Techniques de base de la vitroculture

S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales

Techniques de base de la vitroculture

Vitroculture et vitrométhodes

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Aspects techniques

Organisation du laboratoire

Préparation des milieux et

stérilisation

Repiquage en conditions

stériles

Chambre de culture

Laverie

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S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales Conditions de culture

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Stérilisation des explants

Ethanol Hypochlorite de sodium ou calcium Peroxyde d’hydrogène Nitrate d’argent

Protocole de stérilisation des explants végétaux

Choix del ’échantillon

1/ Ethanol 10 s2/ Ca(OCl)2 7%, 10 mn3/ 3 lavages H2O stérile

Découpage de l’explantet mise en culture

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Milieu de culture

Eau

Agents solidifiants : – agar– phytagel :

polymère d’origine bactérienne (acide glucuronique, rhamnose et glucose)

translucide !! Interférences avec la kanamycine !!

Conditions de culture

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Milieu de culture

Source de carbone

Conditions de culture

?In vitro, la majorité des cultures végétales

sont hétérotrophes

Choix de la source carbonée•Saccharose•glucose•maltose

Cas par cas : •substances de croissance

•génotype

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Milieu de culture

Éléments minéraux

Macroéléments : N,P,K, Ca, Mg, S ex : rapport NO3

- / NH4

+

Microéléments : autres oligoéléments

Conditions de culture

Utilisation de nitrate d’argent comme antagoniste de l’éthylène

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Substances de croissance

Auxines (dérivés du tryptophane) Cytokinines (dérivés de l’adénine) Gibbérellines (diterpènoïdes)

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Substances de croissance

Les auxines

Conditions de culture

Naturelle :•Acide Indole Acétique = IAA N

CH2 CO2 H

HCH2 CO2 H

Synthétiques :•Acide Naphtalène Acétique

•2,4-D (acide dichlorophenoxyacétique)

OCH2 CO2 H

Cl

Cl

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Mode de production des auxines Site de production:bourgeon apical

Diffusion des hormones- dominance apicale- stimulation de la rhizogenèse

Conditions de culture

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Au niveau cellulaire : elles stimulent l’élongation

Au niveau tissulaire : Elles stimulent la croissance racinairepour de faibles concentrations (sauf le 2,4-D)

Rôle des auxines

Elles inhibent l’élongation de la tige feuillée et le débourrement des bourgeons axillaires

Conditions de culture

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Substances de croissance

Les cytokinines– Naturelles

Isoprénoïd CK (ex: zéatine) Aromatic CK (ex: BA)

Conditions de culture

Synthétiques •Kinétine•Benzyl AdénoPurine (BAP)

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Mode de production des cytokinines

Site de production:Racines

Transport vers lessites d ’action :- levée de dominanceapicale- débourrement desbourgeons axillaires

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Au niveau cellulaire : elles stimulent la division cellulaire via l’induction de Cyclines

Au niveau tissulaire : En général, inhibition de la croissanced’apex racinaires

Induction de l’activité des méristèmes apicaux des organes aériens

Rôle des cytokinines

Surexpresseur de CYCD3Riou-Khamlichi et al., 1999 Science

Expression de CYCD3 en fonction des traitements hormonaux chez A.thaliana

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Substances de croissance

Gibbérellines (Acide gibbérellique)– Noyau ent-Kaurène (issu du geranyl-geranyl PP)

Conditions de culture

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Gibbérellines (Acide gibbérellique)– Effets complexes :

Stimulation croissance internodale, expansion des feuilles Inhibition de la croissance racinaire à la lumière Favorise au contraire la croissance racinaire à l’obscurité

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Milieu de culture

Éléments organiques divers

Acides aminés (glycine, cystéine…)

Vitamines (thiamine, acide nicotinique, acide folique…)

Mélanges organiques complexes

Antioxydants

Conditions de culture

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Comment obtenir un calet des cellules indifférenciées ?

Cellules indifférenciées

Coupure

callogenèse

S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales callogenèse

S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales callogenèse

S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales callogenèse

S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales callogenèse

S 7 : Technologie et Biotechnologie Végétales organogenèse

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Organogenèse

Régénération d’organes à partir d’un cal

Skoog et Miller (1957)

[Auxine]

[Cytokinine]

Callogenèse

Rhizogenèse

Cau

loge

nèse

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Méthode classique– 1 – Explants sur un milieu inducteur de cal = CIM– 2 – Transfert quelques jours plus tard sur un milieu

inducteurs de tiges feuillées = SIM– 3 – Transfert après quelques semaines sur un

milieu inducteur de racinesPour un exemple détaillé lire l’article “classique” de Valvekens et al. 1987 PNAS sur la méthode d’Agrotransformation de racines d’Arabidopsis

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