PCR Quantitativa - Lucas Secchim Ribeiro (PGMicro UFMG 2016-1)

Programa de Pós-Graduação em MicrobiologiaBiologia Molecular de Micro-organismos (MIC842)ICB/UFMG

PCR quantitativaTeoria e Aplicações

Lucas Secchim RibeiroLaboratório de Interação Microrganismo-Hospedeiro

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2016 © Lucas Secchim Ribeiro

http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/







SumárioSumário

• PCR Histórico Teoria Aplicações

• Desenho de primers

• qPCR Metodologias Cálculos Aplicações PCR Digital










DogmaDogma central da Biologia Molecular central da Biologia Molecular

Dogma central da Biologia Molecular• Francis Crick / 1956










PCRPCR










PCRPCR










PCRPCR

PCRPCR










PCRPCR

PCR - Polymerase Chain Reaction

PipetarChorarRepetir










PCRPCR

Funções da PCR• Distinguir uma sequência-alvo específica de uma grande quantidade de background;

• Amplificação de cópias de uma sequência específica a partir de pequenas quantidades do DNA modelo.










PCR PCR convencionalconvencional

Aplicações da PCR “convencional”• Diagnóstico

• Avaliação de mutações• Detecção de patógenos (bactérias, fungos, vírus, protozoários)• Tipagem para transplantes - MHC

• Testes forenses• Paternidade• Investigações criminais

• Sequenciamento e clonagem• Epidemiologia molecular e bioinformática• Análise de OGM• ...










PCR “convencional”

Reagentes básicos

PCRPCR

Iniciadoressenso/antissenso

(primers forward/reverse)

Cátions(Na+/K+ e Mg2+)

DNA polimerasecom DNA modelo

Deoxinucleotídeos(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)










Importância do tampão e íon potássio na PCR

• pH 8,3 pH 7,2 a 72º C• Tris/ Tris-Cl• Função enzimática da DNA polimerase

• K+

• Reduz a repulsão entre DNA/DNA e DNA/primer através da neutralização de cargas negativas.

↑ [K+] para fragmentos pequenos ↓ [K+] para fragmentos grandes











Importância dos dNTPs e íon magnésio na PCR

• Deoxinucleotídeos trifosfato (dNTPs)• Associados ao DNA na forma de dNMPs• Sequestradores de Mg2+

• Mg2+

• Cofator da DNA polimerase• Especificidade e eficiência da enzima• Estabiliza ligação de dNTP/dNMP e primers à fita de DNA (↑ Tm)• Rendimento x Concentração crítica e empírica

↑ [Mg2+] ↑eficiência ↓especificidade





















Função e relevância dos primers• Polinucleotídeos sintéticos de fita simples, de sequência complementar e flanqueadora à fita molde, com a extremidade 3´-OH livre











DNA polimerase termorresistente• Antigamente: adição de enzima a cada novo ciclo

• Taq DNA Polimerase• Dependente de cátions bivalentes (Mg2+ > Mn2+

>>>Ca2+)• Inibição por agentes quelantes (EDTA, citrato)

Thermus aquaticusParque Nacional de Yellowstone / EUA











DNA molde• Qualidade • Cuidado com resíduos de processos de extração

• SDS (dodecil sulfato de sódio)• Fenol• Corantes (subprodutos de PCR)• Heparina/EDTA/Citrato• Polissacarídeos vegetais/carragenina• Poliestireno/polipropileno expostos à radiação UV

• Quantidade• Excesso de DNA é prejudicial• Aumento de reação inespecífica





















Parâmetros de termociclagem• Temperatura de anelamento

↑ Tanelamento ↑estringência ↓produtos

inespecíficos

↓ Tanelamento ↑rendimento ↑ produtos

inespecíficos

• Tempo de extensão• DNA Polimerase: 35 – 100 nt por segundo a 72º C• Ideal: entre 30 segundos e 1 minuto • Excesso Atividade de exonuclase 5´-3´











