ADN

gène

transcription

ARNm

traduction

protéine

3- L’expression du génome

4 lettres

20 lettres

1er principe:42=843=64Donc,-Il faut au moins 3 nucléotides (= codon) pour spécifier un acide aminé-Les codons se suivent sans espace et sans chevauchement-Il faut des marques de début et de fin

2ème principe:Colinéarité entre gène et protéine (5’=N, 3’=C).Mais les deux brins peuvent être codants

5’ 3’

N C

5’3’

5’3’

Le code génétique

Caractéristiques du code génétique:-Les 64 codons possibles ont un sens-redondance (dégénéré sur la 3ème base)-pas d’ambigüité-Codons stop-Un codon d’initiation=Met (toutes les protéines commencent par Met)

3-1 Le code génétique: correspondance entre codons et acides aminés

De la séquence de l’ADN on peut déduire la séquence protéique.La séquence est toujours donnée dans le sens 5’ vers 3’, quelque soit le brin codant

La notion de phase de lecture. Selon le nucléotide pris comme 1er constituant d’un codon, la traduction en acide aminé sera différente. Donc lorsque le codon d’initiation n’est pas connu, trois phases de lecture sont possibles.

Séquence non codante Séquence codante

ORF

Notion de phase ouverte de lecture (Open Reading Frame, ORF).C’est le codon d’initiation Met qui indique le démarrage de la protéine et définit la phase de lecture. Pour que cette phase de lecture soit correcte, il faut aussi trouver à une certaine distance multiple de trois, un codon stop (non représenté ici).

Représentation schématique du complexe d’élongation chez Escherichia coli. L’ARN polymérase maintient ouverte une bulle de transcription de 12-13 bp. Elle favorise l’appariement de ribonucléotides avec les désoxyribonucléotides de l’ADN matrice puis elle établie les liaisons covalentes entre les ribonuléotides. L’ARN naissant reste apparié à l’ADN matrice sur environ 8 bp, puis il y a désappariement. La flèche indique le sens de progression de la polymérase qui synthétise ainsi l’ARN dans le sens 5’ vers 3’. L’ARN est de séquence inverse complémentaire au brin d’ADN 3’-5’. C’est pourquoi on donne toujours la séquence codante ADN de 5’ vers 3’.L’élongation se réalise de la même manière chez les eucaryotes.

3-2 La transcription3-2-2 Elongation des ARNm

Transcription par l’ARN polymérase chez E. coli. La polymérase (en bleu) et le facteur de transcription sigma (en violet) se lient d’abord non spécifiquement à l’ADN et se déplacent sur la molécule jusqu’à la région promotrice entre -35 et -10 reconnue par le facteur sigma. La polymérase déroule alors l’ADN autour du site d’initiation de la transcription et commence la polymérisation. Généralement, le site d’initiation +1 est en amont du codon d’initiation de la traduction (l’ORF est indiquée en rouge). L’ARN synthétisé commence donc souvent par une région 5’ non traduite (5’UTR).

3-2-1 Initiation de la transcription des ARNm3-2-1-1 chez les bactéries

Formation du complexe d’initiation de la transcription chez les eucaryotes.Ce complexe est formé de l’ARN polymérase II (en violet) et de nombreux facteurs de transcription (en marron, orange, vert ou bleu). L’un deux, TBP, se lie à la TATA box (séquence consensus TATAA) située 25 à 30 nucléotides en amont du site d’initiation de la transcription. D’autres facteurs de transcription se lient ensuite à TBP et l’ensemble recrute l’ARN polymérase II qui pourra initier la transcription.

3-2-1-2 chez les eucaryotes

Chez les bactéries, la transcription s’achève au niveau d’une séquence palindromique inversée. La transcription de cette séquence palindromique inversée entraine la formation d’une épingle à cheveux au niveau de l’ARN néosynthétisé, ce qui déstabilise le complexe de transcription.

3-2-3 Terminaison de la transcription des ARNm3-2-3-1 chez les bactéries

Chez les eucaryotes, la transcription se termine aux alentours de la séquence de polyadénylation (qui a aussi un rôle dans la traduction). Une fois la séquence de polyadénylation transcrite (en rose), la protéine CPSF (cleavageand polyadenylation specficity factor) qui était associée à l’ARN polymérase s’y lie. La perte de l’interaction CPSF/ARN polymérase déstabilise le complexe de transcription.

