1 mL de préculture de MH20-22B

49mL de milieu CGXIII + 30 mmol.L-1

Mise en culture a 30°C à 104 rotation.min-1 pendant 72H

Prélever stérilement 2mL de cette culture au temps 0,3,6,24,48, et 72H

Mesure de la DO à 600 nm au temps 0 ,0,5 ,1 ,1,5 ,2 ,2,5 ,3 3,5 ,4 ,4,5 ,5 ,5,5 ,6 ,24 ,48 , et 72H

Centrifuger à 5000 x g pendant 10 minutes

Récupérer le surnagentDosage des sucres réducteurs

Dosage des acides aminés

Préparation de la solution étalon de glucose à 10 mM Préparation de la solution étalon de

Lysine à 0,002MEffectuer un pré-test ,pour éventuellement ajuster le volume de prise d’essai (en suivant la procédure ci-dessous

Effectuer un pré-test ,pour éventuellement ajuster le volume de prise d’essai

Effectuer une gamme étalon de 0 à 10 µmol de glucose (en suivant la procédure ci-dessous)

Effectuer une gamme étalon de 0 à 0,4 µmol de glucose

Effectuer 3 mesures pour chaque prélèvement

-ajouter la prise d ’essai

-ajouter de l’eau distillée qsp 1mL

-ajouter 2 mL de DNS

-Mélanger

-5 min au bain –marie bouillant

-refroidir

-ajouter 6mL d’eau distillée

-mesurer l’absorbance à 530 nm

Effectuer 3 mesures pour chaque prélèvement

-Effectuer une dilution approprié

-ajouter 0,2ml de substrat distillé

-ajouter 3,8 mL de réactif ninhydrine

-mélanger

-15 min au bain-marie bouillant

-refroidir

-mesurer l’absorbance à 570 nm

Ensemencement avec la souche sauvage

Ensemencement avec la souche Modifiée Lac Z

Mise en culture pendant 8 heures à 30°C avec agitation à 90 tours minutes

Préparer 25 mL de la solution de tampon Z : Na2HPO4 60mM

NaH2PO4 30mM

KCL 40mM

MgSO4.7H2O 1mM

Ajuster à pH 7

β-mercaptoéthanol 50mM

Préparer 10 mL de solution de Na2CO3 1M

-Pour chaque échantillon faire trois prises d’essai

Plus un blanc avec du tampon Z

-diluer la prise d’essai avec du tampon Z qsp 1mL

-ajouter 10µL de SDS 0,1% et 20 µL de Chloroforme sous la hotte (vortexer 15 secondes)

-attendre 5 minutes.

-ajouter 0,2 mL d’ONPG 4mg/mL ATTENTION noter l’heure de l’ajout

-Lorsqu’une coloration jaune –paille apparaît, stopper la réaction en ajoutant 0,5 mL de solution de Na2CO3 1M ATTENTION noter l’heure de l’ajout

-mesurer l’absorbance à 420 nm contre le blanc, et à 550 nm contre le blanc

LB LBCGXIII CGXIII CGXIII + leucine

CGXIII + Théobromine