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13강. 돌연변이 육종 (Mutation Breeding)
: 자연적 또는 인위적으로 유발된 돌연변이를 직접 품종에이용하거나 또는 육종의 소재 (새로운 유전변이)로 이용하는 방법
1. 돌연변이의 유발
2. 돌연변이의 특징
3. 돌연변이의 발생율
4. 돌연변이 선발법
5. 염색체절단의 이용
6. 돌연변이 육종법의 특징
7. 새로운 유전자 교정 기술
- 자연돌연변이율: 10-5～-6
* 아조변이(bud mutation): 식물체 특정부분의 생장점에서 발생하는 돌연변이
영양번식작물(특히 과수류)에서 다수 품종화
- Muller 1927 --> 초파리
Stadler 1928 --> 보리, 옥수수
인위 돌연변이 육종 각광 , 1960년대까지
1970년대에 위축
(∵ 일거에 우량형질을 모두 보유하는 다수성농작물 육성 목표
우량유전자형 선발에 실패 )
* 돌연변이는 대부분 우성 --> 열성
현재의 돌연변이 육종은
‘ 신 유전변이의 창성과
‘ 소수 형질의 개량에 촛점 ==> 다수의 성과
벼 Carlose (Tall) --------> Carlose 76 (short) 내도복성
품질돌연변이 등
X-ray로 돌연변이 유기
(1) 돌연변이원 (Mutagen)
* 돌연변이: mutation, 돌연변이체: mutant, 인위돌연변이체: induced mutant
① Irradiation & radio isotopes
- X-rays
- γ-rays
- Neutrons
- Beta/Alpha particles
- Protons/deuterons
(nucleus of hydrogen)
- Ion beam (heavier than proton)
(Cyclotron/ion accelerator 이용,
최근사용증가추세)
② Chemicals
- Alkylating agents
- Base analogues and
related compounds
- Antibiotics
- Azides
1. 돌연변이의 유발
① Irradiation & radio isotopes
A. 돌연변이 유발 기작○ Damage to DNA
- single-strand break - double- “ " - cross-linking within the helix- " to other DNA 분자- " to protein Repair of DNA : 방사선에 의한 damag는 대부분 효소에의해 자체적으로 repair됨. repair되지 못한 부위가 존재시 mutation
○ Ionization of partles by high energy of irradiation and recombination of free radicles (unstable and reactive)- H2O ------------> H2O
+ + e-
- O2 가 free radicle 들과 반응해서 peroxide 화합물을 생성 (-->toxic)
○ Damage on macromolecules- Protein : side chain이 특히 sensitive property 달라짐- Enzymes 불활성화
B. 처리 방법
○ 방사선 조사(照射) 포장 (Irradiation field) --- Co60
일본, 방사선육종연구소(http://www.irb.affrc.go.jp)--- Co60
○ 실내처리: gamma greenhouse, gamma room 등
콘크리트벽 + 납(2인치 두께), 밀폐 : Co60
일본, 방사선육종연구소
태국, Kasesart 대학교, Gamma Center
한국, 정읍,첨단방사선연구소
○ 침지처리: 동위원소 (radio isotopes; P32, S35 등)
C. 처리부위a. Whole plant 처리 : γ-field 또는 또는 γ-room
더 선호됨 (안전, 경제적, 소면적, 종자처리 용이)
b. 종자처리- 처리방법, 장소, 환경 등을 자유로이 조절할 수 있고- 종자의 수분상태 조절이 용이해서 선호됨.
