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Programa de Pós-Graduação em MicrobiologiaBiologia Molecular de Micro-organismos (MIC842)ICB/UFMG
PCR quantitativaTeoria e Aplicações
Lucas Secchim RibeiroLaboratório de Interação Microrganismo-Hospedeiro
Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.
2016 © Lucas Secchim Ribeiro
SumárioSumário
• PCR Histórico Teoria Aplicações
• Desenho de primers
• qPCR Metodologias Cálculos Aplicações PCR Digital
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2016 © Lucas Secchim Ribeiro
DogmaDogma central da Biologia Molecular central da Biologia Molecular
Dogma central da Biologia Molecular• Francis Crick / 1956
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2016 © Lucas Secchim Ribeiro
PCRPCR
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PCRPCR
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PCRPCR
PCRPCR
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PCRPCR
PCR - Polymerase Chain Reaction
PipetarChorarRepetir
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PCRPCR
Funções da PCR• Distinguir uma sequência-alvo específica de uma grande quantidade de background;
• Amplificação de cópias de uma sequência específica a partir de pequenas quantidades do DNA modelo.
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2016 © Lucas Secchim Ribeiro
PCR PCR convencionalconvencional
Aplicações da PCR “convencional”• Diagnóstico
• Avaliação de mutações• Detecção de patógenos (bactérias, fungos, vírus, protozoários)• Tipagem para transplantes - MHC
• Testes forenses• Paternidade• Investigações criminais
• Sequenciamento e clonagem• Epidemiologia molecular e bioinformática• Análise de OGM• ...
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PCR “convencional”
Reagentes básicos
PCRPCR
Iniciadoressenso/antissenso
(primers forward/reverse)
Cátions(Na+/K+ e Mg2+)
DNA polimerasecom DNA modelo
Deoxinucleotídeos(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
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2016 © Lucas Secchim Ribeiro
Importância do tampão e íon potássio na PCR
• pH 8,3 pH 7,2 a 72º C• Tris/ Tris-Cl• Função enzimática da DNA polimerase
• K+
• Reduz a repulsão entre DNA/DNA e DNA/primer através da neutralização de cargas negativas.
↑ [K+] para fragmentos pequenos ↓ [K+] para fragmentos grandes
PCR PCR convencionalconvencional
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Importância dos dNTPs e íon magnésio na PCR
• Deoxinucleotídeos trifosfato (dNTPs)• Associados ao DNA na forma de dNMPs• Sequestradores de Mg2+
• Mg2+
• Cofator da DNA polimerase• Especificidade e eficiência da enzima• Estabiliza ligação de dNTP/dNMP e primers à fita de DNA (↑ Tm)• Rendimento x Concentração crítica e empírica
↑ [Mg2+] ↑eficiência ↓especificidade
PCR PCR convencionalconvencional
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PCR PCR convencionalconvencional
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2016 © Lucas Secchim Ribeiro
Função e relevância dos primers• Polinucleotídeos sintéticos de fita simples, de sequência complementar e flanqueadora à fita molde, com a extremidade 3´-OH livre
PCR PCR convencionalconvencional
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2016 © Lucas Secchim Ribeiro
DNA polimerase termorresistente• Antigamente: adição de enzima a cada novo ciclo
• Taq DNA Polimerase• Dependente de cátions bivalentes (Mg2+ > Mn2+
>>>Ca2+)• Inibição por agentes quelantes (EDTA, citrato)
Thermus aquaticusParque Nacional de Yellowstone / EUA
PCR PCR convencionalconvencional
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DNA molde• Qualidade • Cuidado com resíduos de processos de extração
• SDS (dodecil sulfato de sódio)• Fenol• Corantes (subprodutos de PCR)• Heparina/EDTA/Citrato• Polissacarídeos vegetais/carragenina• Poliestireno/polipropileno expostos à radiação UV
• Quantidade• Excesso de DNA é prejudicial• Aumento de reação inespecífica
PCR PCR convencionalconvencional
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PCR PCR convencionalconvencional
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Parâmetros de termociclagem• Temperatura de anelamento
↑ Tanelamento ↑estringência ↓produtos
inespecíficos
↓ Tanelamento ↑rendimento ↑ produtos
inespecíficos
• Tempo de extensão• DNA Polimerase: 35 – 100 nt por segundo a 72º C• Ideal: entre 30 segundos e 1 minuto • Excesso Atividade de exonuclase 5´-3´
PCR PCR convencionalconvencional
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Aditivos• Separação de fitas com alto conteúdo G:C• Estruturas secundárias fortes
• Betaína (1 M)• DMSO (1-10%)• Formamida (1-10%)
• Agentes estabilizantes da DNA polimerase• Redução da adesão de reagentes ao tubo
• BSA (0,1 mg/mL)• Gelatina (0,1 – 1,0%)• Detergentes não-iônicos (<0,5%)
PCR PCR convencionalconvencional
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2016 © Lucas Secchim Ribeiro
Inibidores• Derivados das próprias amostras ou do método de extração/purificação do ácido nucléico;
• Fenol/álcoois• EDTA• Debris celular• Detergentes
PCR PCR convencionalconvencional
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PCR PCR convencionalconvencional
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PCR PCR convencionalconvencional
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PCR PCR convencionalconvencional
Fonte: Koch WH, 2004. Nature Reviews Drug Discovery 3, 749-761 (Sep 2004)
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PCR PCR convencionalconvencional
Visualização dos resultados• Separação por peso molecular: eletroforese• Corantes/marcação fluorescente
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Visualização dos resultados• Sequenciamento capilar• Dideoxinucleotídeos
PCR PCR convencionalconvencional
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PCR PCR convencionalconvencional
Antes da PCR...• Clonagem!