3-2-3-2 chez les eucaryotes

ADN

ARNm

protéine

+1Séquence polyadénylation ou

séquence palindromique

AUG stop

5’UTR 3’UTR

Résumé

ATG stop

UTR: untranslated region

N C

Ajout de la coiffe du côté 5’ des ARN naissants. Cette coiffe consiste en une 7-méthylguanylate (m7G), c’est-à-dire une guanidine modifiée. Les deux premières réactions sont catalysées par une enzyme de capping qui s ’associe àl’ARN polymérase peu après l’initiation de la transcription. Deux méthyltransférases différentes catalysent les réactions 3 and 4. La S-adénosylméthionine (S-Ado-Met) est la source du groupement méthyle (CH3) pour les deux dernières étapes de méthylation.Le capping est nécessaire à l’exportation des ARNm hors du noyau.

3-2-4 La maturation des ARNm, une spécificité des eucaryotes3-2-4-1 l’ajout de la coiffe en 5’ (capping)

L’extrémité 3’ de la plupart des ARNm eucaryotes est polyadénylée. Une fois la transcription achevée, l’ARNm sera clivé 15-30 nucléotides en aval de la séquence signal, puis des AMP seront ajoutés par une poly(A) polymérase pour former une queue poly(A).La polyadénylation facilite l’exportation des ARNm hors du noyau, les protège des dégradations une fois dans le cytosol et facilite la traduction.

3-2-4-2 la polyadénylation en 3’

Polyadenylationsequence signal

3-2-4-2 l’épissage des introns (le splicing)

ADN

gène

transcription

ARNm

traduction

protéine

1er principe:42=843=64Donc,-Il faut au moins 3 nucléotides (= codon) pour spécifier un acide aminé-Les codons se suivent sans espace et sans chevauchement-Il faut des marques de début et de fin

2ème principe:Colinéarité entre gène et protéine (5’=N, 3’=C)

Pas tout à fait vrai chez les eucaryotes

Structure de deux gènes humains montrant leur organisation en introns et exons.(A) Le gène codant la beta-globine, de petite taille, est composé de 3 exons et 2 introns.(B) Le gène codant le facteur VIII, beaucoup plus grand, est composé de 26 exons et 28 introns.

La plupart des gènes eucaryotes sont morcelés:La séquence codante est interrompue par des séquences non codantes, appelées introns. Par extension, les séquences codantes ont été appelées exons.

Les gènes sont d’abord transcrits sous forme d’un ARN pré-messager, lequel sera ensuite cappé, polyadénylé, puis les séquences introniques seront éliminées par un mécanisme appelé épissage pour générer l’ARNm mature.Exemple du gène ββββ-globine. Ce gène comprend 3 exons (rouge) et 2 introns (bleu). Les introns interrompent la séquence codante au niveau des codons correspondant aux acides aminés 31 et 32, et 105 et 106. La transcription commence un peu en amont de l’exon 5’ et s’étend en aval de l’exon 3’, produisant un ARN prémessager contenant les séquences introniques et exoniques ainsi que deux régions non codantes supplémentaires (gris) aux deux extrémités du transcrit primaire (régions UTR). Les régions introniques seront éliminées secondairement par le mécanisme d’épissage. Les régions UTR ne sont pas concernées par l’épissage.

Principe général du mécanisme d’épissage. L’épissage est catalysé par des snRNP (smallnuclear Ribonucleotide Particles) symbolisées par des ronds colorés, plus d’autres protéines (la plupart ne sont pas représentées), l’ensemble constituant le spliceosome. Les RNP sont des structures multimoléculaires composées de protéines et de petits ARN. Ils ont la double propriété de reconnaître des séquences spécifiques et éventuellement ont des activités catalytiques de coupure et/ou ligation.U1 et U2 se fixent d’abord sur le pré-messager, puis U4 et U6 viennent interagir avec U1 et U2, ce qui rapproche les deux extrémités exoniques. Puis l’activité catalytique du spliceosome permet de cliver la séquence intronique et de liguer les séquences exoniques.L’épissage doit être précis au nucléotide près pour conserver la bonne phase de lecture dans chaque exon.