Aditivos• Separação de fitas com alto conteúdo G:C• Estruturas secundárias fortes

• Betaína (1 M)• DMSO (1-10%)• Formamida (1-10%)

• Agentes estabilizantes da DNA polimerase• Redução da adesão de reagentes ao tubo

• BSA (0,1 mg/mL)• Gelatina (0,1 – 1,0%)• Detergentes não-iônicos (<0,5%)











Inibidores• Derivados das próprias amostras ou do método de extração/purificação do ácido nucléico;

• Fenol/álcoois• EDTA• Debris celular• Detergentes
































Fonte: Koch WH, 2004. Nature Reviews Drug Discovery 3, 749-761 (Sep 2004)











Visualização dos resultados• Separação por peso molecular: eletroforese• Corantes/marcação fluorescente










Visualização dos resultados• Sequenciamento capilar• Dideoxinucleotídeos












Antes da PCR...• Clonagem!











Antes dos termocicladores...• Banho-maria!










Desenho de Desenho de primersprimers

Desenho deDesenho deprimersprimers











Características de bons primers• Tamanho adequado

• 15 a 25 pares de bases• Tamanho x Temperatura de dissociação

• Temperatura adequada de dissociação (Tm)

• Conteúdo G:C• Diferença entre primers < 5º C• Concentração de cátions em solução










Características de bons primers• Tamanho do fragmento a ser gerado

• Tempo de extensão da polimerase

• Especificidade Primers específicos x degenerados











Características de maus primers• Inter-complementariedade• Formação de dímeros (primer dimer)

• Atenção à extremidade 3´











Características de maus primers• Auto-complementariedade• Formação de auto-dímeros e hairpins

• ΔG (energia livre) > -9,0 kcal/mol





















Características de bons primers• Adequação para qPCR

• Tamanho do amplicon • Junção exon-exon e contaminação com gDNA












Ferramentas online de suporte• Primer-BLAST

www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

• Primer3bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3

• IDT Oligo Analyzer 3.1www.idtdna.com/calc/analyzer

• UCSC PCR in silicogenome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr?command=start

• RT Primer DB (específico para qPCR)• medgen.ugent.be/rtprimerdb










Problemadetectado


Workflow para desenho de primers

Verificar• Temp. de

anelamento• Temp. de

dissociação• Tamanho do

amplicon• Estruturas

secundárias•

Complementaridade

• Especificidade

NãoSimPCR para confirmação de funcionamento

GenBank/NCBI

Encontrar sequência da

região desejadaPrimerBLASTPrimer3, etc

Desenhar primers

Registrar e arquivar

resultados obtidos

Reaçãoadequada

OK?

CHECAR PRIMERS!










PCRPCR quantitativa quantitativa

PCRPCRquantitativaquantitativa










PCR PCR quantitativaquantitativa

PCR quantitativa

• Nomenclatura• qRT-PCR • qPCR• Real-time PCR

• Análise de End-point











Ensaios químicos disponíveis

• SYBR Green I• Ensaio para 5´-nuclease (TaqMan)• Molecular Beacons• LightCycler• LUX

Detecção de fluorescência!

↑ sensibilidade











SYBR Green I• Corante específico para DNA de fita dupla• Flourescência aumenta ao longo da reação• Não tem ação inibitória• Detecta produtos inespecíficos

SYBR Green I

Brometo de etídio Este obra está licenciado com uma Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial-SemDerivações 4.0 Internacional.








http://en.wikipedia.org/wiki/Image:Ethidium_bromide.svg

http://en.wikipedia.org/wiki/Image:SYBR_Green_I.png



Ensaio para 5´-nuclase – Sondas TaqMan• Atividade 5´-nucleásica da Taq DNA Polimerase• Altamente específica, sem produtos espúrios• Duas marcações simultâneas são possíveis• Tecnologia baseada em FRET

