TECHNIQUES Principes et applications. Culture de Tetrahymena Données de base Température optimale:...

TECHNIQUESTECHNIQUES

Principes et applications

Culture de TetrahymenaDonnées de base

Culture de TetrahymenaDonnées de base

• Température optimale: 28 °C

• Température minimale: environ 12-14 °C

• Température maximale: environ 31-32 °C (choc thermique réversible)

• Temps de génération: 2h30-4h15 (normalement 4h)

Culture de TetrahymenaMilieux de culture

Culture de TetrahymenaMilieux de culture

• Culture axénique: sans autres micro-organismes

• Milieu semi-défini• Source acides aminés: hydrolysat de protéine• Protéose, peptone, tryptone, lait• Source de vitamines: extrait de levure• Glucose• Sels: peu concentrés, maintien du pH• Na ou K, H2PO3

2-

Culture de TetrahymenaCulture stock

Culture de TetrahymenaCulture stock

• Température basse: 14°C• Milieu pauvre

• Pas de source de vitamines ou glucose• Peptone peu concentrée=> Doit utiliser beaucoup d’énergie/temps pour

synthétiser vitamines et autres

• Croissance lente• Repiquage moins fréquent

Culture de TetrahymenaCulture de conditionnement

Culture de TetrahymenaCulture de conditionnement

• Température presque optimale: 25°C

• Milieu riche• source de vitamines ou glucose• hydrolysats plus concentrées et variés

• Réadaptation progressive à des conditions de croissance rapide

Culture de TetrahymenaCulture de croissance

Culture de TetrahymenaCulture de croissance

• Température optimale: 28°C• Milieu riche

• source de vitamines ou glucose• hydrolysats plus concentrées et variés

• Agitation: meilleure oxygénation• Conditions de croissance rapide• Obtention de grandes quantités de cellules

Culture de TetrahymenaCulture massive

Culture de TetrahymenaCulture massive

• Température optimale: 28°C

• Milieu très riche• source de vitamines et glucose• lait comme source d'acides aminés

• Agitation: meilleure oxygénation

• Conditions de croissance rapide

• Obtention de très grandes quantités de cellules

Culture de TetrahymenaCulture en milieu défini

Culture de TetrahymenaCulture en milieu défini

• Milieu défini: [ ] exactes de toutes les composantes individuelles sont connues

• Température optimale: 28°C• Milieu

• Acides aminés• Vitamines• Glucose• Autres éléments (ac. gras, minéraux….)

• => Connaissance et contrôle des conditions

Culture de TetrahymenaMilieu minimal

Culture de TetrahymenaMilieu minimal

• Tris 10 mM + pH 7.6 + Glucose

• Milieu simple pour incorporation acides aminés marqués

• Pas de croissance

• Court terme

• "choc" => induisant une réponse ????

TetrahymenaConcentration des cellules

TetrahymenaConcentration des cellules

• Dispositif de concentration• Certaines manipulations requièrent des

concentrations de cellules non obtenues par des cultures de croissance

Si on a besoin de concentrer les cellules

TetrahymenaConcentration des cellules

TetrahymenaConcentration des cellules

Lang et Gauthier (1993)

TetrahymenaEnumération à l'hémacymètre

TetrahymenaEnumération à l'hémacymètre

• Détermination du nombre de cellules• Hémacymètre

• Normalement destiné à l'énumération des cellules du sang

2 cotés et 5 zones par coté

10 zones = 1 µL

Lamelle spéciale (coûteuse)

Cellules immobilisées (formaldéhyde)

Cellules cotés: supérieurs et gauches

http://www.bdbiosciences.com/discovery_labware/technical_resources/labtools/hemarefpf.html

TetrahymenaTraitements

TetrahymenaTraitements

• Exposition à choc thermique ou toxique• Cellules concentrées/diluées pour obtenir

conc. finale voulue• Tubes contenant le milieu de culture (selon

volume final voulu)+ toxique concentré --> conc. finale voulue

au temps = 0

+ cellules concentrées --> conc. finale voulue

+ N.p.o.: contrôle: volume identique dans chaque tube+ 1 tube sans produit toxique: solvant du toxique

TraitementsTraitements

• Incuber à T° voulue• Prélever aliquotes aux temps voulus -->

µtubes (1.5 ou 2 mL)• Centrifuger > 10 kRPM x 10 min -->

sédiment = cell.• Extraire les cell. en resuspendant dans soln

voulue§ SDS --> électro.

