Effets du sommeil et de la privation de sommeil sur le protéome hippocampique de rat après...

Effets du sommeil et de la privation de sommeil

sur le protéome hippocampique de rat

après apprentissage topographique

Jean-Etienne Poirrier24 mars 2010

Centre de Recherches du Cyclotron& Giga-Neurosciences

Université de Liège

Fonctions du sommeil

SommeilSommeil

Thermorégulation

Restaurationtissulaire

Défenseimmunitaire

Conservationde l’énergie

Plasticitésynaptique

…

…

Consolidation

Bennington 1999 & 2003, Brown 2004, Walker 2006

Consolidation mnésique

Mémoire à court terme Mémoire à long terme

minutes joursheures

Switch

Induction :requiert synthèse d’ARNm et de protéines

Maintenance :ARNm – synthèse de protéines

Stickgold 2007

Hippocampe

d’après Ikonen 2002, Cheung 2005

Labyrinthe de Morris

Quadrants de départ aléatoires :N, E, S, W, E, W, N, S, E, N, W, S

Latence d’échappementDistance parcourue

t(s)

essai4 81

Apprentissage120

20

Morris 1984, D’Hooge 2001

Fenêtre de sommeil paradoxal

ConsolidationConsolidation

Smith 1996

Fenêtre de sommeil paradoxal

ConsolidationConsolidation

Smith 1996

Fenêtre de sommeil paradoxal

Smith 1996, 1997

Effet de la privation de sommeil paradoxal sur l’apprentissage spatial

Période de privation de sommeil paradoxal(heures suivant le dernier apprentissage)

Late

nce

d’éc

happ

emen

t (s

)Essais apprentissage Tests rétention

Thèses

1. La consolidation de la mémoire est liée au sommeil

2. La consolidation de la mémoire nécessite une néo-

synthèse de protéines

3. L’hippocampe est spécifiquement impliqué dans

l’induction de la consolidation mnésique

Hypothèse

L’hippocampe devrait être leL’hippocampe devrait être le

siège d’une modification et/ou néo-synthèse de protéines siège d’une modification et/ou néo-synthèse de protéines

nécessaire à la consolidation mnésiquenécessaire à la consolidation mnésique

et dépendante de certaines phases du sommeilet dépendante de certaines phases du sommeil

Questions

Modification rapide de l’abondance des

protéines hippocampiques de rat suite à

un apprentissage ?

Modification de l’abondance des protéines

hippocampiques et des surrénales de rat

après privation de sommeil ?

Latéralisation de l’expression des protéines de

l’hippocampe de rats ?

Ensemble complet des protéines expriméesEnsemble complet des protéines exprimées

par une cellule, un tissu ou un organismepar une cellule, un tissu ou un organisme

à un moment donné,à un moment donné,

et dans des conditions définieset dans des conditions définies

Le protéomeLe protéome

Analyse du protéome

1. Préparation échantillon

2. Séparation(électrophorèsebi-dimensionnelle)

3. Identification(spectrométrie de masse)

pI 4 7

Mw

m/z

Gel 2DpH 4 7

Mw

2D-DiGE

Ünlu 1997, Patton 2000 & 2002

1 échantillon (pooling)Echantillon 1

+ Cy3

Echantillon 2+ Cy5

Standardinterne+ Cy2

2D-DiGE :

1.1. CyaninesCyanines (Cy dyes) comme marqueurs de protéine

2. Co-migration de 2 échantillons 2 échantillons différents dans le même geldifférents dans le même gel

3. Co-migration d’un standard standard interne et normalisationinterne et normalisationM

w

Lectureà 570nm

Lectureà 670nm

Lectureà 506nm

pH 4 7

SDS-PAGE

Focalisation isoélectriqueMeilleure analyse des patrons de distribution

Meilleure quantification des différences

Meilleure analyse des patrons de distribution

Meilleure quantification des différences

11Protéomede l’hippocampede rat

Asymétries comportementales

l’hippocampe

Asymétries morphologiques

Latéralisation biochimique

Expression différentielle de

transcrits

Résultats : hippocampes gauche et droit

Pas de latéralisation de l’abondance de protéines dans l’hippocampe de rat naïf

Contrôle positif

Différence d’expressiondes protéines hippocampiques

à deux stades du développement :

nouveaux nés (3 jours) etadultes (3 mois)

Fountoulakis 1999, 2000 & 2002, Weitzdorfer 2008

Résultat : adultes & nouveaux nés

Abondance protéique différente entre l’hippocampe des nouveaux nés et des adultes

Résultat : adultes & nouveaux nés

• 44 spots adulte > nouveau né• 50 spots nouveau né > adulte• 34 protéines identifiées• 18 protéines uniques

possibles modificationspost-traductionnelles

Fonctions adultes > nouveaux nés abondance

Fonctions nouveaux nés > adultes abondance

Conclusions – partie 1

G = D

Nouveau né ≠ Adulte

croissancesynthèse ARNm

synthèse protéines

maturation du cytosquelettematuration de voies métaboliques(glycolyse, respiration, fourniture ATP)

