réaction 0, 1 ou 2 en cinétique

chimique A…B V = ‑ d[A] = K[A] dt α = ordre de la réaction; K = constante de

vitesse

IV- Cinétique enzymatiqueIV- Cinétique enzymatiqueRéaction du premier ordre : - transformation d’un seul substrat- [S] est une fonction exponentielle

décroissante du temps et de K la constante de vitesse:

Ln [S] = -Kt + Ln [S0] d’oùV = ‑ d[S] = d[P] = K1[S] dt dtT1/2=durée de consommation de la moitié de [S]T1/2 = Ln2/K1

IV- Cinétique enzymatiqueIV- Cinétique enzymatiqueRéaction de second ordre :- réaction où deux substrats réagissent entre

eux pour donner un ou deux produits A + B …… CV = d[C] = K[A] [B] dt Remarque : V en Ms-1 et K en M -1 S –1

T1/2 = 1/(K2 [A0])

IV- Cinétique enzymatiqueIV- Cinétique enzymatiqueApplication à la réaction enzymatique- 2 étapes essentielles : formation du complexe

ES et étape de catalyse avec apparition de produit (P)

E + S ES E + P

Remarque : - ES = complexe de Michaëlis – Menten- ES se dissocie en P et en E. La constante est

appelée constante catalytique Kcat (en s -1 )

K1

K-1

K2

IV- Cinétique enzymatiqueIV- Cinétique enzymatique

Vitesse initialeV0 = d[P] = Kcat [ES] dtHypothèse de Brigg et Haldane- notion d’état stationnaire :Va = K1[E][S] = Vd= K-1 [ES] + Kcat [ES]

IV- Cinétique enzymatiqueIV- Cinétique enzymatiqueEquation de Brigg – HaldaneK1[E][S] = K-1 [ES] + Kcat [ES]= (K-1 + Kcat) [ES] et

(K-1 + Kcat)/ K1 = Km

D’où [E][S] = Km [ES] Km = constante de Michaëlis .Remarque : Km s’exprime en molarité (ou M),

c’est une concentration.

IV- Cinétique enzymatiqueIV- Cinétique enzymatiqueEquation de Michaelis – Menten

[E]totale = [E]0 = [E] + [ES] d’où [E]= [E]0 - [ES]

On a [E][S] = Km [ES] ( équation de Brigg – Haldane)

Alors ([E]0 - [ES]) [S] = Km [ES]

IV- Cinétique enzymatiqueIV- Cinétique enzymatiqueEquation de Michaëlis – Menten[E]0 [S] - [ES] [S] = Km [ES] d’où [E]0 [S] = [ES] [S] + Km [ES] = ([S] + Km ) [ES] [E]0 [S] = ([S] + Km ) [ES] d’où[ES] = [E]0 [S] / ([S] + Km ) Donc V0 = Kcat [ES] = Kcat [E]0 [S] / ([S] + Km )

= équation de Michaëlis-MentenRemarque : si [ES] = [E]0 =[E]totale

IV- Cinétique enzymatiqueIV- Cinétique enzymatiqueEquation de Michaelis – Menten (MM)si [ES] = [E]0 = [E]totale alorsV0 = Vmax = Kcat [E]0 et on avait V0 = Kcat [ES] = Kcat [E]0 [S] / ([S] + Km )

V0 = Vmax[S] = équation de MM Km + [S]

V- Représentation graphiqueV- Représentation graphiqueCinétique Michaélienne

Km

Vmax

v

[S]

Vmax/2

Courbe de Michaelis-Menten

V- Représentation graphiqueV- Représentation graphiqueLinéarisation de l’équation de MMÉquation de Lineweaver- Burk (LB)

-1/Km

1/Vmax

2/Vmax

1/V

1/[S]

max

1)

][

1(

max

1

VSV

Km

v

Droite de Lineweaver-Burk

V- Représentation graphiqueV- Représentation graphiqueLinéarisation de l’équation de MM

Transformation d’Eadie-Hofstee

Vmax/Km

Vmax

V

v/[S]

V- Représentation graphiqueV- Représentation graphique

-Km

Km/Vmax

[S]/V

[S]

Linéarisation de l’équation de MM par Transformation selon Hanes

Modulation de l’activité Modulation de l’activité enzymatiqueenzymatiqueObjectifs de la leçon1- Décrire les différents types d’inhibition

enzymatique2- Déterminer les constantes Km et Vmax en

absence et en présence d’un inhibiteur compétitif non compétitif ou incompétitif

3- Représenter la cinétique en absence et en présence de de chacun des différents inhibiteurs ( compétitif non compétitif ou incompétitif)

4- Comparer les profils cinétiques de l’enzyme à la cinétique michaëlienne et de l’enzyme allostérique