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PCR PCR convencionalconvencional
Antes dos termocicladores...• Banho-maria!
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Desenho de Desenho de primersprimers
Desenho deDesenho deprimersprimers
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Desenho de Desenho de primersprimers
Características de bons primers• Tamanho adequado
• 15 a 25 pares de bases• Tamanho x Temperatura de dissociação
• Temperatura adequada de dissociação (Tm)
• Conteúdo G:C• Diferença entre primers < 5º C• Concentração de cátions em solução
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Características de bons primers• Tamanho do fragmento a ser gerado
• Tempo de extensão da polimerase
• Especificidade Primers específicos x degenerados
Desenho de Desenho de primersprimers
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Características de maus primers• Inter-complementariedade• Formação de dímeros (primer dimer)
• Atenção à extremidade 3´
Desenho de Desenho de primersprimers
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Características de maus primers• Auto-complementariedade• Formação de auto-dímeros e hairpins
• ΔG (energia livre) > -9,0 kcal/mol
Desenho de Desenho de primersprimers
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Desenho de Desenho de primersprimers
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Características de bons primers• Adequação para qPCR
• Tamanho do amplicon • Junção exon-exon e contaminação com gDNA
Desenho de Desenho de primersprimers
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Desenho de Desenho de primersprimers
Ferramentas online de suporte• Primer-BLAST
www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
• Primer3bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3
• IDT Oligo Analyzer 3.1www.idtdna.com/calc/analyzer
• UCSC PCR in silicogenome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr?command=start
• RT Primer DB (específico para qPCR)• medgen.ugent.be/rtprimerdb
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Problemadetectado
Desenho de Desenho de primersprimers
Workflow para desenho de primers
Verificar• Temp. de
anelamento• Temp. de
dissociação• Tamanho do
amplicon• Estruturas
secundárias•
Complementaridade
• Especificidade
NãoSimPCR para confirmação de funcionamento
GenBank/NCBI
Encontrar sequência da
região desejadaPrimerBLASTPrimer3, etc
Desenhar primers
Registrar e arquivar
resultados obtidos
Reaçãoadequada
OK?
CHECAR PRIMERS!
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PCRPCR quantitativa quantitativa
PCRPCRquantitativaquantitativa
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PCR PCR quantitativaquantitativa
PCR quantitativa
• Nomenclatura• qRT-PCR • qPCR• Real-time PCR
• Análise de End-point
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PCR PCR quantitativaquantitativa
Ensaios químicos disponíveis
• SYBR Green I• Ensaio para 5´-nuclease (TaqMan)• Molecular Beacons• LightCycler• LUX
Detecção de fluorescência!
↑ sensibilidade
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PCR PCR quantitativaquantitativa
SYBR Green I• Corante específico para DNA de fita dupla• Flourescência aumenta ao longo da reação• Não tem ação inibitória• Detecta produtos inespecíficos
SYBR Green I
Brometo de etídio Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.
