Upload
others
View
2
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
� � �
���������� �������������� ����������
�������������������������������������
�
���������������������
���������� ��� ����� ��������������� � ���
���� ������������������������� � ���
��������������!�������� ���"�� �������
#�������������$��� ���%�$��� ����
$���� �� ��
&�������!�������������#�������������$��� ��������������������������'����������
���� ����������������������������������������
���!���())*�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
+&��� ,���������������������-���� ������!� ������������� .���������������
����� �������-��� ������� .������� ����������-��� ��/�+�
0 ������� �����
�
+�������1�2�%�� �%�3� ���������� ���������������/�3�.��-������ ������ ���
������� ��-��4��-��./+�
&�� ��$/�5�������
�
����������������������!��������������!� ������������������������� ���� ���
���.����.��-��./��
&�� ��$/�5�������
�������� � ���
��������
������ �%�������� �����-������ �������������������� ���� �����!�� ����� �����������
���������� �������/� � $ ������ ������������ �������� ����� ������� �� �� �� �������������� 67 8� �����
�������� ���� �� ������ � ��� ���%� �� ��� ���� ���� ���� ����� ��� ���� �/� � ���� �������%�
������ ���� ��� �� ���'�� +������9� � ���������� � ���� ������������ �� ���� � ������� ��� ����� ���
����������6 $8����� $������:���.������� ���������������+������9������ �!����������������� �
� ����-� ������������������ ���%�� ��� ����������� ���/��
�
����������� ��� ��� 63;8������� ��� ��������������� ! �-���������������� ������������ 6����8�����
� ����� ��� �������������������� ����������������� ���� ��� ����������/� ��������� �� ��� �����
��� �� ������ ��� ���� � ����� ���� �� ����� ���� ��� -���� ��� �������� ���� �� !���� �� ���� �� �� ��
�������� ����� ��� ������ � ��/� ���� ��� �������� ����� 3;�� ����� � ��� ��-��� ��������� ���
����� ���� ��� ��� ������� �������� ��%� ��.��������� ��� � ������ ������������ ��� ���� �������
���� ���������� ������� �� � !�� ������� �� �����<��� ���������� ���� �!����� �� ���� ������ ��/�
� � � �� �� ���� �������� ��� -������ ���� ��� �� ����� ��� ��� ����� ���� �� ��������� ��� �� � ���%�
��-����%� �����������6�8� �� ����-����� ��' ��� �������-� ���������!����� �����!�� ���� � � ��
�� ��������������� ���� ���/�
�
&�� !� ��� ���� ��� ��� �������� !�� -����� � � � �� �� ���� ��� ��.��� �� ��� ����� � ����� ��� ���� ��
�� �� ��%� 3� ��� ��.� ���� ��� ��� ��� �� ��� ���� �� ���� ������� ��� ��� � � ��� �� ��� ��� �����
�� �� ��� �� ���������� �� 3;�/� &��� ���� �������!��� ���� ��� ���� �� �����%� ����%� -��� ����
������� ����3;������������/�3���������%��-��.����������� ���������������=�;�����������$����>%�
-��������������������������� ����������� ���������� ����������� �������%�-��������� �����>):�����
�� ���� ��� 3;��-��������� ������-����5������<���� /�&����-�.� ��� ���� ����� ������-� ������������
���� 3;������������� �� ��� ������������������������� ���� � �������/�� �����%� �����!���������
$����>�����;�������� �����������������������!��� �������������� ��������/��
�
$���� ��� ����������� -���� ����� ������������� ���������%� ���� � ������� ��� ���� ���� ����� ��� �������
�� ������ ��� �.��-�/� 3� ��������� ���� ��������� ��� ��������� ����� ����������!������ � ����� ���
��������!������������������������ ���������� ��!�������� ��������������������������� �������/�
���� ��� ����������� ��� ���� ������� ������!������ � ����� ��� �������� ��� 3;�� -��� �!�����/� ��� �����
�������� � ����
�� ��� ��������� -��� ����!��� ��� ���� ����� �� ����� ��� ���� ������ ���� ���� ����������� -���
���� ��������������/������������3;�������-������������������������' ���!����������� �����
������������������������������������������������������������/�3�������!�������!���������� ������
����������3;������������ ������������������������������������� ���������������������! �������-����
������������������������� ��������������������������3;���������������������������� � ����������
��������� ���������� ����������������/� �$������������������������������ ���������� ������� �� ����
�����������������!�����!������� ���3;�����!����� ������ ����� ����������� ����������������������
��� ���� ���������������� ����� �������� � ����� ��� ����������� ���� ����������� � !������/� 3���������
������������ ��������������������� ������ �������������������� 3;�������������� ���������������������!��
-�����3;�����������������������������������������������/�
�
�&�� ��������� ������ ��������� ����� ���� ������������ 3;�� 3���������� ���!�����������������������
����� ���� ������������������������� ��� �����������������/� �&���������������;������������� 3;��
���������� ����� ���������� ������� ����� ������� ������������ -��� ������ ��� ��������%� !�� ���-����
����������������������������-������������������3;���������/����������������������.�������
!��������������������������������3���������������������������� ������������������������
!�!�� ������ ������� ���� ��������� �����/� &���� -�.� ���� ��������� ��� ������������� ��� �������
�������������-�������������������������3;���������������������������������������������/�
�������� � �����
�
���������
&����-�.��������������������-���������!���������������������-������������������������������
������������������������ ������� ���������������%� ��� ����!��������� .��-����������!�����%�������������
�������������������!���������-������!��������������%��������-��������������������!��������
�����������/�
�
3���������������������������������������-���������������������#���������7�!��%�!���������������!���
������������������������%���!,�������������������������������������$���>?@*/�
�
&�����������.��-��������������������������!�������-�.������������-������������������6����������!���-8�
�������-����������������������6�8����������-�.�/�
�
�
�
�
��������������������
�
�
����!��())*�
�
�
�
�������� ��%� 7�����%� A�-�� �%� B����%� ��!.�� �7%� �������� �7� 6())C8� $������ �������������� ����
������:����������������������������������������������������/� ��������((%�(*D(:E)/�
�������� � ����
��"�#�����������
�
3� ���������� ��� ����.������������%������������������������!�������!.�� ��� ����������� ����
��������������������������-�����������������������/�$���%��������������������%������������
����������������������������������'��������-������������������������������������������������
������������������������������������/��
�
&���.��������������������������������������������!������������"������������������������������������
������������ ��������������������%�������������/�&�����������!���������� ��!%�������������������
������������ ����� ����������� ������� ���������%� ����.����1�$��� ���7��%����������%��������� ������ ���
��������������������%�������������!������������!����������������%�3����F��.��-���-�3�-��������������
��������������������-����������/��
�
&����� �������� -��� ������������ ��������� -���� ����� �������� ��� ���� 0�������� ������ ���� ��������
���������������/� 3� -����� ��.�� ��� ��.��-������ ���������� ������� ��� ���� $������� ��� ������ ��������%�
#��������� ��� $�������%� ���� ����������� ��� �!�������� ���� "����������� ���� ���� �������� ������ ���
������������ ������ ��� ������������� ���� �������� ������ ������������� ���� �� ������������
����������/�
�
&���.����� ����� ����������� ������ ��������������������������%� ����������� ��� ���� ����� >(������/�
7������ 3�-���� ��� ����.��� �����G%�������-�2����� ��� -��� 3��� ����!���� �����������������������%�
����%��������������������/�&���.���������������1�
�������� � ���
%�&�������������������� ���� �����
>/ ����������%�7�����%�A�-�� �%�B����%���!.���7%����������7�6())C8�$��������������������
���� ������:������� ������������ ������ ��� �������������� ��� �������/� �� ������ ((%�
(*D(:E)/�
(/ �������� ��%� A�-�� �%� &������� H"%� ��!.�� �7%� �������� �7/� ������� ������� ������
$��������������������������������������������/����'�'��������
�
�������� � ����
�&������������������� ���� �����
())*�
�
>/ �������� +�%� 7���� �%� A�-�� �%� B��� �%� &������� H"%� ��!.�� �7� ���� �������� �7/�
��� ������� ������������ � ��� ��� �������� ������ ������ ��� �� �������� � ��� ������� ��
$����������������� ���������������A������%�0�����������������%������������0�-�I������%�
�����!��())C/��
(/ ������������7�����%�A�-�� �%�B����%�&�������H"%����!.���7��������������7/��
������ �������� � ��� ��� �������� ������ ������� ������ ��� �� � ����� �������� � ���
���������������������������������())C������������������������������������%�3������������
���������%�H���%�&����%�#�$/�
J� ����������%�7�����%�A�-�� �%�B����%�&�������H"%���!.���7��������������7/��
�� ��� ��� ������������ � ��� ��� �������� ������ ������ ��� �� �������� � ��� ��������
$�����������������������������������%��$����������%�$���������$%�H����())C/�
�
!!"�
�
D/ �������� �7%� A�-�� �%�����������%� �������������� ��!.�� �7/��������$����������������
����7��������������������������������5�������������!��������������$����>/�A�������
��������������������())@�
E/ �������������%�2����2�%�����������K����������7/�����#$������� �����%���� � �����
���������� ������ ������� � � �� ������� ��� �� ��� ������ $��������� ������ ���� ��������
�������� �������%� ������ A������� �������� ��� $�������� ���� 0�-� I������%� ���!����%�
0���!��())@/�
@/ �������������%�2������%�����������K����������7/�����#$������� �����%���� � �����
���������������� ������� �� �������������� ���������&������������� 3������������A�����
������������������������%�$����3�����%�����!��())@/�
C/ 2������%����������%����������7�K��������������/�����#$������� �����%���� � �����
���������� ������ ������� � '�� �� ��� ������ $��������� �������� ��� �������� �������%� �$�
�������%�$�������%�H����())@/�
�
�� �� � �����
!!(�
�
*/ �������� ��%� B��� �L� ���� �������� �7� ������ ������ �������� � ��� �������� ������
�������������) ��* �������������� ��$�����������������������������������%��$��������%�
$�������%�H����())E/�
?/ �������� ��%� B��� �L� ���� �������� �7� ������ ������ �������� � ��� �������� ������
�������������) ��* �������������� ��$��������������������������������A������%�0��������
���������%������2$%������!��())E/�
�
�� �� � ������
�&�������������
$!����� ///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////// �
����������/////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////// ���
$�.��-���������////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////// ��
��!������������������������������� //////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////�
$!���������������������������� ///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////// ��
&�!�������������� ////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////// ����
7�������$����� //////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////// ����
7�������&�!��� ///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////// ���
$!!��������� //////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////// �����
�
�+�,�-��. �/����0����/,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,.
>/> A$��"��#0� //////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////(
>/( �����050&���$��#�#7#���$&�3L ///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////E
����� -������ � ��������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������E
����� ���������� ��� ��-�1������������� � �������������������������������������������������������������������������C
>/(/(/> 3���:α������������!����63α38///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////C
>/(/(/( &����������������������:���������������@�6&�����@%�&�"@8 ///////////////////////////////////////////////*
>/(/(/& ���������&�6���&8 //////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////?
>/(/(/D ;������ /////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////?
>/(/(/E $����>///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////>(
>/(/(/@ ���������������������///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////>&
>/& �#�#7#���$&�3L�$0��$5�&373&B //////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////>&
��J�� ��������������������� �������� �� ���������� ����������������������������������������������������������>&>/&/>/> ������������������������������������������� ////////////////////////////////////////////////////////////////////>D
>/&/>/( 5������������������������������������������ ///////////////////////////////////////////////////////////////////>@
��J�� ���� �������2������� �������� ����������� �����������������������������������������������������������>C
>/D ���B&5��$&#�$&3�0 //////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////>*
��3�� * ���� ����������������������� � �������������������������������������������������������������������������>*
�� �� � ����
��3�� * �������������� �4*%�5���������� �����������������������������������������������������������������������������������()
>/E $#0�&3�0���$�& 5�5L&�$�577#7$���$&�3L /////////////////////////////////////////////////////////////////(>
>/@ ��&50&3$7�$#0�&3�0���$�$�$�&�>�$0��;5��3�$0�30�& 5��#�#7#���$&�3L ///////(D
��.�� ������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������(D>/@/>/> ��������$����>������������////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////(D
>/@/>/( $����>��������%������������������������������////////////////////////////////////////////////////////////////(D
��.�� %���� �����������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������(E>/@/(/> ;��������������%����������������������������///////////////////////////////////////////////////////////////(E
>/@/(/( ;���������������//////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////(@
>/C �#��$�B%� B��& 5�5��$0��$3�� ///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////(*
>/* $3���$0�� B��& 5�5� ///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////&)
�+�,�-�� ���-���6 ��/���-�+�� ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,/
(/> �$&5�3$7�//////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////&&
(/( �5& ��� ////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////&&
����� � ����������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������&&
����� ������ ���������������� �� ������������������������������������������������������������������������������������&&
����J 7 ���� ������������� ���������� �����������������������������������������������������������������������������&E
����3 ��������������������� ����������������������������������������������������������������������������������������������&C
����0 8��� �'���� ������������������������������������������������������������������������������������������������������������������&C
����. ��������� ��%���� ���� �'���� �������������������������������������������������������������������������������&C
����9 7 ������������������������ �� ����'1��� �������������� ��%���� ���� ��
�2� ����������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������&*(/(/C/> ������������������������6���8//////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////&*
(/(/C/( �������������M���������� //////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////&*
(/(/C/& ����������������������������� ///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////&?
(/(/C/D �����������������0$/////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////&?
(/(/C/E 7��������///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////&?
(/(/C/@ &��������������5/����� //////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////D)
(/(/C/C ����������:����������////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////D)
(/(/C/* ����������:����������////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////D>
(/(/C/? ��'������� //////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////D(
�+�,�-��/ �6�-�-�����,� ����/�����+-��0�060 ����:�-����,6-;������;�
�0��/1��!�"��������0�����/�������:�- ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,2/
�� �� � ���
&/> 30&���#�&3�0///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////DD
J�� �$&5�3$7��$0���5& ��� //////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////DE
J���� *������ �� ��������������������������������������������������������������������������������������������DE
J���� *������ �������� ���������� ����� ���������� ���������������������������������������������������������������D@
J���J ��������#1��� �������������������������������������������������������������������������������������������������������������DC
J���3 8��� �'��������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������D?
J���0 $���������� ����� �������������������������������������������������������������������������������������������������������������D?
&/& �5�#7&� /////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////E)
J�J�� * ����� ������������� ��%���� ������ �*%����� ��������������������
����������� ����������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������E)
J�J�� * ����������������������������������������� �� ������������� 3����)������
������ ��������%���� � ����������������������������������������������������������������������������������������������������������ED
J�J�J ����#$��� ��%��$*��������� ����� ���������� ����������� �����������������������EC
&/D �3��#��3�0////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////E?
�+�,�-��2 �0�060 ����:�-������;��0/����/��0��/1����:�-����0�����/��/��
��06����/�,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,"
D/> 30&���#�&3�0///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////@&
D/( �5& ��� ////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////@E
3���� *������ �� ����������������������������������4����5�������������������������������������������@E
3���� ���'����4���<������ ���������������������������������������������������������������������������������������������������@@D/(/(/> "�������#���.��$���� /////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////@@
D/(/(/( �����������#���.��$���� ////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////@C
D/(/(/& N�������������������!������#���.� ////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////@*
D/(/(/D ������������$������� ///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////C)
D/& �5�#7&� /////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////C)
3�J�� 7������4���<� �4 ��� �������������������������4����5 �����������������������������C)
3�J�� ����������4���<� �4 ��� �������������������������4����5� �����������������������C&
3�J�J �������� ����7������4���<� �4 ��� ���� ������ ��� ��������������������
��������������4����5������������������������������������������������������������������������������������������������������������C&
3�J�3 ����������4���<� �4 ��� ���*�������� ������ ��� ��������������������
��������������4����5� ������������������������������������������������������������������������������������������������������������CC
�� �� � ����
3�J�0 �������� ����7������4���<� ����� �������������������������4����5������) ��
������ �� �������������� ���������������������������������������������������������������������������������������������������������CC
3�J�. ����������4���<� ����� �������������������������4����5������) �� �����
� �� �������������� ��������������������������������������������������������������������������������������������������������������������*(
D/D �3��#��3�0////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////*E
�+�,�-��( ����� .��/���-� ���/O��-���=�/�/��,���-�/�,���0����/��/��
�0/����/�6���6- ��0��/1��!�"��������:�-����0�����/,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,>!
E/> 30&���#�&3�0///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////?>
0���� ������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������?>E/>/>/> ������������������������������������������������������� /////////////////////////////////////////////////////////?>
E/>/>/( $����>���������������������������///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////?(
0���� %���� �����������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������?DE/>/(/> ����������������������������///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////?D
E/>/(/( 5���������������������������������������������������������� ////////////////////////////////////////?E
E/( �5& ��� ////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////?C
0���� ����' � ������ ��������� ���������������������������������������������������������������������������������������?CE/(/>/> ���������������������� //////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////?C
E/(/>/>/> �&�$7$"���>%��&�$7$":������>%��&�$7$":�������>�������������������3���������&�$7$"�5<$�
���>�////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////?C
E/(/>/>/( �&�$7$":@L ��:">������&�$7$":@L ��:"&////////////////////////////////////////////////////////////////////////////// >)(E/(/>/( ����������� ////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////>)(
E/(/>/& &���������������!���5���������������!�����������������������������//////////////////////>)E
E/(/>/D ������������������!������������� ///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////>)@
E/(/>/E $���:$����3��������������������2������!������� //////////////////////////////////////////////////////////>)C
E/(/>/@ ����������������������������:�$"5�����///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////>)*
E/(/>/C 3��������������������������������������������!������;�����������$����>////////////////>)*
E/& �5�#7&� ///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////>)?
0�J�� *��� ���������� �� ��8��� �'����� �������������' � �������������� � �����������>)?
0�J�� ������ ���������' � �����������������������������������������������������������������������������>>&
0�J�J �������� ��������' � ������������������ �����������������������������������������������������������>>&
0�J�3 ��������������� ��������' � ��%���� ����� � �������������������������������������������������>>@E/&/D/> ;������������������������������� ////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////>>?
E/D �3��#��3�0//////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////>(D
�� �� � �����
0�3�� ������� �� ���������� ��������' � ����������� ��%���� ��������������������������������>(D
0�3�� ������������%���� �� ���������� ������������ �� ��������������������������������������������>(E
�+�,�-��" ��/�60 ��/ ��/���0�0�-����-����/ ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,. ?
@/> �3"03$3�$0�5�$0���7303�$7��575;$0�5 //////////////////////////////////////////////////////////////////////>(?
@/( �$&�3L��5$3�350�35��30�& 5�30�;3&����#�#7#�����B&5�����75L //////////////////////>(?
@/& $7&5�5��A$��35��$#0�&3�0��30�& 5�30�;3&����$&#�5���#�#7#�����B&5�
����75L////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////>&)
@/D �5�&��30"�& 5��5$3�350&�30�;3&����$&#�5���$&�3L�23& �;5��3�$0�$0��
$�$�&�> ////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////>&(
@/E $��3&3�0$7���&50&3$7�$�&3�0���$�;5��3�$0�$0��$�$�&�>��#�30"����B&5�
�$&#�$&3�0//////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////>&(
@/@ �#��$�B�$0��$#&#�5��3�5�&3�0�///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////>&&
�+�,�-��* =�=6��1��,+:,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,./2
�+�,�-��? ,0=6������/���� �/1�������+� ��+- � ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,."
�
�
�� �� � ������
6��������������
�
$�����>/>�����������������������������%����������������������6���8����������������������
��������/ ///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////&
$�����>/(�3������������������� ���������������������������������������������������������////////D
$�����>/&�3������������� ���������-�������������������������������������������������/ //////////////>)
$�����>/D�;������%�$����>�����$����>���������;���������������������������������������������
��� ///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////>>
$�����(/>�5�����������������������������������������������������������-���� ���������������
63;�8/ /////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////&D
$�����(/(�"������������������������/////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////&@
$�����&/>� ������������������������������-��������������-���������������������/ ///////////////E>
$�����&/(�3������������������������%���� ��0$� �����!������� ��������������������@����������
���������������/ //////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////E(
$�����&/&�3������������������������%���� ��0$� �����!������� ��������������������()����������
���������������/ //////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////EE
$�����&/D���������!�����������$����>�����;������������3;���� ���������������/ //////////////////////E@
$�����&/E�����#$�%�%��$*��������-�$���0$�����������������������������������������
����������� ���������������///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////E*
$�����D/>�5���������'��������������������������������������������������������������������6���8
///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////@?
$�����D/(�"�����������.�����������������������������������������6���8������������������
���������������!�����/ ////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////C>
�� �� � �����
$�����D/&����������������.�����������������������������������������6���8������������������
���������������!�����/ ////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////CD
$�����D/D�"�����������.������������������������������������������-��������������������/ ////////////////C@
$�����D/E����������������.������������������������������������������-��������������������/ ///////////C*
$�����D/@�&���������������������������������!�������������������������������6���8���������
��������������������-���� ��������������/ ////////////////////////////////////////////////////////////////C?
$�����D/C����������������.�������������������������������������������������������������-���� ������
��������/ /////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////*&
$�����E/>����������������������������������������������������������������!��������������
���������///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////?*
$�����E/(�����������������$����>�M����!������������/ //////////////////////////////////////////////////////////////////////>)&
$�����E/&�����������������������������������������M���������;��������������������%���� �
���������/ ///////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////>)D
$�����E/D�3��������������������2������!�������������������!������$����>��������/ //////////////>>)
$�����E/E�$7$"�����������!������$����>�����������������������-����!����α:$7$"�����α:
$����>�����!�����//////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////>>(
$�����E/@�����!������$����>������������������������/ //////////////////////////////////////////////////////////////////////>>D
$�����E/C�������������������!������$����>������������������� ///////////////////////////////////////////////////>>E
$�����E/*����������������������������!������$����>�������///////////////////////////////////////////////////////>>C
$�����E/?�����������������������������!������;�������">�������/ //////////////////////////////////////////////>>*
$�����E/>)��������������������!������;�������"&������� //////////////////////////////////////////////////////////////>()
$�����E/>>���������;���������������������������������������������/ ////////////////////////////////////////>(>
�� �� � ����
$�����E/>(�����!������;�����������$����>���������;�����������!���������������������������
���������/////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////>(&
�
�� �� � �����
6�������&����
&�!���>/>��������������������������-�������������������������������������������������
���������������������������������� ////////////////////////////////////////////////////////////////////////>E
&�!���(/>�������������������������������������������������������������� ////////////////////////////////////////&C
&�!���&/>������������&���������'������ /////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////D*
&�!���&/(� ���������&���������'������/////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////////D?
&�!���E/>�������������������������������������������������%���� ������������������/ //////////////??
�
�� �� � ������
�&&���������
α�5�� � ������5���������������������
$�$�� � $�������������������������������
$����>� �� ����������:��.�� �������������������� 6��������� ����8� -���� ���!��������� ����� >�
������
$!�� � ������>�������!����<!�.�����
$0�;$�� ��������������������
$� � $��������������
$�&� � ��������������������������������
!�� � !���������
A�$� � !������������!����
�A�� � ���������!��������������
��0$� � ������������0$�
�53� � �����������������������
�3�� � �����3����������$�.�������������������
���� � ���������������������
���� � ���������������������������
��� � ���������������������
��5�� � ���!����F�����������5�����������
�0$� � ������!���������������
5/������ � 5���������������
��"� � 5'��������������������������
5��� � ������������������
5��� � 5���������-���������
5��:7� � 5��:��.����������
5���� � 5����������
5!A(� � �����!����������.�������������������������(�
5��� � 5�����������������:���������.������
$>� � ������������
$$�� � ���������������.�������
$��� � ����������������
�� �� � �������
$$:�$�� $��������������:������:�����������������
$� � � $������������������� ������
"� � ���!�����
">� � ���!����������>�
"(� � ���!����������&�
"$"� � �����������������
"��� � ��������������
"5�� � �������������������������
"7#&� � �����������������
"�5�>�� ������
";� � ���������������
�� � ����
$� � ���������
��>� � ������������������>�
��(� � ������������������(�
��&� � ������������������&�
�� � ������������
��"� � ��������������"������������
�� � �����������������
��"� � ������������������������������
3α3� � ����:α������������!����
�/�/� � ��������������
3&�� � �������������������������
3#� � �������������������
3;�� � ���������������
.��� � .����������
��� � .���.�����
7A�� � �����!����
7 � � 7������M����������
7���� � �������M���������<������������������������
"�� � ������������������
�� �� � �����
�3� � ���������3�
�33� � ���������33�
��� � ������
���� � �����������������������
�0$� � ����������0$�
0��>� � 0�������������������������������>���� � ���������������
� ��� � �����������������������������
�A� � �����!����
�A�� � ����������A���������������
����� � �������������������������
���� � �������������������������
��� � ������������������
����� � ������������������.���.����
����(� � �������������5��������(%���!�����5�(�
����(� � ������������:���������������������(�
���&� � ���������&�
�;�$� � ��������������������������
���� � �$�:��������&�!����������!������>�
� $��� ���������� $:����������������
���$� � ��������������������%��!��$�
�0$� � �!��������������
��3� � ������������������
���� � �����������������������
��� � ��������������������
�&� � ������������������
�&:���� ������������������������������������������������
�/5/�/� � ����������������������
���� � �����������������������
���:�$"5� �����������������������:��������������������������������
&�����@��� &����������������������:���������������@��
&��:>� � ���!��������������3�
�� �� � ����
;5"$� � ;���������������������-���������
;5"$��� ;���������������������-����������������
I�� � M��������������
��
�
�������>�3������������
�� �� � (�
.,. =���1��0/���
������������ �������� ��� ���������� ��� ���� ������������������� ���� ���������� �������� ��������
��� ���������� ��� ���� ����%� ��� �� ������� .��-�� ��� ���������/� &��� ��-��� ��� ������� ���������%� ��
����������������%� ���� ������� ����������� ���� ��������� ��� ������� ����������� ���� ��������
������������������� 65�����())>8�6$�����>/>8/� 3�� ��������������� ��������%��������������������������
.��-�� ��� ������� ������ ������������ ���� ������/� 5���� ������� ��� ��������� !�� ������� ������ ���
�������������-����� �������������'���������������������>))):&)))�����������������6��������������
>??(8/����������������������������������������������������������������������������������6���%�
$�����>/>8/�&���������������������������� ��� ��������������� ��������������������� ,��������%�-�����
����-� ���� ������������������������ 6P>:(.��8������������!������%� ����������������������������%���
������� ����� ����������� ������������-���������!��'������!�������������� 6A��������������>??)=�
"������������())*8/�"���,���������!��-���������������������������������'��������M������������
�������,�����������������������������M��������������6I�8����������������/�&���������M�������,��������
���������������������������������������������������.������������!�����������������������������
����������������������6$�!������������())>8/�$�,���������������������������������������������������������
.��-�����������������������/�&����������������������������������������������������������������
����������������������������������������������������������������������������������������-����������
��������/�
�
3�� ��������%� ���� �������M���� ������ 67 8� ����� ���������� ��������� ��� ������� ���������� ����� ���
�'������������������6��������������())(8/�&���7 ����������������������������������������������
��������������������������������/��0�����������������������65��8������������������������
����������������������������������������������������������������������������������������������������%�
-����� ��� �'����� ��� ���������� ��� ���� ������/� &��� 7 � ����� ����� ���������� ���� ������� ��� �������
���������� ���������� �������� ��� ����������������� ��������� 6 $8:���������!�� �����������������
6��������������>??(8/�&�������������������������������������:�������������!��-���������������������
���� ���������� ���� ������/� $�� ���� ���������� ��� ������� ���������%� �������� ��� ():����� ���� ��������
���������� ������������� ���� ��������������� ��� ������� 6��������������>??(8�6$�����>/(%��8/��������
���������� ��� ����������� -���� ���� ��������� ��� ������� ���� ������� ��������� ��� ��������� 33/�
$����-��������������������%���������������������������������������������������!��������������
Chapter 1 Introduction
Figure 1.1 Schematic of folliculogenesis, cumulus oocyte complex (COC) expansion and oocytematuration. Folliculogenesis from the primary to the antral stage, whereupon follicles are able to respond to the luteinising hormone (LH) surge, involves granulosa cell proliferation, formation of a fluid filled antral cavity and divergence of the mural granulosa and cumulus cell lineages. Cumulus cells immediately surround the oocyte and mural granulosa cells line the follicle wall. Oocytes remain arrested in prophase I of meiosis during folliculogenesis until the endogenous LH surge or administration of the exogenous LH-analogue, human chorionic gonadotropin (hCG), induce resumption of meiosis and expansion of the cumulus oocyte complex (COC). Following completion of COC expansion the oocyte has extruded the first polar body and reached metaphase II, the COC is ovulated and is capable of being fertilised. Figure modified from (Kimura et al. 2007).