VI- Modulation de l’activité VI- Modulation de l’activité enzymatiqueenzymatiqueEffecteurs physiquesEffet du pH sur l’activité enzymatique - activité enzymatique maximale au pH optimum. Effet de la température sur l’activité

enzymatique- activité enzymatique maximale à température

optimale - Augmentation de la température peut

dénaturer (perte de l’activité enzymatique)

Récapitulatif des effets pH et Récapitulatif des effets pH et température sur l’activité de température sur l’activité de l’enzymel’enzyme

3 7 12 10 40 70

Activité relative Activité relative

pH Température

VI- Modulation de l’activité VI- Modulation de l’activité enzymatiqueenzymatiqueActivateurs et Inhibiteurs enzymatiques- Certains composés agissent sur l’activité

enzymatique :en la favorisant (ce sont les activateurs), ou en la défavorisant (ce sont les inhibiteursInhibiteurs réversibles compétitifsInhibiteurs réversibles non compétitifsInhibiteurs incompétitifs.

VI- Modulation de l’activité VI- Modulation de l’activité enzymatiqueenzymatique

Inhibiteurs réversibles compétitifs (IRC)- Les IRC se lient de manière réversible au site

actif de l'enzyme et en bloquent l'accès au substrat.

- IRC et substrat (S) souvent analogues structuraux d’où la compétition entre IRC et substrat (S)

Cinétique enzymatique en présence Cinétique enzymatique en présence d’inhibiteurs Réversibles compétitifsd’inhibiteurs Réversibles compétitifs

Cinétique enzymatique en présence Cinétique enzymatique en présence d’inhibiteurs Réversibles compétitifsd’inhibiteurs Réversibles compétitifsDevenir des constantes cinétiques KM et VmaxKM

Dans l’équation de Michaelis-Menten KM est remplacé par :

KM' = KM • (1 + [I]/KI )

où KI = ki/k-i est la constante de dissociation de l'inhibiteur.

Vmax La vitesse maximale vmax reste la même.

Cinétique enzymatique en présence Cinétique enzymatique en présence d’inhibiteurs Réversibles compétitifsd’inhibiteurs Réversibles compétitifsReprésentation graphique de Lineweaver-

Burk1/V

E + S

E + S + IRC

VI- Modulation de l’activité VI- Modulation de l’activité enzymatiqueenzymatique

Inhibiteurs réversibles non compétitifs (IRNC)

- IRNC se lient de manière réversible ailleurs qu'au site actif de l'enzyme et n'en empêchent pas l'accès du substrat (S).

Cinétique enzymatique en présence Cinétique enzymatique en présence d’inhibiteurs Réversibles non compétitifsd’inhibiteurs Réversibles non compétitifs

Cinétique enzymatique en présence Cinétique enzymatique en présence d’inhibiteurs Réversibles non d’inhibiteurs Réversibles non compétitifscompétitifsDevenir des constantes cinétiques KM et Vmax

KM

- KM ne change pasVmax

- Vmax change

vmax' = vmax / (1 + [I]/KI )

Cinétique enzymatique en présence Cinétique enzymatique en présence d’inhibiteurs Réversibles non d’inhibiteurs Réversibles non compétitifscompétitifsReprésentation graphique de Lineweaver-Burk

1/V

E + S

E + S + IRNC

VI- Modulation de l’activité VI- Modulation de l’activité enzymatiqueenzymatiqueInhibition incompétitive - l'inhibiteur incompétitif ne se lie que sur le

complexe Enzyme-substrat (ES)

VI- Modulation de l’activité VI- Modulation de l’activité enzymatiqueenzymatique

Effet des activateurs- petites molécules : cations métalliques- Association à l’enzyme ou au complexe ES- Effets délétères des chélateurs de ces ions sur

l’activité enzymatique

VII- Support structural- Mécanisme VII- Support structural- Mécanisme d’action – Régulation des enzymesd’action – Régulation des enzymes

Site actif- centre catalytique constitué de groupements

fonctionnels- groupements fonctionnels non forcément

voisins sur la structure I aire mais rapprochés à la faveur des autres structures (II aire, IIIaire et IV aire)

- Site actif = cible pour le marquage chimique

VII- Support structural- Mécanisme VII- Support structural- Mécanisme d’action – Régulation des enzymesd’action – Régulation des enzymes

Marquage du site actif de l’enzyme- marqueurs présentant une affinité des

groupements du sites- Marqueur inactive l’enzymeExemple de marqueurs :diisopropylfluorophosphate (cible :ser);iodacétamide (cible : Cys); acétylation (cible : -

NH2);estérification (cible : groupe C00H)

VII- Support structural- Mécanisme VII- Support structural- Mécanisme d’action – Régulation des enzymesd’action – Régulation des enzymes

Importance relative des AA dans l’activité de l’enzyme

- AA du site actif : rôle de fixation,d’orientation et d’activation

- AA collaborateurs : pas d’action directe mais leur fragilisation fragilise l’enzyme

- AA auxiliaires : participent fixation de S et expulsion de P

- AA non collaborateurs : rôle non établi.

