Un modèle de régulation - la répression cataboliquetsunku111.free.fr/University of Paris...

Un modèle de régulation -la répression catabolique

et l’opéron lac chez Escherichia coli

cours de Guennadi SEZONOV

BMC421 - 2009

http://

Les diapos du cours en couleur peuvent être téléchargées sur :

les enseignants de BMC421/2009

Céline Fabret

Pierre-Louis Blaiseau

Claude Gerbaud

Guennadi Sezonov

Céline Fabret

Pierre-Louis Blaiseau

Claude Gerbaud

Guennadi Sezonov

La lecture conseillée

Introduction

de l’adaptation enzymatique au principe de régulation de l’expression des gènes chez les bactéries

J Monod à l’Institut Pasteur

1946-1947 Participe avec A. Lwoff à deux congrès de Cold Spring Harbor qui vont marquer l'orientation de sa carrière. en 1946, où il prend connaissance des travaux de Beadle et Tatum sur la reproduction de Neurospora et de leur hypothèse d'une relation entre gènes et enzymes et,en 1947, le 11th Growth Symposium où il donne une conférence intitulée : The phenomenon of enzymatic adaptation

Le phénomène d’adaptation enzymatique – les bactéries sont intelligentes !!

Certaines enzyme apparaissent dans les cellules seulement en présence de leurs substrats.

Ce phénomène a été baptisé par J. Monod « adaptation enzymatique »

maximumjusqu’à 60.000 molécules par cellule

minimum 5-10 molécules par cellulesans induction « la fuite »

enzyme inductible

Le phénomène de la diauxie – E. coli choisit son sucre

croissance bi-phasiquedans le milieu contenant le glucose et le lactose

Diauxie

1959 – le modèle de l’opéron lactose de F. Jacob, J. Monod et A. Lwoff

1 – postule l’existence des gènes régulateurs et des gènes de structure;

2 – constate que les gènes peuvent former des unités de régulation et de transcription - OPERONS

3 – explique la nature (protéine) et le principe de l’action du répresseurLacI – notion de l’OPERATEUR; du PROMOTEUR et de l’INDUCTEUR

F. Jacob, J. Monod et A. Lwoff – Prix Nobel 1965

- opéron- opérateur- promoteur- répresseur- inducteur

Partie 1

l’opéron lac revisité

Opéron – définition du terme et principaux éléments structuraux

A B C D

promoteur

operateur

Opéron – une unité de régulation et de transcription composée de plusieurs gènes placéssous contrôle du même promoteur

Les éléments structuraux d’un opéron incluent :

- un promoteur et un terminateur de transcription- les gènes structuraux- une région régulatrice appelée opérateur

