1

MOYENS D’ÉTUDE EN CANCÉROLOGIE :

-Cytosquelette, -produits de sécrétion,-marqueurs de différenciation lymphocytaire…

(P. Levillain)

2

Les filaments intermédiaires

• Cytosquelette

3

le cytosquelette : les trois composants principaux

microtubules filaments intermédiaires microfilaments d'actine

D= 24 nm

réseau dont le centre est situé au niveau du centrosome.

D= 7 à 15 nm

réseau qui occupe tout l'espace cytoplasmique.

D= 6 nm

réseau principalement localisé sous la surface cellulaire.

4

Rappels

• Les fonctions du cytosquelette :– Confère à la cellule sa forme caractéristique– Assure sa motilité en lui donnant la possibilité

d'accomplir des mouvements amiboïdes– Permet les déplacements des organites

cellulaires– Coordonne des fonctions biologiques

fondamentales, comme la division cellulaire grâce aux microtubules.

5

Rappels

• Les microtubules sont des structures polaires

• Caractérisées par une extrémité positive, à croissance rapide, et par une extrémité négative, à croissance lente ;

• La cellule possède des centres d'organisation des microtubules, qui en dirigent la formation : les centrioles, les corpuscules basaux des cils et les centromères.

• Dans le cas des microtubules évoluant librement dans la cellule, il existe un centre de formation principal à côté du noyau, constitué de deux centrioles perpendiculaires l'une à l'autre (asters), à partir desquelles les microtubules rayonnent, leurs queues négatives étant tournées vers le centre de la formation.

• Les microtubules sont des structures dynamiques qui se forment et sont détruites en permanence.

6

le cytosquelette : les trois composants principaux

microtubules filaments intermédiaires microfilaments d'actine

D= 24 nm

réseau dont le centre est situé au niveau du centrosome.

D= 7 à 15 nm

réseau qui occupe tout l'espace cytoplasmique.

D= 6 nm

réseau principalement localisé sous la surface cellulaire.

7

Filaments intermédiaires

• Les filaments intermédiaires ont été classés en six sous-types :

– type I : cytokératines acides (de CK9 à CK 20)– type II : cytokératines basiques (de CK1 à CK8)– type III : vimentine, desmine, glial fibrillary acid protein

(GFAP), périphérine– type IV : neurofilaments L, M et H, internexine alpha– type V : lamine nucléaire– type VI : nestine (cellules souches du SNC)

8

Filaments intermédiaires

• En pratique on utilise :– les cytokératines (épithéliums)– la vimentine (tissus conjonctifs, mélanocytes)– la desmine (dans les tissus musculaires)– la GFAP [glial fibrillary acid protein]

(astrocytes )– les neurofilaments (neurones du tissu

nerveux)

9

Cyto-Kératines 1

• Les cytokératines dont le poids moléculaire varie entre 40 et 65 kDa, sont caractéristiques des épithéliums (kératinisants ou non). Elles s'accrochent sur les plaques des desmosomes et des hémidesmosomes.

• Il existe une vingtaine de types de cytokératines qui s'organisent systématiquement en paire avec toujours une kératine acide et une kératine basique dont les poids moléculaires diffèrent de 8 kDa.Exemples de paires : K(1, 2) - K10, K (3) - K (12), K(4) - K13,  K (5) - K(14)....Les paires de kératine exprimées varient en fonction de la position des cellules dans l'épithélium, du type d'épithélium et des organes.

• Les épithéliums se distinguent ainsi des autres tissus histologiques fondamentaux qui contiennent des filaments intermédiaires différents : desmine, vimentine, GFAP, neurofilaments

10

Autres filaments intermédiaires

– desmine dans les tissus musculaires  – vimentine dans les tissus conjonctifs, les

mélanocytes.... – GFAP dans les astrocytes – neurofilaments dans les neurones et les

cellules neuro-endocrines.