Electrophorèse (EGPA)Electrophorèse (EGPA)

• Séparation des protéines par EGPA-SDS• Protéines dénaturées: SDS et ßME + chauffage

• Charge uniforme + géométrie similaire séparation selon masse

Système triphasique• Tampon d'électrode: glycine• Gel de tassement: Cl- pH 6.8 (conc. PA faible)• Gel de séparation: Cl- pH8.8 (conc. PA forte)

==> échantillons volumineux peuvent être compactés pour donner une résolution supérieure

ElectrophoresePrincipe de la séparation

ElectrophoresePrincipe de la séparation

Gel de tassementGel de séparationIndicateur

de migration(Bleu de

briomophénol)

Directionde

migration

ElectrophorèseAnalyse des protéines synthétisées

ElectrophorèseAnalyse des protéines synthétisées

• Electrophorèse• Tassement• Séparation

• Fixation et Coloration• Ac. Acétique 10%• Bleu de Comassie (simple et sensible)• Argent (complexe mais très sensible)

• Buvardage ou Séchage + conservation

Buvardageprincipes

Buvardageprincipes

• Transférer à la surface d'une matrice solide

• Différentes matrices: nitrocellulose… PVDF, nylon.

• Capacité d'adsorption• Buvardage: transfert électrophorétique• Adsorption: forces hydrophobes, ioniques

• Méthanol. porosité de la matrice, durée et puissance du transfert

Transfert westernmécanisme

Transfert westernmécanisme

Direction demigration

Gel d'acrylamideMatrice solide(nitrocellulose)

ImmunodétectionImmunodétection

• Identification et détection d'une protéine spécifique

• Anticorps spécifique à la protéine d'intérêt

• Adsorption antigène d'intérêt sur la matrice

• Buvardage électrophorétique• Application directe ("dot blot")

Immunodétectionprécautions

Immunodétectionprécautions

• Blocage des sites inoccupés • Protéines: lait en poudre, albumine, collagene

(gélatine) => Ne contient pas antigène, anticorps, enzyme indicateur

• Prévention des liaisons non spécifiques• détergent doux: Tween (empêche adsorption Ag-Ab et

Ab-marice non spécifique)

ImmunodétectionImmunodétection

• Adsorption de l'anticorps sur l'antigène (primaire)

• Adsorption de l'anticorps secondaire conjugué avec enzyme sur l'antigène primaire (autres marqueurs fluorochromes)

• Détection de l'enzyme: Chromogénique

Chemiluminescent

Radioactif, fluorescent, etc.

Immunodétection: enzymesImmunodétection: enzymes

• Phosphatase alcaline• Sensible• Bon contraste en photo• Stable

• Peroxydase de raifort (HRP)• Assez sensible

• Durée limitée incubation (H2O2)

• Coloration +/- stable (H2O2)

• Contraste moyen

Electro ou ImmunodétectionComparer des patrons de migration

Electro ou ImmunodétectionComparer des patrons de migration

• Déposer même quantité de protéines ou protéines provenant d'une même quantité de cellules = difficile

• Base de comparaison: étalon interne• Protéine qui reste en quantité stable dans une

cellule• Étalons courants: actine, GAP

ImmunodétectionImmunodétection

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Marquage métabolique des protéinesMarquage métabolique des protéines

• Souvent on doit être capable de distinguer les protéines dont la synthèse est induite/ralentie par le traitement

• => Marquage métabolique:

• Exposition des cellules a des ac. Aminés marqués

• Extraction et séparation des protéines

• Autoradio- ou fluorographie