Fountoulakis 1999, 2000 & 2002, Weitzdorfer 2008

22Protéome de l’hippocampeet des surrénales de rat

suite à une privation de sommeil

hippocampesurrénales

sommeilprivation de

Transcrits du sommeil

F3

Grp94

GABA B3

Rxt1

JNK1

BiP

ERP70

CHOP

N-ras

LMO-4

Vgf

IER5

HSP60

BDNF

TIMP-1

GRP75

Glut1

NTT4Calmodulin

NGFI-A

NADH2

NGFI-B

Vin-1

Stat3

TrkBr

KIAA0313

HSP70

CytCOx

Neuroglycan

BiPStripeA

aaNAT1b

Cirelli 2002, 2005

Arc

SWI2

12s rRNA

NFGI-A

c-fos

SNF2

rlf

Homer1a

Protocole

Poirrier et al. 2006 Journal of Circadian Rhythms 4:10

Privation de sommeil – manipulation douce

Poirrier et al. 2008 Proteome Science 6:14

• 64 spots privation > sommeil• 23 spots sommeil > privation• 16 spots envoyés en MS• 12 protéines identifiées

Hippocampe : privation - sommeil

Hippocampes: Privation > Sommeil abondance

Poirrier et al. 2008 Proteome Science 6:14 ; Cirelli 2000 & 2006

(NSF)

Confirmations – α-SNAP

Anticorps anti-α-SNAP (monoclonal souris, conc. 1µg/ml)Rapport : -1.15 (-1.37) ; n = 3

Poirrier et al. 2008 Proteome Science 6:14

Confirmations – NSF

Anticorps anti-NSF (monoclonal souris, dil. 1/2000)Rapport : -1.28 (-1.33) ; n = 3

Poirrier et al. 2008 Proteome Science 6:14

Trafic vésiculaire – plasticité synaptique

Ungermann 2005

Surrénales : privation - sommeil

• 18 spots privation > sommeil• 39 spots sommeil > privation• 13 protéines identifiées• 12 protéines uniques

Surrénales : Privation < Sommeil

abondance

Poirrier et al. 2008 Proteome Science 6:14

Confirmations – G6PD

Anticorps anti-G6PD (polyclonal lapin, dil. 1/1000)Rapport : -1.47 (-1.49) ; n = 6

Poirrier et al. 2008 Proteome Science 6:14

Conclusions

• Courte privation totale de sommeil : stress physiologique / comportemental ensembles de protéines /

• Hippocampes en privation : activation de mécanismes impliqués dans transport et trafic vésiculaire– α-SNAP– NSF– Rab GDI α

• Glandes surrénales en sommeil : activation de mécanismes impliqués dans le métabolisme

Poirrier et al. 2008 Proteome Science 6:14

Où est le stress ?

• Aucun indice physiologique classique de stress• Aucun indice comportemental classique de stress

G6PD : synthèse NADPH (voie des pentoses phosphates)

NADPH contre le stress oxydatif suivant privation de sommeil

CLIC4 maintenance du volume cellulaire et du potentiel de repos membranaire

33Protéome de l’hippocampe de rat

suite à un apprentissage

Protocole

Groupes

G1

G3

G2

G4

G5

G6

G7

G1b

G2b

Rat

s 3

moi

sR

ats

6 m

ois

non-privation

privation

privation

privation

privation

non-privation

non-privation

non-privation

Lab. Morrisentraînement

4h 20hLab.Morris

test rétention

t0 phase claire sacrifice

20

Latence d’échappement rats 3 mois

Dur

ée t

ota

le (

s)120

60

40

Série

Tests 1 Tests 2 Tests 3 Rétention

Apprentissage +Non-privation (G2)

Apprentissage +Privation (G1)

Tests 1 : séries 1, 2, 3 et 4 ; Tests 2 : séries 5, 6, 7 et 8 ; Tests 3 : séries 9, 10, 11 et 12 ; Rétention : re-tests 1, 2, 3 et 4 (24h)

Distance parcourue rats 3 mois

1000

Dis

tanc

e to

tale

(cm

)

Série

Tests 1 Tests 2 Tests 3

Apprentissage +Non-privation (G2)

Apprentissage +Privation (G1)

Rétention Sans PF

4000

Tests 1 : séries 1, 2, 3 et 4 ; Tests 2 : séries 5, 6, 7 et 8 ; Tests 3 : séries 9, 10, 11 et 12 ; Rétention : re-tests 1, 2, 3 et 4 (24h)

Et pourtant …

Smith 1997

Analyse en composantes principales

Ensemble des spots de protéines dans l’expérience

Apprentissage > Apprentissage + Sommeil

abondance

Apprentissage + privation ~ Privation

abondance

Apprentissage + privation > Apprentissage + sommeil

abondance

Rat, hippocampe & apprentissage

Apprentissage tâche spatiale

Rétention tâche spatiale

Apprentissage + privation de sommeil Apprentissage + sommeil>>

Apprentissage Apprentissage + privation~~

Sommeil suivant apprentissage

Conclusions

• Etude du protéome d’hippocampe– privation de sommeil– apprentissage tâche mnésique

• Importance du protocole expérimental

• Privation de sommeil : transport et trafic vésiculaire

• Apprentissage = stress, métabolisme

Remerciements

• Professeurs G. Moonen & A. Luxen• Drs. P. Leprince & P. Maquet• Professeur C. Smith• Professeur PH. Luppi, Dr. R. Goutagny• Professeurs P. De Deyn, R.G. Morris, P. Meerlo,• Drs. A.M. Strijkstra, C. Robert• L. Cambron, JM. Klein• Professeur J. Destiné, Dr. F. Senny, N. Marique, T. Libert• Drs. A. Plenevaux, J. Aerts, A. Silvani, A. Darsaud• D. Lassance, P. Piscicelli, Y. Dohogne, L. Confetti, P. Ernst, A. Brose• Drs. F. Guillonneau, J. Renaut• A. Plenevaux, B. Herbillon, A. Konings