terminateur

Opéron lactose – la position

7,8 min

carte génétique

7,8 min

lacZ lacY lacAlacIséquences régulatrices PlacI

3075 pb 1254 pb 612 pb1083 pb

gènes

Opéron lactose – la position, les gènes

carte génétique

7,8 min

lacY lacAlacIPlacI

3075 pb 1254 pb 612 pb1083 pb

ARNm polycistronique lacZYA- sa demi-vie est de 3 minARNm lacI

ARNm

lacZséquences régulatrices

gènes

Opéron lactose – la position, les gènes , les ARNm

carte génétique

7,8 min

lacY lacAlacIPlacI

3075 pb 1254 pb 612 pb1083 pb

b- galactosidasedemi-vie 5 heures

b-galactoside perméase

b-galactosidetransacétylaserépresseur LacI

protéines

ARNm polycistronique lacZYA- sa demi-vie est de 3 minARNm lacI

ARNm

lacZséquences régulatrices

gènes

Opéron lactose – la position, les gènes , les ARNm et les protéines

carte génétique

La régulation de la transcription de l’opéron lac – vision simplifiée

Deux états de l’opéron lactose sont régulés par le répresseur LacI

Fermé- en l’absence de lactose

Ouvert - en présence du lactose

L’état « fermé » est assuré par LacI en l’absence de lactose

inhibition par LacI de l’initiation de la transcriptionpar l’ARN polymerase

le tétramère LacI, la forme active du répresseur

ARN polymérase

REPRESSION

En présence du lactose le répresseur est inactivé par un inducteur - allolactose

l’opéron est induit

changement de conformation de LacI

inducteur

lac est faiblement exprimé même sans lactose- la « fuite » de l’opéron

entrée du lactoseet induction de l’opéron

opéron lac pleinement induit

il n’y a plus de lactose le répresseur « ferme » l’opéron lac

opéron lacfortement réprimé

lactose devient disponible

Le cycle d’induction et de répression de l’opéron lac

le défaut du modèle lac simple –

le modèle n’explique absolument pas la croissance diauxique

Partie 2

les propriétés des protéines codées par l’opéron lac et le gène lacI

LacZ – b -galactosidaseLacY - b-galactoside perméaseLacA - thiogalactosidetransacétylase

LacI - répresseur transcriptionnel

-réactions enzymatiques-substrats -phénomène de l’a-complémentation

b-galactosidase LacZ

Les réactions enzymatiquesde la b galactosidase

C4C6

– isomérisation du lactose

– clivage en Gal et Glu

La structure de la b-galactosidase: un tétramère portant un ion de Mg2+

Mg2+

monomère tétramère

b-galactosides Substrat Inducteur

lactose,

allolactose+ +

métabolisable

Xgal

(chromogène) + -

IPTG - +non métabolisable

ONPG

(chromogène)+ -

glucose, maltose - -

Résumé:b galactosidase– les substrats et les inducteurs

Inducteur métabolisableallolactose

Inducteur non- métabolisableou « gratuit » - IPTG

Les inducteurs de l’opéron lac

ONPG - dosage enzymatique de la b-galactosidase dans un milieu liquide

ONPG – nitrophényle-galactoside non coloré

galactose +ONP (jaune)

lac-

-LB + Xgal

- MacConkey

- M63 lactose

Les phénotypes Lac+ et Lac- sur différents milieux de croissance

Visualisation de l’activité enzymatique de la b-galactosidasedans un milieu solide contenant X-Gal

X-Galbromo- 5- chloro-4-indolyl- b– D - galactoside

Lac- Lac+ Lac+

peu de colonies beaucoup de colonies

blanches bleues bleues

Réactions chimiques avec le X-Gal produisant la coloration bleue

nécessite l’oxygène

indigo

Le milieu MacConkey: la fermentation qui donne la coloration

Souche lac+

Souches lac-

[MK avec les oligopeptides] +lactose

Souche lac+

un colorant sensible au pH

Le milieu M63 (milieu minimum)+ lactose

une souche Lac+ une souche Lac-

dans ce milieu, le lactose est la seule source de carbone

L’opéron lac et les mutants lacZ-

sauvage lac+

+ + +

mutation non polaire (ex. ponctuelle)

- + +

mutation polaire (insertion d’un Tn)

- - -

effet polaire

La complémentation a

1025 aa

985 aa

40 aa

LacZ+ Lac+

11-40 aaN-terminale Lac-fragment w

N C

40 aa (fragment a) Lac-

985 aa 40 aa+???

La complémentation a

1025 aa

985 aa

40 aa

LacZ+ Lac+

11-40 aaN-terminale Lac-fragment w

N C

40 aa (fragment a) Lac-

Dans un diploïde

plasmide avec le fragment a

Lac+

w

achromosome avec le fragment w

Complémentation a - interaction non covalente entre les deux fragments

fragment w

fragment a

La complémentation a - les vecteurs de clonage

Le gène lacZ comme un gène rapporteur… chez les eucaryotes

Exemple 2: embryogenèse chez la Drosophile

Exemple 1: embryogenèse chez la souris

LacY - b-galactoside perméase -la protéine qui transporte le lactose

LacY – une protéine intégralement transmembranaire

12 hélices transmembranairesde LacY

La fonction de la protéine LacY – une perméase des b galactosides

- transporteur du lactose

-LacY sauvage transporte également le mélibiose (glucose a D-galactoside)

-LacY* - une forme mutée de LacY est capable de transporter le maltose

Le mécanisme de Lactose/H+ symport

b-galactosides transportés

obligatoirement

par LacY

rentrent par

d’autres voies

indépendamment de

LacY

lactose + -

Xgal - +

IPTG - +

glucose - -

mélibiose +

37°C et 43°C

+ à 37°C

- à 43°C

Perméase LacY – les substrats (résumé)