Détails du mécanisme d’épissage chez Saccharomyces cerevisiae (organisme eucaryote unicellulaire)(A) La snRNP U1 se fixe d’abord sur une séquence spécifique à la jonction exon-intron amont grâce à un

appariement entre son petit ARN et l’ARN pré-messager. Puis U6 vient se fixer sur U1, lève son appariement avec l’ARN prémessager et s’apparie lui-même à l’ARN prémessager à la place de U1. Cette double reconnaissance diminue les chances d’erreur.

(B) A la jonction intron-exon aval, la protéine BBP reconnaît d’abord une séquence spécifique puis est remplacée par U2. Mais U2 ne s’apparie pas avec l’avant-dernière A (en rose), ce qui forme une mini-boucle à ce niveau qui favorisera le clivage à ce niveau.

(C) U6 et U2 interagissent ensuite ensemble grâce à un appariement de leurs petits ARN ce qui rapproche dans l’espace les extrémités exoniques. U5 vient alors se fixer à ces deux extrémités, grâce aussi à son petit ARN qui reconnaît les séquences exoniques amont et aval. Les activités catalytiques de clivage et de ligation s’en suivent.

Signification de l’épissage ?

-Conséquence d’un moteur de l’évolution: souvent les exons codent un domaine. La séparation physique des exons permet leur recombinaison génétique et la genèse de nouvelles protéines par nouvelles associations de domaines préexistants

-Générateur de diversité par épissage alternatif

Le splicing alternatif: Permet de générer des protéines différentes à partir d’un même gène

Splicing alternatif d’un pre-mRNA qui code un facteur de transcription. Dans cet exemple, le facteur de transcription est codé par 4 exons: le premier code le domaine de liaison à l’ADN, le deuxième un domaine de fonction inconnue, le troisième le domaine permettant l’activation de la transcription et le quatrième un domaine de fonction inconnue. Le pre-mRNA peut subir deux splicings différents. Dans le premier cas (à gauche), les 3 introns sont éliminés et les 4 exons sont ligués, générant un mRNA qui code le facteur de transcription pleine longueur et actif. Dans le deuxième cas (à droite), l’exon 2 est ligué à l’exon 4 au lieu d’être ligué à l’exon 3, ce qui génère un facteur de transcription inactif car dépourvu du domaine d’activation de la transcription.

5’UTR 3’UTR

intron intron intron

Résumé des différentes étapes conduisant à la synthèse d’un ARNm chez les eucaryotes et les bactéries.(A) Chez les eucaryotes, la transcription a lieu dans le noyau. Le transcrit primaire, ou ARN prémessager, contient à la

fois les séquences codantes et les séquences introniques. Avant de pouvoir être traduit en protéine, il subit des modifications à ces deux extrémités (capping et polyadénylation) qui contribueront à son exportation dans le cytosol, lieu de la traduction, et les introns sont éliminés par le mécanisme d’épissage.

(B) Chez les bactéries, les gènes ne sont pas morcelés et le transcrit ne subit aucune maturation. Comme il n’y a pas de noyau, la traduction peut démarrer dès que l’ARN commence à être synthétisé.

Le taux final d’une protéine dans la cellule dépend de l’efficacité de chaque étape et des taux de dégradation des ARN et des protéines. La complexité des processus chez les eucaryotes permet une plus grande finesse de régulation, et permet de synthétiser plus d’un type de protéine par gène.

Résumé

3-2-5 La transcription des petits ARN (chez les eucaryotes)

ADN

gène

TranscriptionARN pol II

ARNm

traduction

protéine

gène gène

TranscriptionARN pol I

TranscriptionARN pol III

ARNr ARNtARNrARNu

Chez les bactéries, il n’y a qu’un type de polymérase

gène

TranscriptionARN pol II

ARNncFonction?

« petits ARN »Machinerie de traductionMachinerie d’épissage

Autres ?

3-2-6 La régulation de la transcription (régulation de l’initiation)

Chaque étape de la synthèse des ARN est régulée,en particulier l’initiation de la transcription

L’initiation de la transcription est contrôlée par les facteurs de transcription. Un facteur de transcription est une protéine composée d’au moins un domaine de liaison à l’ADN et d’un domaine d’activation. Le domaine de liaison àl’ADN permet à ces facteurs de se fixer à l’ADN au niveau de séquences spécifiques. Le domaine d’activation permet, par différents mécanismes, de moduler à la hausse ou à la baisse l’activité de l’ARN polymérase.