Dunning 3
NOTE: This figure is included on page 43 in the print copy of the
thesis held in the University of Adelaide Library.
�������>�3������������
�� �� � D�
�
�
�
�
�
�����������������������������., �����������������+����������� ����#������������#���������������������,����������� ��� ����� ��������� ��������� ���-���� ������������� ��� ��������� 6!�-�� ��������8� ������������������������������������������ ����������!����� 6�%���������������8%��������E������ 6!8�����>)������6�%�������������8�������������������"����������������������������������/�$��������6��������������>??(8/�
��
!�
��
�������>�3������������
�� �� � E�
������������������������������������������������6������������������������8�-��������������������������
!��������������������������������������������������������/�&���������������������������������������
��� ��������������������� -���� ������� !�� ��������� ��� ������������ ������������/� &��� ������������� �����
�������� ����� ��� ���� �� �������� �� �������������� !���������� ������� �������� ���������� �������
��������%����������������������������������������������������������������������������������������%�
�������������������!��'������!��������������6��������������!.��())C8/�
�
., ���,�/-/� �����0�060 ������;�
., ,. +��������
�
3�� ���� �������� �������� ����� ��%� ���� �,�� ��������� ��� ���� ����� ��� ��������� 6 $=� ���/%�
�������������%�����������8/�������������� $������� �����-����!���� ����7 ������ ��������� ������
������������������� ��������������������������������-���� �������������������������� 6$� 8� 65�����
>?C?!=� 5����� >?*)=� �������� �� ���� >??(8� �� �������� ��-��� ������ 65��86&����� �� ���� >??C8� ���� ���
������������� ����������������������� ������� ��������������������������������������������� 65�����
>?C?�=�5�����>?*)=���������������>?*?=���������������>??(8/�$����������������"�������������� ����%�
$�������������������������� ������������������ ��������������������� �������������� �������%����� ���
���������������������������,������������������6$�����>/(�!8/�0��������������������������������%�
$�����������������!��-����������������������������������������������������������������6$�����>/(�
�8/�
�
��������� ��� ��� ������������ ����������������� 6"$"8� -���� �� ��������� ������������ �������� ���
������������:�������������������0:����������������%������������������������������������������������
��� ������ -���� ���� ����� "$"�� ����� ��� ����������� �� ������� ���������� 6����� ���� ����� >?&D=�
2����������������>?ED=�7����������$����>??(8/�
�
��������� ��� ������������ ��� ���� ��������� !�� ���!���� !����� ��M��%� ��������� ��������%�
-������������������������������������������������������������������������������������!��������
�������� ���� ���������� $������� ������� �����!���� ����� ���� ������������������ 6��������������
���-��M�>?*D=�2������������>??C8/�&������� ������������ �����������������������=�-�$�%�
-�$�� ����-�$J� 63����� ���� ������ >??@=� ���,��� �� ���� >??@=� ������ �� ���� >??C8/� &���� ���-� �����
�������>�3������������
�� �� � @�
������� ��'������ ��������%� !��� ����� ������������ ������� ���������� �������� 63����� ���� ������ >??@=�
���,���������>??@=��������������������>??*=����.�����������())>8���������������� ����������������
����������������63�����������>???8/� ��(�����������!����������������������� $���������������������
���-�������� ���������������-����7 ������������!���� ��������� ������ �������%������������!������
�������������6$�����������>??C!=������������())(=�����������������5���������())&8/� ���������
���������(��������� $��������-��������������������(���>)@��������%� ����� ����� �������������!��
��>��� ��&�63�����������>???8/�
�
$������������ $���������������������!��.!����������-�������������������������������!����!���
���������������� ���� ���� ���������������� ����������������� ���!������������/����-������������� $� ���
����� ������������������������!���������������� ��������!�� �������������� ���6�8���� $� ��� ��������
6��������������������())@8/� ��������� ����!����������������������������������������������������!��
!������� ��� ����� ������� ����������DD� ���� � $��� 6������� ��� $:���������������8%� �������� ���
������� ����� ������ ���� !�������� -����� ���� ������ ��� ������� ��������%� �������%� �����������%�
��������������%� ����� ������ ���� ��������� 6�������� ���� �������� >??&8/� &��� ����������� ��� $� -����
��DD� ���� !���� ���-�� ��� ������ ��������� ������������ ��-��� ���� ����� �������� ������� ����
��������������5!A(� ������/�&������������ ��� �������� ���������������� ���������������������� ����
���������������DD����� $��������������������� ���������������� ��� ��������%� ����������� !������
6�����������>???=�B�.���������())(=�����������������5���������())&8/�3����������%����������������
���������������������-���� $�������������������������������6����.��������()))=�������������()))8/�3��
������������������������������ ������������ $����������������������������� ����������%��������
����� ���������� ��� !���� ���� ����� ���� !������ ��������� ����������� -���� ������� �������������
����������67���������())>=� ����������())(=�B����������())E8/� �-��������������!��-����� $�
��������������������������� �������!������� �����DD� �����!�!����������������� ������� ��������� �
���%�������� -������������������� �����DD�������������� ��������� 6������������� >??C=� ������������
>???8/� &��� !������� ��� $� ��� ���� ����� ������������ $� ������� � $��%� ��� ������� �� ���������
�������/� 3������ ����� �����%� ���� !���������� $� ��� ������ �������� �������� ��������������������������
������� ����������������-����-���� $�!������ $������������� ���������"&������������ ���������
����-�����!���������� $������DD���������������������������������$�����-���6"��������������())@8/�&���
������������� ���������� ��� � $��� ���� !���� ��������� ��� !������ ������� ������ ���������� ����
������������������-������������������������������������ $����������������������!�������������
6����������������5���������())&8/� 3������!�������-�� ������ $���������DD��������� �������%� ���
�������>�3������������
�� �� � C�
���,�������� -���� $%� ��� �������� ����������� ��� ���� 5��><(� ����������� ����-��� ���� �������� ��DD�
���������� 6&���� �� ���� ())@=� ������� �� ���� ())C8/� ;��� �������� ��� -��� ���-�� ����� $� ��������
�����������������������������������������-����!���������������������������������������������
����.����%�-�������������������������������������������������������������� �����%���������������
�������������������������������������������6�������������())*8/�
�
���������������,����������������������������������������������������������������������������
����������������-����-������������������������������������������������������������������������
������ 6$���� �� ���� >??C8/� &���� ������� ��� ������� ��� ���� �����!��%� !��� ������� �������� ��������� ���
�������������/� &����������� $:������������������������ ������������� ��������%�����-���� ����
��������� ���� ��� !�������������� ��� ��� ������� ������� ���� ������ ���� ������ ���������%� !���
�������� ���� ������ ����-���/� &���� ������� ��� !�� �������� ��� ���������� ��� ���� ������� ������
���������/� &������������ ��� �����!��� ��� ��������������� ��!���� ����� �������� ������ -���� Q����F�
6B����������� >?**8/��������� ������������������������� ������ ��� �����!���������� ������������������
������������������������������������������������������!�������������������������������6����������
>??)8/�
�
., , ,�������������+�5��������#�������
�
$�������������������������������������������'������������������������������� $�!���������������
!������������ ������������������������������!�������������������������������������������
������� ������ ��� ���� ����������� ��������/� &����� �������� ��� �������� ��� ���� ������ �������� ����
���!���M������������������������������������������������������:α������������!����63α38%�������������
�����������:�������� ������:@� 6&�����:@8%� ���������&� 6���&8�����;������� �������� ����-��� ����������
!���-/��
�
$% % %$ ������αααα����������� ����αααα���
�
&��� ����:α� ������� ����!���� 63α38� ��������������������������������������������!���� ��������������
������������������������%�-��������������������������������!������������6������������>??@8/�&���3α3�
�������>�3������������
�� �� � *�
�������� ��������� �-�� �������� .��-�� ��� ������ ������� 6 ��8%� -����� ��� ��������� ��� �� �����������
���������6��8��������������������������!�.�����6������������>??@8/������������������������� �����
3α3� ��������� ���� ���� !����� ����������� ����� ���� ���������� �����%� ���� ��� ��������� �����!������ ��� ����
����������������-��������7 �����%�����������������������������������6�����������>??(=���-�����
���� >??E=� ���� �� ���� >??*8/� &��� ������������ ��� 3α3� ����� ���� $:���� �������� ������ ��������� ����
�������������� �������3α3���� $�!����������������������������� ��!������������������!�.�������� $�
6I����������>??E=������������>??@=�0�������������())D8/�A�.���������������������������������������
��������������������������������������������������!����������������������������������������6I������
����())>8/�3α3���������������������������������������������������-������������������������������� �
����%� ��� �����!����������������������������������� 3α3%� $� ��� ��!�������� ������� ����� ����� ���������%�
��������� ��� ���� ���������� ��� �������� ������ ���� ����� ��� ������ ���� ���������� �������� ������
������������� $� 65����� >?C?!=� �������������� >?*?=������������ >??(=�������������� &��������� >??�=�
�����������>??D8/�
�
%!%!%! "�������������� ������������������� ��������������������
�
&������������ �����������:���������������@�6&�����@%����������� ������&�"@8� ���������������������
���������� �'����� �������������������������������� 6������������ ())�8/� &�����@� ���������������!��
��������������������������� �����-���� ���� 7 ������ � ������ ���������������������������� �������
���� ����������� 6������������ >??C�=� B�����.�������� ()))=�!�.���������������� ())>=� ;�����������
())(8/�&�����@�!����� $��������� ������� ���� ���.��������6��������������()))8����� ����'����� ��� ����
������������������ ��������!��-���� 3α3� "������ $�-���� ������������������������������ 6������������
())�=�H����������#����())�=������������())E=����������������())E8/�&����!���������&�����@����!����
$�������������������� "�����3α3���������������!�������������������������������������������"#"�������
6"������ �� ���� ())>8/� �-���%� -�.� ������������� ����� ����� ��������������� ��������� ��� $%�
����!��� ��� ����!������ !������� ��� &�����@� ��� $� 67������ �� ���� ())(8%� ��� ���� ������ "#"� ����������
6!�.����������������())D8�����������������������������������"#"����������� $�����������!������
&�����@����������%����������������&�����@�������������������������.������ $�6#������������())�=�����������
������())C8/�$�����������%������ ���� "����� 3α3���� ��������� ��� $%�&�����@� ����������������-����
��-� "�����3α3�6�����������())E8����������������������������� � ������������������������-���� "��
����������� ,���������������������6#������������())�8/�&������������� ���������������-�����&�����@� �������
"������>�3������������
$� �� � ?�
��������������������������������.������� $�6����������������())C8%����������������������������������"#"�
�����%�!��������3α3%�������������������������������������������� "����� $/�$�����������%�&�����@�����!��
�'����� ��� ���� ������������ ��� ��������� �� ����� ���� �������� ������ 6���������� �� ���� ())C8� ��� ���
����������!���-/�
�
%%&%&%& '�� �����&��' �&��
�
�����������6����8���������������������������-���������������������������������������>)������������
�������������6������������������DE.��� �����M�8�,������!�� ���������������������!�����6A����MM��������
>??C8/�3������������#��J���������������������������������������-��������7 :�������������������������
�������������������������-����������6;�����������())(8/������������������%��������:����������-���� $�
��� ��������������"#"������� 6;�����������())(=���������������())D8/�2�������������������!���� $�
�������%� ���������������� ��������� ���� ��� ���� ������������ ����������������������!���������� ���������
����� ������� ��� �������������� �����!������ 6;����� �� ���� ())(=� �������� �� ���� ())D8/� ������� ���������
���-�� ����� ����� ��������� �������� -���� ���� "�� ��� 3α3� ���� ����� ����� ����������� ��� �������� ��� ����
�������������������!�������������"#"�������6����������������())C8/�&���!������������������&�����@�����
���� �������� ���.����������� ����������������������!��'��������!�����������������������6������������
����())C8�6������>/���8/�&��� �������������������-���� "�%�������!��'����� ������������������� ����� ����
"#"������%�����������������������������������������-����&�����@���������������������������������
��������������� "������������&�����@���� $�6����������������())C8/�
�
%%&%&%( )������
�
;������������ $:!�������������������-��������������������������������6"�8������������/�$���� �
��0$�����!��������������������������������������������������6�""�8������7 �������������-���������
��������������� ����������!���� ��� �����""������ ����5"!��������������"#"�� 6��������������())�!8�
6������>/D�!8/����� ��� ����������������������������;������� ����������������������� � �%� �������
!������������ ����� �����"#"����������������� ����������������� ���� ���� ���������-���� 6��������������
())�!8/�;������� ��������������������� �����������-����� ���������� ������������������������.����� $�
���� ��� ��������� ��� ��������� ���� ����������� ��� ���� �����/� ����������� ;������� ��������� 0:� ���� ":�
"������>�3������������
$� �� � >)�
�
�
�
�
�
�
�
�������.,/�*�����������+�������,�� �������������#���������� ��������������������,�
6�8 ����������������������������������������6 "8�����3α3���� ���������6 $8%�-������������������!��&�����������������������:���������������@�6&�����@8/�&��� "��!�������� $��������������� ����:���.� ���� ���!������ ���� �������� ������ ������� !������� ��� ��������� �� 6����8/� �������������������6����������������())C8/��
6!8 ���������� �������� ���� �������� ��� ���� ��������� "#"� �����/� ��������� ��� ���� ��,��������������������������������%��!������!����"�DD�����������������������������������!���������������������/�����%� "�����3α3�����;�������!���� $��������/������!������������ "�����������������������.�������� $�������/�&�����������������������������������������������������-�./�&���">�����������;�������!����� $���������"���������!�������������������������������������/�$�����>���������;��������������"#"������%�������������������������������������������������������������������!����������;��������"���������-���������������� �������������5����������/��������������������6��������������!.��())C8/�
�������
�����������
!�
"������>�3������������
$� �� � >>�
��
�
�
�
�
�
�
�
�
� �
�
�
�
�
�
�
�
�
�
����������� .,%� �������&� -����.� ��� -����.� ������� �������� ������� �� � �� ������ �� � ����#����������7������������ ��� ;������� ���� $�����>� �������� ��� ������������ ������ ���������� >(� �� �����-���� �""��������������� ��� ��������������������������������������/� 3���������-� ����������������������� 6�8��������������$�����>�6��������������())��8�6!8�������������;�����������6�8���������������������!��$�����>� ��������� ��� ;������� 6�������� ;������� ����������8/� ��$�����>� ���������� ��� ���� �������������������������������������������������������������������������������������������������������6�8/�3�������������������������������;�������������������������������������������������������������"#"�6!8/� $�����>� �������� ;������� ��� ������ ������������� ��� ���� "#"� ������ ���� ������ ����������������������������������������!������ ����������$�����>�6�8/�"#"%�����������������������=��""%�������������������/�
���������� �����������
-����.�
�������������������#��#��
!�
��
,�-����. ����� -����.
����
����
����
����
��
"������>�3������������
$� �� � >(�
�����������!����6"8���������������">�����"�������������%�-�����������������!����"�������������
�����/�&���">�����������������������������!����:��.�����������������!����� $������-�����.�������:
��.����������������67�A����������>??(8/�&���;�������"������������������������'���������������
-���� ���� ��������� ��������� �������� ���� ��������� �-�� ��������� ��-��� ������ 65��8� �������%� ��
��!�����������������������������������������������������������6"��8�������6���������������
>??�8/� &��� "��������� ��� .��-�� ��� �������� -���� ����� ������� �������� ���������� ����������������������
6!����������>???8%������������������������������6#,����������>??D8%���-�����������������6L�������
����())@8����� ���������62��������())(8/�&��������������������������������������;�����������!������
��������-�����������.�����������"�DD�6��-�������������()))8/�;���������������������������.����� $�
���� ������ ��� ���� ���������� "#"� -���� �������� �����%� �� ����� ������ ����������%� �� ������� �����
���������������-�����������!����������"�DD/�3������������������������������%�;������������������������
���������������� ���������� ���������������������� 6I�����������>??*=�B����������>???8%���������������
65���.��������>???8%���������������62��������())E�=�������������())E8/�&���������������;�����������
!������������ !����������� ��� ����"��������� ���������������� ���� �-�����!������������ 6I�����������
>??*=�2��������())>=�L�����������())@8/6B����������>???8�
�
%%&%&%. '��� %�
�
&��� ��������$�����>� 6������������:��.����������������������� 6��������� ����8�-���� ����!���������
����� >� ������8� �������� ;������� ��� ���� "�� ����������� ������� 6������ �� ���� ())>8%� ���� $�����>:
���������;��������������������!�������-�����������������������������"#"��6��������������())��8�
6������ >/D� �8/� &��� ���������� ��� �������� ��� �������� ��� �""�� ��� �������� ��� ���� 7 :����� ���
���������������������������� 6��!.��������()))8%���� 65�����������()))8%���-�6!�����������())�8�
�������� 6A��!���������� ())�8����� �������������������� ���������������������� 6H������������
())D8/� ������������ ��������� ������� .��-�%�!��� �������������������������� ������������ ����""������
�������������������������������6���8�����������6��!.��������()))=���������������())��=�������
������())D�8/�������� ���;������%� �����������������$�����>� ��� �������� ��������������������� ��� ����
��������������������-����������������������������������������"#"������%������!����������!����������
������!������ 6�������������� ())��8� 6������ >/D��8/� 3����������� ��������������������������%�$�����>�
��������� �� ������� ���������� ������� ��� ����������� �������� ��� 5"!� ���������� ���� ����� ����:>�
"������>�3������������
$� �� � >��
����!��������:��.������������� ����":�������/� �&�������������� �������������;�����������������!��
$�����>��������"#"%����������������!�������������������������%��������������!���-�6��������>/�8/�
�
%%&%&%� � ������������������� ��
�
"�����������.������������!����������������!�������6��!�������������>???=�����������())�8�����������
��������������6���������������>??@=�����������������())E8%����� ��� �������-������-�� ��� �������� ����
���������"#"����������� 6���������� ())(8/�&��� ���.�����������;������� !����� ���.������������ �����
������������������� ���������!���������� $� ���;��������������� �������������� �������!��������� ����
"#"� ������ 6���������� �� ���� ())�8/� $�����������%� ��!�������%� ��������:"� ���� �������� ����� !����
����������� ����������������������� 6��������������� >??@=����������������� ())E8�-���� ��������:"������
�����������������������������������������6 ������M:"��M���M�������())@8/�$�������������!��-����
��������:"%� ;������� ���� $� ��� ������������� ��������� ��� ���� ��������� ��� �������� ����� �������
�������� ������ 6$��!��� �� ���� >??C8/� � &����� ����������� ���� �������� ����� ��� ����������������
�����������������"#"��������������������������:������������������������������%�-���������������������
!�����������������������������������/�
�
�,/ ���������� !"#��$%��&! "�" '��
�,/,� !����������������������(���������������������
��
2����� ���� ��������� ��� ���� ��������� �������� ������� �������� 6"#"8������� ���� !���� �����!��� ���
������� �������� �������%� ���� ��������� ��� ����������� ��� ���� -���� ���������/� 2���� ��� ���������� ��� ����
����������� ���������� ��� ��������� ��� ���������� ������������ �����-������������������������ �������������
-���� ����"#"������������ ��� ���� �������!���������!�� ���������� ������� ������������ ��� ������������
������������/�&������������������������"#"�����!�����������������������������������!���������������������
���!�������������������������������!��������������������������6#�������A�������>?C�=�7���������
()))8/����� ��� ������������%� �������������� ����� ������� ���� ���������������������������������������
����������������������"#"/�����������������-�������������������������!������������������6��������
������ ())D8/� $������������ ����"#"�������������������� ����� ��������������� 65����!�������� &�:
"������>�3������������
$� �� � >D�
������>???8%�!��������������������������������6;��������������())(8��������������������������!���%�
����-��������������������!�����������!�������������������6 ����������())D8/�&��������"#"�����������
���� ��� ��������������������������������������/� ���� ��� ���� ���� ������������� ������������ �������������
��-���%��������������������������������������� ������������������ �������!���������'�����������
��������������������/� 3�� ����%���������������������� ���"#"����������������������������������������
��.��� ��������� ������� ������������� ��� -���� ��� ��!��'����� ������������� ������������ �������� ����� ���
�������/�&���������������������������!��������!����������������������M�������������������������������
���"#"�������6&�!���>/>8�&��������������������������������������������������������������������
����������6������������>???=� �M�.��������>???=�2�����������()))=�I����������())>=�;�����������())(=�
������ �� ���� ())�8%� ���������� ������������ 6��!.�� �� ���� ()))=� 2����� �� ���� ()))8� ���� ���������
������������������67���������>??C=� �M�.��������>???=�I����������())>=�;�����������())(=���������������
())D8/� &��� ��������� ���������� ��� ������ �������������������� ������� ������������ ���� �����������
������������������������������������������/�
�
%%&%%%% ������������������ � ������� �������������������
�
�������������������� ���.����"#"������� ������������!��� �����������������������������!������
������������ ��� �������� �����%� -����� ��� ����������� -���� ������� ���������� 6&�!��� >/>8/� $!������� ���
!�.�����6��)�8%�# ���*���+��J%�-���������������������������������%�����������������������%��������
�����������!������������������������ ���������������������� ����������� ������� ��� ��������� 6&�!��� >/>8�
6�����������())>=�I����������())>=�;�����������())(=�������������())�=���������������())D8/������-����
�����������������+��J�����������%��������������������������"#"�������������������������������������
������������������������������������� $�-����������"#"�6;�����������())(=�������������())�=���������
�� ���� ())D8/� � $� ������� ���������� ��� �!������ �������� ���.���� &�����@� -���� ��������� �������� ���
������������������������-������������������������������6������������())�8/����������%��������������
!�.������#�����%�-����3α3�������������������������������������� "����� $������������%������������
�� ���������� -���!�� "#"� ���������� �����%� ���� ��� $� ���������%� !��� ����� ���������� ����
���������������������������������������-��������������6�����������())>=�I����������())>8/�
�
$������������������������� ���.���� ���;������%� ��� �������� ���"#"��������������� ������������%���������
!���������������������������������%�������������M���������������������������;�������������������
"������>�3�����������
$� �� � � � � � � � � � ��>E�
/����,��, ����#����������������,�� ������������������������ ����#�����������������#�������������������������#������� � -����$����
.������.�//�
-����
���/��
�(������!���
.R���#������
�����/�
� ����������������������
.R/�
����������#�����0�
��������# ����
!���������
������������������ +��� )� :� �����������!������ 67�����������>??E=���!.��������()))8�
��������������� ��� @(� 0<�� ������������������� 6 ��������())D8�
0�������������������������������>�6�3�>D)8� 0���� )� :� ������������������� 62�����������()))8�
�������������5��������(%���!�����5�(�65�(%�5�(�������%�������(8� +���1� @C� */E� ������������������� 6 �M�.��������>???8�
D)� )2��������������(2��������������� 0���������� 67���������>??C8� �
���
��#��
����
���
����
������������:���������������������(�6"#L(%����������������(8� +���1�
E� 0<�� ������������������� 6������������>???8�
��� 0<�� �����������!������ 6�����M�������())D8�������������:��.�����������������������6�������������8�-����
����!��������������>�������6$�$�&�:>%��5& >8�
��������(�2���������������(2��������������� (C� �����������!������
�!�����������������!������ 6��������������())E8�
����������������������������������������@�
6&�����@%�&�":@%�&��@8� # ���*� D*� )� ������������������� 6������������())�8�
������>��������!����<!�.�����6$��3%� 3:�)%�3����D%�3���%�#�����&������3���!���%�#&38� ��)�� D�� P>)� ������������������� 6I����������())>8�
DE� (� ������������������� 6;�����������())(8�
����
����
���
����#�
���
��
&���
�����
����
����
�#�
����
��
��
���
����
���
���
����
���������������������
6����������%�&�":>D8� +��J�0�����������S� )� ������������������� 6��������������())D8�
S#�������������������>D���6;�����������())(8����()���6��������������())D8�������""��������������������������������������������������+��J�����������������/�&�!����������������6��������������!.��())C8/��
"������>�3�����������
$� �� >@�
����� !�� ��!������ ���� >)/E� ��� �� ������ ��� �� ����� ������� 6�,�������� �� ���� >??*8/� �-���%� ����
������������������������������������������;������� ���"#"�����������!���������������� ���!����
������������ ���� ����������� ������� 6+��8� .���.��������/��������� ����� ���������� ������� ��� ��
�������������������!����������������6�������������()))=������M�������())D8����������������������������
��� ������������� ���� ��:����� ��!��� ������������ ����� 6�������� �� ���� ())E8� 6&�!��� >/>8/� 2�����
���������������������������������������������������������-������������������������6�����M�������
())D8%� ������ ������������������ ����"#"������� !�� ���������������������� $� ���� ;������� �������
������ ����� ����!�������������!������������������������������� �����������!�������� ������� �����-����
���������� 6�������� �� ���� ())E8/� &���� �!������ ������ ����������� ���������� ;������� ���������� ���
������������������������������������-������������������%�-����!�����������������������������/�&���
��������� ��� ������������������ ��� ��.�������� ��� �����!���������������������"#"������� ��� ������������
���������%���-���� ���� ���.����������������M�������������������������������������������'���������
���������/������������� ���.��������������� ������� 6��8����������������!�����������$�����>�
������E)2���������� �������������������;������� ��� ��������������"#"�6��������������())��8/�&�����
����� ����� ��� �������� -����� ���%� ��� ���� !�� ���� ��� ������� ���������� ��� ;������� ������ ��������
���������� � ��6��������������())��8�6&�!���>/>8/�
�
%%&%%%& 1��� ���������������������������� ��������� ���
�
&���������� ��� ���������������������%���� ������������� ��������� ��� ���� ��������������������������
���������������������������!���.��������������!����������������������6"������������())�=�A����������
())�8/� $�� ���������� �!���%� ������� ����� ���.���� ���� ����������� ������� 6������8� �������� ���
��������������������������������������������������������������������������������������67�����������
>??E=���!.��������()))8�6&�!���>/>8/�&����!����������������������������������������������������!����
�����!�������������������������������6��!.��������()))=���������������())��8/�
�
$!������� ��� ���� �������� ������� 6��8� ���� �������� ����������� �������� ���� ���������� ���� ���
��������� ��� �������������������������������/� 5������������ ����������� !������������� ��� !���� ���
6���������()))=��M������������())�8�����������6 ��.���������())E8��������������/�$��������������
6$8� .���.���� ����� ����� ��� ������� ���� ���� ���� ������ ����������� ����� ���� ���!%� ��������� ���
��������� �������� ���������� ���� �������������� ������� ���������� ���� 6 �� �� ���� ())D8� 6&�!��� >/>8/�
�������>�3������������
"� �� >C�
��������%� �������� ��������� ��� ���� ������� ������� ����������� ������� >� 6#���%� ���������� ������
�3�>D)8%� �� �������������� �������� ������� ��� ����������� ��������� �����%� �������� ��� �����������
���������%������������������������ 62����������� ()))8������!��������������������������������
����������� ���� ��������� ��� ������ ���������� ���������%� �������%� ����%� ���J$� ���!$�
������������:������������ ��������� (� 6�����8%����������%� ��������������� !������������ 6&������ �� ����
())E8/��
�
�������� ���������� ��� ����� ���������� ��� ���������� ��� ������������:������������ ��������� (�
6�����8%� ���� ���:��������� ��M���� ��� ������������� ���������� 62���� ���� �������� >??(=� ������ ����
�������� >??(8/� ������ ���������� ��� ������� �������� �����-���� ���� 7 � ����� ��� �������� ���� �����
��������� ������ 6������ ���� �������� >??(8/� %������ ����� ���.���� ����(� ����� �������� ��������� -����
�������������������������������� ����������������� ����� 67��������� >??C=������������� >???8%�-�����
���� !������!����� ����� ��������� ��� ����������������� ���!� 6������������� ())�8/�&����-�����������
��������� ��� ���� ����(� ������%� ������������� 5� ������� (� 6�����%� �������=� 5�:(8%� �������������
���������!�����������������������%� �������� ������������������������ ����!�����������&�����@� ��� ����
����������6�������������())�8/�
�
3������%�������!�������������������������������������������������������������������������������
���������������������������������������������������������������������������������������������������
6&�!���>/>8/�&���������������������!��������������-���������������������������������������!�����������
������� ��� �������%� �������� ������������� �� �� ���!�������� ��� ������ ������/� �-���� ���� ����������
-���!������������������������������������������������������.��-�/�&���������������������!���������
�����-��������������������������������������!������!���!���������������������������'������/�
�
�,/, '�����������(�����������)��#�������#�����
�
%����-���� ������������%� ������:�������������������������!��� ��� ���� !������������������������������%�
��������������������� �������������� ��� �������� ��� !��������������� ����������������������������%���
'������%���� ����������/�&���������������� ���� � �������������������!����-��������������������%�
�������������������!�������������������� � ���� 6"������ ())(=� ������ ())D=� ����� ������ ())@8/�
&����������������������-����� �����������������������������������������������������������'�������
�������>�3������������
"� �� >*�
6 �������())E=�2������������())C=�����M��������())*8/����������������������������������������
�������������������!�������������-�����������'����������� �������������������������������!����
����������� ����������������� ������� '������� ��� ����� ����� 6A���� �� ���� >?*�=� ������� ������ ())D8/� 3��
�������������%������������������������"**�!����������������6�����������>???8����� $��������������
��� ���������� ������ 6������ �� ���� ()))8� �������� -���� ������ �������������� ����������/� 3�� ���� !����
������� ����� � +J� ���������� ��� �������� ������ ��������� -���� ������� '������� 6I����� �� ���� ())E8/�
�-���%� ����� ���������� -��� ���� ��������� ��� �-�� ����� �������� 6&����M��� �� ���� ())D=������� �� ����
())C8/�&������������������,������� -,��-��������� ����������������������� ���������������������
����� ���������� ����� ��!���� ��� �� ������ '������� -���� �������� ��� ��!���� ��� �� ������ '�������
6&����M��� �� ���� ())D=� ������ �� ���� ())C8/� ����� ����������� ��� ����� ����� ��� ���� ��-� -���� �����
���������������,�%�� -,������ #(�.�!� !�� �������� ������ !����� ��������� -���� ����������������
�������������� ����������� 6$������ �� ���� ())*8/�������%� ����� ���������� ����� ���� ���������� ��� ������
�'����� ��������������������%�������!��'��������������%��������� ��������������������'�����������
��!��'����� ��!��� ������/� &��� ���������� ��� �������� ������ ����� ���������� ���� ������ �������
�����������������������������������������������������������%�����������������������������������
����������������%��������������������������������/�
���
�,3 ���/ 0��� 1'� "�$�
�,3,� "������������������������������ ��� ���
�
2����������������������%�����������������������������������������������������������%������.��-�����
��������������������6";8������/����������������������������������-�������������������7 �����%���
���������������������������������������������������6��"8�6%�����>/>8/��&���� ���������������!��
";� !��.��-�� �����-��� !���������� ��������%�������������� ������������������ �����'��������� ����
����������������������������������3�6&38%�����������-����������������������������������!���/�&����������
������������� �������������33�����������������������������������6&338/�&������'������������-������
���� ��������� ���� ��� .��-�� ��� ������� �� �������� ���������/� &����� �������� ��� ����� ��������� ����
����!������������������/�������������������������33����������������������/�
�
$�� ������� �����%� ���� ������� ������� ���������� 6��������������8� ������ �������������� -���� �������
���������%� �������� ��� �������� ��� ���� 7 � ����/� �-���%� �������� ������ ��� ���� ������� ���� 7 �
�������>�3������������
"� �� >?�
�������62����8%������������������������-�����������������������������������������2�������0$�
6�����������>??>8����������6A�.���.��������>??�8%�-����������������������������������!�������/�&�����
�����������2��������������������������!������������� ��� ��������������������������������� ����
�����%�!�����������'�����65�����������>??C=�"������������>???=���!���������())�8/� ��������������7 �
��� ���!��� ��� ���������� �������� ���������� ��� ��������� ����� -����� %� � ����� 65����� >?C?�=� 5�����
>?C?!8/� &������������ ��������� ��������������������� �������� ��� ���� �������� ������ !��� �������� ����
����������������������� ���� ��������%�-����� ����� �������� ����������� ��� �������� ��������������������
��������������������/�&�������������������� �����-� �������� ������������ ��������� ��������������� ����
7 ������6-������>:������8����5��:��.��65��:78� �������%����������%�����������������!�����������%�-�����
��� �������� !�� ��������� ������ ���� �������� ���� ��������� ������� ��� ���� ���� 6��.� �� ���� ())D=�
��.������� �� ���� ())D8/� &����� ��������� ������������� ��� �!��� ��� ������� ���� ���������� ���� ����
�����������������������������!������������5����������������������!���.������������������������������
7 ������ ��� ������� 6��.�������())D=�$��.���M��������())E8/�%����� ��� ����%� ������5��:7� �����������
�!��� ��� ������� �������� ����������� ����� ��������������%� ���!� ���������� ��� ��������� ���������� ���
�������6$��.���M��������())E8/�A�����������������������������������������������������������������
!�� ��������� -���� 7 � 6%������� �� ���� ())D�=� %������� �� ���� ())D!8/� &����� 5��:7� ��������� ���
�����������!�����������������������������������-�����������������������������������������������������
��������� 67�����.��������>???=�7���������())D8/�&���5��:7������������������������� ��� ������� ���������
�������!���� ������� ����� �'����� ��������� ���� ��� ����������� ��� �������� ��� �������� �����%� ���
���������-����������������!���������!������!���.�����7 ����������������������������������6�����������
>???=�$��.���M��������())E8/�3��������������%���������������5��:7�����������������-�����!�����������
!������$�$&�6$����������������&�������������8���������������������������6�����������>???=� ��.���
������ ())D8/������������������������-�� �����$�����>� ����!��� ��� ������������������������ �������5��:7�
��������� ���������������� ��������!����� ������������������ ����5��� �������5!A:(�67���������())E8/�&���
���������'�����������������������������������5��:7�����������������������������������.��-�%�!������
������������!����� ������������������� ������/����� ��� ������������������������ ������������������ ���
��������������%������������!��������$�����>���������������������������5��:7����������������������������-����
����7 �����/�&���%�������������������������$�����>�����!�������������������������������5��:7����������
������!��'���������������������� � �/�
�
�������>�3������������
"� �� ()�
�,3, "��)������������3"4�5���������
�
&��� � ���� ���������� ������������� �������� ��� �� ������� �������� ��� ��������� ������� ���� �����
��!��������������/�$�����������%� ������������������ ����������� ��������%� � �������������� 63;&8�
��� �������� ��� ��� ���������� ����������%� -����� ������ ������ ���� �������� ���� ��.�� ����������� -����
������ ������� ���������������� !�� �������� ��������� ��� -����� 62���� ���� "���� ())D8/� 3�� ������
�������%� -����� ��� ���������� ������������ ����� ������ ��� ���������� ������������� ��� ����������
��������� ��������� ��-��� ���� ���������� ��� �������� �������� � �� ���� ��� �������� ��� � ����
������������/� �-���� ������������ �������������� ��'������� ������ ��� ���� ������������ ��� �������
������������������������6� ��8%��������������!��������������������������������������������������
-���� ��������� ����������� ����������� 6������.������ �� ���� ())@8/� ��������� ����������� -����� ���
�������� �!�������� ����%�������%� ��������%� �������%� -������ ����%� ����� ������������ ���� ��������� ���
!�����������-�������������������������������������6���������������M��!���())(8/�&�����.����� ������
��������� ��� -����� ������� ����� �)%� -��� ����� !���� ���������� -���� ����������� ������� ��������
6����8�����������������������������������������������������������������������������������%�������
��������������������� 6��"8� 6���������������M��!��� ())(8/� 3�� ��������� �'������ ��������� ���������
-�������������������������.�������%��������������������������������������������������-�����!����
����� ����������/� $�����������%� ��� �������� ���.���� ��������� ��������� -���� ����� ������ ����������� ���
���������%�������-�����������!��������������.�����������������������������/�. � ��������������
����������� �'����������������������������������������������������� ������������� ���������/� � . �
���� ���������� ��������� ���� ������� ��� ���� �������%� ����������� ���� ���� ������ ���������� ����
��������������������������������6����������338����������/� �-���%������������3;&��������������������
��������������� � ���������������'�������62��������"����())D8/�2��������������� � ���������
�������%���!���������������3;&������������������������������������%����������������������!���
��-��� ������������������ �������������������������� ����� 6"����������>?*C=�A�����������>??@=�
"����������>??*=�����������()))=�&�������������())>=�2��������"����())D8/�&��� � �����������������
�������� ��� ��������� ��������� ��� ��������� �������� ��� �������� ��!���� ���� ������������� �������
6"������������&��������())C8%���������������-���������������������������������������������!����
6&��������������>??E=���M���������())(8/�&�������������������������������������������������������������
���� ������� �������� ���� ��� ���� ��-� �������� ����/� %����� ������������� ��� ���� ������ ����������
��������������-���������������������������-�3;&����������������������������������������������������
��������������������������������������������3;&��������/�
�������>�3������������
"� �� (>�
�
#������������3;&��������������������������������������������%� ���5�������������,��������-����
��-��� ������� �������� !�� ����������%� ���� ������������������� �'����� ��� �������������� ���������
�������������65�����>?C?�=���������������>?*?=�5�����������>???=���������������())E8%� ���!�6%�����
������>??C�=�B�����.��������()))8%����J�6;�����������())(=���������������())D8�����������6H�����������
())>=���.�������())D8������/�&���������������������������������������%�3α3%������������������������
�������%�������������������������%�����������'���������������������������������������3;&�6�������
���� >??(8/� &���� ������ �������������� �������������� �������%��� ��������� ��� �������������������%�
�����������������������3;&����������������������������������������������������������������������
�������������������������������������������.��-�����!������������������������������������6��������>/�8/�
3��������������!����������������-���%�-������$�����>�����;��������������������<�������������
������������������������3;&����������/�
�
&��� �������� �������� ���������� �������� ��� ��������� ��� ������� ���������� ���� ��!����������
6"����������>??*=�$����������())E8/�5�!���'������� ���� 3;%���� � ����������������� ������������
-��������������������������������5�&������� 6&����M���������())D=�I�����������())E8/���������
������ ����� ������� �������� ������ ����!������� ��� ���� ������� ����������� 65����� ())E=� ������� �� ����
())E8%�����������������������������������������-�����������������������������'�������6 ���������������
()))=��������������())(=��������������())�8/�&���%�������������������������������!����������������
���� ����������������������� ��������������������������������� 3;&/�2����� ���� �������������������
������������������������������������-�����!���������������������%�������������������������������������
��.��-�/��
�
�,6 �1$� "�$����� 40�0# '��0��1��'��� '"#��
���-�����������������������������������������������������������������������������������������������
.�������������������������������������/�5�����������������65�&8�����������������-��������������������
�� �������������������-���������������������������� ���-�������������������������������/�&���5�&� ���
��������������������������������������!����������������������� ��������-������������������-����
��,������������/�%����������������5�&���������������������������������-��%����������������������������%�
�������>�3������������
"� �� ((�
���!����� ,���������� �������� ����!��!� ������������� ���������%�����������!���������� �����������!�����
���������������������������������M�/�
�
&��������������������� ����������������� ����� �������������������-���� Q����F���������������M��%�-����
����������������������������� ��������� ������������� ���������M�� 6������������������>?@>8=� �����
'������� -����� ����� !�� ���������� ��� ���� ������ ��� ��������� ���� ����:���.���� !��-���� ������
���������/� &����� ��������� -����� ���������� ���������� ��� -��������������� ������������ ������� ����
�����/�3����������%��������������������������������������������������������������������������!������
��������� ����������� 6�������� �� ���� ())C8/� � 5�������� ���� � ����������� ����� ������������ ����
���������������������������5�&�������������������������������������������������������������������������
�������� ������� �� ������ ��� ��������� 6������� ���� ������� >?@>=� &���!�� >?C(8/� ��������%�
�����������-���%�������������������������������!��E)7�����������������������������6��������������
>?E>8%� �� ������������ ���� ���������� ��� ���� ������!��� ����� �������!��� ��� �!��!���� �������� ���
������/��
�
&���� ��������� ������ ���� �����!������ ����� �����-���� ���������%� ���� ������������������ ����� ���� ��� ��
!���������� �����%� ������������ ���������� �������������� ���� ��������������������� ��� ���� ������/� 3�����%�
������������� ��������� ��� ���� �������� ������ ���� ���-�� ����� ��� ����� ��� ��������� ����� �� ����� ��.��
���-�.� 6���� �� ���� >??)8/� $� ������ �������� $:���� ������ ����� ��� ���� ���� ������ ���� !��
��������������� ��� �� �������� ���-�.� ��� ����� !��-���� ���� 5�&� ����������� ������� -����� �����
���������� ����� ������� ��� ���� ��� ������� ������� ���� ������ ��������� !�� �����/� � &��� ������ ���
������������������������������������������������������������������������Q����F%�-�����!�����������
�����������-��������������������������������������������������������6���������8���������/�
�
&��� ����������!������ ��� �������������� ��� ������ ���������������� ������!������� -����� !�� ��������� ���
���������%� �� ��������%� �������� ��� ���� ������� ��� ����������� ���������� �� ������� ��!�������/� $��
�������� ��� ���� ���������� �������������� ��������� ��� ����� �� ����������� ������� ��� ���� ���������
�'��������������������!���������������������������/�&��������������������� $�����������!����������
������ ��� ������������ -���� ��� �������� ��� �������� ����.�� ���� �������� ����� ������� ���� �����������
����-�������������� $���!������6������:&���-����������())D=�������:&���-����������())E=� ������
����())C8/� �-���%� ��������������������� �������������������-��%����-���������� ��� ���������������
��������������������������� ������������ ��������!����� ����%� ������ ���������������������������������
�������>�3������������
"� �� (��
����������� 6 ��������������� ()))=� ������:&���-���������� ())@=� &�������������� ())C8/� &��������
����������������������������������!������������������� $�������������������������������������
����������������������������� ��� �������������� 3;&/� 3�� ����%������������������������������������ �
���� ��� ���� !���� ���-�� ����� ���� �������� ��� �������� ��� ��������� ��� ���� ����������� ��� ��������
6 ��������� �� ���� ()))8/� �-���%� ���� �������� ��� �������� ��� ���������������� ����� ��������
�������������� �������� ����������� �������� ��� �������������� ����������� 6 ��������� �� ���� ()))=�
�������������())(=��������������())�8/�%�������%�-��������������������������������������%������������
������ ����� ����!������� ��� �������� ������������ ��� �������� ������ ��� ����� ��!������� ��� ������
���������� ������� ���������� ��������������� 6A������ �� ���� >?@C=� 7����� ���� A����� >?*E8/� � &���
��������� �������� �������� ��� �������� ������ ���� �������� �������������������� !������ ������� ��
��������� ������� �������/� � 3�� ����������%��������� ��� ��������!��!�����������!������� !����������
�����%�-��������������������� �������� ����������!�� ������������������� ������������������������������
�������������� !��-���� ���� ������ ������ ���� ���� ���� ���� ������� ��� ���� �����/� 3�� ������� ��� �����
�������%� �����-���� �������� ���������� � �� ����� ��� �� ��������� ��� �������� ����.�� !�� ���� ������%�
-�����-��������������!�%�������.�������������%��������������������������,����������������������!��-����
�����������������������������6������������>??D8%�-����������������-��������7 ������6"������������>?C*=�
7�����������>?*@=�"�����������.���>??D=�����:$!��������������())E8/� �-���%��������������������
���������������������������������������!�����������������������������������������������������/��
�
3����������� ����������%� ������������������������ .��-�� ����������������������������/� �&����� ��������
�������%���������������������������������6����������&������>?*)=�5�����������>?*�=�A�������
����())D=�"����������())D8%�������������������������������6%%:&$�8%�-������������������������������
��� ������ ��������� -���� ����������� ����� �������� 6"������� �� ���� ()))8� ���� ��������� �������
�������������� ����������� ��� !���� ������ ���� ���� 6&���� A������ �� ���� ())D=� %����� �� ���� ())@=�
��.�����������())C8/� �$���������� ������� ������������������������� ���� �������-����� ����������� ���
�����������������������������������������������������������������������������������������/��
��
�
�
�������>�3������������
"� �� (D�
�,) ,� 0$ "��� �1$� "�$�� ��� �%�� ��� �$%� 40'�"��$� "$� 40�
�1�1�1���� '"#��
&����������������%�$�����>�����;�����������!��������������������������������������������������
���������� � �� 6�������������� ())��=� �������������� ())�!8/� �-���%� ����� ������������������������
����������������������%��������������� ������������� �����.��-�/�A����$�����>�����;���������������
�����������������������������������������������������������������������������������������������
�������������������������!�����������!��������������!������������/��
�
�,),� �������
�
%%�%%%% 2������'����%� ����� � ���
�
$���������������������%��!��������������������������������������������������������������������������%�
�������������������:�������!��������������������6�������������()))=�&����M�������())D=���������������
())E8/� 2����� -���� ����������� ����� �������� 6����8� ��� ����������� ���� ���� �����������
�������!��������������������������-���������������/� �-���%��������!���������������������������
������������� 5�&�����������%� �����������"�* ,�%� -����� �����-�� ��������� ��� ����%� ������ �����
����.��������� ������������������� ����� ��� ��������� ��� ��������������� ���������� 6H������������ ())D8/�
&���� ��������� ������������ ����� $�����>� ��� ���������� ��� �������� ���������� ���� ��� ��������� ��� ����
������� ������� ����������� ��������� �'����� ������ ����������������%� ���������� ���� ������������/�
$��������������������������%���������������������������������������������������������!������!����%� ���
���%� ������������� ����������'���������������� ����������������� ����������� ���������������� ��� ��������
���������������������/�
�
%%�%%%& '����%���������5����� ����������� �������� ���
�
A����������������� -���� ����������� .��-�� ��������%� ��������������� $�����>���� ��������� ��������
����������%���������%�����:��������������� ����� ����������� ��������/� ������������������������� $�����>�
�������>�3������������
"� �� (E�
�'������������������������������!�������6�����������>???=��������M:&��M���'���������()))8/�3��
��������%�!����������:�������������������$�����>������������%������������>):����%������-��������
7 ������ -������0$���������� ������������� ��� ������������������ ����� 6�������������� ())��8/� ��:
$�����>����������������������������������������������������������������6��������������())��8%�-�����
�������������%�$�����>�!��������������������������������������������������������-���������������
;������� 6�������� �� ���� ())��8� 6%����� >/D� �8/� $�����>� ��������� ��������� ���� !�� ��������� ���
�����������;��������������������������������������6��������>/@/(/>8/��
�
$�����������������������$�����>�����������������������������������%�������������������!����������
��������� �������������������������%�$�����>� ���.�� ���������"�<L������%�!�����������������������
����������������������������������������������-�������������6������������>??D=�#�����������>??D8/�&���
�:�������� &��:>� ����������� !�� ��������� ��� ��������� $�����>� ��� ���� 5�&� ���� �����!��� ��� ����:
���������������������������������6���������&����������>??*=�;�M'��M�������>???=�3����:$�����������
())�8/�
�
&��� �������� ��� $�����>� �������� ��� ���� ��������� ��� ���� ������� ��������� ������� ���� ��������%� �����
����������� ���� ����:����������� ��������/� 3�����������%� ������ $�����>� ���������� ��� ���� ������� ���
�������� ����������� ����� $�����>����� !�� ��������� ��� ������:����� ��������������������������������
��������� �� M���� ���������� ����������� 6�������� �� ���� ())��8/� �-���%� ����� �!��������� �'�����
������������ ���������� �� ������'��� ����� ����� �������������������%� ����� ��� ����!������ ��!������
������/���������������� ������������� ��.���� ��� ����������������������������������������������������
������ ���������%� ����������� ��� ������ ��������� ��������� ���� ���������� ��� ����������� !��-����
�����������������<������������%��������!�!������.�����������������������������������������/��
�
�,), 4�������
%%�%&%% 6�� ������������5� ������������� �������� ���
�
$���������������������%�;������� ��������������������������������������������������������������������
������/� ;������� ��������� ��� �-�� ���!���� �������%� ">� ���� "�%� ��������� !�� �� ������������������
6"$"8��������-����������������������������������������/�����������������������������"$"���������
���������������������� �������=�;)%�;>%�;(�����;��6���������������>??�=�����:I�������������
�������>�3������������
"� �� (@�
I��������� >??D=� 3��� �� ���� >??E=� I�.�� �� ���� >??E8/� $��� �������%� -���� ���� ���������� ��� ;(%� ���
��������������������%�-����;)�����;>�!����������������6��������������())�!8/�3����������%�;�������
���������� ���������������������������� ����"��������-��������7 ������-����;�������������� �����������
����������������������������������������������6��������������())�!8�6%�����>/D�!8/�
�
%%�%&%& 6�� �������� ���
�
&�������������� ������������������������� 6��8�������� ��� ����"$"�����������;��������������-���%�
����������������������!��-���� $�������������� $�����������������������������������������65���.����
���� >???8/�&������������������� �������������������������%�-����� ����!��� �������������� !������-���
������%� ����.����� ���� �����.����� 6�����.:���M���� �� ���� >??D8/� "������������������ ��� �!��� ���
�������� �� ������� ��� ��-��� ������%� -����� ����-�� ���� ������ ��������� ����� ������������ ��� �����
���������������6��������������B���������>??>=�&���.��������>??�8/�;�����������������������������
����������������%���������������-������������������������������������������������������������!������
���<������������������-������������������������������/��
�
;�������������������������������������������%��!����������!��������������������������������62����
����())E�8/�%����������%��������������������������6���8%��������������������������������-�������
���������������������-������������������������������������������������ ������/� &��������������
;������� ��� ������������������������������������������� ����������� ������������������������� �
��������������������������������������������������������-�������������� � �/�
�
;������� ���� ������������ ����� ��� ���� ��������%� ��������� ���� ������������ ��� ������ ������� ���
����������� !��-���� ����� �������� ���� ����� ������ �������� 6I��������� ���� ���������� >?*?8/�
�������������������������;������������������������������:��������������������������">�����"����������
������������6$���������>???=�B����������>???=�2��������())(=�7������������())C8/�$�����>����������
������������;������%��������������������������� � ��6��������������())��8%��������������������������
�����������������:���.��������������������">�����"���������%�-�����-���������������������������������
�!���������;������������������-���������������������������������������������������������!�����������%�
�����������������������������������������/�3����������������������;�������������������������������
������ ���� ����� ��� ����:��������� ��������� ��� ��������� ���� ������������� ���� ���� ���������� -���/�
�������>�3������������
"� �� (C�
�-���%� ���� ���������� !�� -����� ��������� ��� ;������� !�� $�����>� �������� ���� ���������� ����
����������������������������������������������������!�������������/�
�
&���5��:��.�����������������������"������������;�������������������������������6I�����������>??*8�
������������� ����5��� ������� 65���8�������-������������������ ����-���� 6L�����������())@8/� 3�� ����
����%�������������������5�������-�������'��������������������������������������������������������� �
��������������������7 �����/�$��;��������"������������.��-��������������5����%�;�����������!��
��������� ��� ���� ���������� ��� �������� ���������� ���<�� ������� ���������� ������� ���� ����������� ���
�������� ����� 5����/� %����%� ��������� ���� �������� ��� ����� ������������� ��������� ����� ;�������
��������� ��������� ����������� ���� ����� -���� ������� ;������� 6���� �� ���� ())C8%� $�����>� ���������
������������;������� ���������������������-������������� �������������� ����5��:��.���������-���������
������� �������� 6%����� >/�� !8/� A���� $�����>� ���� ;������� ��� ������������ ���� ������������
����������� ����� �������������� � ����� 6%����� >/D8� ���� ��� ������ $�����>� ����!�������� ��� ��������/��
2���� ��� ���� ���� .��-�� ��� ����� ��������� ��� �������%� �� ���� .��� ���������� ��� ����������� ����� �'����
$�����>�����;������/�
�������>�3������������
"� �� (*�
�,8 �1���'/&�4/,� 40�0���$%��"����
&��������������������������������������������������-���� ����������������������������������
��� ������ �������� ���� �!������� ��� �������� ������ ������ ������� ��� ��!��������� �� ����������/� � &���
�������������������������$���� ���0$������-��������7 ������ � �� �����������%����������������
������������������������-����������������������������������������������%�����������������������������
��������������������� ���� ������������������ �������� ���� ������������ ��������/�"����� �������������
������� !�� 3;&� �������� ���� �������������� ����������%� ������ �������� ��� �'����� ��� ���������
-������ ���������������� ��� ���� ��������������������� ��� ������������ ������� ����� ������� �� ���.
of �'���������������������-���������������������������/�
�
���������� �#� ��������� ��� ��������������������������7������������9��� ���#���������
������)��������� ��#������#�����������������,�
�
%�����������������'�����������������������������������������������������������������/�3����������
!��������������-��������������������������������������������������������������������������
�����3;&�����������/�������������������������������������������������������������������:�
�
�� ������� �� ����� ������� �� � ���� ������� ��� ����� ���� �� � ���� �� ����������
�������� ��� ������ ��������� ����5� ��� ������ '����%� ���� 6�� ���5� ���� ����� �� �
�� ������� �������������� ����� ����� �������������������� �%�
�
A����� ��� �������� ��� ����� �������� ��� 5�&� -���� ������� �����������%� ���������� ������������� ��������
�����������������:��
�
�5���������� ��������������)�������,������������������������������������������������������
������������!���������������������������������������������������������������������������!��������������
������� ��������������/� "����� ����� � ���� ���� � �� �������� ��� ����� !���������� ��������
�����������������������������%�������������������������������������������%�������������!�������������
����� ���������������������������/�2������ �������������� ����!��� ������������ ��� �������������������
!����������������/��
�������>�3������������
"� �� (?�
��������� �� ����� ������������ ����� � ����� �� ����� ���������� ������ �����������
������� �������������������������������������� ��5����;������������������� ����� ���
��������%��
5���������������������������#�����,�5��:��.�� ����������������!��������������������������
���� 7 ������������� ����������������� ������������������%� ������������������������������� !�������������
�'����������������������������������������������/��;��������:��������5��:��.�����������������������
5��� ������� ����������� ����-���� ��� ����� �������/� � %����%� ������ ��!������ ����� �����������%�
����������������������;�������!��$�����>%������������������������������� � �%���������������������
���;�������������������������������������������������/��2������;�����������5��:��.���������������������%�
����-�������������������!��$�����>�����������������������������������������������!����������������/��
��������� �����������1��� <��������� ����6�� ����; ����������������������� ��� ��
� ����������������� ��������������'����%�; �������������������� ���� ��%�
�
%���������������������������������$�����>�����;������������ ���������������������-������������!�����
������������� ��� ���� ���� ��� �������� ������ ���������� ��� ������� ����������%� ���� ������������ ���
�������� � �����������������������������������/��
�������>�3������������
"� �� �)�
�
�,= �"����$%�4/,� 40�0���
�,0�"�"��4/,� 40�0���$%��"���
�
4�#� ������O������� ��� ��������������������������������� �����#���������������9��
������������������� ���������#�����������������#������,�
�
&����������������������������������-���������-������������:�
• ���������-������;�����������$�����>���0$������������������������� ��� �������������
������������������������������-���� � ��������������������������/�
�
• ���������-������$�����>�����;���������������������������������������������������
��������������������-���� � �����������/�
�
�
4�#� ����� O� �� ������ �� � �� ��#����� ���� ��������� � �� #����� ��� ��##��� ��
���9��������� ����������� �������������������#�������� ����������"4������,�
�
&����������������������������������-���������-������������:�
• 5���!������������ �������������� ���������������!��������������!������� ������� ������������
��������������/�
�
• ��������� -������ ���� ������ ���� ���� ��� �� !���������� �����%� ����������� ���� �������� ���
�������!����������������������!��������������������/�
�
• ���������-������ ���� ���������� ������������ �������������� ������������ �����-���� � ����
���������/�
�
�
�������>�3������������
"� �� �>�
4�#� �����/O�4������������������������������ ������9�����#���������������#�����
��� ���&����������� ������� ��������,�������)���9��������,��
�
&����������������������������������-���������-������������:�
• "������� ������ ���������� ���������� ��� ;������� ���� $�����>� ���� ��������� �����
�����������������������������������������������������������/�
�
• ���������������������������������;���������������������������������� � �������������/�
�
• �������������������������:�������������������;�����������$�����>����������������������
������ � �������������/�
��
�������(�&������������&��������
"� �� ���
,� �� 0'"�����
5'��������������������������6��"<"�����8�-�������������������������������������������������
$�������%�6������%�0�28/� ��������������������������6��"<������8�-����������������������%�
$�������� 6������%�0�28/���������������$A��-��� �������.���.�� 65����%�������%�&$8/����������
����!���� 6���������� ���������:��!����������:����:�!!��8�-��� ��������� ����&�������� 60��������%�
0�2%� $�������8/� �������� ������� ������� -��� ��������� ���� �$��&5�&� $�������� ���/� 7��/��
6$�������%� �$8/� ������� ������ -��� ��������� ���� "3A��%� 3��������� $�������� ���/� 7��/� 6;3�%�
$�������8/�$����������������-���������������������:$���������/�7��/�6������� ���%�0�2%�$�������8�
������������������-���/�
�
, �0 4�%��
, ,� �������
�
$�������� 6%>��ECA�<@� L��A$������������������������������� ����8� -������������������� >(��:>(���
���<������������-�������������-�����-�����������������!����/�$��������������������-�����������
!������#������������$�������F�����������������������-��������������������������-��������$���������
�������������������������������#������$����������������������������/�
�
, , �����������������������#�����
�
&��������������������������������� � �������������������-���������������()���3;&���������!���-��
������������!���������������������������������������������!���6;����������������>??)=���������
������())E8/�A�����%�����������)� ���������������������������������������%�U>� �������������� ���������
��������������������=�U(�������������� ������������������������������=�U������ ����������������������
����������������=�UD�����������������������������������������6%�����(/>8/�%�����������������������
������������������������6�538�6)/):D/)8�-�������������/�
Figure 2.1 Example of scoring system used to assess cumulus expansion following in vitro
maturation (IVM)
The degree of cumulus expansion of cumulus oocyte complexes (COCs) following 20 h of maturationwas assessed by two independent blinded assessors using a scale previously described (Vanderhydenet al. 1990). Briefly, a score of 0 indicates no expansion with cumulus cells lost from the oocyte andadhering in a monolayer to the culture dish (a), +1 indicates no expansion however cumulus cellsremain attached to the oocyte (b); +2 expansion of the outer half of cumulus cells (c); +3 all layersexpanded except the corona radiata (d); +4 expansion of all layers of cumulus cells (e). For eachtreatment a mean cumulus expansion index (CEI) (0.0-4.0) was calculated. Scale bar = 50μm and allimages captured at equivalent magnification.