11

Cytokératines et Diagnostic des carcinomes

• Lorsque des cellules épithéliales subissent un processus de cancérisation, elles donnent des carcinomes qui reproduisent les caractères spécifiques des épithéliums :

• la spécificité biochimiques des filaments intermédiaires est telle que la mise en évidence, par des réactions immunohistochimiques, de kératines dans de petits échantillons de cellules cancéreuses, suffit à indiquer leur origine épithéliale

• Ainsi dans les cas difficiles, au niveau de la tumeur primitive et surtout au niveau des métastases à distance, le diagnostic de carcinome peut être porté grâce à l'immunohistochimie.

12

Microscopie électronique

Peau

Epiderme

Kératinocyte basal

13

Applications 1

• Anti-cytokératines à large spectre (KL, AE1/A3) :– nature carcinomateuse d’une tumeur indifférenciée

• Cytokératine 5-6– Mésothéliome– C épidermoide

• Cytokératine 7

• Cytokératine 20

14

15

• CK à haut poids moléculaire (prostate)

16

Autres marqueurs des épithéliums et des carcinomes

• EMA (antigène membranaire épithélial)

17

Marqueurs des muscles et des tumeurs musculaires

• Desmine

• Autres marqueurs :– Actines musculaires lisse et striée– H-caldesmone (muscle lisse)– Myogénine (associée à la différenciation

musculaire striée)

18

Marqueurs conjonctifs (non musculaires)

• Vimentine

• Autres marqueurs du tissu conjonctif :– CD 31 : vaisseaux– CD 34 : vaisseaux / cellules souches hémato– CD 117 : cellules de Cajal, mastocytes

19

Marqueurs des mélanomes

• Protéine S 100

• HMB 45 (mélanosomes)

• Melan A

• Vimentine

20

Mélanocyte

21

Tumeurs des tissus mous et filaments intermédiaires : exemples

TUMEURS Vimentine Desmine CytokératinesAngiosarcome + - +/-Fibrosarcome + - -Léiomyome + + -

Léiomyosarcome + + -Rhabdomyosarc. + + -

Liposarcome + - -Synovialosarcome + - +

Mésothéliome + - +

22

Marqueurs du mésothéliome

• Co-expression cytokératine/vimentine

• HBME-1

• Calrétinine

• CK 5/6

• Négativité – des marqueurs d’adénocarcinomes comme

l’ACE, le TTF-1…

23

Autres marqueurs cytoplasmiques

• Produits de sécrétion– Hormones– Neuropeptides– Protéine S 100– Marqueurs d’organes

24

Marqueurs nucléaires

• Récepteurs hormonaux– Hormono-dépendance : facteur pronostique– Traitement hormonal– Dans une tumeur indifférenciée : oriente vers

une origine mammaire ou du tractus gynécologique

25

RE RP

26

RE

27

Marqueurs d’organe

• PSA

• Thyroglobuline

• TTF1

28

anti-P63 (noyaux) et anti-p504s (cytoplasmes)

Carcinome urothélial

P63 +

P504s -Carcinome prostatique

P63 -

P504s +

Glandes prostatiques normales p63 +

Prostate : carcinome prostatique et carcinome urothélial de vessie

29

Marqueurs neuro-endocrines

• Chromogranine A : granules neuro-sécrétoires

• Synaptophysine : vésicules sécrétoires

• remplacent les colorations d’argyrophilie (Grimelius) et d’argentaffinité (Fontana)

• CD 56 (N-cam)

• NSE : peu spécifique

• Leu 7 : (CD57)

• Typage de la sécrétion :

– Insuline, gastrine, somatostatine, sérotonine, VIP, glucagon, etc...

30

Marqueurs de différenciation lymphocytaire

• CD1 = thymocytes, cellules de Langerhans• CD2 = lymphocytes T• CD3 = lymphocytes T périphériques• CD4 – CD8 = sous-populations de Lc T• CD5 = lymphocytes T et certains Lc B• CD20 = lymphocytes B• CD30 = Cellule de Sternberg, lymphomes

anaplasiques à grandes cellules• ...