c. 화분처리: - 종자나 식물체 처리에 비해 거의 chimera현상이 없다.∵ 정상 egg cell + 돌연변이된 화분 heterozygous zygote,
seed 내의 세포간 유전자형은 동일- but 충분한 화분량의 확보가 어렵고, 화분수명이 짧아서 처리가 어렵다.* 옥수수 : 화분수집 또는 tassel에 직접 처리후 수분시킴
※ Chimera : 1개 식물체가 부위별(세포)로 서로 다른 표현형(유전자형)을 보이는 현상* 배수성이 혼재시는 (polyploid) cytochimera
LI-Epiderm(epidermis) LII- Sporoderm
(sporogenous tissues,reproductive organs)
LIII- Ground Tissue(vascular tissues)
생장점 조직
A. Sectoral: usually a wedge-shaped segment of tissue extending from epidermis inwards toward the center of leaf, stem, root, etc…
B. Periclinal: characterized by an entire layer of tissue one or more cells deep.
C. Mericlinal: characterized by a portion of a tissue layer with a different genotype.
Chimera DevelopmentPericlinal MericlinalSectoral
Chimera 종류
종자로는 이러한 chimera상태가 보통 유전되지 않는데, 색소(plastid) 돌연변이의 경우는 세포질유전을 하는 것이 보통이고 egg cell형성시 2개 이상 type의 plastid가 동시에 embryo로전달되어서, 유전하는 경우도 있다.
* 영앙번식작물 ---> 그대로 품종화 이용(화훼)
d. Meristems(생장점)- 영양번식 작물에서 많이 이용 --> bud mutation- 종자처리도 일종의 embryo meristem 처리임 (∵ 이미 기관분화가 되어있음.)
e. 기타: cell 또는 tissue culture시 irradiation 처리
② Chemicals
A. 종류 및 특징a. Alkylating 화합물
: DNA 염기를 alkyl화시켜서 변형시킴. 특히 Guanine의 구조를 쉽게 변형시킴(alkyl guanine으로-- 99% 이상). 매우 효율적인 mutagen
- G A 변화 (다음 슬라이드)- G와 ribose의 결합을 파괴(대신에 R기 결합) ---DNA분자에서 G 소실됨.
- 종류 : EMS (ethyl methane sulfonate)dES (diethyl sulfate)ENU (ethyl nitroso urea)MNU (methyl nitroso urea)Nitrogen mustards : (ClCH2CH2)2NCH3 등
b. Base analogues and related compounds: 원래의 base 대신에 삽입되어 mutation 유발- 종류: 5-bromo-uracil(BU) ---> thymine의 analogue
2-aminopurine(AP) ---> adenine의 “ 등Maleic hydrazide(MH) --> uracil의 구조 isomer --> 염색체절단도 유발
c. Antibiotics : 주로 염색체 절단 유발- mitomycin C, streptonigrin
d. Azide : 주로 point mutation- sodium azide(NaN3) 등
정상 pairing EMS 처리시 비정상 pairing
B. 처리방법: 처리부위를 용액에 침지 또는 용액을 주입
- 처리부위 ---> 방사선과 동일
* 벼의 수정란에 MNU처리 예)- 1.0 mM의 MNU 용액을 사용직전 조제 (∵ 광분해)- 당일 수정된 영화들을 용액에 침지( 25oC, 45 min., dark)- 1일간 수세- 등숙 ---> 종자 수확 (M1 종자)
벼 MNU 이삭처리 후 수세
2. 돌연변이의 특징
: 작물의 종류, 품종, mutagen, 처리방법, 처리농도(강도), 처리되는 식물의 상태 등에따라 돌연변이의 종류, 발생빈도 등이 크게 변화함.
(1) 형태적- 간장단축(矮性)--- 식물체 전체가 왜소
* 곡류의 반왜성 돌연변이는 도리어 수량 증대 --- 다수성 초형* 벼의 Japonica품종 sd-1유전자는 돌연변이로 유도함.