b ca
d e
34Dunning
Chapter 2 Materials and Methods
�������(�&������������&��������
"� �� �E�
, ,/ -����#������'����%����������������
�
&����������������������������� ����������>(?��H<�ECA�@���������!��.����������� ��� �����������-���
�����!��� ���������� 6&����M� �� ���� ())D8/� ����M������ ������� 6���������>8� ���� ����M������ �����
6����������8� ������� -��� ����������� ��� �� >(� �:>(� �� ���<������ ������ -���� ������ ���-� ���� -����
�������� ��� �)���/� $��� ������ ����������� -��� �������� !�� &��� #��������� ��� $�������F�� �������
��������������-������������� �������������-���� ����$������������������������� ��� ������������
#������$����������������������������/�$�������>?:((�����������������%������-���-��������������������
-���!������������������������������/�"����������������������-�����������!�����������������������
�0$/� "������� �0$� -��� ��������� ���� ����� ���� !�������%� !�� ����!������ ��� EE��� ��� >� ���� 6>�)���
���.���8� ��� !����� 6>)�&� &��: �7� � � C/*%� CE�&� 0���%� (E�&� 5�&$%� >7� 6-<�8� ���8� �����������
)/>@μ�<μ�� ���������� �/� &�� ���� ��������� �����%� (E)μ�� ��� ������� ��������� -��� ������ ���� ������
�����-��� !�� ����������������� >�%)))��� ��� >)��������/� $������������ ())� ��� ��������%��'������
������-��� ��������� �������-� ��!�������0$�-���������������!���������E))���� ����������!�������
�������/��������������0$�-������������!�������������������>�%)))������()��������/�&���������������
�0$� -��� ����������� ��� >))� ��� ��������:���� (�/� &��� �0$� -��� ���������� ��� �-�� ����������
�������������������������������������������������-�����&�!���(/>/�&�������������������������������
���� Q$�����>� ��(� 6%8F� ���� Q$�����>� ���� 6�8F� -����� �������������� (� ���� �� 6%����� (/(��8/� &�����
����������������������������EC@!����������-��������������-���������(�-���������%����������������
��������������������������-���:������������6%�����(/(�!%�7����>8/�&��������������������������������
����������Q$�����>����6%8F�����Q$�����>����6�8F%�-�������������������>������������6%�����(/(��8/�
$� ���������� (C*!�� -������������� -���� ����� (� -��� �������� 6%����� (/(� !%� ������ (����� D8%� �������
����������� ������� ��� >�(�!�� -��� ���������� ��� ���� �������� ��� ����� (� 6%����� (/(� !%� 7���� (8/� &���
���������������������(C*!��������������������������Q$�����>����6%8F�����Q$�����>����6�8F��������
!���� ��� ���� �������� ����������� ����� ���� Q$�����>� ��(� 6%8F� ���� Q$�����>� ��(� 6�8F� ���������� ��
����M����������������� ������� 6%����� (/(� !%� 7����������� D8/� "���������� ��������������� E� EL�
"�&�'� %������ !����� 6����������������%� $��������%� 0�2%� $�������8� ��&�&���(%� )/E�&� �����
�0&�%�E���������������%�>/(E����������"�&�'���������������� (�����(Eμ�/�������������������������
-���?D��%�E��������� 6>������8=�?D��%�>�������=�@)��%�>�������=�C(��%�>�������� 6�E�������8%�C(��%�E�
��������6>������8/�$�����������������-��������������!���������������������������6��������(/(/D8/�
500
1200
1517
300
200
bp
Mark
er
1 2 3 4
Adamts1+/- Adamts1-/-
a
b
Figure 2.2 Genotyping of Adamts1 mice.(a) Schematic representation of the location of oligonucleotides utilised for genotyping in relation to 3 ofthe 9 coding exons of Adamts1. Adamts1 null mice were generated by targeted deletion of exon 2(Mittaz, et al. 2004). (b) Ethidium bromide stained 1% agarose / 0.5 X TBE gel showing PCR productsgenerated using primer pairs Adamts1 ex2 (F) and Adamts1 ex3 (R) (lanes 1 and 3) and primer pairsAdamts1 KO (F) and Adamts1 KO (R) (lanes 2 and 4). Genotyping of a heterozygous offspring yieldedPCR products as seen in lanes 1 and 2, while genotyping of an Adamts1-/- offspring produced thepattern seen in lanes 3 and 4.
Exon 3
Adamts1
ex3 (R)
Exon 2(homozygous
deletion in -/-)
Intron 1
Adamts1
ex2 (F)
Intron 2
Exon 1
Adamts1
KO (R)
Adamts1
KO (F)
36Dunning
Chapter 2 Materials and Methods
�������(�&������������&��������
"� �� �C�
9��� ,����������������#������������������������#������'����%��������,���
,������
��(������36�7/�5� "����80���?�
����������
���9���
3$��@@@@= ,65�
'�)�����
,������
��(������36�7/�5� "����80���?�
����������
���9���
3$��@@@@= ,65�
,���������
,������
��A��39#5�
$�����>�
��(�6%8�
$"&&$��&��$$&"�$"�&�&�$� 5����(�
6(*?�:(?>E8�
$�����>�
����6�8�
$&���"$"$"&"&�$�$�"&"
&�
5������
6�DD*:�D@?8�
EC@�
$�����>�
���6%8�
&��&�$$"����$����&&""� 3�����>��
6(>*>:(()>8�
$�����>�
���6�8�
&��&"�&""""&�$�$&$�$"� 5�������
6�D*D:�E)D8�
>�(��62&8�
(C*�6��8�
�
�
, ,3 ����������������# ������
�
���������������������������������-������������!�����������������������������������������������
>:(7� 6-<�8� ������� 6������� ���������%� $��������%� 0�2%� $�������8<)/EL� &A5� 6DD/E�&� &��%�
DD/E�&�A��������%�>�&�5�&$�� */)8�����(��<���5��������A�����/�5�������������-�����������
���)/EL�&A5�!��������>));/�&�������������%�EL���������!�����6(E7�6�<�8��������%�E)�&�5�&$%�)/(E7�
6-<�8�!����������!���8�-��������������������>L�������������/�&�������������M����������������������
�������� �0$� ��������� ���� �����-���� �0$� ��.��� -��� ��������%� ���><5���3� ���� �#�>?< ��33�
6"���-�.�%�$��������$�������8�����>))!��������6����������������%�$��������%�0�2%�$�������8/�
"����-����������������������#;���������������������������������������������6����.���>()8/�
�
, ,6 B�������9�������
�
�������� -��� ��������� ��� D:>E7� &��: ��� ���������� ����� 6A��:���� 7�!�������� ���/� 7��/%�
"����������%�0�2%�$�������8�����������������������������������������6�;�%8����!����63���!����:
�%� &�������%� 0���� ����%� 0�2%� $�������8/� $��� 2������ ����� ��������� ��:�������� ������� ���������
-��������.���6A��:����7�!�����������/�7��/%�"����������%�0�2%�$�������8/��
�
, ,) ����������4������������9�������
�
&��!�����-���!���.������&A�&�6>)�&�&���6� �C/E8%�>E)�&�0��������)/)E7�&-����()8������������
�7� 6-<�8� ���:���� ���.� ��� >� �� ��� ���� ���������/� &��!����� -��� ����� ����!����� -���� ������
�������(�&������������&��������
"� �� �*�
����!���������>������������������������7����.<&A�&/�����������!������-��������������>:E)))����
α:$�����>:&&�� 6�������� �� ���� ())��8� �� >:())� ��� α:H����5� 6���������� ������ ����:��5$$58�
6������������())>8/�A�����-��������-���������&A�&���������!�����-�����������������������:���.���
����:�!!��� 3�"� ��� >:>))))� 6&�������%� 0���� ����%� 0�2%� $�������8/� 5�������� ������������������
���������� -��� ����� ��� �������������F�� ������������ 6$������� A����������%� "5� ��������� 7����
��������%����������0�2%�$�������8/�
�
, ,8 -������ ��� ��� ��� �#��������� ��� ��97������� �� '����%� ���
6�� ������������(�������
&%&%9%% '������������ ��2���� ����'�2��
�
%�� ��������������������� �0$� �����!�������� ����� ����!���������������� ������%� ���� ����� �������
���������� &�'� �0$� ���������� 63��������� $�������� ���/� 7��/%� &�� 2������%� ;3�%� $�������8� -���
��������/�&��������%����������-����������������E)���������������������>/)�������������������&�'%�E���
>)L� ����%������������A����%�)/(�&�������0&�%�(�&�&���D%�)/D�&����������%�>:>)���������������
�0$� ���� ��,������ ��� �� ������ ������� ��� E)��� -���� (�/��������� ����������� -��� ��� �����-�%� ?D��� (�
��������6>������8%�?D��%��)��������=�EE����)��������=�@*��%�>������<���.!�6(E�������8/�������������
-����������������"����$����$A3�?C))�������������/�
�
&%&%9%& 2��� �� �����:����� ����
�
����������� ��M����� -��� ��������� ���� ������� ���������� 6$��������%� 0�2%� $�������8/�
&��������%�������������������-����������� �����()����������������������())��:>�������0$%�(:E#����
��������������������������M���%�(��������������������F�������������>)L�A���������������� (��
��� ()��/� �������� -��� ����!����� ��� �� ��� !���.� ��� >:(� ����� ��� �C��� ���� ��������� !�� ������� ����
��������������6(/(/D8�������������������������������������������������������������������/�
�
�
�
�
�������(�&������������&��������
"� �� �?�
&%&%9%& 2��������� ����� ������������
�
%���� ����� ����������� -��� ������� ���� ���������� ��������� ��� ������� �:�������������� ������
��������/�&����()����������������������������>)���������������3����������$�.������������������6�3�%�0�-�
5�������A����!��3��/%�3��-���%�&$%�#�$8�-�����������������!���������C�������)��������������-��������
������/�
�
&%&%9%( '��� � ��� ������+'�
�
3��������� ��������� ���� ������������������-��� ��������������������������������������� �����-���
!�� ������������/� &���� �����������,������� ���� ������� ��� >))��� -���� ()%� ��� -���������'���� ����������
������:��������:�������� 6(E:(D:>8� -��� �����/� &���� -��� ������ !�� ��������� ���� ����������� ���
>�%)))������>)��������/�&����'�����������-�������������-�������><>)������������&�0��$�������
� E/(� ���� �� �������� ��� �������� -��� ������ ���� ������ !�� ��������/� &��� �0$� -��� ����-��� ���
�������������� ���� ���������� ���>����� �������������������>�%)))��� ���>����/�&��������������
-�������������������������������0$��������������� (�/�
�
&%&%9%; 3 ��� ���
�
������������$���� ����������'�������-����������������������������������������%7$"�:�&;�:>���
������ 6�����:$������ ���/� 7��%� ������� ���%� 0�2%� $�������8� ��� �����!��� ��� ��������� E/(/>/>/>� ����
E/(/>/>/(/� $��������� ���� �������� -��� �������� ������ ���� 2�M���� ����� �;� ���������:#�� �������
6����������������%�$��������%�0�2%�$�������8%� �������������������-��������������!�������������
�������������� 6(/(/D8%� ���� ���� ������ -��� ��!,������ ��� ���� ���������� ���������� ������6�8/� &���
������������������-�����!,������ ��� ���� ���������� ���������������������������� ���� �����/����������
���� �������� ���� ��������� -��� ���� �������� ������ ���� &��5������ "��� ���������� .��� ��� ���
�����������F� ������������ 6������ $������� �������%� ������� ���%� 0�2%� $�������8/� 7��������� -���
�������� !�� ������� �� �:>���������� �������� �����:�����%� >��������� &D� �0$� ������� 6������ $�������
�������%� ������� ���%� 0�2%� $�������8%� (��� >)L� 7�������� !����� 6������ $������� �������%� ������� ���%�
�������(�&������������&��������
"� �� D)�
0�2%�$�������8����� ()����()�����������!��������>@������>@�����/�$�����������%������������������-���
�����������������������������/�
�
&%&%9%� ��������� �����1%���� �
�
��������� -��� ���������� ����� ����������� ���������� 5/� ����� L7>� �� A���� �������������� ������
6���������%�7��H����%��$%�#�$8������� ���������������� �����������/�A�����%��������>/E������������
��!���-�����:����������� ���/����������������������������-��� ���-������ ��������>)������'������ �����
�������!�������-���!��)/(������6>/D(&8��:��������������/�%����-��������!����������������>)��������%�
)/>:E)���������������0$�-��������/�&�����!���-�������������!����������������)������������������:
������� �����D(���-����!���� ���DE��������� �����-���!�� ����!������ ��� �-������������� ���/�&���������
-�����������������?))������D(�������������6()�<7��������%�E�<7�������������%�)/E�<7�0���%�>)�&�
&���(%�()�&��������8%�������������>E������������!�����������!���������C���-������������6(�)��8�
���>����/�&��� ����������5/������-�������������7A:$����������6>)�<7� �������%�E�<7�������������%�
E�<7� 0���%� >E�<7� ���8� ����������� ����������� 6>))��<��%� �����:$������ ���/� 7��%� ������� ���%� 0�2%�
$����������������!���������C������>@�����/�
�
&%&%9%9 '��� ��� � ��������� ���
�
������ ����������-���� ���������������:����������������-�����������!����������������������������
�����������������������������2�M����������;�&�������.���6����������������%�$��������%�0�2%�
$�������8/�����������������-������.�����������������������(������7����!����67A%�>)�<7��������%�E�<7�
������ ������%� E�<7� 0���8� ����������� >))��<��� ����������� 6�����:$������ ���/� 7��%� ������� ���%� 0�2%�
$�������8����� ����!���������C���-������������ ���>@������6(E)��8/�%��� �������������%�>/E���-���
������%� !������� -��� ��������� !�� �������������� ��� >�%)))��� ��� >� ������� ���� ���� �����������
������/�&����������-�����������������(E)��������������������������������������-���!���������������
���(E)�����������7������������������������!�� ��������/�$�.����������������������� 6>)��8�-��������%�
������!�� ��������%� ����!������������ ���������� ���E��������%� �����-���!�������������������E)������
0������M�������������������������!����������/�&���!���������������-�����������������>�%)))������>)�
�������/�&��������������-��� ����������� ��� ���������������%���������������>�%)))����������� ���-�
������� ������� ���� ���� ����������� ��!�/� &��� ������� -��� -������ -���� CE)��� ��� ������� 2����
�������(�&������������&��������
"� �� D>�
��������%� ����������� ������ ��� >�%)))��� ��� >� ������%� �����-��� !�� �� ������� (E)��� -���� ����
�����������������(��������/�&���������������-������������������������>/E��������������!����������
���������0$���������������)������������� (�/��������-�����!,������ �������������� ������������������
�����-��� !��������������������������� ��� ������� ���� �������� ��� �������� ������/� ��������� ���������
-�����'������������������������������:�������'��������������������������������/���
�
&%&%9%< '��� ��� � ��������� ���
�
������� ��������� ����������� ���������� ���������� -��� ��-�� ��� �� ����� ������ ��� ������� ������
�������� ��� ����� ������ ���������:���� �������� �0$� ��� ������������ ����� ���������� �����/� � � (��� ���
�����������7����!����67A%�>)�<7��������%�E�<7�������������%�E�<7�0���8������������>))��<��������������
6�����:$���������/�7��%�������� ���%�0�2%�$�������8�-��� ����!���������C���-������������ ���*������
6(�)��8/�%��� �����())���-�������� ��� ����������>))������7A� 6>))��<�������������8����� ����!��������
����!���������C���-������������ 6(�)��8� ��� >@�����/� &��� !�������-��� ��������� !���������������%�
>)%)))��� >)� �������� ���� ���� ����������� ��������/� ��������� -��� �������� ������ ���� ����������
��������&��������������6����������������%�$��������%�0�2%�$�������8�����������������������
�����������/�A�����%��������������!�������-�������������� �����������������������������������������
���� ��� ����� 7����� ��������� -��� �����%� ������ !�� ��������� ���� ����!����� ��� �� �������� ��� ����
�����������������-����������������������!�������������/�0���%�E������0������M���������������-���������
����������!�� ������������� ���������������������������>D%)))��� ����)��������/�&��������������-���
������������������������B�����A��������������������������������>%E))���������������/�&����������
-��� -������ -���� E��� ��� 5��������� �������� -���� ���� ()��� ��� ������� 2���� ��������� -����
�������������� !��-���� -������ ��� >%E))��� ��� E� �������� ���� ������� ��� ���� ���-� ������/� $� ������
�������������� ����� -��� ��������%� >%E))��� ��� >)� �������� ��� ������ ���� �������� �������� ���� ����
-����������������/�&������������0$�-����������-����())������������� (�����������������������>%E))���
��� E� �������/� &��� ������������� ���� ������ ��� �������� ����������� -��� ���������� ������
���������������%�����������������������������������������������(@)�������(*)��/�
�
�
�
�������(�&������������&��������
"� �� D(�
&%&%9%C ��=���� ���
�
��'�������� ��� ��������� -��� �������� ������ A������ &�������� �/>� .��� 6$������� A���������%�
�����!�%� ;3�%� $�������8/� ��'�������� ��������� ���������� ��� >?)��� ��� �������� �0$%� (/D����� ���
���������������%�)/D���&�����������������������&����/>%�(������EL�A���������'��������A���������
(�����()��/������������������������������'��������-�����������-�%�?@��%�>��������6>������8=�?@��%�>)�
�������=� E)��%� E� �������=� @)��� D� �������� 6(E� ������8/� ��'�������� �������� -��� ������������ !��
������������*)������CE7� ����������� 6�<�8%�!��������������������������������� ���� ���������� ���>E�
�������%� �����-���!�������������������>�%)))��� ���()������������� ���������� ��������������/�&���
�������� -��� -������ -���� (E)��� ��� CE7� ����������� 6�<�8� ���� �:������������� ��� >�%)))��� ��� E�
�������/�&��������������-������������������������ ���������������������!�� ����!������������!��%�
-���� ���� ����� ����%� ��� �� ?)��� ����� !���.� ��� >� ������/� �������� -��� ��������� ��� ���� &��������
������������'��������%�������� 63������������&�����������;���������������%� 3&;�%�$��������$�������8�
!�� ��� $A3� �C�)� ��������� ��'������ 6$������� A���������%� �����!�%� ;3�%� $�������8/� ����������
������������-�����������������������-������!���������'������������������/�
�
� �
� �
� �
� �
� �
� #����/ �
����������#��������� ����������������
��#����������%������ ��� ��������������
�������
���������$������������������������������������������������&����������� � ����&��������������������
"� �� � DD�
/,� "$ '�%1� "�$��
3�� ���� �������%� ���� �������M���� ������� 67 8:����� ���������� �� ��'������ ��� ������� �'����� ���
���������� ���������� �������������� ��� ���� ������� 6�������� �� ���� ())(8/� $����� ������ ��� ��������
���������%� -���!�� ������������� ��������� 6 $8����� ������� ����������������������������� 65�&8�
���������������������'��������:����������������������������������������������������6���8�6��������
������������())@8/�&����������������������������������������������������������������������������6��������
���� ��!.�� ())C8� ��� ������������ !�� ����������� ��� ������ ��������� ��� �������� ��� �������������� ���
������ �������������������������������������������������������������� ��������67���������>??C=�
��!.��������()))=�I����������())>=�;�����������())(=��������������())�8/�&��������������������
������������������������� !������������� -������������������������������������ 6A���������� >?*�=�
$��-��������$�!������>??�=������������>??�=�&����M���������())D8/�
%����������� �������������� �'������������������������������������!����������������� ��������
������������������������������-��� ������� ������������ ��� ���������� !�� 7 /� ������������������ (�
6����8� ��� ��������� ��� ����� -��� 6&����� �� ���� >??C=� ��� �� ���� ())D=� �������������� ())E8����������
��������������!�������������-������������������������������������������/�;������������ $:!�������
������������ ����� ���� ��������� ���������� ���� ���������� ��� ���� ����/� $���� � ��0$� ���� !����
���������� ��� ������ ����� ��������� ������ 6�"��8� ����� 7 � ������������ -����� ���� �������� �������
�����������������5�&����������������������6��������������())�!8/��;�������������������������������
!�� !������� $� ���� ���� 0:�������� ���.� ������:������%� -����� �����:�������� �������� �������� -���� �����
������� �������� ���������� ���������� ������������ 6&���� �� ���� >???8%� ������� ��������� �������������
6#,����������>??D8%���-�����������������6L�����������())@8��������������62��������())(8/���
�
;������� ��� �� ��!������ ��� ���� �������� $�����>� 6�� ����������� ���� ����������������� -����
����!���������������� >8� 6������ �� ���� ())>8%� ���� $�����>���������� ;������� ��������� ������ ���
���������������������6��������������())��8/�3����������������$�����>����������������������C)7�
�����������������������������������;�������6��������������())E8�-�����$�����D�����!���������!����������
������������������6��������������())��=���������������())E8/�&��������������������������0$� ���
������������"���������������������7 :�������������6��!.��������()))8%����65�����������()))8%���-�
6&����� �� ���� ())�8� �������� 6A��!���� �� ���� ())�8� ���� ��� �������� ��������� ��� ������ ������
�������6H������������())D8/�$�����>������������������������-����������������������������������������
���������$������������������������������������������������&����������� � ����&��������������������
"� �� � DE�
6&����M�������())D8������������������6A�-�%��������%��������%�����������������������8/�&����;�������
��� ���� ����������<���������� �������������� ���� ����������������������� ���������������������������
���������%��������������<��������������/�
3�� ������ ��������� ����������� ��������%� � ���� ���������� 63;&8� ��� �������� ��� ��� ����������
������������������������������������������������%��������������������������������.�������������-����
��������������������62��������"����())D8/� �-���%������������3;&����������������������������������� �
���������������'�������62��������"����())D8/�2��������������� � ����������������%���!����
������� ���� 3;&� �������� ����� ��������� ��������� ����%� ��������� ������� ��� ��!��� ��-���
�������������������������������������������������6"����������>?*C=�A�����������>??@=�"������
����>??*=�����������()))=�&�������������())>=�2��������"����())D8/�&�����������������������������
�������� ��� ��������� ��� ����������������� ���� ��!���������� 6"���� �� ���� >??*=� $���� �� ���� ())E8/�
5�!���'������� ���� 3;%���� � ����������������� ������������-��������������������������������
5�&� ������ 6&����M��� �� ���� ())D=� I����� �� ���� ())E8/� �������� ������ ����� ������� �������� ������
����!������� �������������������������65�����())E=��������������())E8%����������������������� ����
������� ����������%� -����� �������������� ���������� '������� 6 ��������������� ()))=�������������� ())(=�
�������������())�8/�&���%�������������������������������!�������������������������5�&������������
�����������������������3;&/�
�
3�����������������������3;&���������������������������������������������"����������������������
������� �������������������������������������%�������������� ;����������� $�����>/� � &�����������
-������ ;������� ���� $�����>� ��� ���������� ��� 3;&������ -�� ��������� �������������� ���� �������
�������!���������� � ������ � ���������������������������/��$�����������%�-������������-������
������ ������ ����������� ��� �������� ������� ��� ������ �������� ���� �"��� �����-���� � ��
���������/�
&%& �� 0'"�����$%��0 4�%��
/, ,� "����������������������������������#������
�
%�� 3;&%������-��� ��������� ������:��!�����(�:���:����%>��ECA�<@�L��A$������DD:D*�������� �/�/�
��,����������D3#���"/�������-���-������������������&5&�6������&5&��������������������-����E7�
���������$������������������������������������������������&����������� � ����&��������������������
"� �� � D@�
6�<�8� ������ ����� ����� 6%��8%� )/(E� �&� ������� �������� 6"3A��%� 3��������� $�������� ���� 7��%� ;3�%�
$�������8����������������"�6>))#<��8%����������������������6>))��<��88��������������������������)����
�C��%� E7��(%�?E7���� ���������@���()��� ����������� >))�������������&5&������� �-���������!���
���������� ������������ -���� �������������� ���� 6�����:$������ ���/� 7��%�������� ���%� 0�2%� $�������8/�
������� ���������� ��������� ������ ������������� -���� ������ E)�3#<��� ����!������ ������ %� �
6�����:$���������/�7��%�������� ���%�0�2%�$�������8������<���5���6�����:$���������/�7��%�������� ���%�
0�2%�$�������8���!����5�������%� ������������������/��
�
5������������������-����������� �����-����@�����()������ 3;&�������/� �$����@��� �����������������
�������%� $���� � ��������� ����� ���������� !���� ���-�� ��� !�� �������� ����������� ��� ���� �����
6%����������� >??C!=� ��!.�������� ()))=�������������� ())�=� �������������� ())�!8%� -����� ()��� 3;&�
��������������������� !�������-�� ���!�� ���� ����� ���������������������������������� � ���� 65�����
>?C?!=���-���>?*?8/��"���������)������-����������������0$����������������@�����()������������/�
"����������������� ������ ������-����������� ��� � ���������������!������� �����-����@��%�>(���
6����������8���>@���6������������8���"���������/��. � ��������������-����!�������������:
��!����� ����� ������� -���� �/�/� �������������� ��� ��"� 6D3#8� �����-��� ����� DD� �� !�� ��"� 6E3#8� ����
���������������@�����>(���6����������8���>@���6������������8/���������������"�����������-���
���������� !�� �������� ��� ����� ������ ���������� -���� �� (@:������ ������� ��� ������� �����/� ����� -���
�������� ��� ����� ��������������� ����"��� !����� ����������� ��� �0$� �� ������� ���������/����������
�����6>@����������"8�-������������!���������������������������������������/���������������"���
-����������������������0$��������������������!�������������������������������%��������������-��������
��M���������������� :*)��� ��� �������0$������������������������������2������!����������������
�����!���!���-/�
�
/, , "�������� ����������������������������
�
5�������������������������������������������-����!���������������2����F�������������F�� ��������
����� �������� 5������ ���������%� $�������� $�������/� 3������� -������ �������� ��� ���� ���� ���
�������� ���� ����� ��������� ������ -��� �!������� ���� �������� ���������� ����������� ��������� ���
�������%����-���%�������$�������/����������-������������� ��������������� ��������������������������
-�����������������������������/��������>D��������������������������������6������������D/E��/C�����8%�
���������$������������������������������������������������&����������� � ����&��������������������
"� �� � DC�
�����������-�������!�������������������6��E8%���!�����������6��D8%���������������6��E8/��2�������������
!����� ����� ��������� �����%� ����� -��� ������������ ������ %� � 6>E):�))3#%� "����:%%� ������ ��
������%�������%�0�2%�$�������8����� �����-����*:>D�����%����������-������������������� �������������
�>*��� �������� �!������ !�� ������������ ���������� ������ -��� ���������� ��� ������� �������/�
%����-���� ����� �!��������%� -����� -��� ������������ >)%)))3#� ��"� 6������%� ������%� 0�2%�
$�������8%�������@�������������-�������������������������/�%����-��������������������������������������
*:(������/��$���������������������������������������%�-�����������@)��)7����������������������6C@7����
3��3� ��E%� �� E(7� ��� 3;%� ��?8/� %����� ������� ��� ��������� ��������� ��������� ���� �� ������� ��!���
���������������������������������%�����������!������������!���������*:-��.�/�2���!���������������
����������������������������������������������������������������������������������������/���������
������-��� ��������� ��������� !��������������� ����������� ��������������������������� !����� 3;%�
6��?8%���������������� �����������������!����� 3��3� ��� ���� ��������������-��������� ������ ����������/�
&����� ��������� ����� ����������� �������� ���-��� ��� ������������ ����������� ��� ���� ���������� ���
$,-,.��#%��"�* ,������,�/�&���������������������� -����������������� ����������� �*)���������
�0$�����������-����������/��
�
/, ,/ '��������' 7,�'�
�
&������0$�-������������������&�M���63���������$�����������/�7��/%�&��2������%�;3�%�$�������8%�������
����������F�� �����������%�-���� ���� ������������� C/E�A����"�������� 6$�!���%�$�������A���������%�
�����!�%�;3�%� $�������8������� ������������/� &����� �0$� -��� ����� ������� -���� >#���� �0������� ���
����������F�� ������������ 6$�!���%� $������� A���������%� �����!�%� ;3�%� $�������8/� %���� ������
��������������0$� 6��0$8�-��������������� ���� �������0$� 6�E)��� D))��8������� �������������
������ 6"���-�.�%� �������� �$%� $�������8� ���� ���������� 333� ������ ������������ 63���������
$�����������/�7��/%�&��2������%�;3�%�$�������8/��
�
���������������������������������&:����-����������������������!���������0$���'�������6&�!���
�/>� ���� �/(8� ������ ����� 5������ ����-��� 6�5� $������� A���������%� �����!�%� ;3�%� $�������8� ����
������������!��������"�������6�����:$���������/�7��%�������� ���%�0�2%�$�������8/���������������
��'�����������������������%�$���� %����������-�2�>%������������"�* ,�%�$,-,.��#%���,��
���� -�2�>� ��� ������� ��� &�!���� �/>� ���� �/(� �����������/� ����� ��'������� ����� ������� ������ ;>�
���������$������������������������������������������������&����������� � ����&��������������������
"� �� � D*�
$,-,.��#��������������������������"�* ,��-��������!�������������6�����������())D=��������
����())E8/������ ������&:����-����������� ��� ���������� ���������������������$A3�"���$���EC))�
��'�����������������������6�5�$�������A���������%������!�%�;3�%�$�������8/��3��������������%�(����
��0$� 6�'��������� ��� >)������ �������0$8%� )/(���� ��-������� ������ �����%�>)�����BA��"����
����������-������������� (�����������������������(Eμ�/�$���������-�����������������������������
E)μ&� -���� ���� ���������� ��� ������ ;>�$,-,.��#� �����%� -����� -��� ����� ��� (Eμ&� ���� ������
�"�* ,�%�-�����-�����������@/(Eμ&/������������������������-���E)������(����%�?E������>)����%�
�����-��� !�� D)� �������������� ������� ��� ?E��� ��� >E� �������� ���� @)��� ��� >� ���/� �������� ���������
������������������0$�������������&���M�����������-����������������������������=���������-������
���������������������������������������������/��������%�$���� �������������������������-���
������M��� ��� -�2�>:�������� ������� ���� �"�* ,�%� $,-,.��#� ���� ��,�� ����� ���������� -���
������M������-�2�>������-��������������������������������!����������������������(:6���&8��������
6�/�7���.��5:$A3%���'��������������#���A��������(8� 67���.����������������())>8/��������� ��������
����-���������M��� ��� ��������!���%�-�����-��������� �����!��������������>/�%��������$���� �
�����������%� ���� ������&:���%� ��������!����-����0$� �����"����������"�U���"�>(��� � ��
��������/�%������� ��������!����-���������������"�U���"�@��� � �� ��������/�%��������;>�
$,-,.��#%��"�* ,��������,������������&:���%���������!����-����0$�������������������������
(?�&/�%����-�������� ������&:���%������������� �������������������������������� ���������������������
-����������������������������/�
�
9���/,���������'��� ����,��������(�������
�
"���� �����0���� $����������M��6!�8� ��'������6EF:�F8� $�����������/�
�������� $�$&&�>�%� >D*� &"$&$$"&"&""�"&&&"&""� 0&D))?@(>�
�������� $�$&&�>��� � �����&&&"$&&��"$&"&� 0&D))?@(>�
������ ;�������%� >D�� �&&&"�&�$&�"$�"�$�$&� L&DD**E>)�
������ ;��������� � &"&�$&&"$""��"$&��$� L&DD**E>)�
����� ��(�%� >)D� �$"$��&&�&�$�$&"�$�$$&"$"� 0&D))*(>@�
����� ��(��� � &�$"&&$�$"&&�"���$&"&$$$�� 0&D))*(>@�
-���>� 7>?�%� >)�� &&���"$"&$�$"�$��&&&"$�� 0&D))?)C*�
-����>� 7>?��� � �$�""�&&&""�&&�$&&&&$$�� 0&D))?)C*�
���������$������������������������������������������������&����������� � ����&��������������������
"� �� � D?�
�
9���/, �4����'��� ����,��������(�������
�
/, ,3 B�������9���
�
3���-���������������������%������������������������������"���-����������!�����������������
���)/)E&���������������%�@&���������)/>7�&�����!����������������� ����!����� 6)/>&�5�&$%�E��&�
!��M�������%� )/))E&� �������������������� �������%� >)� 3#<��� ��������� ���� >)μ�<��� ������ ��������
����!���� ���.����� 6�����:$������ ���/� 7��%� ������� ���%� 0�2%� $�������8/� ������� �������������� -���
����������!��A������������ 6A��:����7�!�����������/�7��/%�"����������%�0�2%�$�������8/���������
-����������������� �������!�����������>:E� ���)/D&���������������%�)/>7�A�$�����)/D&�&��: ��%�� �
*/)������������)/)(#<�����������������$A����������!��������>������C��/�&����'������������(>������
-��� ������� ��� ����� ��������/� %�� ��������� ����� �������%� ���������� ��� ���� ����� ����� ��� � ��
������� ����%� ���� ������� '�������� ������� -��� �'�������� ��� ���� �������������� ������� ��� ����-�
������������� �������������!�����������$�����>�����;������� �������� �����������������/���������
-������������!�����:�$"5����� ����!����������������������������������6�;�%8����!����������
�������� (/(/E� ���� ������!�������� �������� ������ ����!������ �������� �������� $�����>� ���� ����
����������� ��������� !�� $�����>� ��������� ��� ;������� 6��5$$58� 6(/(/@8/� &��� !����� ��������� !��
2������!����-���'�����������������������������N�����������6A�����%�����������.%�0�2%�$�������8�
����-�����������������!�����������������������������������/��
�
/, ,6 �����������������
�
"���� �����0���� $����������M��6!�8� ��'������6EF:�F8� $�����������/�
�"�* ,�� �$�$&&�>%� *?� "�$�&"�$$""�"&$""$�� 0&D))@?**��"�* ,�� �$�$&&�>��� � $$"�$&""&&&��$�$&$"�"� 0&D))@?**�
$,-,.��#�6;>8� �;>�%� >((� &"$"$$���&"&$&�"&&&&"$"$� L>E??*�
$,-,.��#�6;>8� �;>��� � �&"$$&�&$&&""$&"$��$$&&$�$�� L>E??*�
-�2�>�� �7>?�%� C?� �$&"��$$$&""$��$$&"&�� 0&D)>DC@��
-�2�>�� �7>?��� � &"�&�$""&&��$&"�&�$&&$� 0&D)>DC@��
���������$������������������������������������������������&����������� � ����&��������������������
"� �� � E)�
&���������������&:��������������������������������������������������������-����������� ���
���������� ���� ��������� !�� ��������� �����:2��� $0�;$� ���� �� &�.��� ����� ���� ����� ������ �����
�������>��6����%��������%� 37%�#�$8/�$���������P)/)E�-��������������������������������������/�%�� ����
������ ���� ������&:��������������%� ���������������������������-������������!��-������������
���������������������������������:����/������������-������������������������������������������������
)/)E/�
�
/,/ '0�1� ��
/,/,� "�������� �� '����%� ��� 6�� ���� �'$�� ��� "4�� )�� �� � ��� �������
����������#�����,��
�
&������������������������������-������������6��������(/(/(8� ������������-������ 3;&������������
-����������/�$����������%�������������� -�������5�����%� ��������� ������� ��������������������
����������6������53���)/*(%�%������/>8�-�������������������������������������������������6�538�-���
�!������ �������� �������-����5"%� 6���<��%��53����/@8%�%� �6E)�3#<��%��53����/D8���5"%�U�%� �
6���<���UE)�3#<��%��53����/D8%�-����������������������������������53�!��-����������������������������
6%������/>8/�&��������������������������� �������� � �������������������������-���������������
�!������������������������!����������6��-���>?*?=�;����������������>??)=���.�������())D8/�
�
5������������������������$���� ���0$�-�����������!��@�����(D:������������������������������@�
�� ��"� ��������� � �� �������� ��� ����� ���� ��"� ����� ������� ����� 6%����� �/(%� �� ���� !8/��
�-���%������ 3;&� ��������� ���@��� �����-������������������ �����������������������������$���� ��
!��%� %�5�������������!�������/��&��� �������������������$���� ����������� ���3;&������-���>)�
����>E:�������-�������������������@�������������������������������@��� � ����"���������/��. � ��
���������������������D)7���-���������������������������$���� �������������"����������������
�������������%�!������������������-������������������/��
�
��!����������������������������������������3;&����������������������������3;&������������-����������/��
�-���%��������'���������������������������������������������������������������������������������
����������-����������������3;&����� � ������������6%������/(��8/�$����������%�����������������
Chapter 3 Altered Composition of the Cumulus Oocyte Complex Matrix During in vitro Maturation of Oocytes
Dunning 51
Figure 3.1 High degree of cumulus expansion was demonstrated with all treatment regimes. Cumulus Oocyte Complexes (COCs) were cultured in the presence of Egf (3ng/mL), FSH (50mIU/mL), Egf (3ng/mL) + FSH (50mIU/mL) or no stimulus (-) at 37ºC/5%CO2/95%air for 20 h. The data is expressed as mean +/-S.E.M. (n = 3 independent experiments).
a
b
b b
Chapter 3 Altered Composition of the Cumulus Oocyte Complex Matrix During in vitro Maturation of Oocytes
Dunning 52
b
a
COC
mGC
Egf + FSH Egf FSH -
eCG in vivo 6 h in vitro maturation
eCG in vivo 6 h hCG in vivo
eCG in vivo
Ada
mts
1 R
elat
ive
mR
NA
Exp
ress
ion
b,c
b
a
a
c
b,c
c
b,c
COC
mGC
eCG in vivo 6 h in vitro maturation
eCG in vivo 6 h hCG in vivo
eCG in vivo
Egf + FSH Egf FSH -
Vcan
Rel
ativ
e m
RN
A E
xpre
ssio
n
a
a
b
b
a a a a
Vers
ican
Chapter 3 Altered Composition of the Cumulus Oocyte Complex Matrix During in vitro Maturation of Oocytes
Dunning 53
Figure 3.2 Induction of Adamts1 and Versican mRNA in vivo but not in vitro in response to 6 h oocyte maturation stimuli. Analysis of mRNA expression in mural granulosa cells (mGCs) or cumulus oocyte complexes (COCs) from equine chorionic gonadotrophin 44 h (eCG) stimulated mice after 6 h of maturation by in vivo hCG treatment or IVM culture with Egf, FSH or a combination of the two. The mRNA expression of (a) Adamts1 (b) Versican and (c) Has2 is normalized to the Rpl19 internal control and presented as mean ± S.E.M. (n=3 independent experiments). (a) Adamts1 and (b) Versican are expressed relative to the calibrator (mGCs treated in vivo with eCG + 12 h hCG), which was set at 1. (c) Has2 is expressed relative to the calibrator (COCs treated in vivo with eCG + 6 h hCG), which was set at 1. Bars with different characters are significantly different (P<0.05).
eCG in vivo 6 h in vitro maturation
eCG in vivo 6 h hCG in vivo
eCG in vivo
Has
2 R
elat
ive
mR
NA
Exp
ress
ion
COC
mGC
d d
b,c
c,d
c,d
a
b
a
Egf + FSH Egf FSH -
c
���������$������������������������������������������������&����������� � ����&��������������������
"� �� � ED�
���@���-�����������������������������%����������������� ����������������������������-���������������
����� �����-�����������������-���%������������������� � ���� ������� ���������-����������5��%�
%� � �� 5��� U� %� � �������������� ��������� ����� ���������� *%� D� ���� @:����� ������������ ���� ����
��������������������(D)%�>()�����()):��������������������������������������������/��&��� � ��
��������������������0$������@��������"����������-���C):�������������������������:���������������
���%�����-�������������������-������������������������5����������3;&�����6%������/(��8/���
�
&�� ��������� -������ �������� ���� $���� � ���������� ��� ������� �������� ����� 3;&� ����������%�
��0$� ������� -��� ��������� ��� 3;&� �������� ����� ()� �%� -����� ��� ���� ��������� ����� �'����� ���
��������� ���������� �������������� � ���� 65����� >?C?!=� ��-��� >?*?=� ��� 7�� %������ �� ���� >???8�
6%������/�8/�5�������������������!����������������$���� ����3;&������-����������!��������������
��� �������� ������� ����� ����� ��"� ��������� ������ 6%����� �/�8/� 3�� �������� ���������� ��� !����
�������� ���� $���� � -��� ��.����� �������� �������� ������� � �� ��� >(� �� 6(>:� ���� >@:�����
�����������8� �� >@� �� 6�:� ���� E:����� �����������8� �������� ��� �������� �����������/� &��� ������ ���
������������$���� ���0$� ����"���-����������������������� ����� �������� ���� ��������� ����������
�����>(�����"�6(�����>/�:����������������8/��
�
/,/, ��� � ���� ������� �������� ����� ��#������ ��� ���������� ��� �������
#�����&���,������������������)���4������,�
�
&������������!���������������0$����������%�-������������������!�����������$�����>%�;�������
��������C).���;��������������������������������!��$�����>��������6��������������())��8/�2������
!�������������-����������������-����()������ � ������������������������������������!�������-�����
!���������������������������������������������� � ����65�����>?C?!=���-���>?*?8/�&����-�����������
�������������"���!���������������������:�������:����������6>(�����>@�����"������������8�����������
���������� !���� ���-�� ����� �������������� ������� �����-���� ���������� � �� ����� ���� �'���������
������� ��� ��������� ��� ����� ��� � ���� ��������� ����� 6�������� �� ���� >??(8/� $!������� �������
��E).��� ;������� -��� ������� ������� �����"�� �������� ����� ��"� >(� �� ��������� 6%����� �/D� �%�
7�����D�����@8�!��������������!�����������������"�������������6%������/D��%�7����>8/�&����-������
�������!�������� �������;������� ����������������-����������������67����(8�������������()���-����5���
67�����8/�&���C).����������������������;�����������!�������������������������������$�����>�
���������$������������������������������������������������&����������� � ����&��������������������
"� ��� EE�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
��������/,/�"����������'����%����6�� �����'$�� ��� ���9������ ��� ����������#������ @� ���������������������,��$�������������0$����������� ����������������������������� 6�"��8����������������������������6����8���������������>(���>@��� � ��!����"������������ ���3;&��������-����5�����%� ����()��/�&�����0$��������������6�8�������������6!8�$���� ����������M����������-���>����������������������������� ��� ����� �� �/5/&/� 6���� ������������ ����������8/� 6�8� �������� ���� 6!8� $���� � �������������������� ��� ��������!����6�"��� ������� � ��-������"�U�>(�����"8%�-�����-����������>/�A���-������������������������������������������������6�P)/)E8/�
a
b
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
� � � � � � �
Ada
mts
1 R
elat
ive
mR
NA
Exp
ress
ion
COC
mGC
eCG in vivo20 h in vitro maturation
eCG in vivo 12 h hCG
in vivo
eCG in vivo 16 h hCG
in vivo
eCG in vivo
Egf FSH -
Ada
mts
1 R
elat
ive
mR
NA
Exp
ress
ion
a a a
b
c
a a a
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1 2 3 4 5 6 7 8
Vcan
Rel
ativ
e m
RN
A E
xpre
ssio
n
COC
mGC
eCG in vivo20 h in vitro maturation
eCG in vivo 12 h hCG
in vivo
eCG in vivo 16 h hCG
in vivo
eCG in vivo
Egf FSH -
Vcan
Rel
ativ
e m
RN
A E
xpre
ssio
n
d
c,d c
b
a
d
c,d
d
Chapter 3 Altered Composition of the Cumulus Oocyte Complex Matrix During in vitro Maturation of Oocytes
Dunning 56
Figure 3.4 Protein abundance of Adamts1 and Versican after IVM or in vivo stimulation. Adamts1 and versican protein were analyzed by Western blot in mural granulosa cells (mGCs) and cumulus oocyte complexes (COCs) after in vitro maturation (IVM) or in vivo stimulation. The equivalent of 21 COCs from 3 mice was loaded for each treatment. For mGCs the protein quantity loaded was equalized to the respective COC sample. The blot was probed with antibodies that detect full length versican (a), the ectodomain DPEAAE generated by Adamts1 cleavage of versican (b), or Adamts1 pro- and active isoforms (c) as described in Materials and Methods. Molecular weight marker sizes (kDa) are indicated to the right of the Western blot. Quantified intensities of each protein are shown in d and e. (d) shows relative intensities of full length and cleaved versican bands. (e) Relative intensity of pro- and active Adamts1. Data shown is from one representative of two replicate experiments with identical results.
e d
0
50
100
150
200
250
300
350
COC
P/hCG12h
COC
P/hCG15h
GC P/hCG12h GC P/hCG15h
Den
sity
X10
6
versican
Adamts1 Cleaved
Vcan
COC
12 h hCG
COC
16 h hCG
mGC
12 h hCG
mGC
16 h hCG
0
50
100
150
200
250
COC P/hCG12h COC P/hCG15h GC P/hCG12h GC P/hCG15h
Den
sity
X10
6
Pro Adamts1
Active Adamts1
COC
12 h hCG
COC
16 h hCG
mGC
12 h hCG
mGC
16 h hCG
100 75
c
b
75
50
350
a
�
in vitro maturation
in vivo maturation
7 6 5 4 1 2 3
COC
44 h
eCG
COC
12 h
hCG
mGC
12 h
hCG
COC
-
20 h
COC
Egf
20 h
COC
16 h
hCG
mGC
16 h
hCG
versican
Adamts1
Cleaved
versican
Pro
Active Adamts1
���������$������������������������������������������������&����������� � ����&��������������������
"� �� � EC�
����������������������������������6��������������())��8�����-��������������������������������������
>(� ���� >@� �� ��"� ��������� 6%����� �/D� !%� 7����� D� ���� E8/� $�����>� �������� ;������� -��� ����
�!������� �������� �����-�������������� 6%������/D� !%� 7����� D����� E�����%������/D��8%���-���� �����
;������� ��������-������������!��� ����"��� 6%������/D�!%� 7����� @�����C8/� � 7�.�-���%� ������������
;������� �������� -������������!��� ��� �������������� ����� ��������� 3;&������ 67����� (� ������
�����������%�%������/D�!8/� � 3������������-���� �����������������������;������%��������$�����>����
*E.���-���������!������� ��� � �������������� 6%������/D��%�7�����D�����E�����%������/D��8/��
&���������� �������� -����/D:����� ��������������� ���� ��:������� 6>>).��8������ >(�����"� � ��
������������ 6%������/D%�7����D�����%������/D��8%����� ������������������ �������������>@��������
��"%�������������$�����>�-����������!��� 6%������/D%�7����E�����%������/D��8/� � 3���"��� ���� ����
�����������������:������������$�����>�-��������������'�����!��������6%������/D��%�7�����@�����C�
����%������/D��8/�A���� ��������������������� ��������$�����>�-����!����� ���������������":�
��������� ����/� � 3���������%������ �������� ������ -������� ������������ �� 5��� ����������� 3;&������
��������������������!���$�����>��������67�����>%�(������%�%������/D��8/�
�
/,/,/ '�'���%� ���612���'+� �'$�� ��� ���� �������� ��� ����� �������
������
�
5�������������"�* ,������$,-,.��#���0$� -��� ������������� ������������������������������
��������������������-����������������������������������/�3������������������������������������
����� �������� ���� >D� ��������%� �"�* ,�%� $,-,.��#� ���� ��,�� ��0$� -��� �!��������� �������
6%������/E8/��&������������������,����0$�-�����������������D/�:��������������������������������������
�������� ����� ��������� ����� ����%� ���������� ���� ������ ��� ����� ��������� ����� ����/� � 3�����������%�
$,-,.��#���0$�-����������������������*/(:��������������������������������������������������������
6%������/E8/� � 5�������������"�* ,����� ����� ��������-�����������!�������������0$� ��� !���������
�����������/�
Chapter 3 Altered Composition of the Cumulus Oocyte Complex Matrix During in vitro Maturation of Oocytes
Dunning 58
Figure 3.5 ADAMTS1, VERSICAN and HAS2 mRNA are expressed in human cumulus and granulosa cells after in vivo stimulation. Real Time RT-PCR analysis of mRNA for ADAMTS1, VERSICN (V1 isoform) and HAS2 in paired human cumulus and mural granulosa cells. The data is expressed as mean ± S.E.M. and normalized to RPL19 (n=14 patients). ADAMTS1, VERSICAN (V1 isoform) and HAS2 are expressed relative to the calibrator (293T cells, human embryonic kidney), which was set at 1. Asterix indicate significant difference (P<0.0005).