3-2-6-1 Principes généraux de la régulation de l’initiation de la transcription

Exemple de liaison d’un facteur de transcription sur l’ADN. Exemple du répresseur du bactériophage 434. Ce facteur de transcription est un homodimère dont chaque monomère s’insère dans la double hélice au niveau du

grand sillon.(a) Modèle en boule du répresseur lié à l’ADN.(b) Modèle en ruban du répresseur lié à l’ADN montrant les acides aminés impliqués dans l’interaction avec

l’ADN.(c) Diagramme de Wire montrant les liaisons hydrogène entre le répresseur et l’ADN. N’importe quelle base ne

peut pas interagir avec le répresseur. La fixation du répresseur sur l’ADN ne peut se faire que sur des séquences spécifiques. Les cercles noirs représentent des molécules d’eau.

Les séquences reconnues par les facteurs de transcription sont localisées:

- en amont du site d’initiation de la transcription, dans une région appelée promoteur

- très proche du +1: promoteur proximal- plus loin en amont: promoteur distal

- n’importe où ailleurs dans le génome- si effet positif sur la transcription: enhancer- si effet négatif: silencer

Il existe des facteurs de transcription dits généraux capables d’agir sur la transcription de très nombreux gènes, et des facteurs spécifiques actifs sur un nombre de gènes plus restreint.

Les facteurs de transcription spécifiques sont sensibles aux signaux de l’environnement

Les facteurs de transcription peuvent activer et/ou réprimer la transcription.

Rôle du facteur de transcription général sigma d’E. coli. La polymérase et le facteur de transcription sigma se lient d’abord non spécifiquement à l’ADN et se déplacent sur la molécule jusqu’à la région promotrice entre -35 et -10 reconnue par le facteur sigma. La polymérase déroule alors l’ADN autour du site d’initiation de la transcription et commence la polymérisation. Le facteur sigma est un facteur général de transcription, capable d’agir sur de nombreux gènes.

3-2-6-2 Régulation de l’initiation de la transcription chez les bactéries

Promoteurs d’E. coli reconnus par le facteur de transcription σσσσ70

(a) Alignement de séquences de quelques promoteurs faisant ressortir les homologies au niveau des régions -35 et -10.

(b) Séquence consensus des régions -35 and -10 déduites des alignements précédents. La fréquence à laquelle apparaissent les bases dans différents promoteurs reconnus par le facteur s70 sont indiquées par un code couleur: rouge, >75 pourcent; gras, 50-75 pourcent; normal, 40-50 pourcent. Des mutations connues pour diminuer le taux de transcription sont indiquées.

(c) Exemple des régions -35 and -10 du promoteur du gène lac, qui dévie de la séquence consensus au niveau de 4 positions indiquées en bleu. Le facteur sigma a peu d’effet sur ce gène. Des mutations sont connues sur ce promoteur. Certaines (Down) diminuent encore l’expression du gène lac. D’autres (Up) ramènent la région -10 vers la séquence consensuelle, et donc augmentent le taux de transcription.

Facteurs Sigma d’E. coli

TTGCACTGGNAGènes du métabolisme de l’azote

σσσσ54

région 12région 24

??Gènes de la phase stationnaire et de réponse au stress

σσσσ38

CCGATATCTAAAGènes de motilité etchimiotaxie

σσσσ28

CCCCATNTATCTCNCCCTTGAAGènes induits par chocthermique

σσσσ32

TATAATTTGACATnombreux gènesσσσσ70

région -10région -35

Séquences Promoteurs ReconnusFacteur sigma

Rôle du facteur de transcription spécifique cAMP-CAP sur le promoteur lac. L’ARN polymérase seule et le facteur cAMP-CAP seul ont une faible affinité pour leurs sites de liaison respectifs dans le promoteur lac. En revanche, lorsqu’ils interagissent pour former un complexe, ils deviennent capables de se lier fortement et stablement au promoteur. Le facteur cAMP-CAP n’est actif que lorsqu’il fixe du cAMP (en violet foncé), un second messager produit dans la cellule en réponse à certaines signaux de l’environnement.

Contrôle transcriptionel négatif et positif de l’opéronlac par le facteur répresseur lac et le facteur activateur cAMP-CAP. Chez les bactéries les gènes sont organisés en opéron. Un opéron regroupe sous un même promoteur des gènes codant des protéines impliquées dans une même fonction. La transcription génère un ARN polycistronique qui sera ensuite traduit sous forme de protéines indépendantes. Ce regroupement assure la coordination de l’expression de protéines impliquées dans une même fonction.

