Biologie MoléculaireTD 8

(Ex. 28 + CC2-CC3 2007)

Exercice 28 : bactériophage T7

Exercice 28 : Rifampicine

Transcription in vitro, ADN Pol de T7ARN Pol de E. Coli4 NTP (avec ATP marqué au 14C)

Après 2 min., addition de rifampicine=> Incorporation de 14C pdt 40 min. puis arrêt.

=> Action sur la phase d’initiation

CC2 : question 1 (4 pts)

(4 pts) Le génome du virus SV40 a été traité séparément par 3 enzymes de restrictions différentes, dans des conditions appropriées ; les résultats obtenus après électrophorèse sont présentés ci-dessous.

Sur quels principes reposent la séparation et la révélation des bandes observées ?En supposant que le génome du SV40 est circulaire, préciser le nombre de site(s) EcoRI présents.S’agit-il d’ADN ou d’ARN ? Expliquer.

CC2 : question 1 (4 pts)Sur quels principes reposent la séparation et la révélation des bandes observées ?

ELECTROPHORESEMigration de particules chargées sous l'effet d'un champ électrique

Support : gel d’agaroseSéparation basée sur la taille

APPLIQUEE à l’ADN :

Révélation des bandes d'ADN (coloration) par le bromure d'éthidium

CC2 : question 1 (4 pts)

En supposant que le génome du SV40 est circulaire, préciser le nombre de site(s) EcoRI présents.

Enzymes de restriction : - endonucléases (hydrolysent les liaisons phosphodiesters de l’ADN)- reconnaissent des séquences spécifiques (palindromiques)

Les trois sortes de coupures générées par des enzymes de restriction de type II. HaeIII -> extrémités sans simple brin dépassant : des bouts francs; PstI et BamHI -> extrémités simples brins dites cohésives (« bouts collants »). PstI a une extrémité 3' qui déborde alors que BamHI en a une 5‘.

CC2 : question 1 (4 pts)

En supposant que le génome du SV40 est circulaire, préciser le nombre de site(s) EcoRI présents.

Après traitement BamHI, 8 bandes (8 fragments) donc 8 sites

Après traitement EcoRI, 5 bandes donc 5 sites

Après traitement HindIII, 5 bandes donc 5 sites

dans le texte : circulaire

après traitement Eco RI, 5 bandes donc 5 sites

I

1 2

3

4

5

II

IIIIV

V

1

2

3

4

5

6, 7, 8

CC2 : question 1 (4 pts)

S’agit-il d’ADN ou d’ARN ? Expliquer.

Action des enzymes de restriction => ADN double brin

Enzymes de restriction : - endonucléases (hydrolysent les liaisons phosphodiesters de l’ADN)- reconnaissent des séquences spécifiques (palindromiques)

CC2 : question 2 (5 pts)

Le bactériophage PBS2, qui infecte la bactérie B. subtilis, incorpore naturellement l’uracile à la place de la thymine dans son ADN. Dès que l’ADN phagique entre dans la bactérie, une enzyme de réparation de la bactérie intervient pour éliminer les uraciles. Le virus contourne aussitôt cet obstacle en synthétisant un inhibiteur de cette enzyme, inactivant celle-ci ce qui permet à l’ADN phagique d’être répliqué.

Quelle est l’enzyme bactérienne de réparation qui intervient ? Dans quel processus est-elle « normalement » impliquée ?

Uracile glycosylase

Mode d’action des ADN glycosylasesCes enzymes hydrolysent la liaison glycosidique de la base altérée correspondante (en rouge) pour produire un site AP

CC2 : question 2 (5 pts)

CC2 : question 3 (2 pts)

Qu’appelle-t-on région codante d’un ARNm ? Comment appelle-t-on les régions situées en amont et en aval de la région codante ?

CC2 : question 3 (2 pts)

Qu’est ce qu’une unité de transcription ?

CC2 : question 3 (2 pts)

les cellules eucaryotes renferment 3 types d’ARN polces ARN Pol, toutes nucléaires, diffèrent selon les ARN qu’elles synthétisent.

Type d’ARN pol Localisation ARN synthétisés

Pol I Nucléole Précurseurs de la plupart des ARNr

Pol II Nucléoplasme Précurseurs des ARNm

Pol III Nucléoplasme Précurseurs de l’ARNr 5sARNt

Différents petits ARN nucléaires et cytosoliques

Il existe également des ARN Pol mitochondriales et (chez les plantes) chloroplastiques

CC2 : question 4 (5 pts)

Pourquoi y a t il plusieurs ARN polymérases chez les eucaryotes ?

CC2 : Bilan ARN Pol, Proc./Euc.

On dit que l’ADN de type B tourne à droite ; qu’est ce que cela signifie ? Faire un schéma.

CC2 : question 5 (4 pts)

Figure 2.16

CC2 : question 5 (4 pts)

Comparaison de la conformation de la désoxyguanosine dans l’ADN -B & -ZDans l’ADN –B, la liaison glycosidique C1-N9 est toujours en position anti (gauche).Par contre, dans l’ADN –Z (de pas gauche), cette liaison subit une rotation (comme montré)et adopte en conséquence la conformation syn (à droite).

CC2 : question 5 (4 pts)

CC3 :

question 1 : TD suivant (9)

question 2 : plus tard (TD11 ou 12)

CC3 : question 3 (4 pts)

Le phage fX174 : modalités de sa réplication

Le génome du phage fX174 est constitué d’ADN à un seul brin appelé brin (+). Une fois dans la cellule d’E. coli, le brin (+) dirige la synthèse du brin (-), complémentaire avec lequel il s’associe pour former un ADN double brin circulaire appelé forme réplicative.Des expériences d’hybridation montrent que l’ARN produit par E. coliinfecté par fX174 ne s’hybride pas avec l’ADN génomique du phage mais s’hybride avec la forme réplicative.Expliquer.

Le phage φX174 : modalités de sa réplication

Brin (+)

Brin (-)

Forme réplicative

réplication

transcription

association

ARN

Hybridation ADN - ARN

L’ARN formé ne s’hybride pas avec l’ADN génomique mais avec la forme réplicative.C’est donc le brin (-) qui est complémentaire de l’ARN formé; le brin (-) sert de matrice pour la transcription.

HHéélices droiteslices droites

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HHéélices gaucheslices gauches

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