Répresseur transcriptionnel LacI

Le répresseur LacI agit comme tétramère

-domaine de fixation à l’ADN

-domaine de fixation de l’inducteur

domaine d’oligomérisation

une séquence répétée inverséecomme pour beaucoup de protéines régulatrices se fixant à l’ADN

LacI – le site de liaison à l’ADN reconnu dans l’operateur lac

3 séquences opératrices de l’opéron lac

lacZ lacY lacAlacIpromoteur

PlacI

O1+11

O2+412

O3-82

formation d’une boucle d’ADN

O3O1

La répression par LacI nécessite la présence de trois opérateurs

TD1

LacI – un obstacle stérique pour l’ARN pol

~40 molécules de LacIpar cellule =10 tétramères

Le répresseur LacI – l’action de l’inducteur

Un peu de génétique…

les mutations lacI-, lacIS et lacOC

Mutation lacI-

en l’absence de LacI fonctionnelle, l’opéron lac est exprimé de façon constitutive

transcription

c’est une mutation recessive

Mutation lacIS

LacIS ne peut pas se lier à l’inducteur

l’opéron lac est réprimé de façon constitutive

c’est une mutation dominantenegative

Mutation OC

LacI ne se fixe plus sur son operateurl’opéron lac est exprimé de façon constitutive

c’est une mutation dominante

Conclusion:

le phénotype « Lac constitutif » peut êtreobservé à la suite des mutations qui touchent des site distincts

- soit le gène lacI- soit l’operateur o

Réfléchir sur la distinction entre les deux cas

Régulation de l’expression du gène lacI

Comment les ribosomes terminent la traduction de l’ARNm lacI tronqué?

Les principales étapes de la traduction

releasing factors

l’action de SsrA – un ARN trans-messager sur les ribosome bloqués sur les mARN sans codon STOP

P A

l’action de SsrA – un ARN trans-messager sur les ribosome bloqués sur les mARN sans codon STOP

P A

La structure de l’ARN SsrA

l’action de SsrA – un ARN trans-messager sur les ribosome bloqués sur les mARN sans codon STOP

P A

La structure de l’ARN SsrALe rôle de la protéine SmpB

SsrA – un ARN trans-messagerqui sauve la traductiond’un ARNm sans codon STOP

P A

Régulation de l’expression du gène lacI – SsrAtmARN

SsrA tag –AANDENYALAA11 aa peptide

TD3

Partie 3

l’opéron lac et la répression catabolique

pourquoi en présence de lacose+glucose l’opéron lac ne s’exprimera pas??

maximumjusqu’à 60.000 molécules par cellule

minimum 5-10 molécules par cellulesans induction « la fuite »

enzyme inductible

Cette régulation s’explique parfaitement bien par l’action de LacI

??????????????????????????????????

Quelle que soit la proportion entre les deux sucres les bactéries ne se trompent pas

le phénomène de diauxie

La synthèse de la b-galactosidase ne commence que en phase lag apresla consommation du glucose

b-gal

unités de b-galDO

glucose lactose

La répression catabolique (la préférence pour le glucose)

– un phénomène général

Repression Catabolite(glucose)

catabolic operons

LactoseMaltose

Arabinose

Rhamnose

SymbiosisCentral metabolismVirulenceMotilityNitrogen utilizationChemotaxis

5%-10% of all bacterial genes!!!!

flux de phosphates

le transportdes glucidesest couplé à leur phosphorylation

non spécifique

spécifique

histidineprotèine

enzyme I

La protéine EIIA-Glu est le senseur principal de la présence du glucose

-la forme non phosphorylée de EIIA-Glu est majeure -si le glucose est présent

- la forme phosphorylée de EIIA-Glu s’accumule si le glucose est absent

La protéine EIIA-Glu est le senseur principal de la présence du glucose

-la forme non phosphorylée de EIIA-Glu est majeure si le glucose est présent et transporté

-Cette forme bloque l’activité du transporteur LacY. -Le lactose ne rentre pas – c’est « l’exclusion de l’inducteur »-l’opéron lac reste réprimé par le répresseur LacI

X

lactose

La protéine EIIA-Glu est le senseur principal de la présence du glucose

-la forme phosphorylée de EIIA-Glu est majeure si le glucose est absent

-lactose est transporté par LacY

-la répression par LacI est levée mais l’opéron lac s’exprime seulement siune autre protéine , CRP, est présente et activée

