2. Les systèmes de réparation de l’ADN

- Les mutations surviennent à des fréquences relativement faibles :

Ex. E. coli : His + ® His - : f = 10-6 à 10-7 (par génération)

StrS ® Str R : f = 10-10 à 10-11

His - : auxotrophie pour l’histidine, cad incapacité de synthétiser cet acide aminé (11 enzymes codées par 11 ORFs distinctes interviennent dans la biosynthèse de l’histidine ® la gamme de mutations pouvant induire le phénotype His- est donc très vaste)

Str R : résistance à la streptomycine : due à des mutations faux-sens dans quelques acides aminés d’une seule protéine du ribosome (le gamme de mutations induisant le phénotype StrR est donc très restreinte, d'autant plus que ces mutations ne peuvent altérer la fonctionnalité de cette protéine du ribosome)

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2.1 Introduction

Ex. projet 1000 genomes : séquençage du génome de deux parents et de leur enfant -> fréquence de mutation = 10-8

- Le faible taux de mutations spontanées s'explique par l'action des systèmes enzymatiques de réparation de l'ADN

- Une déficience dans l'un de ces systèmes conduit en général à un taux de mutations spontanées anormalement élevé ; chez l'homme, le symptôme associé est en général un risque accru de développer des cancers (car ceux-ci sont causés par des mutations)

- Quatre grands mécanismes de réparation de l’ADN sont connus. Le fonctionnement de deux d’entre eux est basé sur la complémentarité entre les deux fibres de l'ADN

ex. Xeroderma pigmentosum, maladie génétique chez l’homme ("enfants de la lune") ® sensibilité anormalement élevée à l'effet mutagène des U.V. ®prédisposition au cancer de la peau

ex. prédisposition génétique au cancers du sein et des ovaires (gène BRCA1)

- Comment déterminer qu'une substance chimique est potentiellement cancérigène ? On teste si elle augmente le taux naturel de mutation

ex. test de Ames : le taux naturel de réversion/suppression de bactéries His- > His+ est de 10-8 ;en présence d'une substance mutagène (et donc potentiellement cancérigène), il est plus élevé

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2.2 Réparation directe ("direct repair")

Anomalie particulière dans l’ADN : repérée par une enzyme spécialisée capable de réparer directement le dommage. Par ex. l’ADN ligase (dépendante de l’ATP) reforme les liens phosphodiesters ayant subi une hydrolyse.

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Autre ex. : - Enzymes Ada de E. coli (= alkyltransférases, par ex. les méthyltransférases) : enlèvent les groupements alkyles (-CH3, -CH2CH3, ..) attachés sur certaines positions des bases G, T, ou sur les liens phosphodiesters

CH3

Alkylation d'une base G en 6-méthyl-G, qui ne s'apparie plus à C mais à T

Photolyases : enzymes capables de se lier et rompre ces photodimères de pyrimidines (méc. appelé "photoréactivation")

rem : les gènes de photolyases ont été perdus dans la lignée des mammmifères placentaires

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Sous l'action des U.V., absorbés par les bases de l'ADN (± 260 nM), des liens tendent à se former entre deux pyrimidines successives >

photodimères de pyrimidines (T-T ou T-C) ( > problèmes d'appariement).

Liaison sous l'effet des U.V. (a) entre deux thymines > formation d'un cycle cyclobutane (b)

entre une thymine et une cytosine

(a)

(b)

Ex. :

NH2

Bases thymine et cytosine adjacentes

Lien 4-6 entre la thymine et la cytosine

Bases thymines adjacentes

Dimère de thymines (liens 5-6)

2.3 Réparation par excision ("nucleotide excision repair")

Où ?

Au niveau de bases désaminées (C ® U, A ® hypoxanthine, G ® xanthine, ..), des bases ayant subi des lésions oxydatives (ex. 8-oxo-G) ou d’autres modifications comme des méthylations (3-méthyl-A, 7-méthyl-G, 2-méthyl-C, ..) non réparables par les alkyltransférases, et au niveau des dimères de pyrimidines (T-T ou T-C) induits par les U.V.

Comment ?

Repose sur l’intervention de protéines spécialisées dans la reconnaissance soit de bases chimiquement altérées (par ex. les ADN glycosylases) soit de distorsionsdans l’ADN (par ex. les protéines de type UvrA de E. coli ou XPC des mammifères).