- 각 기관의 크기나 모양 변화, 화기구조의 변화(2) 생리적
- 엽색 변화 (chlorophyll 생성 mutation)- chlorosis(黃化), virescent(白化, 일시적 백화), albino 등의 주로 chlorophyll deficiency
- 저항성의 변화- 저장양분의 변화: 성분함량 등* 단백질 조성 mutant(벼):
현미의 단백질 albumin, globulin : salt soluble (PB3) 19 %prolamin : pepsin-resistant (PB1) 21 % 낮은 mut. 단백질↑효과glutelin : ＂ –digestible (PB2) 60 %
(3) 염색체의 이상- 염색체의 구조적 이상 : 절단, 전좌, 역위, 중복, 결실 등 (Irradadiation시 발생 많음) 불임으로 나타남.
- 염색체의 수적 이상
An all-purpose technique
Mutant TraitEarliness
Semi-dwarf
Yield
Quality
Disease resistance
Cold tolerance
Salinity tolerance
Agronomy
Varieties165
165
145
98
98
96
23
10
벼에서 돌연변이에 의해 육성된품종 수 및 개량된 형질 (IAEA)
Mutations in carrots have produced overt color distinctions. USDA
왼쪽 : 원품종, 오른쪽 : 돌연변이체 (원농8호)원자력연구소
국화 방사선 돌연변이(원품종: 대평(가운데)일본 방사선육종연구소
Giant embryo Sugary endosperm Floury endosperm
Low amylose, waxy
벼에서의배와배유돌연변이체
태국 방사선 농업연구소(심비디움 mutant, Dr. Rusli)
Officially released mutant varieties of seed propagated crops in the FAO/IAEA mutant varieties
database (Nov. 2004)
2359 mutant varieties in 169 species
cereals 1072
legumes 311
industrial 81
vegetables
66oil crops 59
other 111
3. 돌연변이의 발생율
(1) 발생율
선량,농도 강 <-----------> 약돌연변이 발생율
Desirable high lowUndesirable high low
치사율 high low
Optimum dose of irradiation or chemical mutagen- 생물의 종류, 품종(유전자형), mutagen 종류, 처리방법, 처리되는
생물의 조건 별로 검토 필요
* Lethal dose(LD50): 처리된 표본 중50%를 치사시키는 방사선량 또는chemical 농도 작물별로 다름
4. 돌연변이 육종과정
Seeds
Pollens
Fertilized egg cells
Plant, tissues M1
M0: Original,
unmutagenized material
M2 Seeds
M2 Plants
M3 Seeds
M3 Plants
M1
Mutagen treatment
개체별 재배/종자(M2)수확, Selfing,
계통재배/집단재배, 개체선발
선발개체의 계통재배, 계통/개체선발영양번식식물의 경우는 영양계 증식
AA Aa AA AA Aa
AAAAAAAAAAAAAA
AAAaAAAaAaaaAa
AAAAAAAAAAAAAA
AAAAAAAAAAAAAA
AaaaAaAAAAAaaa
aaaaaaaaaaaaaa
aaaaaaaaaaaaaa
aaaaaaaaaaaaaa
Selfing
계통육종법과 동일하게 진행
(1) 종자식물① 과정
② 고려사항
- 염색체의 수적, 구조적 변이, 우성 돌연변이는 M1 식물체 당대에 선발이 가
능 하나 hetero 상태임.
- 열성 돌연변이는 M2세대에서 개체 분리되어 고정.
우성돌연변이는 M3에서 고정계통 확보 가능
- 종자나 식물체 처리시에는 chimera현상이 발생하므로 선발시 주의. M2에서
분리비 이상.
- 항상 원품종과 대비하여 형질 비교.
- 목표하는 특정형질만 mutation되는 것이 아니라 여러형질이 동시에 다발적
으로 mutation되므로(우량 + 불량 mutation 혼재) 돌연변이 개체를 원품종과
교잡 후 목표형질만 원품종으로 이전시켜 품종화 --- 일반적.
- 화학제에 의한 돌연변이 유기시 다음대에도 약제의 잔류로 인해 새로운 돌연
변이 생성 가능
(2) 영양번식 작물 --- 대부분 hetero 상태Aa ---> aa
당대에서 구별가능(bud mutation) ----- 식별 및 선발 용이그러나 chimera(Aa, aa의 혼재)가 보통이므로
↓원래의 가지와 경합하여 도태될 우려 큼.