31

Immunoglobulines

• Ig de surface

• Ig intracytoplasmique

32

• Diagnostic de lymphome– Phénotype aberrant– Monotypie – Répartition anormale des sous-populations

• Type de lymphome

33

34

Anticorps Carcinomes L.N.H. Mélanomes

Anti-leucocytes CD45

- + -

Anti-cytokératine

+ - -

Anti-EMA + +/- -

Réactivité de trois anticorps avec 3 types de tumeurs

Application

35

Application

36

Le diagnostic d’une tumeur à petites cellules rondes chez l’enfant (TPCR )dominé par les tumeurs rétro-péritonéales.

1. neuroblastome,

2. tumeur du groupe Ewing/PNET

3. néphroblastome blastémateux

4. autre type de tumeur du rein, tumeur rhabdoïde, sarcome à cellules claires.

autres tumeurs abdominales ou thoraciques

5. rhabdomyosarcome,

6. synovialosarcome,

7. tumeur desmoplasique intra- abdominale

8. hématopoiétiques (essentiellement sous forme d’adénopathies). Elles sont beaucoup plus fréquentes chez l’enfant que les adénopathies métastatiques des carcinomes indifférenciés ou des mélanomes)

37

Le diagnostic d’une tumeur à petites cellules rondes chez l’enfant (TPCR )

Les données de la morphologie pures (notamment l’aspect des noyaux peuvent orienter : nucléole éosinophile souvent présent dans les neuroblastomes).

Immunomarquages : arbre décisionnel (permet d’utiliser à bon escient les coupes peu nombreuses des ponctions biopsies).

Les 3 anticorps utilisés au départ sont Kératine, Vimentine, CD 45RB.

A. Si les résultats de la 1ère étape sont Kératine (+)Vimentine (-)CD45RB (-), les possibilités sont restreintes : tumeur épithéliale, blastème rénal (Wilms) deuxième étape immuno rarement nécessaire. Le blastème rénal exprime souvent la desmine qui peut donc être pratiquée dans un second temps, ainsi que WT1

38

Le diagnostic d’une tumeur à petites cellules rondes chez l’enfant (TPCR )

B. Si les résultats de la 1ère étape sont Kératine (+)Vimentine (+)CD45RB (-), possibilités plus nombreuses

1. Là encore du blastème rénal (Tumeur de Wilms)2. Tumeur desmoplasique intra abdominale, qui est polyphénotypique, et exprimera en plus un ou plusieurs des antigènes suivants : NSE, CD 99, WT1, desmine et présente une fusion EWS-WT1 détectable par RT-PCR : t(11 ;22)(p13 ;q12)3. Une tumeur rhabdoïde, également polyphénotypique (EMA, NSE, etc) et qui présente une délétion 22q11.24. Un synovialosarcome (rechercher en Biologie Moléculaire la translocation spécifique t(X ;18) 5. Un mésothéliome qui exprimera la calrétinine.

39

Le diagnostic d’une tumeur à petites cellules rondes chez l’enfant (TPCR )

C . Si les résultats de la 1ère étape sont Kératine (-)Vimentine (+)CD 45RB (-), possibilités également nombreuses

1. Neuroblastome, exprimant NSE, NB 84, pouvant ou non amplifier N-myc2. Tumeur du groupe Ewing, PNET qui va exprimer NSE, et surtout CD99. Une translocation t(11;22)est la plus fréquente mais d’autres translocations, toujours concernant le Chr 22 sont également possibles.3. Le blastème rénal peut la encore présenter ce phénotype.

4. rhabdomyosarcomes, positifs pour les marqueurs musculaires classiques et présentant en biologie moléculaire la translocation t(2;13) caractéristique des RMS.

40

Le diagnostic d’une tumeur à petites cellules rondes chez l’enfant (TPCR )

D . Si les résultats de la 1ère étape sont Kératine (-)Vimentine (-),CD 45RB (+)

→ prolifération hématopoiètique,

B si elle exprime CD20,

T si elle exprime CD3,

lymphome anaplasique si elle exprime CD 30 et EMA.

Attention : CD 99 positif dans la plupart des leucémies et des lymphomes, et dans le chondrosarcome mésenchymateux, il n’est donc pas spécifique des tumeurs du groupe Ewing/PNET.