• Flourescence Resonance Energy Transfer











FRET - Transferência de energia por ressonância fluorescente

• Fenômeno quântico entre duas moléculas muito próximas (10 – 100 Å), com bloqueio da emissão de luz• Fluoróforo x Quencher (bloqueador)• Sobreposição do λ de absorção e emissão










PCR PCR quantitativaquantitativaPCR PCR quantitativaquantitativa

Ensaio para 5´-nuclase – Sondas TaqMan





















Ensaio para 5´-nuclase – Sondas TaqMan• Discriminação alélica











Conceitos importantes• Fases exponencial, logarítmica e plateau

• Threshold• Baseline• Cycle threshold (CT)

Ciclos

Flou

resc

ência

(ou

prod

utos

de

PCR)

Plateau

Linear

ExponencialThreshold











Ciclos0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Amostra A

3 6 12 24 48 96 192 384 768 1536

3072

Amostra B

15 30 60 120 240 480 960 1920

3840

7680

15360

↑ CT ↓ Qtde. inicial

~7,05 ~9,38

Quantidadeinicial CT

Amostra A 3 9,38Amostra B 15 7,05











Conceitos importantes• Quantidade inicial de amostra• Relação CT x Quantidade inicial











Conceitos importantes• Eficiência

2n = cópias em n ciclos Eficiência teórica= 100%












Qtde. inicial

de DNA1 10 100 1000 10000 100000 1000000 1000000

010000000

0

CT 40 35 30 25 20 15 10 5 1










Log 10da qtde. inicial

0 1 2 3 4 5 6 7 8

CT 40 35 30 25 20 15 10 5 1












E = 10(-1/slope) -1



Eficiência 100% = 2n a cada ciclo = log 2 x

Para um aumento de 10x = log 2 10 = 3,32

Slope(inclinação)











Conceitos importantes• Curva-padrão e blank sample

• Gene de referência/constitutivo/normalizador• Gene de interesse

Controle InfectadoGAPDH IFN-γ Relação GAPDH IFN-γ Relação

Amostra 1 20 20 1 5 40 8,0

Amostra 2 30 40 1,33 5 20 4,0

Amostra 3 60 80 1,33 10 50 5,0

Amostra 4 50 60 1,2 15 80 5,33

Amostra 5 40 50 1,25 10 60 6,0

Média + EPM 1,22 + 0,06 Média + EPM 5,66 +

0,67










Conceitos importantes• Curva de dissociação (Curva de melting)

• Indica a temperatura em que 50% dos primers estão anelados;• Ligação específica do corante à fita dupla













• Diretamente relacionada ao conteúdo G:C• Pode apontar amplificação inespecífica e dímeros de primers











• Importante para distinção de amplicons/primers em protocolos multiplex












Fatores que afetam a eficiência da qPCR• DNA degradado• Produtos inespecíficos• Tamanho do amplicon• Condições de termociclagem

• Prática laboratorial inadequada• Reagentes contaminados• Primers mal desenhados• Diluições mal feitas• Falta de calibração e manutenção

• Pipetagem errada!











Funções da PCR quantitativa• Quantificação absoluta

• Curvas-padrão• Quantidade conhecida de “cópias por volume”• Semelhante a um ELISA• Exemplos: carga viral, 16S bacteriano

• Avaliação relativa• Ausência de curva-padrão• Gene de referência para normalização• Apresentada em aumento/redução em relação a um controle experimental• Exemplo: expressão gênica










CÁLCULOS E ANÁLISES

Verificar dispersão entre replicatas biológicas e

técnicas

Checar controles positivos(curva-padrão) e negativos

(blank)

Conferir curvas de dissociação (Tm)

Verificar ajuste do threshold


Análise de resultadosAvaliar as curvas de

amplificação











Cálculos em qPCR – Quantificação absoluta

• Regressão linear simples• Método Pfaffl Método Pfaffl Curva de cópias Curva de cópias (plasmídeos)(plasmídeos)