L’opéron lac regroupe les gènes de trois enzymes, Z, Y et A permettant l’utilisation du lactose. Son expression est contrôlée négativement par un répresseur actif uniquement en absence de lactose dans le milieu, et par un activateur actif uniquement en absence de glucose. L’activateur est en fait sensible au cAMP dont la concentration est inversement proportionnelle àcelle du glucose. L’opéron sera donc transcrit en fonction de la disponibilité en lactose ou glucose.

(a) En absence de lactose et en présence de glucose dans le milieu, le répresseur est actif et l’activateur inactif; aucun mRNA n’est donc formé parce que le répresseur est lié àl’opérateur. Les enzymes du métabolisme du lactose ne seront pas synthétisées, mais la bactérie n’en a pas besoin puisqu’elle dispose de glucose.

(b) En présence de glucose et lactose, le répresseur lie le lactose, ce qui entraine un changement de conformation et le rend inactif. L’activateur est toujours inactif. Dans cette situation, la transcription a lieu a un taux basal.

(c) En présence de lactose et en absence de glucose, le répresseur est inactif et l’activateur actif. Le taux de transcription est donc maximal. La bactérie pourra utiliser le lactose.

La séquence de l’opérateur lac est une séquence inversée presque parfaite centrée autour de la paire GC en position + 11.

Séquences consensus rencontrées dans les promoteurs proximaux de gènes transcrits par l’ARN polymérase II. Le nom donné à chaque séquence consensus est indiqué dans la première colonne et le facteur général de transcription qui la reconnaît dans la dernière colonne. N indique la présence d’un nucléotide quelconque, et deux nucléotides séparés par un slash indique que ces deux nucléotides ont la même probabilité d’être présents à cette position. Dans la plupart des promoteurs, seulement deux ou trois de ces quatre éléments sont présents. Bien que la plupart de ces éléments sont situés en amont du site d’initiation de la transcription, certains peuvent être localisés dans la séquence transcrite.

3-2-6- 3 Régulation de l’initiation de la transcription chez les eucaryotes

Quelques centaines de facteurs de transcription spécifiques

Activateurs et/ou répresseurs

Reconnaissent chacun une séquence consensus spécifique- 6-10 pb- tandem parfois

Dans le promoteur en amont, dans des enhancers ou silencers n’importe où (en amont, en aval, parfois dans des introns)

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Mode de fonctionnement des facteurs de transcription spécifiques eucaryotes. Bien que parfois situés à plusieurs milliers de nucléotides du site d’initiation de la transcription, les facteurs de transcription spécifiques, une fois fixés sur l’ADN au niveau d’une séquence spécifique, interagissent avec le complexe de transcription pour moduler le taux de transcription en établissant une boucle dans l’ADN. Ils peuvent aussi recruter directement ou indirectement des protéines qui vont modifier l’activité de l’ARN polymérase ou modifier l’état de la chromatine. Généralement, plusieurs facteurs de transcription spécifiques contribuent à moduler l’activité d’un promoteur.

Organisation du promoteur du gène codant la transthyrétine (TTR). Ce promoteur contient une TATA box et plusieurs sites de fixation pour plusieurs facteurs de transcription spécifiques. C’est l’action combinée de ces différents facteurs qui détermine le taux de transcription.

Quelques centaines de facteurs de transcription spécifiques pour plusieurs dizaines de milliers de gènes: la spécificité dépend de la combinatoire de

ces facteurs

Modèle de l’assemblage coopératif du complexe de transcription au niveau du promoteur de la TTR dans les hépatocytes. Les 5 facteurs de transcription spécifiques se lient par leur domaine de liaison à l’ADN à leur site dans le promoteur ou l’enhancer, et par leur domaine d’activation soit avec des co-activateurs ou des facteurs généraux de transcription en établissant une boucle dans l’ADN. L’assemblage d’un tel complexe ne peut se faire que dans les hépatocytes et pas par exemple dans des cellules épithéliales qui contiennent C/EBP mais pas les facteurs HNF.

Eléments de contrôle transcriptionel des gènes transcrits par les ARN polymérases I (a) et III (b,c).