X lactose

La protéine EIIAGlu est le senseur principal de la présence du glucose

X lactose

adenylatecyclase

catabolite répresseur protéine

opéron lactosed’autres gènes régulés par la répression catabolique

Les deux conformations de CRP – activateur transcriptionneml

se fixe à l’ADN en présence de l’AMPc

incapable de se lier à l’ADN sans soneffecteur AMPc

L’adénylatcyclase catalyse la synthèse de l’AMP cyclique (AMPc) à partir de l’ATP

l’adénylatecyclase est codée par le gène cyaA

sans AMPc

avec AMPc

en présence de glucosel’adenylate cyclase n’est pas activée

X

lactose

adenylatecyclase

catabolite répresseur protéine

XX

X lactose

adenylatecyclase

catabolite répresseur protéine CRP

opéron lactose???? quel cible?

en l’absence de glucosel’adenylate cyclase est activéeet la forme active CRP est presente

AMPc

CRP activée

transcription par RNApol

répresseur LacI inactif

promoteur lac

operateur lac libresite de fixationde CRP

La double régulation de l’opéron lac– activation par CRP et répression par LacI

en présence du lactose et en l’absence de glucoseCAP+AMPc active la transcription de l’opéron lac

La position du site de fixation de CAP dans le promoteur de l’opéron lac

Quel est le rôle de CRP dans la régulation de l’opéron lac?

1 - c’est un activateur transcriptionnel

2 – son rôle n’est pas accessoire, sans CRP l’opéron lac n’est pas transcrit

Le mécanisme d’action de CAP

promoteur canonique-35 -10

TTGACA TATAAT

promoteur lacTTTACA TATGTT

promoteur lacUV5 indépendant de CAPTATAAT

sans CAP le complexe ouvert ADN/ARNpol n’est pas stable

T69T79G61A56C54A54 -- 161717431817 -- T77A76T60A61A56T82

-61 +1

opérons lactose, arabinose opéron galactose-50

ARNPol.alfa

4 états de l’opéron lac - état 1

4 états de l’opéron lac - état 2

4 états de l’opéron lac - état 3

Double verrouillage en l’absence de lactose et en l’absence de glucose

CAP favorise la formation d’uneboucle de 93pb

-82 +11

LacItétramère

CAP

4 états de l’opéron lac - état 4

Comment le glucose activela répression catabolique?

Modèle 1 – inhibition de l ’activité de l’AMP cyclique par EIIA-Glu

variation de la concentration de l’AMPc

Modèle 2 – inhibition de l ’activité de la lactose perméase (exclusion de l’inducteur) par le système PTS

X

TD4

TD5

EIIBC

sans action de CRP sur le gène ptsGil n’a pas de répression catabolique

TD6

Inhibition de l’entrée du lactose… par le lactose lui-même

Troisième clef de la régulation???

TD7

Comment EIIA-Glu agit sur l’adénylate cyclase

Partie 4

X opéron lactose

Combien de gènes lacZ chez E. coli ?

étalerlacZlacY+ lacA+ sur milieu minimum+lactose

pas d’activitéb-gal autre que codée par lacZ

il existe une autreactivité b-gal

soit soit

http://genolist.pasteur.fr/Colibri/

ebgA– « evolved » beta galactosidase

l’opéron lac est faiblement exprimé même en l’absence de l’inducteur – LA FUITE

Pourquoi une régulation parfaite serait-t-elle une erreur biologique?

La fuite transcriptionnelle de l’opéron lac ou le paradoxe d’une régulation parfaite

avec la fuite

-après une longue absence le lactoseest ajouté dans le milieu

- les bactéries possèdent toujours quelques molécules de LacY et LacZpour transporter le lactose et produirel’inducteur - allolactose

- l’induction du système est donc possible;l’opéron lac s’exprime; le lactose estmassivement transporté et consommé

opéron lacest faiblement exprimé même en l’absence de l’inducteur

Pourquoi une régulation parfaite serait-t-elle une erreur biologique?

