De la mécano-perception du peuplier à la sensibilité colique chez la souris

Rôle du facteur de transcription EGR-4?Alison ACCARIE, Emilie MULLER, Alain ESCHALIER, Agathe GELOT, Denis ARDID

INSERM, UMR 1107 Neurodol, Laboratoire de pharmacologie fondamentale et clinique de la douleur, Université d’Auvergne, Clermont-Ferrand, France..

INTRODUCTION

MATÉRIELS & MÉTHODES

Animaux : souris C57Bl/6J mâles, wt n’ayant subit aucune stimulationTissus prélevés : Côlon (dans sa partie terminale), DRG viscéraux (T10-13, L6 et S1) et moelle épinière. Immunohistochimie : Les DRGv et la moelle épinière sont inclus en paraffine puis coupés au microtome en coupes de 7 µm. les tissus sont déparaffinés puis réhydratés, saturés avec du TBS-tween 0,1% et 5 % de sérum d’âne pendant 1 heure. Après prélèvement, le colon est ouvert, Le côlon après son prélèvement est ouvert, étalé sur une gélose puis recouvert de PFA 4% toute une nuit. On le rince ensuite avec du PBS 1X puis on sépare les 4 principales couches (« Whole Mount »): la muqueuse, la sous-muqueuse, les couches musculaires et les plexus myentérique. On ne garde, pour l’immunohistochimie, que les plexus myentériques. Les tissus sont perméabilisés et saturés avec une solution de PBS triton 1% sérum d’âne 4% pendant 1h. Incubation avec l’anticorps primaire toute la nuit dilué au 1/500ème pour EGR-4 (sc-133540) et au 1/1000ème pour PGP9.5 et CGRP. L’anticorps secondaire est déposé le lendemain à la concentration de 1/1000ème pendant 2 heures. Les lames sont montées avec du milieu de montage pour fluorescence.Western Blot : Les tissus sont broyés et les protéines extraites. Dépôt de 50 µg de protéines dans un gel d’agarose 10%. Transfert sur membrane PVDF, saturation avec une solution de TBS-T et régilait 5 %. L’anticorps primaire est mis pendant la nuit à 4°C au 1/1000ème. Le lendemain l’anticorps secondaire est déposé à la concentration de 1/1000ème. Révélation avec le kit ECL qPCR :Extraction des ARNm du colon au Trizol, dosage des ARN, vérification de l’intégrité et de la quantité par gel d’agarose. Utilisation du protocole invitrogen superscript II pour la reverse transcription, qPCR avec amorces forward 5’ CTCCAACCTGAGCGACTTCTC 3’ et reverse 5’ TGCCAGACATGAGGTTGAG 3’.

UMR 1107

CONCLUSIONS

RÉSULTATS

Colon

Western Blot

Moelle épinière

EGR-4

Immunohistochimie paraffine

qPCRX 40

X 40

X 40

X 20

Coloc

Immunohistochimie Whole mount

EGR-4

X 20

PGP9.5

X 20

Coloc

DRGv

EGR-4

CGRP

Immunohistochimie paraffine

Outils validés pour ces deux techniques.

Expression basale ARNm et protéine EGR-4 dans le colon.

Expression EGR-4 dans les plexus myentériques et fibres musculaires lisses coliques.

Expression EGR-4 dans les neurones

peptidergiques des DRGv.

Expression EGR-4 dans les neurone de la corne dorsale.

37.5 KD

Immunohistochimie paraffine

EGR-4

x40

PGP9.5

x40

x40

Coloc

coloc

X 40 X 40

X 40

X 20

•Validation des outils qPCR, WB et IHC pour EGR-4.• EGR-4 est exprimé dans le colon et les tissus impliqués dans les premiers relais de la perception mécanique colique.• EGR-4 semble être une cible intéressante pour l’étude des mécanismes liés à l’hypersensibilité viscérale.

X 20

100 pb

200 pb