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
CSPG2/Versican ADAMTS1 HAS2
Cumulus Granulosa
Rel
ativ
e m
RN
A E
xpre
ssio
n
*
*
Versican (VCAN) ADAMTS1 HAS2
���������$������������������������������������������������&����������� � ����&��������������������
"� �� � E?�
/,3 %"��1��"�$��
&�������������������� � ������������ �������� ���������� ��������������������%� ����������������������
����������������������������"������������������������������������������������-���������������
� ������������6���!������������())(=�2��������"����())D=����!������������())E8/�3�������������
������ -�� ����� ���-�� ����� ������ ����� ������� !�� 3;&� ��� ���������� ��� ���� ������ ����������%�
$�����>�����;������%����������!��������������� � �/��
�
&����������������������������$���� �-��������������-������@��������-������"���������������!����
�������������"�����������������������������>(�������@:>(��������������������������������������
�"���6��!.��������()))=���������������())�!8/� �-���%����������������������3;&����������@���
()� �� ���-� ��� ������������ ���������� ��� �������� �� $���� � ��0$� ����� %� � ���<�� 5��� ���������
�������� ������������ �������/� &�������������� >):E))� ����� ��-������������ �������� ��������
������"<>(�����"������������/�&��������������������������� � ��������������������!�����������
����� ���������� ��� �������� ����$���� � -����� ��� 3;&� -���� %� � ���<�� 5��� �������� ����� ������ �����
���������� ������������/�&��������3;&���������-��������������������������� ��������������������0$%�
�����'��������������6��������������())E8/�� ��(�����������-�������������������@��3;&�����������
����������@��������������� � ������������ ����� ����������� ����������������������������� ����������
����-����-����������������������3;&�����������/������������������!�������������������������������
$���� %�������������������������� ��� �����"�� ������������������������������� � ��6��!.����
����()))=���������������())�!8/�� �-���%����� �������!����������������'�����������������������������
���������� ��������� ����� ����'������������������� ���������������� ���-�����!����������-�����������
����������������/��2��������-���%�����������������������.��������������6��"<>(�����"8�������������
$���� � ���������� -��� �������������� ������ ��� �"��� ����� ����%� ����������� -���� ������ �����
������������������������������������7 ����-�������������������������������������������������
6��!.�������� ()))=� ������������ ())D!8/� � &����� �-�� ����-�������������������������"�����������
������ �������������������� ���������� 65�����������>??C=���!.��������()))8/� �%�������%�����������
������� ��� ��:$�����>� ������� ������������� �������� ��� �"��� ���� ���� �������� ������� ��������
����������� �������� -������������������� ���������� ������� 6�������������� ())��8/� &������������
������� ���������� ������"������ ������������������$�����>����������� ��������� ���������� � �/�2��
��������������!����������������$���� ����7 :������������������������������������������"��%�
!������������������������������ � �/���
���������$������������������������������������������������&����������� � ����&��������������������
"� �� � @)�
�
$���� �@� �� ��"� �����������%� ������ $,-,.��#� ���� ��,�� -��� ������������� �������� ���������
�����/� &��� ������� ��� ������ $,-,.��#� ���������� ������� ��� ���� ��������� ���� ����� ��� ������
���������%�-�������������!�������������0$�������� ��������������������������������/�&��������!��
���� �������������� �������������� ������������ �����-�������������������������������������������� ���������
��������� ����������� ��� ��������������� ��� �������� ���������� !��-���� ������ �������� -���� ;�������
!����� ������������� �������� ��������� ��� ������ ���������/� 3�� �������%� �"�* ,�� ��0$� -���
�'��������� ��� !�����������������������"��� �����-���������������%�������� ��� �������������� ���������
���������/� �������%� ����������������������� �����$�$&&�>�����;5��3�$0���� ��������� �������������
����������������������������������%�!���-��������������$,-,.��#������"�* ,���������������
����������������������������3;&��������������������������/�
�
&������������������������������������ � ���������������������!��������3;&��������������������� �
������������������������������3;&�������������������������������������������������������������
������������������!��������������������'����/�2������$�����>�����;������������������������������
������������������������%����������������������%������������.��-�%�!���������������������-������������
����������� !�� -����� ��������� ����/�%�����%� ��� ��� .��-�� ����� ;������� ������������� ��-��� ������
������� ������������ 62�� �� ���� ())D8%� ���� ����� ;������� ���� ���� ��������� �������� ����� 5��:��.��
�������������������6L�����������())@8/�$�����������%�$�����>�������������������������-��������������������
;5"%�%� %"%�� ���� ���� 5��:��.�� ������� 67�'��� �� ���� ())�=� 7��� �� ���� ())@=� ����� �� ���� ())@8%� ����
���������� ;������� ������� ��� ���� ����������� ����� 6���� �� ���� ())C8/� 3�� �������� ����� $�����>�
�������� ;������� 6�������� �� ���� ())��8� !��� ���� ����� ���� ��� ������� ��������� !����� 5��� ����
������������ ��������������� ��� ����� ������ 67��� �� ���� ())@8/� &��� ���������� 5��:��.�� ��-��� ������� ���
������������������������'�����������������������������������6��������-�!����������������!.��())C8/�
&���%������������������������������:�����������������������������!����-������������������!���������
$�����>� ���<�� ;������� ��� ��.���� ��� !�� ����������� ��� 3;&� ������� '������/� ��������%� ;�����������
��������� �������� ��������� ��� �������� ������� �������� 6���8� ����������� -���� ���� ������������
��������� ����� ����� ������ ���������� � �$� ���� ������ 3;&� -���� ������� ����������� ����� ��� ���
�������� ��� ���� -����� ��� !������ 3;&���������������� ������������!��������������� 67������������
>??@=� ���������������()))8/�&��������������������������������������;������%���������!�����������
������� �������� 62�� �� ���� ())E�8%� ���� ������� �������� ������ ���� �������� ���� �������� ��� ����
�������/�
���������$������������������������������������������������&����������� � ����&��������������������
"� �� � @>�
�
���������������-������������������������ � ��������������������!����$�����>�����;���������0$�
���� ������%� ����.�� � �� �����������/� � ����� � �� ������������ �������� ������� ������
������� ����%� ��������� -������ ����� ���������� ��� ���������� ��� ������ 3;&� ����������� ������� ��� !��
�������������������/�&������������������������������������������3;&��������������.������������!����
�����������������������!���������������3;&/��&���������������!��-��������������������������.��
����������'����������-�����������������������������������������$�����>�����;����������3;&������������
������!,��������������������������/�
�
�������D����������������&�����%���������������������&�����������������������
"� �� � @��
3,� "$ '�%1� "�$��
2����� ���� ������������ ������������������������������������6���8������� ���-���������!��� ��������
�������%���������������������������������������!����'������������������$�&%�������������������������������
���� -���� ���������/� ��� �������� ������������� ��� ���� ����������� ����� �������� ���� ���� ������ ���
��������� ������ ���������%� ��� �������� ������� ���� �������� ���� ��� ������������/� �-���%� ���� ���� ���
������ �������������������� ��� ������������.��-�/� &����������������� ������������������ ��� ��������%����
�����������!������ �������� -������������������� ��� ������ �������������� �������� �����������������
�������������������������6&�!���>/>8�6������������>???=���!.��������()))=��������������()))=������
������())>=�I����������())>=�;�����������())(=�&����M�������())D=���������������())D8/�&�������������
����������������������!��� ������������������������������������� 6������������ >???=� �M�.��������
>???=�2�����������()))=�I����������())>=�;����������� ())(=�%�����������())�8����-������� �������
���������� ����� ����������� �� .��� ���� ��� ������ ��������� 6&�!��� >/>8/� %����� ��� ����%� ����� ����!���
������������ ��������� ��� ������������� ����%� ���� ��� ����� ������ ��� ���� �������� ������ !����� �� ��������
����������� �������� �����������/�$�����������%���������������%�����������������������!������ ���������
���������!�����������������������������'������/�&��������������������������������������������������
���� ���������� !�� -����� ������ ����� ���������� ��� ������ ������ ������ ��� �������� ��������� ��� �������
��.��-�/��
�
&��� ���������� !��-���� � ���� 63;&8� ���� � �� ������� ���� ������ 6������� �8%� ������� ����
����������� ���������� ���� ����������������'���������� ������������������ ���������������!������ ��� 3;&�
����/�&����!����������������������������%�$�����>�����;��������������������������-���� � ��
���������� !��� ���������������!������ �����-���� 3;&� 6��������8%� ���� ��� ���� ���������������������������
��������������������������������������������������'��������������������3;&������/�
�
�������������������'����������������������� $�!����������������65�����>?C?�=���������������>?*?8�
������������������!����������������������������.���������������������������������������������-������
����������� $���!������6������:&���-����������())D=�������:&���-����������())E=� ����������())C8/�
$�� ���� ����� ����� ��������� ����������� �����!������ ������ ���������� ����-�� �� ����� ������� ��� !�����
������������������ ������������������ ����� ���� ��������� 6����� >??E=���������������� ())�8/� � &��������
�'����������������������������������� !���������������� ��� ���� ������������� $�������!��'�����
�������D����������������&�����%���������������������&�����������������������
"� �� � @D�
�������� ���������� ������������ ���� ���������� ��� ������ �������� ������� ��� �������/� 3�� ��������%�
�������� ����!��� ��� �������� ���� ��������������� �������������������������������������������������
�����������6 ���������������()))=��������������())(=�������:&���-����������())E=�������:&���-����
������())@8/� �-���%��������������������������������������������������������������������������������
�������������������������6 ���������������()))=��������������())(=��������������())�8/��
�
&��� ����� �'�������� ��� �������� !�� �������� ������ ���� ���� ��������� �������� ��� ������ ��� �������
���������������������������������������������������������������������%�������������������������������
����������������������������������������%����������������������������������������������������������
����������!������%�!��������������������������������������/�3������������������������%������-������������
���������� � �� ����� ����� ��������� ���������������.�� !�� ����������� 6������������ >??D8/� &��������
����������!�������������������������������������������,���������!��-���������������������������������
6������������>??D8%�-����������������-��������7 ������6"������������>?C*=�7�����������>?*@=�"�����
������.���>??D=�����:$!��������������())E8/�2��������������������������!���������������������������
������� ������������� ���������� ������������ ���� ������������������ ����� ������������������ ��������
�������������� �������������������������������������������� ��������������������� ������������������
���� ������/� 7�������������������� -���� .��-�� ����������� ����� ��� ����������� �������� �������%� ��������
����������� ���� ��������%� -����� ��� .��-�� ��� ��������� ������� ���������� 6������ ���� &������
>?*)=�5�����������>?*�=�A�����������())D=�"����������())D8������������������������������ 6%%:&$�8%�
-���������!�������-�����������������������������������������������-����������������������������
6"�������������()))8����� ���������������������������������������� ���!������������������ 6&����
A������������())D=�%�����������())@=���.�����������())C8/�7����������������������������������������
��� ������ ���������� !�� ���� �������� ������ ���� ����������� ��� ��������� ������� ��!������ �������
�������������������������������������������������������������������������/�
�
$�� ������������� ��������������������������������!�����������������������������������������������
����/� &��� ������ ���� ������������� ��� ���� �����%� ���� ������� ���� ����-�.� !������� 6������� ����
������� >?@>8/� &��� ������ ��� ����:���.���� !��-���� ������ ���������� -����� ������������� ����������
����������������� �����������'������������ ��������-�./�A���� ���������������-������������������ ����
�!������ ��� ������ ���������� ��� �������� ������� ���� �����%� -���� ���� ������ ��� ���������� ��������� ���
�������� -���� ���������� ������������� ��� �����/� 3�����%� ��� ��� � ���� ������ ������%� ��� ���� !����
������������ ����� ����������������������������� ������� ��������������������� ��������������������
�������D����������������&�����%���������������������&�����������������������
"� �� � @E�
���������� ��������� 6������������������>?@>8/�&���%����������������������-�.�����������������
�!����������������������������������������������� ����%�-�.������������������������67������>??E8/�
%���������%������������������������������%�������������� ��-����������-��������������%� ����������!��
E)7� ��� �� ������ ��� ����������� ��� �� ������������� ����� ��-�� ����� ����� ������� ��� ����� ��������
6&���!�� >?C(8/� $������ -���� ����!������� �������� ��� ���� �������� ��������� ��� ���� ����!��%� ��
���������������������������������;�������6�M���������������())(8%�-���������,����:��.���������������
���������� ��� �����!���� ������� ���� ���� ������!��� ������ ����� ����������� 6 ��M��� ���� �������
>?**8/� &��� ���������� ��� �������� ������� ���� �������� ��������� ��� E)7� ���-�� ����� ���� ���������� ����
�������-����6��������������>?E>8/�&����� � �������� � ��������������������������!���������������
����������������������������������������������!������%�������������������������������/��������!��������
���������������%�3����������M�����������������������������������������������-�.�-�����������������
���������������������������������������������/��%�������%���������������'�����������������������
���������������������������������� ��������������������������������������� ��������������'���������
�������� ������� ��� ����!������ �������������/� &��� ���!�������� ��� ��������� ���������� ���� ���������
�������������������������������������������������-�������������������������������������-������������
������� �������������� ��� ���� ���� ������� ���� ��-�� �������������� ��� ���� ������/� &�����%� 3�
���������M��������������������������������������������-�����!������������3;&�����%���������������.����
.���5�&�����������/��
�
3� ������������� ��������������=�����������������������%� ��� ����������� ��� ������������ � ���������
�����!����������������.��������������������!����������������!������������������������������������
�������/������������-��������������������������.������������������������� ���������������������
.��-�� ��� ���������� �������� ���������� ���� �������������� ����������� ����� ��� ����������%�
��������%� ������������������%%:&$�/� &����������� -������������������� ����������������� 3;&�
������������������������������%����������������������������������-��������������3;&������� � ��
�����������/�#�������������������������������������������������;����������������!��$�����>�
������������������������������������������������-��������������������/�
�
3, �0 4�%��
3, ,� "�����������������������������������#������3����5�
�
�������D����������������&�����%���������������������&�����������������������
"� �� � @@�
����������������������������������������������-���������������������!��������������(/(/�/�. � ��
������������-����!������� ���� ���������:��!�����(>:(E:���:�������������>���������������������
������� -���� �/�/��������������� ��� ��"� 6E3#8� �����-��� D*� �� ����� !�� ��"� 6E3#8/�&���� -��� ������� !��
�����������������������>@����������"%��������-���������%�������� ������������&5&�6α&5&�������
������������� -���� E7� 6�<�8� ������ ����� ����� 6%��8%� )/(E� �&� ������� �������� 6"3A��%� 3���������
$�����������/� 7��/%�&��2������%�;3�%�$�������8����� ����:������������������������ ������������� !��
!���������������/�%�� �����������������������������%������-����������!�������������������������>>���
����� ��"%� ������� -��� ������%� ������� ��� �������� �������� ���� ������� ����� ��������� &5&/�
�����������������-��������������������������������!��������������������(C:������������/�3�������
���������������� -��� ��������� ��� ���������������� ��������� DD����������"�������������������
������������������������!����������.�������������!,���������3;&/�%�� � �������������%������������
�������������-���-������������������&5&�������������������������>)�����C��%�E7��(%�?E7����
���>@������>))������������������&5&������������������E)�3#<�������!������������%� �6�����:
$���������/�7��%�������� ���%�0�2%�$�������8��������<���5���6�����:$���������/�7��%�������� ���%�0�2%�
$�������8���������-����������������������6�����:$���������/�7��%�������� ���%�0�2%�$�������8/��$����>@�
�����������%���������������-������������6��������(/(/(8������������������������������������!������
����.��������/��
�
3, , ���9�����1#�?�������
�
N�������������������-����������������������������������������������������.�������������������!������
��� ����� ��� ����!������� -���� ����������� 6�������8� ���� ����������� 6����������8� ��������� ����������
���������������!���������������/��
�
(%&%&%% �������4���<��'���
�
$� ���������M�!��� ����������� �������� �������� 6@:60:6C:����!��M:(:���:>%�:���M��:D:��8�����8:@:
������������=�@:0A�:"������%�3���������$�����������/�7��/%�&��2������%�;3�%�$�������8�-�����������
������ �������������-�����������!�������!��������-����������� ������ ��������� �������� ��������������
�������D����������������&�����%���������������������&�����������������������
"� �� � @C�
�����������������������������������!������/��@:0A�:"�������-����������������������������&5&������
-�.��������������������>))μ&/�
�
$����������������������-���������������� ��� �������������������������������!���������.��������
�������.����������������������!��� ���������� ����� ��� ��!���������� ���������������������������� �
�������� � ��������������������������/� ������-���������� ���(E)μ7������-��������������
&5&������������>))μ&�@:0A�:"����������� ����!���������C��� ���)%�(%�C���>E��������� �����-���!��
����������E))μ7���������-������������&5&����(��������/��3����������������������������-���������
��!������������������������!������!���!��!���������������!��-���������%�������������������������������
-������������������������������!��%�!����������������������-���������������������!����������������
�������� ���������������������/���������� ��!���������������������@:0A�:"�������-��������������>E��������
��������������������������!��������-���!����(��������-���<�����������/�&���������������-�������������
����������� ��� �������������!�������.����� ������!������!���������� �����-��� ������-���� ������������%�
������������������������������������������������������������������������� � ������ � ���������
�������������������������6%�����D/(8/�
�
(%&%&%& �����������4���<��'���
�
%������������ ��!������ ����������� 6((:60:6C:����!��M:(:���:>%�:���M��:D:��8�����8:(�%(D:!����:E:
������:�:��=� � 0A�:����������%� 3��������� $�������� ���/� 7��/%� &�� 2������%� ;3�%� $�������8� -���
������������� ��� �!������� �������� ��� �� ����.� ������������� ��� E��<��/� &���� -��� �������� ��� �� -�.����
����������������Eμ�<���������������&5&/�
�
$��-�����������%��� ���������������������-�����������-��������������� �������!����� ����.�����������
����.����������������������!�����������������������!�������������������������������������� � ����
���� � ��������������������������/������-���������� ���(E)μ7������-��������������&5&�
�����������Eμ�<���0A�:��������������� ����!���������C������)%�>���(��������������-���!������������
E))μ7���������-������������&5&����(��������/��
�
$������������-�����������%�-���������� ����������� ����-��������%� ��!����������������� ����!��� ���!��
�!��!��������������!��-���������%�������������������������������-������������������������������!��%�
�������D����������������&�����%���������������������&�����������������������
"� �� � @*�
!����������������������-���������������������!���������������������������������������������/����������
��!���������������������0A�:�����������-��������������(����������������������������������!��������-���
!�� �� (� ������� -���<������ �����/� &���� ����� ������ -��� ������� ��� ����������� ��� ������� ������!���
����.�����������!������!���������������-���������-����������������%���������������������������������
����������������������������������������� � ������ � ����������������������������������6%�����
D/�8/�
�
(%&%&%& E���� ��� ������������ ���4���<��
�
3��������������������-���������%������-�����������!������������ ���>����-�����������������
���� ���������� ��� �� ��������/� 3������ ��� ��������� -��� �������� -������ (��������� �����-���� ����
-���<������!���������������������-�����������������������������������%��������������������������/��
&��� ������ ��� ������ ��� -����� ���� ������� �������� -��� ������� -��� �������� ��� !�� ���� ��������� ����
�������� ���� -��� ��������� ��� �������� ���� ��������/� �%�� ����� ��������� ����� �≥� >C������ -���
���������������������� ����������������������/� &������������� ������������ ������������ -���
'���������� ������ ������3�� ��� ����-��� 6�������� $�������� ���/� 7��/%�&�� 2�����%� ;3�%� $�������8/� $�
�����������������6��38%������������M�%�������������������������������������������������������������
�������������������������������������������������������-����������������������������������������
���������������������������������������������������6%�����D/>��8/�$��������������3�-����������������
���� �����������������/� &���������� ������������ �������� ������ ������������� ���� ��3� ��� �������
������� ��� ������� ������ ��� ���� �������� ������������ ���������� ��� >/((μ&� ���������/� %�� �����
��������%� ���������±��/5/&/�-�������������� �������������������������������������� ����������
����������������������������������������������������6%�����D/>�!8/�
�
&�� ��������� ���� ���������� ��� ����������� ��!��� ������������ ���������� ��������%� ���� ������� 6U<:
�/5/&/8� ��� ���� ���������� ������� ���� ���� ��������� >)� ��� ����� ���� ��� ���� ��3� -��� ����������/�
��������%� ��� ��������� ����������� ����.�� ������������� ��� �������� �����%� ���� ������� 6U<:�/5/&/8� ���
������������ ����������-�������������� ��� �����������������!��-����>)):>>)�����(D):(E)���� ����
��3%� �-�� ������� ������ ����� ��� ���� ������� ����� ���������� �������� �����%� ��� ����� ���/�
a
b
Figure 4.1 Example of quantification of fluorescence intensity across a cumulus oocyte complex
(COC).
Oocyte and cumulus cell metabolite uptake was quantified using confocal images of COCs andAnalysis Pro Software (Olympus). (a) Example of the quantification process, measuring the distributionof fluorescence intensity across a COC. The highlighted region of interest (ROI) was placed over theCOC such that an equal distance was measured either side of the geometric centre of the oocyte. Theaverage fluorescence in each column of pixels within the ROI is reported. (b) Example of the graphicaloutput obtained using Analysis Pro Software where the data is expressed as mean intensity offluorescence +/- S.E.M. (n=17 COCs, 4 independent experiments).
69Dunning
Chapter 4 Cumulus Oocyte Matrix Function during Oocyte Maturation and Ovulation
�������D����������������&�����%���������������������&�����������������������
"� �� � C)�
�&�������.�������!��%��������������!���������%�-�������������!����������������������������������������
������ ��3� 6E)�E)μ&8� ����������� ������������� ����������������� ����� ������������ ����������� 6U<:
�/5/&8���������������������������������������������/�3����������������%��������� � ��������������� �
��������������-�����������%���!��������������������������������/�
�
(%&%&%( ���� � ����'���� �
�
#���.�� ��� ����������� ��!��� ��� �������%� �������� ������ ���� ���������� ������ -��� ��������� !��
��������������:2���$0�;$�������&�.������������������������������������������������������������
�������E� 6"�����������-��� 3��/%����������%��$%�#������������8/�$��� ������P)/)E�-�������������
�������������������������/�
�
3,/ '0�1� ��
3,/,� -������1#�?�����1���#���������������������#������3����5�
�
&���.�����������@:0A�:"������� �������������� ��������������������������������������6���8�����
������������������)%�(%�C���>E����������������������� ��!��������!������6%�����D/(��:�8����-��������
���������������������������������������������������������/�������������������������.��-����!������
-������ �����������-�������� ��!����������������(��������� 6%�����D/(�!%� �8/�&�������������������@:0A�:
"���������!������������������������!����-�����������������������������������-�������������������������
��!������� ����!������ ���C�����>E���������6%�����D/(��������������������8/�%����������� ����������-���
������ ��� �������� ������ ����� ���� ������� �����-���� �� (� �� C� ������� ����!������ ��� ����������� ��!��%�
��-���������-����>E��������%�������������������-�����������������������������������������������������
������6%�����D/(��������8/�&�������������������������������������������������������������������6�P)/)E�
��� ����� �������8����� ��� �� ������ �������� 6�(�� )/??>(=� �P)/)))>8� -���� ��!������� ������ ��� (%� C����� >E�
�������� 6%����� D/(� �������8/� ������ ���� ������ ������� ������%� ������������������������ �����������
��������-������������������������������������������������������.����������������-�����������������
������������6%�����D/(��8/�&������!����������������������������������������'�������������������������
.����������������������������������������/�
f
g
Figure 4.2 Glucose uptake in the unexpanded cumulus oocyte complex (COC) is proportional to
duration of incubation.
Analysis of fluorescently labelled glucose uptake in unexpanded immature COCs from Adamts1+/- mice.Confocal images of unexpanded COCs incubated in 6-NBD-Glucose for 0 min (a), 2 min (b), 7 min (c)or 15 min (d) all followed by a 2 min wash. Quantified intensities of glucose uptake across the diameterof COCs for 0, 2, 7 and 15 min incubation periods is shown in e, data expressed as mean intensity offluorescence +/- S.E.M. (n�16 COCs, 3 independent experiments). Quantification of fluorescenceintensity within oocytes was determined as described in Figure 4.1 with the region of interestencompassing the oocyte only. The average (+/-S.E.M) of intensity values was then calculated (f).Glucose uptake was proportional to time of exposure as shown in g. Bars with different characters aresignificantly different (P<0.05). Scale bar = 200μm.
a
b
c
d
72Dunning
Chapter 4 Cumulus Oocyte Matrix Function during Oocyte Maturation and Ovulation
�������D����������������&�����%���������������������&�����������������������
"� �� � C��
�
3,/, � ��������1#�?�����1���#���������������������#������3����5,�
�
&��� .�������������������������������������� ���������������������������������������.��!����������
-���������%�!������� ����� ������������/� �$��������������������������-��������������-���������������
-������ �� >�������� ��!������� ������ 6%����� D/�� !� ���� �8/� &��� ������������� ��� ����������� -������ !����
�����������������������������������������������-���������������������������!�����������6%�����D/��
�������8/����������������.�������������������-����������������������������������������-����!������>�
���� (� ������� ������ 6%����� D/�� �8/� &��� ����� ���������� ��� ������������ ��� �������� -��� ������ 6�(��
)/???�%��P)/)))>8����������������������������6�P)/)E8������-������������������!��������������>�����(�
�������� 6%����� D/�������� �8/� ������ ���� ������ ������� ������%� ������������������������ �����������
����������� -��� ���� ��������� ��� ���� ���������� ������ ��� ������������ !�� ���� ������ �������� ���
����������������������6%�����D/���8��������������������������������-��������!��������������������.��������
������������������.������������/�
�
3,/,/ ��#����� �� -������ 1#�?�� ��� 1���#����� ��� 0�#����� �� � ���
�����������������������#������3����5,�
�
$�����������������-��������!��-����������������.������������������������6DD�����"8����� � ��
�������������������������������������������6>>����������"8����������������6>@�����"%���������
D/(/(8/� &��� ������� ���-��� ����� ����������������� -�����.��������� ��������� ��� @:0A�:"�������
����������������>E��������������������������������6%�����D/D��:�8/������.�!��%�������,��������
���� ������������-���������� ��� ���������� ���������������������� ���� � ���������������������
�����(����������<-���� ���E))� �����&5&� 6%�����D/D�!������8/� � �&���� ������������ ���� ��!��� ��� ����
���������������� ��������� ������������������������ �������������������� ��������������� ����� ����
��!��� ��� �������� ��� ���������������/� � "������� ����.�� ��� �������� -��� �������������� ������� ��� ����
��������� ������������ ���� ����������������� �������� ��� �������� ���������������� 6�P)/)E%�
%�����D/D��8/��&�����!�����������������������������������������������������������������/�
e
f
Figure 4.3 Cholesterol uptake in the unexpanded cumulus oocyte complex (COC) is proportional
to duration of incubation.
Analysis of fluorescently labelled cholesterol uptake in unexpanded COCs from Adamts1+/- mice.Confocal images of unexpanded COCs incubated in NBD-Cholesterol for 0 min (a) 1 min (b) or 2 min(c) all followed by a 2 min chase wash. Quantified intensities of cholesterol uptake across the diameterof COCs for 0, 1 and 2 min incubation periods is shown in d, data expressed as mean intensity offluorescence +/- S.E.M. (n�19 COCs, 4 independent experiments). Quantification of fluorescenceintensity within oocytes was determined as described in Figure 4.1 with the region of interestencompassing the oocyte only. The average (+/-S.E.M) of intensity values was then calculated (e).Cholesterol uptake was proportional to time as shown in f. Bars with different characters aresignificantly different (P<0.05). Scale bar = 200μm.
a
c
b
75Dunning
Chapter 4 Cumulus Oocyte Matrix Function during Oocyte Maturation and Ovulation
Figure 4.4 Glucose uptake in oocytes is significantly reduced following cumulus expansion.
Analysis of fluorescently labelled glucose uptake in unexpanded and expanded in vivo matured COCsfrom Adamts1+/- mice. Confocal images of (a) unexpanded, (b) periovulatory (11 h post hCG) expandedand (c) postovulatory (16 h hCG) expanded COCs incubated in 6-NBD-Glucose for 15 min followed bya 2 min chase wash. Quantification of glucose uptake in oocytes in shown in d. Quantification ofglucose uptake within oocytes was determined as described in Materials and Methods (Section 4.2.2.3)with the region of interest encompassing the oocyte only. The average (+/-S.E.M) of intensity valueswas then calculated (n�13 COCs). Bars with different characters are significantly different (P<0.05).Scale bar = 200μm.
a
d
c
b
a
Expanded
a
bb
76Dunning
Chapter 4 Cumulus Oocyte Matrix Function during Oocyte Maturation and Ovulation
�������D����������������&�����%���������������������&�����������������������
"� �� � CC�
�
3,/,3 � ��������1#�?�����1���#�����"����������0�#����� ��� ����������
���������������#������3����5,�
�
����������� ��������������������������������.��!��-������������������� � ����������������-���
���������������-������(�����������������0A�:�����������������(��������-���<������6��������D/(/(/(8/�
�����������������������0A�:���������������.�������������-�������������-�������������%������-���
��������� ��� ����������� �!�������� -���� �������� ��� ����������� ����� 6%����� D/E� �� ���� !8/��
3��������������������������������������������������������������-������������������.�%�!�����-����
���� ������� ��� ���� ���������%� �������� ������ ���� �������� ���������� ����� �������� �����������/��
N��������������������������������������������������������-��������������������������6*:����8������-����
���������� 6%����� D/E��=� �P)/)E8/� � � &������!������������������ ����%����-�����������%� �������������
�����������������������������!�����������������������������������������������������/�
�
3,/,6 ��#����� �� -������ 1#�?�� ��� 0�#����� �������� ����� ��#������
3����5����,���� ��� ������ ��� �����������,�
�
3��������������������������������������������������������������!�����������������������������%��-��
������� ���-�����.����������������������� ���.����-�����������/�&�������� ������� � ��������������
��������������������������%�-�����-����������������������������!������������ ���!����$�����>�����
;������� 6��������%�������������/%�())C8/�&���������� ��� ����������������������������� ���-����� �
��������������������������� ���$�����>��������������������;������� 6��������������())E8/�%��
����������������� � �������������������<������������������ -��� ��!,������ ��� ��������!������
����.������������������������ � ����������������>�������/�
�
%�����%�������������.�� ����������������� �����-���� � ���������������������������� 3;&� 6��������
D/(/>8�-����������������� ����������������������������!����!���/�%�� � ����������������>���
����%� ������,�������������������������������������� ���� ������������������� 6%����� D/@��8%�-���������
������������������������������������ �������������������������������-���� ����������������.������
��������-��������������������������������6%�����D/@��8/�3�������������������-��������������!�������
Figure 4.5 Cholesterol uptake in oocytes is significantly reduced following cumulus expansion.
Analysis of fluorescently labelled cholesterol uptake in unexpanded and expanded in vivo maturedCOCs from Adamts1+/- mice. Confocal images of (a) unexpanded and (b) postovulatory expandedCOCs incubated in NBD-Cholesterol for 2 min followed by a 2 min chase wash. Quantification ofcholesterol uptake in oocytes is seen in c. Quantification of cholesterol uptake within oocytes wasdetermined as described in Materials and Methods (Section 4.2.2.3) with the region of interestencompassing the oocyte only. The average (+/-S.E.M) of intensity values was then calculated (n�16COCs, � 3 independent experiments) Bars with different characters are significantly different (P<0.05).Scale bar = 200μm.
c
a b
a
b
78Dunning
Chapter 4 Cumulus Oocyte Matrix Function during Oocyte Maturation and Ovulation
79Dunning
Chapter 4 Cumulus Oocyte Matrix Function during Oocyte Maturation and Ovulation
IVMIVM IVMIVM
-/-
+/-
-/-
+/-
c
e
f
b
d a
g
Figure 4.6 The accumulation of glucose is perturbed in the cumulus oocyte complex (COC) and
its surrounding matrix following in vitro maturation.
Analysis of glucose accumulation in cumulus oocyte complexes (COCs) and their surrounding mediafollowing in vivo and in vitro maturation (IVM). Confocal images of 6-NBD-Glucose uptake in (a) in vivo
matured Adamts1+/-, (b) in vivo matured Adamts1-/- and (c) IVM COCs following an incubation period of15 min followed by a 2 min wash. Quantified glucose uptake across in vivo matured Adamts1+/- andAdamts1-/- and IVM COC is shown in d, e and f respectively, data expressed as mean intensity offluorescence +/- S.E.M. (n�15 COCs, 4 independent experiments). Overlay of the graphical intensityprofiles for all treatments is shown in g. Quantification of glucose accumulation in the surrounding matrixwas determined by calculating the average (+/-S.E.M) of fluorescence intensity values from 10μm fromeach end of the region of interest (h). Similarly, for cumulus uptake, the average (+/-S.E.M) offluorescence intensity values from 100-110μm and 240-250μm for each COC were used (i).Quantification of glucose uptake within oocytes was determined as described in Materials and Methods(Section 4.2.2.3) with the region of interest encompassing the oocyte only. The average (+/-S.E.M) ofintensity values was then calculated (j, n�15 COCs, 4 independent experiments) Bars with differentcharacters are significantly different (P<0.05). Scale bar = 200μm.
ih
j
80Dunning
Chapter 4 Cumulus Oocyte Matrix Function during Oocyte Maturation and Ovulation
a
b
b
Adamts1-/-Adamts1+/-IVM
In vivo Matured
bb
a
b
Adamts1-/-Adamts1+/-IVM
In vivo Matured
p = 0.79p = 0.08
Adamts1-/-Adamts1+/-IVM
In vivo Matured
�������D����������������&�����%���������������������&�����������������������
"� �� � *>�
������������ � ������������������������������������������� � ������������������������������������
���@:0A�:"����������������/�$��������������������������������������������������������������� � ��
��������������>��������������-����������������������������������������������������������������
�����������������������������������������-���������������������������!������-�����������������6%�����
D/@��8/�
�
$����������������������.��-�������� ��� � ������������������������%���������������������������
-��� ����� ��� �������� ������� ��� ����������� ����� �������� ������ ����� ���� �������� ����������� ��������
6%�����D/@�!8/�$����%�'�����������������������������������������������������������������������������
��� �������� ������������� ���������� ���� �� ����� ���������� �������%� ��� �� ���� ��-� ���������� -������ ����
�������6%�����D/@��8/�
�
$����.������������� ��� ��������.������������� -�������� !��-���� � ������������� 3;&�����������
6%�����D/@��������� �����������8/�%����-���� 3;&����� ��!����������%�!������������������������������
���������� ������ @:0A�:"������� ������������ 6%����� D/@� �8/� &��� ����� ���������� ��� ������������
'���������� ��� 3;&� ���������� 6��� >C�����%� D� ������������ ����������8%� �������� ����� ���� ��������
������������������������-���-������������������������������������������%�-����������-���������������
��� ���� ����� ����� 6%����� D/@� �� ���� �8� ��������� ��� �� ������� �������� �������� ������� ��� ��������
������������� ������ ���� �������� ����� ����������� �������� ��� ����� ����� ����� � �� ����������
6%����� D/@� �:�8/� � &��� ������� �������� ������� ��� �������� ������������� �!������ �����-���� 3;&� -���
������� ��� ����������-�������������������� 6%�����D/(��8/�2������������� ����������%� �������!�����
'������������ ��� �������� ����.�� ��� � ����������������>��� �������������������� ���� 3;&������
6%�����D/@��8%����-����������������������������������������������������������������������������� �
���������� ��� 3;&�����/�&���������������.�� ����������� ���� ������=� �������������������=� ����
����������������������������%�-�����������!��-������������������/�
�
������������� �������������� ��� ����!��.������@:0A�:"������� ������������!��-���� � ������ �
���������������� 6��������!��� �����������D/(/(/�8����-��� �����-��������������������� �����������
��������������������������������������!������������-���!��-������%���� � ������������������������
3;&������6�P)/)E%�%�����D/@��8/�
�
�������D����������������&�����%���������������������&�����������������������
"� �� � *(�
�&����������������������������������.�������������!��-���� � �������������3;&�����%�'����������
��� ��� �������� D/(/(/�� ������������� ���-��� �������������� ���� ����������� �������� ��� ���� ��������
����������� ��� 3;&������ �������� ��� � ����������������>��� �������������������� 6�P)/)E%�
%�����D/@��8/�
�
&��� ����� ���������� ��� �������� ������������ ������� ��� �������� -��� ���������� ������ �� ������ ���
��������������������� ���������������� 6�������� D/(/(/�8� ��� ���� ����������������� ��������������� ���
���-�����%�����D/@�,/�&�������������������������������������������������������������������3;&�-���
������ ����� ���������� ��� � ����������������-���=� �����-������������������������������ 6��)/)*%�
%�����D/@� ,8/�$�����������%� �����-���������������� ����������� ����������!��-���� 3;&���������������� �
�����������������6��)/C?%�%�����D/@�,8/�
�
3,/,) � �������� 1#�?�� ��� 0�#����� �������� ������ ��#������ 3����5�
���,���� ��� ������ ��� �����������,�
�
����������� ����.�� !�� �������� ������ ���� �������� ��� �������������� -��� ����� �������� ��� � ��
��������������>���������������������� 3;&��������������!��� �����������D/(/(/(/� �%����-���� � ��
���������� ���� �� (� ������� ��!������� ������ �����-��� !�� �� (� ������� -���<�����%� �������� ������ ����
�������� ��� � ����������������>��� ��������������� ���� 3;&������ �!��!����������� ������� ���
�����������6%�����D/C��:�8/��
�
&����-������������������������������������!�������������������������������������������������������
3;&� ���� � �� ��������������>�������� 6%����� D/C� �8/� &���� -��� ��-���%� �� ������������ (:�����
�������� ��� !��.������ ������������ ������ � �� ������� ����������� ����� �������� ��� �����
�����M�����������������6%�����D/C��8/��
�
&�������������������������������������.��-����������!��-����3;&����� � �������������%�-������-�
!��.����������������������������������������������������������������-����������������������������
��-��!�������������������������������������(������������������(��������-���<��������������6%�����
D/C��:�8/�3���������%���������������������������������������������������-����3;&�-���������������!����
���� ������� ���� �������� ������ �������� ��������������� � �� 6%����� D/C� �8/� ������������������
83Dunning
Chapter 4 Cumulus Oocyte Matrix Function during Oocyte Maturation and Ovulation
c
e
f
b
d a +/-
-/-
IVM
+/-
-/-
IVM
g
Figure 4.7 Cholesterol uptake is significantly increased in cumulus cells and oocytes following
in vitro maturation.