sans fuite

La fuite transcriptionnelle de l’opéron lac ou le paradoxe d’une régulation parfaite

avec la fuite

-après une longue absence, le lactoseest ajouté dans le milieu

- les bactéries possèdent toujours quelques molécules de LacY et LacZpour transporter le lactose et produirel’inducteur - allolactose

- l’induction du système est donc possible;l’opéron lac s’exprime; le lactose estmassivement transporté et consommé

lac est faiblement exprimé même en l’absence de l’inducteur

Pourquoi une régulation parfaite serait-t-elle une erreur biologique?

sans fuite

-aucune molécule LacY n’est présente dans la bactérie;

-le lactose ne rentre pas -l’opéron lac n’est pas induit

-pire encore, l’opéron lac ne peut jamais être induit

- E. coli meurt de faim en baignant dans le lactose

-après une longue absence le lactoseest ajouté dans le milieu

La fuite transcriptionnelle de l’opéron lac ou le paradoxe d’une régulation parfaite

Et le gène lacA?

Acetyl-CoA

Thiogalactosidetransacetylaseest capable d’acétyler des b-galactosides non métabolisables pour les détoxifier et de les éliminer des cellules. Ses substrats naturels sont inconnus.

Acetyl-CoA + isopropylb-D-thiogalactoside

CoA + acetylatedisopropylb-D-thiogalactoside

L’opéron lactose est-t-il là pour assurer la dégradation du lactose?

- peu de lactose dans le tract digestif des adultes

- le lactose n’est pas l’inducteur direct de l’opéron lac

- beaucoup de b-galactosides sont libérés pendant la digestion des plantesLes membranes des chloroplastes contiennent beaucoup de b-galactosyl-glycérol

-b-galactosyl-glycérol est à la fois un substrat de la b-galactosidase et un très fort inducteur de l’opéron lac

le gènes lac ont été transférés dansle génome d’E. coli par le transfert horizontal

les gènes lacI et lacZ n’ont pas le même% de GC que lacYA.L’opéron lac à été rassemblé des sources différentes.

Partie 5

Travaux pratiques BMC421: les principales expériences

Les principaux buts de ces TP

- identifier les génotypes d’une collection de mutants par les approchesphénotypiques, par le dosage de la b-galactosidase et par l’analyse à l’aide dela PCR

les gènes visés - lacZ, lacY, lacA, lacI, cya, crp

- lacA – a –t –il un rôle dans la catabolisme du lactose?

- le mutant cya, peut il être sauvé par l’ajout de l’AMPc exogène?

-peut on « sauver » ces mutants cya- par un milieu de culture d’une souche lac+(bio feeding)?

- la fuite de l’opéron lac en l’absence de lactose, existe-t- il vraiment?

Les principaux buts de ces TP

- construire par la transduction avec le bactériophage P1 et à partir de simplesmutants lacI-::CmR et cyaA::Km un double mutant lacI::Cm cyaA-.

Question posée – quel sera le phénotype de ce mutant en l’absence à la fois de larégulation positive et de la régulation négative

AMPc

CRP activée

transcription par RNApol

répresseur LacI inactif

operateur lac libresite de fixationde CRP

X

X

Les principaux buts de ces TP

construire par l’approche de génétique inverse les mutants knock-out pour les gènescrr, ptsG, ptsH, cya ou crp. Analyse moléculaire de ce mutants.

- étudier par le dosage de l’activité de la b galactosidase le phénotype de ces mutants pour déterminer si l’effet de glucose est toujours observable et si le rôle de crp et de cya est vraiment important

ptsG

crr

ptsH

crp

cya

Délétion propre par la recombinaison homologue avec un fragment linéaire

courte région de homologuel’extrémité 5’ du gène

5’ 3’cassette de remplacement

recombinaison homologue

mutant lacA::KmR

lacY lacA cynX

KmR

lacY cynX

X X

courte région de homologuel’extrémité 3’ du gène

lacA::KmR

TD7

Les principaux buts de ces TP

-- analyser directement la quantité de l’ARMm produit dans le mutant dérépriméLacI- et comparé avec la souche sauvage (RT-PCR)

Les principaux buts de ces TP

La lecture critique et la discussion de 7 articles scientifiques pour

-mieux comprendre le sujet-comparer vos résultats avec les résultats publiés par des chercheurs chevronnés

TD1TD2

TD3TD4

TD5TD6

TD7

fin