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PCR PCR quantitativaquantitativa
Ensaio para 5´-nuclase – Sondas TaqMan• Atividade 5´-nucleásica da Taq DNA Polimerase• Altamente específica, sem produtos espúrios• Duas marcações simultâneas são possíveis• Tecnologia baseada em FRET
• Flourescence Resonance Energy Transfer
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PCR PCR quantitativaquantitativa
FRET - Transferência de energia por ressonância fluorescente
• Fenômeno quântico entre duas moléculas muito próximas (10 – 100 Å), com bloqueio da emissão de luz• Fluoróforo x Quencher (bloqueador)• Sobreposição do λ de absorção e emissão
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PCR PCR quantitativaquantitativaPCR PCR quantitativaquantitativa
Ensaio para 5´-nuclase – Sondas TaqMan
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PCR PCR quantitativaquantitativa
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PCR PCR quantitativaquantitativa
Ensaio para 5´-nuclase – Sondas TaqMan• Discriminação alélica
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PCR PCR quantitativaquantitativa
Conceitos importantes• Fases exponencial, logarítmica e plateau
• Threshold• Baseline• Cycle threshold (CT)
Ciclos
Flou
resc
ência
(ou
prod
utos
de
PCR)
Plateau
Linear
ExponencialThreshold
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PCR PCR quantitativaquantitativa
Ciclos0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Amostra A
3 6 12 24 48 96 192 384 768 1536
3072
Amostra B
15 30 60 120 240 480 960 1920
3840
7680
15360
↑ CT ↓ Qtde. inicial
~7,05 ~9,38
Quantidadeinicial CT
Amostra A 3 9,38Amostra B 15 7,05
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PCR PCR quantitativaquantitativa
Conceitos importantes• Quantidade inicial de amostra• Relação CT x Quantidade inicial
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PCR PCR quantitativaquantitativa
Conceitos importantes• Eficiência
2n = cópias em n ciclos Eficiência teórica= 100%
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PCR PCR quantitativaquantitativa
Conceitos importantes• Eficiência
Qtde. inicial
de DNA1 10 100 1000 10000 100000 1000000 1000000
010000000
0
CT 40 35 30 25 20 15 10 5 1
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Log 10da qtde. inicial
0 1 2 3 4 5 6 7 8
CT 40 35 30 25 20 15 10 5 1
PCR PCR quantitativaquantitativa
Conceitos importantes• Eficiência
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E = 10(-1/slope) -1
PCR PCR quantitativaquantitativa
Conceitos importantes• Eficiência
Eficiência 100% = 2n a cada ciclo = log 2 x
Para um aumento de 10x = log 2 10 = 3,32
Slope(inclinação)
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PCR PCR quantitativaquantitativa
Conceitos importantes• Curva-padrão e blank sample
• Gene de referência/constitutivo/normalizador• Gene de interesse
Controle InfectadoGAPDH IFN-γ Relação GAPDH IFN-γ Relação
Amostra 1 20 20 1 5 40 8,0
Amostra 2 30 40 1,33 5 20 4,0
Amostra 3 60 80 1,33 10 50 5,0
Amostra 4 50 60 1,2 15 80 5,33
Amostra 5 40 50 1,25 10 60 6,0
Média + EPM 1,22 + 0,06 Média + EPM 5,66 +
0,67
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Conceitos importantes• Curva de dissociação (Curva de melting)
• Indica a temperatura em que 50% dos primers estão anelados;• Ligação específica do corante à fita dupla
PCR PCR quantitativaquantitativa
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PCR PCR quantitativaquantitativa
Conceitos importantes• Curva de dissociação (Curva de melting)
• Diretamente relacionada ao conteúdo G:C• Pode apontar amplificação inespecífica e dímeros de primers
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2016 © Lucas Secchim Ribeiro
Conceitos importantes• Curva de dissociação (Curva de melting)
• Importante para distinção de amplicons/primers em protocolos multiplex
PCR PCR quantitativaquantitativa
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PCR PCR quantitativaquantitativa
Fatores que afetam a eficiência da qPCR• DNA degradado• Produtos inespecíficos• Tamanho do amplicon• Condições de termociclagem
• Prática laboratorial inadequada• Reagentes contaminados• Primers mal desenhados• Diluições mal feitas• Falta de calibração e manutenção
• Pipetagem errada!