Analysis of cholesterol uptake in cumulus oocyte complexes (COCs) following in vivo and in vitro
maturation (IVM). Confocal images of NBD-Cholesterol uptake in (a) in vivo matured Adamts1+/-, (b) invivo matured Adamts1-/- and (c) IVM COCs, following an incubation period of 2 min followed by a 2 minwash. Quantified intensity profiles of cholesterol uptake across in vivo matured Adamts1+/- andAdamts1-/- COCs and IVM COCs, is shown in d, e and f respectively, data expressed as mean intensityof fluorescence +/-S.E.M. (n�13 COCs, 4 independent experiments). Overlay of the graphical intensityprofiles for all treatments is shown in g. Quantification of cholesterol accumulation in the surroundingmatrix was determined by calculating the average (+/-S.E.M) of fluorescence intensity values from 10μm from each end of the region of interest (h). Similarly, for cumulus uptake, the average (+/-S.E.M) offluorescence intensity values from 100-110μm and 240-250μm for each COC were used (i).Quantification of cholesterol uptake within oocytes was determined as described in Materials andMethods (Section 4.2.2.3) with the region of interest encompassing the oocyte only. The average (+/-S.E.M) of intensity values was then calculated (j, n�16 COCs) Bars with different characters aresignificantly different (P<0.05). Scale bar = 200μm.
84Dunning
Chapter 4 Cumulus Oocyte Matrix Function during Oocyte Maturation and Ovulation
j
h i
a,b
a
b
Adamts1-/-Adamts1+/-IVM
In vivo Matured
a
bb
j
Adamts1-/-Adamts1+/-IVM
In vivo Matured
a
bb
Adamts1-/-Adamts1+/-IVM
In vivo Matured
�������D����������������&�����%���������������������&�����������������������
"� �� � *E�
�����������-���������� ����������������� �����-���� 3;&� ��������������������������� ���������-���� �
������������6�P)/)E%�%�����D/C��8/�$�����������%����������������������������������.����������������!��
��������-�������������-����3;&�������������������>������������������ � ��������������6%�����
D/C�,8/�
�
3,3 %"��1��"�$��
&��������������������������������� �������!����������������������.����������� ���!���������-���� ����
����������� ������������� ��� ������ ���������/� � 3� ������������� ����� ��� ���� ����� �� ���� ��� �����������
����!������ ������� ��� ���� ������� ��� ���� !����� ��� ���������� ���������� ��������� ��� �������� ���� ����
.��-����������������������������������������������������������/�&�����������������������������������
������� ����������� ����� ���� �������� ��� �������� ������ �������� ��� �� �������� ���������� ��� ����
�!�����������!��������������������������/�
�
&-�� ����!������� -��� ������� ����� ��.���� ���������� ������� �������������� ���������� !��� ����� �����
��.����� ��������� ���������������� ��������/� � "������� ��� �� ����������� ��������� ����� ������ ������
������� ������������� ������� ��������� �������� ���� "7#&�� 6&���.��� >??D8/� � ����������� ��� ��
�������!�������������!��� ��� �������������� ������� ���������!����/� � 3�����������%�-�� �������������
���������� ��� ���� �!�������� ��� �������� ���� ����������� ����� ���� ���������� ����������� ����� ����
��������� ���� ������ �������� ��� ������� !���� ��� �������� ���� ����������� ����.�� �������� ���
���������������������������������������������������������������������������������6%�����D/D�����
D/E8/��%�������%������������������������������������� � ������������������������������������
�������!��3;&��������������������������������������������������� $������%�!�����������������������
������������������������/�
�
����������������%����������������������������������������������������������������������-�������%�
-��������.������������������������-������(�����6%�����D/(�!������8/�%����-������>E������������!�����%�
��������� ����!����������������� ��� �����������������%��������� ����������-������ ������������������
����������������������������������������������������������6%�����D/(��������8/�3���������%������-�����
������������ ������������������������.�� ��� �����������-������ ����� ��������� �����-�������������� 6%�����
D/D��8/� 3�� ����%� ���������� ������������� ��������������������� ���� �����������-���� �������� ������������
�������D����������������&�����%���������������������&�����������������������
"� �� � *@�
������������������ ��� �������������������� ��������� 6%�����D/D�����%�����D/@8/�&����������������
�������� ���� ������������������ �����!���������������������.�� ������������������������� �����������
��� �������.��� ��� 3;&����� ����������� ����� �������� ��� 3;&����������%� �����!��� �����!���������
$�����>� ���� ;������%� ����� �������� ���� ����.�� !�� ���� ������/�������%� ������ ������� ���-� �����
��������������� ����������� �����-������������������ � �� �����������������������/� �&���� ������������
���� ������ ���� !�� ��������� ������ ���� �������� ���������� ���� ������������� ��� �������/� &��� ������
��������� ������ 3;&� ���������� ������� ��� ��������� ����!������ ���������� �������������� ���� �����
��������������������� ��������������������������������������� !�� ������/� �&�����!�������������
��������������������.��-�������������������������������������������������3;&<3;%�������������/�
�
�
���������������.���������������������-������������-�������������������������������������-������
>����� 6%�����D/��!8/�%����-���� � �������������������������%����������������.��-��� ������� ���
������������������-���������������������������������������������������������������������������������
6%�����D/E�!8/������������� � �����������%���������������������������������������������������
��������.�� �������������� 3;&������-��������������� ���������6%�����D/C��8/�&������������ ���������
����������������������'������ ���� � �:���������������� ��������� ������������� ���������������������
����������� ������ ���� �������� ���� ����.�� ��� ����������� !�� ���� ������/� ����������� ��� ��������
���������� ��������� ���� ����������������������-����-������������������������������������.�����
�������� ��� �� �������������������/� $�������� ����� 6������ ����� ����8� -��� ������� ��� ���� �������%� -��
�����������������������������������������������������������������������������������������������������
��������������������������������������������������������������������������������������'�������������
��������������6A��������������())C8/������������������������������������!����������������������������
����������� ���������� ����������� �������� ����� ��� ����������� ���� ��������� ��� -���� ��� �������
�����������������������������������������������������������������������������������6����������&������
>?*)=�5�����������>?*�=�"�������������()))=�A�����������())D=�"����������())D=�&����A������������
())D8/�$�����������%�������������������������!��� �����:�����������������������������6���������())*8�
���� ���� ���������� ������� ��� ���� ������� ���� !�� ��������� ��� ���� ������� ��� �����!��� ������ ��������
����������6����������H���!��())D8/��&�������������������������������������������������������������
������������������������������������������������!���� � ������ � ���/�
�
�������D����������������&�����%���������������������&�����������������������
"� �� � *C�
��� �������� ����� 3;&�����%� -����� ���.� ;������� ���� $�����>%� ����� ������� ����!������ ����������
��������%� -����� ��������� ����� ��������� ����������� ��� ���� �������� ������ ��� �������!��� ��� ����
�������������������������� � ��������������/���!�����������������������������������������������
�������� ������ ������� ���� ����� ����� ����� ������ ����� �� ��������� �����/� � &��� Q��������� ���F� �����
��������������������������� $%��������������������� ������������� ���������� ;������%���� -�������
����:���.���� �������� ����� ��� ���������� 6B��������� ()))=� A��.��� �� ���� ())�8/� &���� ��.�� ����
�������� ���� ������������� ��� ���������� �������� ���� ������������� ������%� ���� ��������� ���� ���
-���������������������������������������������������6&��-�.��������())D8/�;����������������!����
���-�� ������������������������ ���!������������ ���������������������������������� 62��������())E�8/��
%��������������������������������������������������������������������������������������������!��
�������������������6A��.���������>??�=� �����������>???8/��
�
&�����������������.��������������� ��������������������������������������������������������������
�����������������������������������������������/�;����������� $���������������������������������
������������������� ��������������-��������������!�����������;�����������������-���� ����������
6H������������ ���������())�=� H��������������())@8/�7�.�-���%� �����!��������� �������� ���� 3;&�
���� ������ ������ !�� �������!��� ��� ���� �������� ���������� ��������� �!������ ��� ����� �����/� &���
������������ ��� ������������ !��-���� ��������������� ��� ������������������������� ������ 6"5�8� -���� ����
��������� �������������������������� ������������'����������-���!�� �����������������������������
�������������������������������� !�������� !����������������M�/� &����������������� ��������� ���� ����
"5�������������������������������������������������������������!���������������������6H��������������
())@8%��������������������.����;�����������������������������������������!�����������������������
������M��������� � ��������������/�
�
&���������� 3;&����������� ����������������'�������������-�����%� ��������� ����!���������!������
��������������������������-����3;&/�������������������������������������������������������������%����
-�������!������������������������������������������������������!������!����������������6A������
�� ���� >?@C=� 7����� ���� A����� >?*E8/� $�����������%� �������� ����!������ ��� �������� ������ ���������
������������ ���������� ���������<����������������� ���� ��� �������� ��� �������� ������� �����������
6������:&���-����������())@8/�2��������������������%������-���������������������� � �%������������
��� �������� ��� �������� ������ ��� �������/� &���� -����� ������!��� ������ ��� �� ������ ���� ��� �������� �����
������������!������������������� �������������!������������!�����/�$������������������ ������������ ���
�������D����������������&�����%���������������������&�����������������������
"� �� � **�
!����������� ��� ������������������������� ��������������� ��� ����������������!��������������������
�������� ���� ��� ������� ��������� ������� ��� ��!������� ���������!������� ��� �������� ������������ �����
���'�������!������'��������/�&�����������������������������������������������������������������
�����������������������!���������������������������������������<���������������%�-���!����������������
-������������'����������������������������������%����������������-�������������������������������
�����������/�5���!��������������������������������������� ��� �����������!�� ������������������-�����
����-�������������������������������������������������������������������������������!������/��3��3;&�
����� ����� ��� ������� ��� ��������� ���� ��� �������� ����.�� -������ ���� �������� ����� ���� �������
�����������������������������������!��������������!��������������������������������������������������������
������������������������������3;&/��3����������������������!���������3;&���������������������������������
����� ��.���� ��� ������ ��� ������� ����� ���� ���� ����������� !������������ ����-��%� -����� ��������� ����
��!���������� ������������������%������:���.�����������������������������������������-����%�����������
���������������������������������������������������6������:&���-����������())@=�&��������������
())C8/� &���� ���� ����������� ����� ���� ��� �������� ���������� ���� ����.�� ��� 3;&� �������� ��� ��������
������������������������������������������������������������������������������������������������
����������6 ���������������()))=�������:&���-����������())@=�&��������������())C8/��
�
&������������������������������������������������� �������������������������������������� ���
������������������������������������������������������������������������������������3;&������������
������������������������������������������������������������������������������������������3;&�
�������/� ������������������������-�� ����� ��������������������� �������������!������� �����������������
��������������������������������� � 6%%:&$�8%���� ������������ ��� ���������������!����������������-��%�
��������������������-���������������������������������6��.�����������())C=���������������())*8/�
3��������%�����������.��-���!����������������������������������������.��!�������������������������!���������
��������������������������!���������������������������.�������������������������������������������!��
����������/�
�
&����-�.���������������������������������������������������������/�2����������������������������
���������������������������������������������������������������������������������'���������������
����������� ��� ���� �������� ������/� � %����%� ����� ��������� ��� ������ ��� 3;&� ����������� ���� ����
������������ ������ ����������%� ;������%� ��������� ���� $�����>� �����!���/� $� ������
���������������������������������������������������������������������������������!���������������
�������D����������������&�����%���������������������&�����������������������
"� �� � *?�
��������� 3;&� ����������/� ������������� ���� �������� ���������������� ��� ������ 3;&� ������ -����
����!������ $�����>� ���� ;������� �������� ��� ����� ��� ����������� ����� ���������� ��� ����������
����%������������� ��������� ���������������� ���� 3;&����� ����������� �����-����������������/� 3�� ����
�������� ������ �������� � ���� ���� !�� �������� ��� ������������ ���� � �� ������� ����������%�
���������� ���������� ������� ��� ����������!������� ���� ��������������������%� 3;&� �������� ����� ����
������� �������������� ����������� ���� !�� �������� �������� ��� 3;&� !�������� �� ���!��� ������� ���
��������� �'������ ��������� ��������%� ����������� ������ ��� ��.� ��� ������� ���������������� ��������
6� ��8�67�����������())E=�����!���������A��.����())*8/�
�
� �
� �
� �
� �
� �
� #����6 �
����������4������O�'���9�����#������
#�������������������������������� ��� ����
�������������
�������E�$�����>�����;������:������!������������������������������������������������� � ���������������������
"� �� �
� � ��?>�
6,� "$ '�%1� "�$��
&����������������%�$�����>�����;�����������!��������������������������������������������������
���������� � �� 6�������������� ())��=� �������������� ())�!=� �������������� ())C8�������������8/�
�-���%� ����� ����������������������������������������������%��������������� ������������� �����.��-�/�
2����������-����������������������������3;&������������������������������������6��������8����������
���� ������� ��������� ��� �������� ���� ������� ��� ������ ����!������� !�� ���� ������� 6������� D8/� A����
$�����>�����;������������������������������� ��������������������������������������� ����������
����������������������������������������������������!����������/�&������� ����.��-�������������
$�����>� ���� ;������� ������ ����������� ���������� ���� ���� ������� ��������� !��� ����� ���� ��� !��
������������/�&���'�����������-������������������������� 3;&��������-���� ����!������$�����>�����
;����������������������������������3;&�����-����������������/�����������������-��������!������
������������������� �������������������������������� ������ �������� ��������������� ������������� ����
����������������������������������$�����>�����;��������������������������������/�
�
6,�,� �������
;%%%%%% 2������ ���������� ��� ��������������������� ����� � ���
�
&��������������������������0$� ������������������6"��8� ��� �������� ������������������7 ������ ���
���������������������������6��!.��������()))8����65�����������()))8%���-�6&�����������())�8�����
����6A��!����������())�8/� ������"�* ,����0$�������������������������������������������
6H������ �� ���� ())D8/� $�����������%� -�� ����� ���-�� ����� �@� ����� ����� ��"� �������������%� ������
�"�* ,����0$�����'�������!����������!������������������������������������6��������8%���-���%�
������������������"�* ,����������������������������.��-�/��
�
$�����>��������������������������������%����������������������������������������������������������������/�3��
������%� ��������"�* ,������������-��� ������� ��� �����������������������-��������������������
�������� 6����8� 6H������ �� ���� ())D8/� 2����� -���� ����� ����� ��� �������� ���� ���� ��������� ��� �����
���������������-�������������=���-���%��������������������������������������������5�&�����������%�
�����������"�* ,�%������!�����������������������������%���������.�������������������������������<��
�������E�$�����>�����;������:������!������������������������������������������������� � ���������������������
"� �� �
� � ��?(�
�������������������������6H������������())D8/������������������������������� �������������� ��� ����
���!���������������� ��������6�������������()))=�&����M�������())D8��������������������������� ��� ����
���!���������������-����������������������������������������������������������������5�&�6A�-����
���� ())@8/� $�����������%� ����� ��� �� ������������ ��������� ��� ������������� ����� ���� ��:����� ��!���
���������������������������������6��������������())E8�-��������%�������%�!�����������������������
�������������� ����������� ��������� ���� ��������� ���� ����������� ���������������� ��� ��������������
���������������/�%����� ���������� ����� �������%� ������������������������������������ � ����
-����� ���.� $�����>� 6������� �8� ����� ����� ��������� �������������� ����������� 62���� ���� "����
())D8/� &��� �!������ ��� $�����>� ������ ������� ���������� ���������� -���� �������� ��� ��-��
������������������������%����������������������������$�����>�-������������������������������������
���������/���
�
;%%%%%& '����%����� ������������������� ����
�
&���������������������$�����>������������������-������'�����������������������������%���������%�
����:��������������������������������������/�&���������������������'�������������������������%�
����!������*�/D7���'���������������������������������������6;�M'��M�������>???8/�&���$�����>��������
��� ������������ ��� ��� ��������� ������� ���� ��������� ������� ���������� ������/� 3��������� �� �������
���������� �������� ���� ������� �������� ������ ����������� ���� ������������� ������� ���� ������������
���������6�����������())E8/�&������������-���!����������������������������%�-�������������������!��
���������!�������������������6�����������>???=��������M:&��M���'���������()))8/�3������������������
���������������������:�����������������������������������������������=���-���������������!�����������
���������������� �'����� ��������� ����������� ��������������� ������������ 6&�����������>???=�����������
()))=� ����� �� ���� ())E8/� � %���� ������� $�����>%� ����������� ���� ��:������%� ��� >>).��� ��� ��M�� ����
������� ��� *E.��� �����-���� ����������� ����������� !�� ���� ������� ��� ���� ��� ������� 6�������M:
&��M���'��� �� ���� ()))8/� 3�� ���� ����%� !���� ���� ��:� ���������� ����� ��� $�����>� ��� ��������%�
������ �����>):����%� �����-���� ����7 ������ 6��������������())��8/�&��� ��������%���:$�����>��������
6>>)�.��8�������������������������������������������������������������!�������������������6����������
����())��8/�&����%�����������������������$�����>�6*E�.��8� ��������������� ���������� ��� ������������� ����
��������������6��������������())��8/��
�
�������E�$�����>�����;������:������!������������������������������������������������� � ���������������������
"� �� �
� � ��?��
�������� $�����>� ����������� ����� ���� ������������ ������ ���� ���� �:�������� ������� 6����� ����
&����������>??*8���.����������������������-����������������������������������������5�&�!�������� �
������������-������������������������!������������������$�����>�����������������������6�����������
>??C8/� $�����D� ����������� ��� ��������� !�� �� ���������%� -����� ��� �������� ��� ������� ���������
������������� 6 ��"8� ��� ���� ������� ���!���� 6&���� �� ���� ())*8/� ���� ��� ���� ����� ������ ���
���������������!��-����$�����>����� :D%�$�����>����������!���������� ��� ��"�� ��������������
������������������/�
�
���-���������������$�����>��������������!����������������!����;�������������������6�����������()))=�
������������())>8/�$�����>���������;��������������"��DD>:$��DD(�-������������'��������5$$5DD>:$DD(�
��"N�������������C).�������������������-������������������������5$$5�6������������())>8/�&���
�����������������������;�������!��$�����>%���������� ��� ������������������ � �� 4-������������
�@@J�5%�����!�������������������������;�������������������������������������/��
�
$�����>� ���� !���� ���-�� ��� �������� ��������������� ��������=� �� ������ ��� ���� &��:>� �������� ���
$�����>� !������� ��� ;5"%:>@E%� ����� ����!������ !������� ��� ���� ������%� ;5"%�(� 67�'��� �� ���� ())�8/�
$�����>����������������������������������������������-���������=�%"%�����5��:��.���������67�'���������
())�=�7���������())@=������������())@8/��&�������������5��:��.����-�����������������������������������
��'�����������������������������������6��������������!.��())C8���������������!����.�������������!��
-�����$�����>�����������������������������������������������/�
�
$���������� ������������� $�����>���������� ���� ���������������������%� -����� ��������� �-�������������
���������������������������!���������������������������������������������6������������>??D=�#�����
������>??D8/�&�������������������������'���������>�:>E����������������������������������������"��
���"L�6-����L���������������������������8/�&�������������������!���������!�����������������������������
���������������������������������������������%�����������!�����������������������62����!�������2�����
>??@8/� $�����>� ���.�� ���� ���� �"�<L������%� !��� �� ��������� ��������� ���������� ����������� �����
��������������������-������������/��
�
&������������ ����������������������$�����>��������� ��������������������%�������������������������:
��������������������-�������������������������/�3�����������%�$�����>��������������������������������
����������������������������������� 6��������������())��8/�&�����!��������������� ���!�����������
�������E�$�����>�����;������:������!������������������������������������������������� � ���������������������
"� �� �
� � ��?D�
���������������������������������������������!��������������%�������������!��������!������������%�
!���������������������$�����>���������������������������������������������M������������������������%�
������������� ����� ���������:����� ������/������ ���������� ������������� ��.���� ��� �������������������
���������� ��� ������ ���������� ������ ���������%� ����������� ��� ������ ��������� ��������� ����
������������������������!��-���������������������<�� ����������%��������!�!��� ���.������������ ������
��������� ��������������/� $�� ���� �������� ��� $�����>� ����� !���� ��������� ���� .��-�� �������
���������%� -�� ������� ��� ����������� ����� ����������� ���������� ��� ���� ����!��������%� ��������� ����
����������������������������������/�
�
6,�, 4�������
;%%%&%% ���� ������� �� ������� �����
�
&��� ����������� ��������� �����������%� ;������� �������� 6%����� E/�8� ��������� ���� ������ ��������
���!�����������6">8������������������������!����:��.���������������������������.�������:��.���������
�����!���� $�67�A����������>??(8/�&�����!���� �����������!����������� 6"�8����-���������'������
���������� ��� ���� ��������� ��������� �������� ���� ��� ��������� ��� �-�� ��������� ��-��� ������ 65��8�
�������%� �� ��!�������� ����������� ������� ���� �� ����������� !������� ������� 6�A�8� ������
6��������� �� ���� >??�8/� &��� ����� "$":����������� ������� ,������� ">� ���� "�� ��� �������� !�� �-��
������������� �������� ������ 6"$"α� �� "$"β8� ����� ������� ������� ��� ����������� ��������� �����
������������67�A����������>??(8/�����������������������������-����������"$"������������������%������
������� ���� ��������� �������� ��� ;������=� ;)%� ;>%� ;(� ���� ;�� 6��������� �� ���� >??�=� ����:
I��������� ���� I��������� >??D=� 3��� �� ���� >??E=� I�.�� �� ���� >??E8/� &����� ��������� ����� ���
;������� ������ ��� ���� ������� ��� ���� ���� ������� ���� ���� ���!�� ��� "$"� ������������ 6����:
I�������������I���������>??D=�3���������>??E=�I�.��������>??E8�&���;)� ����������;������� ���
������������������������!����"$":����"$":��������63���������>??E=����������������>??E8/�&���
;>� ������������������������"$":�����������;(����������"$":�����������;�� ���.��!����"$"�
�������������������6���������������>??E=�I�.��������>??E8/�$��������������;�������������������">:
���������!��������������������� ���������!��� ��� ���������������M������������-���� ���������
-����%� ��� ����� ������%� ���������� ������� ������� 62����� ���� &������� ())D8/� &��� �����������
���������-��������������������������C)%�(@�%�>*)�����CD.��� ���;)%�;>%�;(�����;�� ������������
6����:I�������������I���������>??D=�3���������>??E=����������������>??E=�I�.��������>??E8/��
�������E�$�����>�����;������:������!������������������������������������������������� � ���������������������
"� �� �
� � ��?E�
�
;%%%&%& 1���� ����������� ��� ��������������������������������������
�
;������� �������=� ;)%� ;>����� ;����� ������� ���������� ����������������� -���� ;)�����;>� !����� ����
���������������%���������������������������������������������������������-��������7 ������ � ��
6��������������())�!8/�;�������������� ��� �������������� ����!�����������!������� ���������������
���������!����������������������������������������������������������7 ����������������������;�������
��� �'����� ������ ��������� ������������ �������������� 6�������� �� ���� ())�!8/�&���� ����M������ ��� ��
��������� ��� ���� ;������� ����� ���� ��� ����� !�� ��!������ ���� >)/E� ��� �� ������ ��� �� ����� �������
6&,��������������>??*8�����������������!��������������������������������������������/��
�
;�����������!���� $������������0:�����������.����������������������������-���������� $�����������
��� ������������������ 67�A���������� >??(=� �������������� ())�!8/� &����:������������������ ���� "��
����������� ��������-������������������������ �������������������������������������������� 6&����������
>???8%�5�&�������������%������������������������������ 6#,����������>??D8����� ��������� 62��������
())(8/�;����������� ������������� �����!������ ����������.� ������������ ������������������������
-���������������������������������������������������������������������������������������'������/���
�
&��� ������� ����������� ������� ����������� ��������� ����� ������� ��� ;������� ������� ���� !���� ��-���
������%�����.��������������.�����6�����.:���M����������>??D8�����������������������-����������
��� ���� 5�&������ �������������������� -���� ��������� !�� ��������� ��� ����� �������� 6��������������
B��������� >??>=� &���.�������� >??�8/� $���-��� ������ ������� -������ ������������� ��������������
�������� ���� ������� ���� ����� ��� �������� ��� ��-��� ������� �'����� ��� �������� ������� ���������/�
���������%� �����!���������;��������������������-��� ������������������� 3;&����������!���� ���
������-���������������� � ������������������/��
�
;������� ������%� ������� ��� �����������������������%� ����������� !�� $�����>������������ C).��� 0:
�������� �������� ��������������� ��� �����������������5$$5%�6��������������())��8/�&���������������
������������������������������������������:���.����������������;������F��0:������:���������������%�
�������������;�������� ������������-��������������������������������������������������������62��
������())(8/�&��������������������������� ������������%����������������������������������� �������
�������E�$�����>�����;������:������!������������������������������������������������� � ���������������������
"� �� �
� � ��?@�
������������!��-����;�����������������������������������������6I�����������������������>?*?8/�
;������������������������������������ ����"�%��:��������������%�-���������!�������-�������������
-����β>:������������������������������������.������6%$�8%�������������������������������������������
���������� 62��������())(=�7������������())C8/� �-���%�;������� ������������������ ���!���������:
��������� ��������� ����!��� ��� ��������� ���� ����������� ��� ��!������ ��!�!������ ��� ��������� ����� 3%�
��!������������ �������� 6B��������������>?*?=�B��������������>??�8/�&��������:�������������������
;������� ��������������������">��������6$���������>???=�B����������>???8/�&����������������������
;������������������������������� � ������������������:�������������������������������������������
����������������������-�������������������/� �-���%���������������!��-�����������������;�������
!��$�����>���������������������������������������������������������������������� ������� ��� !��
�����������/�
�
�������������������������������������"��;�������������%�-�����������������������������������5��:��.��
������� 6I����� �� ���� >??*8/� &��� 5��:��.�� ������� ��� ;������� ��� ��������� 5��� �������� 65���8� ����
��-�������������� ����������������-���� 6L�����������())@8/�&��� ������������������������������� �
���'�����������������������5�������-�������7 ����������������������������������������������������
5��:��.�� ��������� �����������%� ���������� ���� !���:��������� 6��.� �� ���� ())D8/� &����� �������� ��
�������� ������� ��������� ��������� ������ ��� ���� �������� �����%� -����� ���.� 7 � �������%� ���������
�������� ���������� ���� ���������/� 0���� ��������� ��� ������ ������� ������������� ����� ���� ������ ����
����������6 ���������������())E8����������������������!������������������������������������:����������
���������������/��$������5��:��.������������;��������������!�����������������5����%�3�������������������
;�������-����!������������������������������������������������������������������������������������
���5�������������������������������������!������������!������������������;�������!��$�����>/�
�
&�� ������������ ���� ����� ���������� ������������ ������ !�� -����� $�����>� ���� ;������%� �� �����
����������������� ����������� ������� ����������������������������<������������������� 3�������������
�����������!������������������������������������������������������������3;&��������/�
�
�
�������E�$�����>�����;������:������!������������������������������������������������� � ���������������������
"� �� �
� � ��?C�
6, �0 4�%��
6, ,� '���9�����,������,��������
;%&%%%% �������� ��������� ��
6, ,�,�,� #/����-'��&� #/����-7�,�'��&� #/����-7�%��'��� ��� ����������� "����)��
#/����-�08��'����
�
&-�� ����������������������������� ���������� -�����������=� ���%7$":���>� ����������� ���� ���������
����������������'�������������%7$":������>�������������������������������������'������-����
�� ���������� ��� ���� EF:� ��:�����%� -����� -��� ��������� ��� ������� ��������������� ������� ����!������
��������6%�����E/>8/��
�
&��������������������������'�����%�������>�6��������� ���%�����E/>8%�-���������������������0$�
����������������03 �&�������������������$�����>6%8��������$�����>6�8�������6&�!���E/>8/��&���
���� �������� ���� ������� -��� ��!������� ����� 0��3� ���� ���333� ������ ��� ���0$��/><���: ��6:8� $�
63���������$�����������/�7��/%�&��2������%�;3�%�$�������8/�
�
&���������>� ��'������ -��� ��!��'������� ��!������� ���� ���0$��/><���: ��6:8� $� ����� ���%7$":
�&;�:>�� ���������� ���������� ������ 6�����:$������ ���/� 7��%� ������� ���%� 0�2%� $�������8/� &���
���%7$":�&;�:>������������������������������������'���������������������������������!������
������� ����� ������������������������:���������L%7$"�� �������������� ���������������� ����!������
������/� &���������>� �������� -��� �������� ���� ���0$��/><���: ��6:8� $� !�� ������� ���������� -����
$��3/� &��� ��������� EF� ��������� -��� ������� ������ E������� ��� �0$� ���������� 3%� ����� 6�����-8�
%������� 60�-�5�������A����!�� 3��/%� 3��-���%�&$%�#�$8����� ����!��������� ���� ���������� ��� ()�
�������/� &���� �������� -��� ���� �������� ���� ������ ��������� -���� 0��3/� &��� ��������� �������� -���
������ ���� �������� ���� ��!������� ����� 0��3� ���� 5���;� ������ ��� ���%7$":�&;�:>�/� &��� �������
������>� �������� -��� ������ ��L%7$":������>/�������� ��������� -��� ��'������� ��� �������
�����������������������!�����������������'�����/�
�
&�� �������� ���� ��� ������ ��� ���� �������� ������� ��'�����%� 03 �&�� ��0$� ���� ���� ������
��$�����>6%8�������$�����>6�8�-������������ 6&�!���E/>8/�&��� �����������$�����>������������
98Dunning
Chapter 5 Adamts1 and Versican: Recombinant protein production and functional roles during in vitro oocyte maturation
Figure 5.1 Schematic representation of Adamts1 domain structure and generated recombinantAdamts1 constructs.Schematic representation of the configuration of Adamts1 domains (a). Pre, signal peptide; Pro,prodomain; MMP, metalloprotease catalytic domain; Dis, disintegrin like; Cys, cysteine rich domain; TS,thrombospondin type I repeat; Spacer, spacer domain. Constructs were generated to assess thefunctional importance of different domains (b). Full length and serially truncated constructs of Adamts1
were amplified by gene specific primer based polymerase chain reaction (PCR) and sub-cloned intomammalian expression vector p3xFLAG-CMV13 (Sigma-Aldrich). Generation of a catalytically inactiveconstruct of Adamts1 was achieved by PCR based mutagenesis of the zinc binding domain asdescribed previously (p3xFLAG-6xHis-E/A Ats1; Kuno et al. 1999). A 6x Histidine tag was alsointroduced at the C-terminus of the Adamts1 constructs, upstream of the FLAG tag present in thep3xFLAG-CMV13 vector. Designated names of each construct are found to the right of each schematic.