Cálculos em qPCR – Quantificação relativa• Relação matemática entre a expressão dos genes de referência e os de interesse;• Amostras controle (não tratadas) e estimuladas• Método Livak Método Livak 2 2--ΔΔΔΔCTCT










Cálculos em qPCR – Quantificação relativa• Avaliada a conformidade de todos os outros parâmetros, a única informação útil será o CT• Exemplo:

Controle InfectadoGAPDH IFN-γ GAPDH IFN-γ

Amostra 1 15,1 32,5 14,9 29,4

Amostra 2 15,4 33,1 15,5 29,1

Amostra 3 16,0 32,8 15,1 28,8

Amostra 4 18,1 31,5 15,8 29,9

Amostra 5 15,7 32,0 15,5 28,9












GAPDH IFN-γ Amostra 1 15,1 32,5 17,4 1,08 0,47Amostra 2 15,4 33,1 17,7 1,38 0,38Amostra 3 16 32,8 16,8 0,48 0,72Amostra 4 18,1 31,5 13,4 -2,92 7,57Amostra 5 15,7 32 16,3 -0,02 1,01

GAPDH IFN-γ Amostra 1 14,9 29,4 14,5 - -1,82 3,53Amostra 2 15,5 29,1 13,6 - -2,72 6,59Amostra 3 15,1 28,8 13,7 - -2,62 6,15Amostra 4 15,8 29,9 14,1 - -2,22 4,66Amostra 5 15,5 28,9 13,4 - -2,92 7,57

Controle

Infectado

ΔCT ΔΔCT 2-ΔΔCT

ΔCT

Média ΔCT

16,32

Média ΔCT ΔΔCT 2-ΔΔCT

0




















DicasDicas

Extração e manuseio de ácidos nucléicos• RNA = extremamente lábil!• Extração e armazenamento correto• Dosagem e normalização das amostras

• A260/280 e A260/230 > 1,8• Contaminação com DNA genômico

Confecção de cDNA• Normalizar a mesma quantidade (p.e. 1 µg) de RNA para todas as amostras;• Todo o procedimento deve ser realizado no gelo;• Evitar ciclos de congelamento/descongelamento.










Escolha do gene de referência• É necessário ter opções!

• Ex.: 18S, GAPDH, RPL4, HPRT para camundongo

• Diferentes estímulos/tecidos/tratamentos podem ter a expressão do gene constitutivo alterada; •Preparar um pool com amostras-controle

• 6 diluições em triplicata• Diferença entre o CT mínimo e máximo < 1,0

•Algoritmos gratuitos na internet!• Ref Finder: Cotton EST Database• NormFinder: macro para Excel

DicasDicas











Antes da qPCR...• Northern Blotting (RNA)• Southern Blotting (DNA)










PCRPCRdigitaldigital

PCR PCR digitaldigital











PCR digital (dPCR)

Baseada na compartimentalização da amostra

• Gotículas (droplets) em emulsão = microfluidos• Chips com nanopoços

Individualização das moléculas!Distribuição de Poisson

Aplicações• Quantificação absoluta sem curva-padrão• Expressão gênica• Detecção de alelos raros e/ou mutações• Discriminação de baixas diferenças para CNV











Sample DNA

Target











Fonte: Baker M, 2012. Nature Methods 9, 541 (Jun 2012)










http://www.gene-quantification.de/

DicasDicas










DicasDicas










DicasDicas









DicasDicas



PCRPCR

O que é importante saber?

• Teoria e suas diferenças entre as técnicas

• Vantagens e desvantagens de cada uma

• Como aplicar a PCR ao seu projeto

• Aplicações gerais e específicas

• Boas práticas laboratoriais



Lucas Secchim RibeiroDpto. Microbiologia

Laboratório de Interação Microrganismo-Hospedeiro

Sala C4 191 – Ramal 2735

[email protected]

Aula disponível pelo endereço

http://bit.do/qPCR-UFMG2016



Education

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