- L’analyse des résultats de double hybride (fig 1B) montre que les protéines SRC1-Net GRIP1-N sont capables d’interagir avec LMP2 dans un système cellulaire comme la levure, en témoigne l’activation du gène rapporteur obtenu dans les cellules cotransfectées par les vecteurspACT2-LMP2 et pGBKT7-SRC1N oupACT2-LMP2 et pGBKT7-GRIP1N.

- L’autoradiograhie présentée fig1C indiqueque les protéines SRC-1, GRIP1, A/B1,SRC-1-N,GRIP1-N, AIB1N interagissent physiquement avec la protéine GST-LIMP2 alors que ces mêmes protéines n’interagissent pas avec la protéine GST.De plus, les protéines SRC1-C, GRIP1-C etA/B1-C ne sont liées ni par la protéine GST, nipar la protéine GST-LIMP2. Cette expérienceindique que les protéines SRC-1, GRIP1, AIB1 interagissent avec LMP2 via leur domaineN-terminale.

- L’expérience de co-immunoprécipitation réalisée dans les cellules ECC1 montre que la protéine LMP2 est spécifiquementprécipitée par l’anticoprs LMP2 (elle n’est pas présente dans les extraits immunoprécipités par l’anticorps control). Par ailleurs, cette immunoprecipitation avec l’anticorps

LMP2 entraîne les protéines SRC-1 et GRIP1.

-La dernière expérience de GST pull-downmontre que la protéine SRC-1 interagit physiquement avec le récepteur aux estrogènes alors que la protéine LMP2 n’en est pas capable.

Note sur 4-compréhension : 2-clarté : 2

- La première expérience réalisée par WBmontre que l’expression des protéines SRC1,GRIP1 et AIB1 n’est pas modifiée par l’expressionde la protéine LMP2. Seule la quantité de protéine LMP2 augmente dans les cellulestransfectées par le vecteur permettant l’expressionde LMP2, comparé à la quantité de protéinesobservées dans les cellules contrôles (transfectéespar le vecteur vide). Il n’y a pas d’action de LMP2sur l’expression des coactivateurs.

-Les figures B et C montrent que l’E2 augmentel’expression des vecteurs CyclinD1luc, EREluc transfectés dans des cellules ECC-1. Par ailleurs,une analyse par RT-PCRQ montre que la quantitéd’ARNm Cyclin D1 et pS2 endogène est égalementaugmentée après stimulation par E2 dans ces cellules.Cette augmentation de la transcription des plasmidesou de la quantité des ARNm endogènes est accruede manière significative lorsque les cellules exprimentla protéine LMP2. Cette augmentation est abolit en présence de RNAi LMP2.LMP2 augmente la transcription des gènes estrogéno-dépendants.

-La figure D montre que la quantité de luciferase(produit du gène rapporteur) est plus importante dansles cellules co-transfectées par le vecteur d’expression LMP2 et les vecteurs exprimant les coactivateursSRC-1, GRIP1 et AIB1, démontrant une coopérationde ces protéines dans l’activation de la transcriptiondu gène rapporteur.L’expérience de RNAi montre que lorsque les 3 membres de la familles p160 sont ciblés, l’expression du plasmide estinhibée.

-La figure E rend compte de la quantité de chaque protéineSRC1, GRIP1, AIB1 et LMP2 dans les différentes conditionsexpérimentales.

Note sur 4-compréhension : 2-clarté : 2

- La figure A permet de positionner sur le gènepS2 les régions amplifiées avec les différentesamorces utilisées dans les expériences de ChIP. La taille des fragments d’ADN est présentée dansla figure C.

-L’expérience de ChIP présentée figure Bmontre que en présence d’E2, la région du promoteur située entre -353 et -30 estimmunoprécipitée par tous les ACutilisés, démontrant une proximité de ces facteurssur le promoteur du gène pS2 et une associationde ces protéines dans un même complexe.De plus, d’autres régions du gène sont immuno-précipités avec l’AC anti LMP2, démontrant que la protéine se localise à différentes position du gène.

-La figure D montre que la région -353 -30 est précipitée avec les AC anti RE, SRC1, LMP2, polII mais pas avec l’AC anti elongin A.La figure D présente également les résultats d’une expérience de double IP. Les fragments d’ADN sont immunoprécipités à l’aide d’un premier AC, puis d’un deuxième AC. Après une 1er immunoprecipitation avec un AC anti RE, la région -353 -30 est immunoprécipitée avec lesAC anti SRC1,LMP2 et polII.De même, après une immunoprecipitation avec unAC anti SRC1, la région -353 -30 est immu-noprécipitée avec les AC anti RE, LMP2 et polII.

polII

a

RE

SRC1AIB1

GRIP1

LMP2

LMP2

Note sur 3-compréhension : 1,5-clarté : 1,5

Rôle de LMP2 dans l’initiation de la transcription.Rôle de LMP2 dans la phase d’élongation?

Note sur 3-compréhension : 1,5-clarté : 1,5

Cette figure rend compte d’expériences de doubleChIP réalisés à l’aide de différents anticorps.L’analyse de ces double ChIP montre que lesprotéines LMP2, polII et Elongin sont associéesdans un même complexe.Ces résultats suggèrent que LMP2 joue également un rôle pendant l’élongation de la transcription.

Note sur 3-compréhension : 1,5-clarté : 1,5

A. Cette figure montre le caractère cyclique du recrutement des protéines sur le promoteur. Ce recrutement cyclique des protéines ne se fait plus lorsqu’on empêche l’expression de LMP2ou des protéines p160. Lorsqu’on bloque l’expression de LMP2, ces cycles de recrutement sont à nouveau possible si on exprime un peu plus tard la protéine LMP2.B. Ces western blot témoignent de la quantité des protéines étudiées en ChIP.C. Cette expérience montre l’augmentation de la transcription d’un vecteur rapporteur estrogénodépendant en présence de protéine LMP2.

Le recrutement des co-activateurs sur le promoteur et l’activation de la transcriptionnécessite la protéine LMP2.

Note sur 3-compréhension : 1,5-clarté : 1,5

A. L’activation de la transcription médiée par E2 + LMP2 est abolit en présence d’inhibiteurdu protéasome MG132.