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PCR PCR quantitativaquantitativa
Funções da PCR quantitativa• Quantificação absoluta
• Curvas-padrão• Quantidade conhecida de “cópias por volume”• Semelhante a um ELISA• Exemplos: carga viral, 16S bacteriano
• Avaliação relativa• Ausência de curva-padrão• Gene de referência para normalização• Apresentada em aumento/redução em relação a um controle experimental• Exemplo: expressão gênica
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CÁLCULOS E ANÁLISES
Verificar dispersão entre replicatas biológicas e
técnicas
Checar controles positivos(curva-padrão) e negativos
(blank)
Conferir curvas de dissociação (Tm)
Verificar ajuste do threshold
PCR PCR quantitativaquantitativa
Análise de resultadosAvaliar as curvas de
amplificação
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PCR PCR quantitativaquantitativa
Cálculos em qPCR – Quantificação absoluta
• Regressão linear simples• Método Pfaffl Método Pfaffl Curva de cópias Curva de cópias (plasmídeos)(plasmídeos)
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PCR PCR quantitativaquantitativa
Cálculos em qPCR – Quantificação relativa• Relação matemática entre a expressão dos genes de referência e os de interesse;• Amostras controle (não tratadas) e estimuladas• Método Livak Método Livak 2 2--ΔΔΔΔCTCT
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Cálculos em qPCR – Quantificação relativa• Avaliada a conformidade de todos os outros parâmetros, a única informação útil será o CT• Exemplo:
Controle InfectadoGAPDH IFN-γ GAPDH IFN-γ
Amostra 1 15,1 32,5 14,9 29,4
Amostra 2 15,4 33,1 15,5 29,1
Amostra 3 16,0 32,8 15,1 28,8
Amostra 4 18,1 31,5 15,8 29,9
Amostra 5 15,7 32,0 15,5 28,9
PCR PCR quantitativaquantitativa
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PCR PCR quantitativaquantitativa
GAPDH IFN-γ Amostra 1 15,1 32,5 17,4 1,08 0,47Amostra 2 15,4 33,1 17,7 1,38 0,38Amostra 3 16 32,8 16,8 0,48 0,72Amostra 4 18,1 31,5 13,4 -2,92 7,57Amostra 5 15,7 32 16,3 -0,02 1,01
GAPDH IFN-γ Amostra 1 14,9 29,4 14,5 - -1,82 3,53Amostra 2 15,5 29,1 13,6 - -2,72 6,59Amostra 3 15,1 28,8 13,7 - -2,62 6,15Amostra 4 15,8 29,9 14,1 - -2,22 4,66Amostra 5 15,5 28,9 13,4 - -2,92 7,57
Controle
Infectado
ΔCT ΔΔCT 2-ΔΔCT
ΔCT
Média ΔCT
16,32
Média ΔCT ΔΔCT 2-ΔΔCT
0
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PCR PCR quantitativaquantitativa
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DicasDicas
Extração e manuseio de ácidos nucléicos• RNA = extremamente lábil!• Extração e armazenamento correto• Dosagem e normalização das amostras
• A260/280 e A260/230 > 1,8• Contaminação com DNA genômico
Confecção de cDNA• Normalizar a mesma quantidade (p.e. 1 µg) de RNA para todas as amostras;• Todo o procedimento deve ser realizado no gelo;• Evitar ciclos de congelamento/descongelamento.
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Escolha do gene de referência• É necessário ter opções!
• Ex.: 18S, GAPDH, RPL4, HPRT para camundongo
• Diferentes estímulos/tecidos/tratamentos podem ter a expressão do gene constitutivo alterada; •Preparar um pool com amostras-controle
• 6 diluições em triplicata• Diferença entre o CT mínimo e máximo < 1,0
•Algoritmos gratuitos na internet!• Ref Finder: Cotton EST Database• NormFinder: macro para Excel
DicasDicas
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PCR PCR quantitativaquantitativa
Antes da qPCR...• Northern Blotting (RNA)• Southern Blotting (DNA)
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PCRPCRdigitaldigital
PCR PCR digitaldigital
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PCR PCR digitaldigital
PCR digital (dPCR)
Baseada na compartimentalização da amostra
• Gotículas (droplets) em emulsão = microfluidos• Chips com nanopoços
Individualização das moléculas!Distribuição de Poisson
Aplicações• Quantificação absoluta sem curva-padrão• Expressão gênica• Detecção de alelos raros e/ou mutações• Discriminação de baixas diferenças para CNV
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PCR PCR digitaldigital
Sample DNA
Target
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PCR PCR digitaldigital
Fonte: Baker M, 2012. Nature Methods 9, 541 (Jun 2012)
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2016 © Lucas Secchim Ribeiro
http://www.gene-quantification.de/
DicasDicas
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DicasDicas
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DicasDicas
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DicasDicas
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PCRPCR
O que é importante saber?
• Teoria e suas diferenças entre as técnicas
• Vantagens e desvantagens de cada uma
• Como aplicar a PCR ao seu projeto
• Aplicações gerais e específicas
• Boas práticas laboratoriais
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Lucas Secchim RibeiroDpto. Microbiologia
Laboratório de Interação Microrganismo-Hospedeiro
Sala C4 191 – Ramal 2735
secchimribeiro@gmail.com
Aula disponível pelo endereço
http://bit.do/qPCR-UFMG2016
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2016 © Lucas Secchim Ribeiro
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