↓변이부분을 잘라내어 번식시킴.
* 또는 mutagen처리 이외의 가지를 잘라내어 처리부위의 budding을 촉진시키기도 함.
(3) 기내 돌연변이 (mutation in vitro; 세포/조직배양을 이용한 돌연변이)* somaclonal variation
: in vivo 보다는 in vitro 에서 대량집단 취급 가능 내염성, 내냉성, 특정 아미노산함량 등
조직배양callus
(돌연변이원처리)
재분화배지에서선발callus 재분화
생존callus
선발
선발배지에서callus 계대배양(선발환경조성)
식물체검정및선발
* 특수배지: 내염성 -- NaCl 배지 첨가고 lysine -- lysine analogue (S-aminoethyl-L-cysteine)내냉성 -- 저온배양
5. 염색체절단의 이용 --- 주로 방사선- 불량유전자와 우량유전자가 극도로 가깝게 연관되어 있어서 교잡육종으로 재
조환형을 얻기가 어려울 때 ---> 방사선처리로 ---> 절단, 전좌, 역위 등
- 종속간 교잡시 異種 genome의 유용유전자 보유 염색체 부분만을 원하는 종
에 도입시킬 때 ---> 절단, 전좌
6. 돌연변이 육종법의 특징 :(1) 품종내에서 특성의 조화를 파괴하지 않고 1개의 특성만을 용이하게 치환할 수
있다.
(2) heterozygous인 영양번식식물에서 변이를 작성하기가 용이하다
(3) 염색체 단편을 치환시킬 수 있다.
(4) 인위배수체의 임성을 향상시킬 수 있다. --- pairing 방해 요소의 제거를 통해서
동질배수체의 준상동염색체 --> 비상동염색체에 분할 --> 감수분열 정상화
(5) 자가불화합, 교잡불화합을 극복할 수 있어 육종범위의 확대가 가능하다.
(6) 새로운 유전변이를 창출할 수 있다.
FAO/IAEA Joint Division Homepage : http://mvgs.iaea.orgWelcome to the Mutant Variety Database (MVD):
http://mvgs.iaea.org/AboutMutantVarities.aspx
http://www.toolgen.com/html/eng/technology/engineered_nucleases.phpFichtner et al. (2014) Planta 239: 921-939
7. 새로운 유전자 교정(편집)(genome/gene editing; GE) 기술
Genome editing is defined as a collect ion of advanced molecular biology techniques that facilitate precise, efficient, and targeted modifications at genomic loci
3가지group의engineered nucleases 사용
GE 기술: SDN-1, SDN-2, SDN-3 비교
SDN: site-directed mutagenesis = genome editing 기술
돌연변이
Allele 교체
Gene 삽입
구분 기 술 원리 결과 산물 효율 비고
inducedmutation (conventional)
Treatment of chemical or physical mutagens
Randommutation of unknown genes
Mutants(대부분recessive)
- 상대적 낮음- 돌연변이 한계
기술 용이
SDN-1/SDN-2 Targeted engineeringof genome/ genes
Targeted mutation of known genes
Mutants(recessive/dominant)
- 상대적 높음- 돌연변이
무한대 가능성
고도 기술 +유전자 정보
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induced mutation (conventional)과 SDN-1/SDN-2와 비교
• 목표하는 유전자의 파괴, 교정, allele 교체 가능• SDN-1과 SDN-2는 기존의 형질전환과는 기술과 결과가 다르기 때문에 GM 논의 불필요??
( Vector, 선발마커 등 사용하지 않음, 변화된 식물에 변이유전자 외에는 잔여물이 없음)
Gene-editing 으로 개발된 주요 작물들
polyphenol oxidase (PPO) knockout
fad2-1a, fad2-1b, fad3 knockout (fad: fatty acid desaturase)
Oleic acid ↑