Structure des nucléosomes. Dans un noyau de cellule eucaryote, l’ADN n’est pas nu mais associé à différentes protéines. L’ensemble forme la chromatine. L’état de compaction de l’ADN dans la chromatine contribue à déterminer son taux de transcription.L’unité structurale de base de la chromatine est le nucléosome. Un nucléosome est constitué par l’assemblage de 8 protéines, les histones, autour desquelles l’ADN s’enroule en deux tours. D’autres protéines interviennent pour compacter encore plus l’ADN (non montré).Les facteurs de transcription spécifiques peuvent indirectement modifier chimiquement les histones (acétylation) et déstructurer la chromatine de façon àrendre les gènes plus faciles à transcrire.

Pour mettre en évidence par approche bioinformatique un gène potentiel dans un génome (annotation des génomes) on peut rechercher:

-Des ORF-Des jonctions intron-exon-Des séquences de polyadénylation-Des séquences consensus de facteurs de transcription

Structure d’un ARN de transfert. Exemple du tRNAAla de levure. Les ARNt ont deux particularités:-ils présentent une structure secondaire due à des appariements locaux-certains nucléotides A, C, G et U sont chimiquement modifiés, de façon post-transcriptionelle (en orange, D = dihydrouridine, I = inosine, T = thymine, Y = pseudouridine, and m = methyl group).

Il existe autant de tRNA que d’acides aminés. En effet le tRNA est l’adaptateur entre le codon sur l’ARNm et l’acide aminé.-Chaque tRNA fixe un acide aminé à son extrémité 3’ grâce à l’intervention d’une enzyme de charge (il y a 20 enzymes de charge différente, une par acide aminé)-Chaque tRNA porte un anticodon, c’est-à-dire une séquence de 3 nucléotides inverse complémentaire d’un codon (=anticodon), celui correspondant à l’acide aminé chargé sur le tRNA. Il n’existe aucun ARNt possédant un anticodon du codon stop.

3- 3 La traduction3-3-1 Les acteurs

3-3-1-1 Les ARN de transfert

Structure d’un ribosome. Un ribosome est composé de deux sous-unités (small et large). Chaque sous-unité est elle-même composée d’un assemblage de petits rRNA de différentes longueurs et d’un ensemble de protéines. Les ARNr participent à la fois à la structure du ribosome et à ses fonctions catalytiques, la formation de liaisons peptidiques.

(a) ribosomes procaryotes.(b) ribosomes eucaryotes.S est une constante de sédimentation des ARN, qui reflète leur longueur.

3-3-1-2 les ribosomes

Modern Genetic Analysis, Griffiths et al, 1999

Les sites de liaison aux ARN d’un ribosome. Un ribosome peut fixer un ARNm et 3 tRNA sur les sites A, P et E (A pour aminoacyl-tRNA, P pour peptidyl-tRNA, et E pour exit).

(A) Structure d’un ribosome bactérien avec la petite sous-unité en vert foncé au premier plan et la grande sous-unitéen vert clair au second plan. Sont représentées en vert aussi bien les protéines que les ARN constituant le ribosome. Son treprésentés en plus les tRNA liés au ribosome, en rouge quand lié au site E, en orange quand liéau site P et en jaune quand lié au site A. Pendant la traduction, seuls deux sites sur trois peuvent être occupés.

(B) Même ribosome qu’en A, mais avec la petite et la grande sous-unités séparées. (C) Même ribosome qu’en A, vu à 90°(D) Représentation schématique d’un ribosome.

Molecular Biology of the Cell, Alberts et al, 2000

3-3-2 Le déroulement de la traduction

-Etape d’initiation: un ribosome portant un tRNAMet reconnaît l’extrémité5’cap, fixe l’ARNm puis se déplace sur la séquence jusqu’à l’anticodon Met-Etape d’élongation:

Modern Genetic Analysis, Griffiths et al, 1999

-Etape de terminaison: quand le ribosome arrive à un codon stop aucun tRNA ne se fixe. Se fixent à la place des protéines appelées facteurs de terminaison. Ces facteurs favorisent le relargage de la protéine néo-synthétisée et la dissociation du ribosome de l’ARNm

Transcription et traduction. Ces deux processus sont étroitement couplés chez les bactéries, alors qu’ils sont séparés dans l’espace et le temps chez les eucaryotes.