VII- Support structural- Mécanisme VII- Support structural- Mécanisme d’action – Régulation des enzymesd’action – Régulation des enzymes

Niveau d’organisation des enzymes- systèmes poly enzymatiques :cas des enzymes

cellulaires (succession des réactions )- Exemple de chaîne séquentielle :  E1 E2 E3 E4

A → B → C → D → Produit final

VII- Support structural- Mécanisme VII- Support structural- Mécanisme d’action – Régulation des enzymesd’action – Régulation des enzymes

Enzymes allostériquesCaractéristiques- enzymes volumineuses, fragiles (purification

difficile)- enzymes inactives à 0°C; activité optimale à

+20°C- Enzymes formées de plusieurs sous-unités - Coopérativité des sous-unités par transition

allostérique

VII- Support structural- Mécanisme VII- Support structural- Mécanisme d’action – Régulation des enzymesd’action – Régulation des enzymes

Enzymes allostériquesCinétique des enzymes allostériques-Allure sigmoïdale (Enzyme allostérique)

contrairement à celle hyperbolique (Enzyme à cinétique michaëlienne)

VII- Support structural- VII- Support structural- Mécanisme d’action – Régulation Mécanisme d’action – Régulation des enzymesdes enzymes

cinétique d’enzyme allostérique v

[S]

VII- Support structural- VII- Support structural- Mécanisme d’action – Régulation Mécanisme d’action – Régulation des enzymesdes enzymes

Enzymes allostériquesDésensibilisation des enzymes allostériques- perte de l’effet coopératif - Insensibilité aux modulateurs- Activité enzymatique : l’allure sigmoïde est

remmplacée par une hyperbole (cinétique michaélienne)

VIII- Les CoenzymesVIII- Les CoenzymesGénéralités sur les coenzymes- Enzymes distinguées en holoenzymes et en

hétéroenzymes- Hétéroenzyme : apoenzyme + partie non

protéique- Partie non protéique :Cofacteur = ion métalliqueCoenzyme = molécule organique (groupement

prostétique, co substrat)Exemples de coenzymes : NAD; NADP; FAD; FMN, phosphate de pyridoxal;

pyrophosphate de thiamine, Coenzyme A

IX- Les isoenzymesIX- Les isoenzymesGénéralités sur les isoenzymes- Isoenzymes = formes moléculaires d’une même

enzyme- Formes actives sur le même substrat principalÉléments de différence :- Charge- pH optimum d’activité- Thermostabilité- Substrats secondaires- Inhibiteurs chimiques

IX- Les isoenzymesIX- Les isoenzymes Intérêts bio cliniques des isoenzymesExemple de la lacticodéshydrogénase (LDH)- 5 isoenzymes LDH1, LDH2, LDH3,LDH4 et LDH5

- Chaque isoenzyme, tétramérique, est formées à partir de deux types de sous-unités M et H

- origine tissulaire des sous-unités :M : prédominant dans le muscleH : prédominant dans le cœur (H = Hearth)

IX- Les isoenzymesIX- Les isoenzymes Intérêts bio cliniques des isoenzymesProfil électrophorétique des isoenzymes LDH M4 M3H1 M2H2 M1H3 H4

LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1

Dépôt

- +

IX- Les isoenzymesIX- Les isoenzymes Intérêts bio cliniques des isoenzymesExemple de la créatine kinase (CK)- 3 isoenzymes : CK-BB, CK-MB et CK-MM- Chaque isoenzyme, dimérique, est formée à

partir de deux types de sous-unités M et BM : prédominant dans le muscleB : prédominant dans le cerveau (B = Brain)- CK-BB, CK-MB et CK-MM sont séparables par

électrophorèse- CK-MB augmente au cours de l’infarctus du

myocarde

X- Les macroenzymesX- Les macroenzymesGénéralités :macroenzymes : formes inhabituellesComplexes divers : - association enzymes et immunoglobulines - enzymes autoagrégées - association enzymes et lipoprotéines - enzymes de fragment membranaire

circulant

X- Les macroenzymesX- Les macroenzymes Intérêts bio cliniques des macroenzymesExemples :Macroamylase : élévation dans affection

pancréatiqueMacrocréatine kinases : macro CK de type 1

et macro CK de type 2

X- Les macroenzymesX- Les macroenzymesValeur diagnostique des macrocréatines

kinases - Élévation macro CK de type 1 : sans valeur

diagnostique, faux positif au cours de l’infarctus du myocarde

- Élévation macro CK de type 2 :infarctus massif du myocarde (mauvais pronostic)

FINFIN