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glycosylaseendonucléase AP,

exonucléase ADN pol ase

*5’

3’

3’

5’

Ex. réparation des cytosines désaminées (> uracile) :

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L'uracile glycosylase hydrolyse le lien glycosidique pour libérer l'uracile, ce qui crée un site AP (site apurinique ou,dans le cas présent, apyrimidinique) (un site AP apparaît parfois spontanément aussi). L'endonucléase AP se lie auniveau du site AP et hydrolyse le lien phosphodiester en 5', créant ainsi des extrémités 3'-OH et 5’-phosphate. Uneexonucléase 5' -> 3' se lie à l'endroit du lien hydrolysé et hydrolyse les liens phosphodiesters suivants, créant ainsiune brèche dans l'ADN, qui est ensuite comblée par l'ADN polymérase. Une ADN ligase forme le dernier lienphosphodiester.

- Un complexe UvrA-UvrB parcourt l’ADN et UvrA détecte les distorsions dans l’ADN (dimère de T, base modifiée, ..)

- UvrA se dissocie du complexe, UvrB désapparie l’ADN (activité hélicase)

- UvrB recrute UvrC (endonucléase) qui coupe les liens phosphodiesters en amont et en aval de l’anomalie

- UvrD (hélicase) déplace UvrC de l’ADN et désapparie le court monobrin contenant l’anomalie

- UvrD se dissocie de l’ADN, reste alors une brèche qui est comblée par l’ADN polymérase et finalement l’ADN ligase

Ex. réparation de l’ADN présentant une distorsion (ex. causée par un photodimère TT ou TC)

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dernières étapes par ADN pol et ADN ligase

Remarques :

Que signifie ″ Uvr ″ ? = ″ UV resistance ″. Les gènes Uvr de E. coli ont été à l’origine découverts en isolant des mutants (Uvr) ultrasensibles aux UV

Chez H. sapiens, 25 protéines de type Uvr, appelées XP, interviennent dans la réparation de l’ADN – des mutations dans les gènes XP rendent les personnes atteintes ultra-sensibles au rayonnement solaire ® cancer de la peau (XP = Xeroderma pigmentosum, maladie dont sont atteints les ″ enfants de la lune ″)

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2.4 Réparation des mésappariements ("mismatch repair")

réplication

- Après réplication, l’ADN reste transitoirement hémi-méthylé

- Apparition d’un mésappariement (erreur de réplication) - le système de réparation des mésappariements est capable de distinguer la fibre néosynthétisée (sites 5'-GATC-3' transitoirement non méthylés) de la fibre parentale (sites 5'-GATC-3' méthylés).

- Des méthylases (ex. enzymes Dam et Dcm de E. coli) ajoutent (sur une base azotée) un groupement – CH3 au niveau de séquences spécifiques d’ADN (ex. 5’-GATC-3’ pour Dam, 5’-CCAGG-3’ pour Dcm). Cette méthylation n’altère pas les propriétés d’appariement de la base.

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- MutS (dimère) parcourt l’ADN et s’immobilise au niveau du mésappariement

- L’endonucléase MutH se lie à l’ADN hémiméthylé, mais est inactive

- MutL se lie à MutS

- MutL interagit avec MutH (formation d’une boucle d’ADN en général) qui est alors activée : coupure du brin non méthylé (hydrolyse du lien phospho-diester)

- Une exonucléase 5' -> 3' enlève une série de nucléotides y compris celui du mésappariement

- Une ADN polymérase comble la brèche à partir de l’extrémité 3’OH

- Une ADN ligase "ferme" l’ADN (formation du dernier lien phosphodiester)

MutS

MutL

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5’

3’

5’

3’

3’5’

x

x

x

3’5’

3’5’

2.5 Réparation par recombinaison ("recombination repair")

Les radiations ionisantes (rayons X, gamma), certains agents chimiques et la réplication de l’ADN provoquent des coupures double-brins dans l’ADN.

Deux mécanismes interviennent dans la réparation de ces coupures.

Rem : système Mut aussi présent chez H.s.; une prédisposition génétique au développement du cancer du colon est due à une mutation dans un gène codant pour une protéine de type MutS

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Rem : que signifie “Mut” ? Nom donné à l’origine à des mutants particuliers de E. coli. Ceux-ci présentent un taux naturel d’apparition de mutations Str R et T1 R supérieur à celui de la souche sauvage (phénotype “Mutator”).

2.5.1 Réparation par jonction d’extrémités non-homologues (“nonhomologous end joining”, NHEJ)

S’accompagne souvent de la perte de nucléotides (un moindre mal ..)

coupure double-brinaccidentelle

la protéine Ku (hétérodimère) se lie aux extrémités

d’autres protéines se lient et interagissent entre elles

jointure des extrémités, ligation

2.5.2 Réparation par recombinaison homologue (“homologous end joining”)

Sans perte de nucléotides, possible que si une molécule homologue d’ADN est disponible (cf. plus loin dans ce chapitre). 34