3- 4 Méthodes d’étude de l’expression du génome

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Caractériseun individu

(voire une espèce)

Caractérisent une cellule donnéedans une situation donnée

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���� �/��différenciation cellulaireréponse cellulaire

� ���� ����� � �/��stabilitétraductibilité

�

Étudesmolécule par

molécule

Étudeglobale

3-4-1 Etude des produits de transcription3-4-1-1 Le Northern blot

Détection d’ARN spécifiques par Northern-blot. Cette technique est une adaptation du Southern-blot pour détecter des ARN.(A) Les ARN totaux de cellules en culture ou de fragments d’organes sont extraits et séparés en fonction de leur taille par électrophorèse.(B) Les ARN sont ensuite transférés sur une feuille de nitrocellulose.(C) et (D) La feuille est placée dans un récipient pour être incubée avec une sonde spécifique de l’ARN d’intérêt marquée radioactivement.(D) Après lavage pour éliminer la sonde non hybridée, la feuille est autoradiographiée. Un signal sur une bande indique que l’ARN d’intérêt

est présent dans les cellules d’origine, donc que le gène correspondant est exprimé.

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3-4-1-2 La RT-PCR

Faire une banque de cDNA. Les ARNm totaux sont extraits et purifiés de cellules en culture ou d’organes. La rétrotranscription par la reverse transcriptase (une enzyme virale capable de polymériser de l’ADN à partir d’une matrice ARN) est amorcée à l’aide d’un primer oligo(dT). La RNase H (une enzyme qui dégrade uniquement l’ARN dans les hybrides ADN/ARN) est ensuite utilisée pour éliminer l’ADN. L’extrémité 3’ du cDNA résultant a tendance àformer une petite épingle à cheveux; cette petite épingle sert de primer « naturel » pour amorcer la polymérisation du 2ème brin d’ADN. La nucléase S1 permet ensuite de couper la liaison interbrin. Le cDNA double brin ainsi généré est ligué à ses deux extrémités à un linker, c’est-à-dire un petit fragment d’ADN contenant un site de restriction pour EcoRI. Une digestion EcoRI permettra de l’insérer dans un vecteur plasmidique ouvert par EcoRI. Le clonage des bactéries puis le séquençage individuel de chaque insert plasmidique permettra de déterminer les gènes exprimés dans les cellules d’origine.

3-4-1-3 Les banques de cDNA

3-4-1-4 Les puces à ADN

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3-4-2 Etude des produits de traduction3-4-2-1 Le Western-blot (ou immunoblotting)

Principe du Western Blot. Les protéines totales sont extraites de cellules en culture ou d’organes. Elles sont dénaturées par un détergent anionique, le SDS, qui se fixe en grande quantité sur les protéines et les charge négativement. Les protéines sont ensuite séparées en fonction de leur taille par électrophorèse en gel de polyacrylamide. Cette étape est suivie d’un transfert sur feuille de nitrocellulose et d’une mise en évidence de la protéine d’intérêt à l’aide d’anticorps spécifiques marqués radioactivement.

Détection par Western blot de la dystrophine. La dystrophine est la protéine déficiente chez les patients atteints de certaines myopathies. Les pistes numérotées correspondent à des protéines extraites de différents patients; les pistes notées C sont des contrôles positifs correspondant à des protéines extraites de sujets sains. A et B sont des blots révélés à l’aide d’anticorps différents, spécifiques de la dystrophine dans les deux cas. Les mêmes blots sont incubés avec des anticorps spécifiques de la myosine, une protéine commune dans les muscles, permettant de vérifier que les puits sont bien équichargés.

3-4-2-2 La protéomique

Principe de la protéomique. Il s’agit d’identifier simultanément toutes les protéines présentes dans une cellule, sans recourir à des anticorps. Les protéines sont d’abord séparées par électrophorèse bidimensionnelle. Cette électrophorèse se fait dans une première dimension selon la charge de la protéine native, et dans une deuxième dimension selon sa masse. Après électrophorèse, le gel est coloré de façon à révéler l’ensemble des protéines. Chaque tâche est ensuite découpée et les protéines éluées du fragment de gel. Chaque type de protéine ainsi purifié est analysé par spectrométrie de masse. Cette technique permet de mesurer la masse d’une protéine très précisément, ce qui permet de l’identifier. Il existe maintenant des banques de données qui répertorient les masses exactes de très nombreuses protéines.