p3xFLAG-6xHis-Ats1
3xFLAG C-terminal tag
6xHistidine C-termianl tag
p3xFLAG-6xHis-ΔDisAts1
p3xFLAG-6xHis-ΔProAts1
p3xFLAG-6xHis-E/A Ats1
Pre Pro MMP Dis SpacerCys
MMP SpacerCys
SpacerCys
Dis
Pre Pro MMP SpacerCysDis
Pre Pro MMP TSDis Spacer TSCys TS
a
b
TS TS TS
TS TS TS
TS TS TS
TS TS TS
X
�������E�$�����>�����;������:������!������������������������������������������������� � ���������������������
"� ����� � � � � � � � ����������??�
9���6,��,�������������������� ���������������'����%����6�� ������#�������#������,���'������� ����������� ��� ������������������ ����$���� � ��'������ ��� ���-�� ��� �������/� 7������ ��� !���� �������� ��������� ��M�.� ��'�����/� #��������� ��'������
��������������������������������������������/�7������������������������������@����������������/��
��������� ��,���#������ ��(������6�7/��
"���������
'���������������
3�����������
��(�����5�
'�)������#������ ��(������6�7/��
"���������
'���������������
3�����������
��(�����5�
,/����-��%� ���������6%8� """���-� $"�� -��-������- ���� 0��3� ���������6�8� """���-� � --� ���-- ����&"� A�� 3�
,/����-ΔΔΔΔ,�'�%� Δ���������6%8� """���-�&'"�� -- �- --� -����- �� 0��3� Δ���������6�8� """���$$"�& -��� - - ��- - -�����- �� ���333�
,/����-ΔΔΔΔ%��'�%� Δ����������6%8� """���"�&�"�� --�-�� -� �� � 0��3� Δ����������6�8� """���$$"�& -��� - - ��- - -�����- �� ���333�
,/����-7-�� $���� �">�6%8� � "�-"��"� ����--��'�-� -- �� #��.� $���� �">�6%8�&$""$&��� -� -� -� -� -� -�-� � -��-�
� --- ��A�� 3�
,/����-7-/� $���� �"��6%8� &$"�"-��-���-�$&-���� � � ��� #��.� $���� �"��6%8� &$""$&��� -� -� -� -� -� --�-�� �-�� ��� A�� 3�
�������E�$�����>�����;������:������!������������������������������������������������� � ���������������������
"� ����� � ��>))�
-�����!����������������33:&����33�63���������$�����������/�7��/%�&��2������%�;3�%�$�������8�������
�����������F������������/�A�����%������@��������������������-����-��������%�(����������������%�>���
�����������������6())�&�0���%�>)�&�&���(8%�>������&��������������(��� (�/�&�����������-���������
����������� ����!�������� ���� ���������� ���E��������/�&��� ��������-��� ����� ����!�������� ��������
���������� ����� ��������� &$�� >&&D&>�� ���������� 5/����� 63��������� $�������� ���/� 7��/%� &��
2������%�;3�%�$�������8/�&����������������������������(����������&���������������������������������
���������5/�����%������������������� ����!���������E������������ ���/�������-�����������������.������
�)��������������D(���-����!�����������������������/�&���������!��(E)����������-�����������������
��!��� ���.��� ���M�������� 6())��8� ��� �C��� ��� >� ���/� &��� ���������� !������� -��� ������� ����
�����������������������������������������E/>/>/>/*/�
���
��$�����>�-�����!��'���������!�����������0��3�����A�� 3������������L%7$":������>������������
������������� ������ ����������� ���� ��������� ���������'��������������� $�����>/� &��������������
������-�����������L%7$":���>��������������������%�����E/>/�
�
&����������>���������������������$�����>����������'��������-�����������������������������������
$�����>�6%�����E/>�!8%�-�����������������������$�����>6%8���������$�����>6�8�������6&�!���E/>8/��
&��������������������������-�����!������� �����0��3����� ���333�������������0$™�/><���: ��6:8�$�
63��������� $�������� ���/� 7��/%� &�� 2������%� ;3�%� $�������8/� &��� �������>� ��'������ -��� �����
��!������� ���� ���0$™�/><���: ��6:8� $� ����� ���%7$":�&;™:>�� ���������� ���������� ������
6�����:$���������/�7��%�������� ���%�0�2%�$�������8� ������ ���������������� ��� ���������� ���������>�
6�����!���8/�&�����������������>���������-�����������L%7$":�������>�������'�����������������
���������-����������!�����������������'�����/�
�
&����L%7$":���>%���L%7$":������>�������L%7$":�������>�������%����:��������@����������������
-�����������������������,������ ��� �����L%7$"� ������� ���� 6%�����E/>%�!8/�&����-��� ���������� ���
�������������������/�&��������������� ����� ���� ��������� ���� �����-���=������������������������������%�
����������� @� ���������� ������� ���� ����������� L!�3� �����%� -��� ��!������� ��� �� �������� �����������
>))��<��������������������������%�@� ���7��.��6%8�EF�� �-�&�$&�$&�$&�$&�$&�$& ��F�����@� ���
7��.�� 6�8� EF� � �-�$&"$&"$&"$&"$&"$&"$ � �F� � 6������� ��� �������� ��������� L!�3� ����������
��������8%�>)���()L�����6�&�0���%�)/�&��������������%�� �C/)8����� (�����>))�����������!���������
>))�����������!���.����>)��������������-���!������!��������������������������>@�����/�&����
�������E�$�����>�����;������:������!������������������������������������������������� � ���������������������
"� ����� � ��>)>�
�
��!�������@L ��� ���%������������L!�3�������������������%�-��� �������� �����L!�3������������L%7$":
���>%� ��L%7$":������>� ���� ��L%7$":�������>� ������� ������� -���� $�.������ ������������ ����
������������6(/(/C/������(/(/C/D������������8/�&�������������������-�����������L%7$":@L ��:���>%�
��L%7$":@L ��:������>�������L%7$":@L ��:�������>�6%�����E/>�!8/�
�
"���������������������������������������������������������-������������!��������!�����������������
�������M����!����������������������!�������������6�����������>???8/�$�����������������������6"$$���
�$$%�"�����������������%�5���N8���������������>E?@:>E?*�60&D))?@(>8������������������������
D)��60�D)��CE>8�-�����������������������"���&�������������������&������������������63���������
$�����������/�7��/%�&��2������%�;3�%�$�������8����������������������F������������/�����������������
-��� ��� �����-�%� 6%8� EF� $��$�$"���$��$$&&"""��$&"&"� �F� ���� 6�8� EF�
&""&"&�"""&""&&$$���""&$�$���F� 6����!����������� ���������� ������������������� ����������
��������������>E?@8/�&����������������������L%7$":@L ��:���>�6>))��8�-������������!���������C������
>� ���� ��� �� �������� ����������%� >/@���&����������� !����%� >/@��� >)L �:������������������� 6�$&8%� D�
����������0$��������������� (�� ���>@��/�&���� ������������������� �������������������� ������� ������
-���� ��� ���� ��'������ �$"�&"/� $� ���� -��� �������� ��� �� E)��� ������� ����������� >/)� ����� ���
���������� &�'%� E��� >)L� ���� %�������� ���� A����%� )/��&� ����� �0&�%� >�&�&���D%� )/��&� �����
����%�>(/E���������������������������0$����� (�����E)��/��������������������-�����������-�%�?D���(�
��������6>������8%�?D��%��)��������=�EE����)��������=�@*��%�D���������6()�������8%�@*��%�>)���������
6>� �����8/� ���� �������� -��� ������������� "���� $���� $A3� ?C))� ������� �����/� &���������������
��������-��� ���������� ������ E�™� :&>��5/������ 63���������$�����������/�7��/%�&��2������%�;3�%�
$�������8�����������������F�� ����������/�A�����%�(������ ���������������� ��������-��� ����������
�����E)������5/����������������������/�&�����!���-�������!���������������>)������������������:�������
��� �� D(��� -���� !���� ��� �)� �������� �����-��� !�� ����!������ ��� >� ������� ��� ���/� &��� ������ -���
����������� ��� ())������ D(��� ���� 6()�<7� �������%� E�<7� ������������%� )/E�<7� 0���%� >)�&�&���(%�
()�&��������8/�&��������������������-�������-������������!�� ����!����������C������>�����-����
��������6(�)��8/�&����������������-�������������7A:$����������6>)�<7��������%�E�<7�������������%�
E�<7� 0���%� >E�<7� ���8� ����������� ����������� 6>))��<��%� �����:$������ ���/� 7��%� ������� ���%� 0�2%�
$�������8���������!���������C������>@�����/���������������-����������������������������������������
����������� 6�������� (/(/C/C8� ���� ��'������� 6�������� (/(/C/?8� ������ �� ����� ������������� (E)!��
�������E�$�����>�����;������:������!������������������������������������������������� � ���������������������
"� ����� � ��>)(�
��-���������������������������������������6EF�""$$"$&�$"$$"""$"�&&"$��F8������������������
�������������������-��������������������������6%�����E/(8/�
�
6, ,�,�, #/����-7)#4��7-�����#/����-7)#4��7-/�
�
&����������������������������������������������������-�����!���������������������$,-,.��#%�">�
���� "�� -��� ���������� !�� ���� ������ �5�5:;>� 6���������� ���� ������� ��'������ ��� ;>� ������� ���
$���� 8���������������6.�����������������H���������%�%�����E/��!8/�$��������������������">��������
�������������������;�������">�6%8�����;�������">�6�8����������������������"�%�������;�������"��
6%8�����;�������"��6�8�6&�!���E/>8/�&���������������������������-���������� �����0��3�����A�� 3�
������������%7$":�&;™:>�/�&���������������������������������������">�����"�%�;�������"��6�8�
����;�������">� 6�8%� ��������������:�������� @L����������� ���� ��� �������������������� 6&�!��� E/>%�
%�����E/��!8/�&����������������������-�����������L%7$":@L ��:">�������L%7$":@L ��:"������
-�����'�������������������������������-����������!���������'�����/�
�
;%&%%%& �������������
�
&���������(?�&%�03 �&������� ��>������������-�����������������&CE�����.��6�������7������������%�
��-�� ����������%� &����%� 0�2%� $�������8� ����������� >(��� ��� ���!����F�� &�������� 5����� &������
6�&5&8� �� ������ &������� 5��������� &����� 6�&5&8� ������������� -���� >)7� 6�<�8� ������ ����� �����
6��������� �&5&<�&5&8/������� -��� ����!����� ��� �C��� -���� E7���(� ��� �� ����������� ����!���/� $���
��������������-���������������������������������'��������!����M�������/�&�����-������������-����
��-��./�������-������������!��������������������%�-�������-�����A������ ������������-���� (������
)/(E7� 6-<�8� &������ )/�*��<7���� 5�&$¡D0�� 6"�!��%� 3��������� $�������� ���/� 7��/%�&�� 2������%� ;3�%�
$�������8/� &��� �������������������� -��� -������ ��� >(���� ��� ��������������� ����� ���������� ����
�'���������������������������������������������.����������/�&-���������������������������������������
-��������������������������������������������������?):?E7��������������������������������������/�
103Dunning
Chapter 5 Adamts1 and Versican: Recombinant protein production and functional roles during in vitro oocyte maturation
Figure 5.2 Mutation of the Adamts1 zinc binding region.
Generation of a catalytically inactive construct of Adamts1 was achieved by PCR based mutagenesis ofthe zinc binding domain as described previously (Kuno et al. 1999). A single point mutation of Guanine(a, red box) to Cytosine (b, red box) at nucleotide 1596-1598 (NM_009621) and corresponding residue403 (NP_033751) was introduced. This missense mutation resulted in a GAA � CAA codon change (aand b respectively, blue boxes) and a Guanine (E) � Cytosine (Q) amino acid substitution.
a
b
Wild Typep3xFLAGAts1 sequence
Mutagenised zinc binding regionp3xFLAG-E/A Ats1 sequence
Chapter 5 Adamts1 and Versican: Recombinant protein production and functional roles during in vitro oocyte maturation
104Dunning
Figure 5.3 Schematic representation of the domain organization of Versican and generatedVersican constructs.Schematic of Versican domain organization (a). SP, signal peptide; Ig, immunoglobulin-like; TR,Tandem repeat, Egf, epidermal growth factor-like; CRD, carbohydrate recognition domain; CBP,complement binding protein. Constructs were generated to assess the functional importance of differentdomains (c). Designated names of each construct are found to the right of each schematic. The pECE-V1 contained the entire coding sequence of the V1 isoform of Versican and was a kind donation fromJohn Sandy (b). The G1 and G3 domains of Versican were amplified by gene specific primer basedpolymerase chain reaction (PCR) and sub-cloned into mammalian expression vector p3xFLAG-CMV13(Sigma-Aldrich) (c). The amplified G1 domain terminated at the DPEAAE amino acid sequence normallygenerated by Adamts1 cleavage. A 6x Histidine tag was also introduced at the C-terminus of the G1 andG3 constructs, upstream of the FLAG tag present in the p3xFLAG-CMV13 vector.
p3xFLAG-6xHis-G1
p3xFLAG-6xHis-G3
pECE-V1
SP Ig CS attachmentTR CRDEgf CBPTR Egf
G1 Domain G3 Domain
SP Ig CS attachmentTR CRDEgf CBPTR Egf
SP Ig TR TR
CBP
3xFLAG C-termianl tag
6xHistidineC-termianl tag
Chondroitin Sulphate
a
b
c
CRDEgf EgfDPEAAE
�������E�$�����>�����;������:������!������������������������������������������������� � ���������������������
"� ����� � ��>)E�
�
;%&%%%& ���� ���� �����������1���� ����� ������ ���������� �� �������� ���
�����
�
5��������������������������� ����������� ��������������������$���� �6%�����E/>�����%�����E/�8�
-��� ����������� ����������� ����� (?�&� ������ ������� ��� @� -���� ������� 6������� 7���� ��������%� ��-��
����������%�&����%� 0�2%� $�������8%� ��� (��������������������/� &�������� ������������� -��� ��������
������ 7������������™� ()))� 63��������� $�������� ���/� 7��/%�&�� 2������%� ;3�%� $�������8� ��� ��� ����
�����������F� �����������/�A�����%�D���������������0$�-������������(E)�������:���������� �������
��!������>)���7������������™�()))�-������������(E)����������:�������������������������!�/�&���
��!���-�������!��������E�������������������������=���������������-�����������!�������������-���
�������!��������������������������������()��������/�&����0$<7������������™�()))����������-���
����� ��������� ����� ������ ��� �� ���� -���������/�&����� -��� �������� E� ����� ����� ������������ -����
����������&5&��������������>��������������3&��6�������%����������������������%������:$���������/�
7��%�������� ���%�0�2%�$�������8/�%������������������������������������������%� ������6E��<��8�-���
��������� ��� ���!��� ����������� ��� ����!������ ������� ���� ���������� 6����� ����&���������� >??*8/�
&�������������� ������ -������������ D*������ ����� �����������/� &��������� -���������������������
��!��� !�� �������������%� >>))��� >)��������� ���� ����������� -��� ��������� ��� �� ��-� ��!�/������
������ -��� -������ -���� ������� �A�� 6)/>�C&� 0���%� )/))(C&� ���%� )/))D�� 0�( ��D%� )/))>DC&�
� (��D8� ���� ��������� !�� ����� �������� �����-��� !�� �������������%� >>))��� E��������/������ ��������
-�����������������>))����3�$�!�����6>E)�&�0���%�>7�6�<�8�0�:D)%�)/E7�6-<�8�������������%�)/>7�
6-<�8� ���%� E)�&� &��: ��� � *8=� ���:����!��� �������� ��!��� -��� ������� !�� �������������� ���
>�%)))������>������������������������-�����M������2������!������������/�
�
2���!���������� �:�>��������������!��������������-��������������������������;>�$,-,.��#�6�5�5:
;>8� ������ � �:;>� 6%����� E/�� !%� .���� ��������� ���� ���/� �/� 7�A���%� ��������� ��� 7���� �������%�
#������������ &�������� ���� $������8/� ;������������������ �:;>������� -��� �������� ������������
���������� 6��&� &����������� ��� ��������� α&5&8� ��� ���� ��� ��������� ���!��� ���������/� ���!���
������������ ��� ���� ���%7$":@� ��:���>� �������� ����� ���� � �:;>� ����� ����� ��������� �������� ����
��������������� ���������������� 7������������®� ()))� 63���������$�����������/� 7��/%�&��2������%�;3�%�
$�������8� ��� �����!��� �!���� ��� ��������� �����������/� ���!��� ������������� -��� ��������� ������
�������E�$�����>�����;������:������!������������������������������������������������� � ���������������������
"� ����� � ��>)@�
D))��<���"D>*�6������������α&5&8������������-����������������������������������-����������-�������
����������/� ����$�����>�����������-�������������������������������������%�-�����-���������� �:
;>:���>/�
�
;%&%%%( '�� ��� ����������� ���������� ��
�
��������������� @� ��� ������� ����!������ �������� -��� �������������� ��A����� ������ 63���������
$�����������/�7��/%�&��2������%�;3�%�$�������8/����������������-�����������������@������������� (��
�����-��� !�� �-�� -������������ (� �� @������ -���<�'����!������ !����� 6D)�&� ����� � � C/)%� >&� 0���%�
>)�&� �����M���8/�%����������������������������������� 6��������������������!��������'����!����� �����
����������������������()�&� ������ �C/)%�)/E&�0���8�-���������-������������������������������
����)��������/�&������������������-�������������������������������������6A��:����7�!��������
���/� 7��/%� "����������%� 0�2%� $�������8� ���� ���� ���-������� ���������/� &��� -������� ����������� -���
����������!�����������������������������������������M�����������-����!�����6D)�&� ������ �C/)%�>&�
0���%�>):E))�&� �����M���8�����������������������������������!���������������������!�������������
��� �������/� �����������!��������������������������������� ��� ������������������� ����!������$�����>�
��������-��=�-���<�'����!������!�����6D)�&� ������ �C/)%�>&�0���%�E)�&� �����M���8�������(���D�
���-������ �����-����!����������D����������������������������D���E))��� �����������������������!�����
6D)�&� ����� � � C/)%� >&� 0���%� (E)� �� E))�&� �����M���8/� ���������� !����� ������������� ����
����������� ��� ������������������� ����!������">��������-��=�-���<�'����!������!����� 6D)�&� �����
� �C/)%�>&�0���%��)�&������M���8�������(���D����-�����������-����!����������D������������������������
���� D� �� E))��� ����������������������� !����� 6D)�&� ����� � � C/)%� >&� 0���%� (E)�&� �����M���8/� &��
����������!������"��������%�-����������������������������� ���������������� �����������:��������������
���� �����-���������������-�������=�-���<�'����!������!����� 6D)�&� ������ �C/)%�>&�0���%�>))�&�
�����M���8�������(���D����-�����������-����!����������D����������������������������D���E))������������
��������������!�����6D)�&� ������ �C/)%�>&�0���%�E)�&�5�&$8/�
�
�������� ����� �������;�������-�����.������������� ������������������������� 6#������������$�������%�
$�������8/������!������;�������-���������������� �:;>���������������������������!�������������
6������������ �� ���� ())C8� ������ �� ���!�������� ��� ������ ��������� ���� ���� ���������� ������������/�
A�����%� ������������ ������ -��� !����:����!��� ��� N:��������� 6>)� ��<����� ��� ������%� $�������
�������E�$�����>�����;������:������!������������������������������������������������� � ���������������������
"� ����� � ��>)C�
A����������%�"5� ���������A��:������������/�7��/%����������0�2%�$�������8����D¨�� ���(D:D*��� ���
���� �������� ��� �������� ����!���� ��!����� 6������ $������� �������%� ������� ���%� 0�2%� $�������8/�
;�������-����������������(&�0��������A�%�� �C/D�������������!���������������������������������
�D))�6>E�x�@E):���������%�$�������A����������%�"5� ���������A��:������������/�7��/%����������
0�2%� $�������8���������!��� ���������� 6��..�������� ())�8/� &������������ ����������� ;������� -���
�����������������>):():������������������������������� ������� 6$������A������������%�A�����%�&$8�
���� 0������&&� ���������������� 6����� $�������%� ����������%� ;3�%� $�������8� -���� *� E)%)))� ����
�))%)))����:����%������������/�&������������������������������������;���������������-�������������
!�� 2������ !���� ������ ���� α:;�� ����!���� �������� ����!������ ������ ;������� �������� !�� ���/�
7�A����������������������!���6�������������>??E8/�
�
;%&%%%; '�� ������������� ������ ��������A����������� ���
�
���� ����!������ �������� -��� ����������� !�� 2������ !���� ��������� ��� ����%���� ���/� � �������� -���
���������!��>(7����:�$"5������������������;�%����!����6��������������(/(/E8/�&��!�����
-��� !���.��� -���� �� ��������� ��� E7� 6-<�8� ���:���� ���.� ��� �A�� 6*)�&� 0�( ��D%� ()�&� 0� (��D%�
>))�&� 0���8� ��� >� ���� ��� ���� ���������/� � &��� ���!���� -��� -������ ����� ������ ��� �A��
����������� )/)E7� &-���� ()� 6�A�&8/� &��� ����������!���%� ��!!��� $0&3:%7$"�� ����������� $���!����
6�����:$���������/�7��%�������� ���%�0�2%�$�������8�-����������� ���� ���������������������������
(/Eμ�<��� ��� �A�� ����������� >7� A�$� 6�����:$������ ���/� 7��%�������� ���%� 0�2%� $�������8� ��� ����
�������������(�����/�A�����-��������-����������A�&���������!�����-�����������������������:
���.�������:�!!���3�"����>:E)))�6&�������%�0��������%�0�2%�$�������8/�5��������������������������
���������� -��� ����� ��� �������������F�� ������������ 6$������� A����������%� "5� ��������� A��:
������������/�7��/%����������0�2%�$�������8/�
�
$���:%���� �������������������� -��� ����������� ��������-������ �������������� ������� ���������/�
3�������������������-�����������(D����������������������/�������-���-������!����������A������
������-����������������������������>)�����>�������6�8����������������:()��/�������-�����!��'�������
-�������-����-�����A�/�������-���!���.��� ���>7�A�$<�A�����>)�������������������������/�&���
��������!!���$0&3:%7$"�������������$���!���� 6�����:$���������/�7��%�������� ���%�0�2%�$�������8�
-��� ����!����� -���� ��������� Eμ�<��� ��� �A�� ��� >�������� ���� ���������/������� -��� -����������
�������E�$�����>�����;������:������!������������������������������������������������� � ���������������������
"� ����� � ��>)*�
����!����� -���� ���� ��������� ����!���%� $����� %����� D**:���.��� ����:�!!��� 3�"� ��� >:E))� 6&��������
��!��%� 3���������$�����������/�7��/%�&��2������%�;3�%�$�������8� ����A�������������>7�A�$� ����)�
�������� ��� ���� ���������/������� -��� -������ ���� ������� �������� -���� �))�&� �$�3� 6&��������
��!��%�3���������$�����������/�7��/%�&��2������%�;3�%�$�������8/�
;%&%%%� � ������ �������� � ���������''�1�����
�
���������������������:�$"5������-����������������� ���������������������.���6A��:����7�!��������
���/� 7��/%� "����������%� 0�2%� $�������8� ��� ��� ���� �����������F� �����������/� � A�����%� �����-����
�������������%����:�$"5������-��� ������ ���%��������5���������������� 6E)7���������� 6�<�8%� >)7�
������������6�<�8%�>)7�%��������5������������������6�<�8������)7�&����N� (��6�<�8����()���������-����
���������/�"����-���-�������-�������&����N� (�����>)��������/�������������������������-�����������
!�� ����!������ ���>E:()��������%�-�������������%� �����������������E7������������������������ 6�<�8%�E7�
���������� &������� ��������� 6�<�8%� E7� 3����� ������������ ������� 6�<�8%� E)7� ������������
$������������������ 6�<�8������E7� ()� 6�<�8/�&�������������������-�����������!��-������������ �����
������������E7�������������6�<�8����>E��������������-���!������������&����N� (�����E��������/�"����-���
��������������������������������6��>()�����.8/�
�
;%&%%%9 "�� )������������������ ��� �� �������������� ������ �����6�� ���� ����
'����%�
�
��������������������������%������������������������������������������� ���������������������������
�����-���������������������!���6���������/(/>8/�3������������������������������;������������������
���������� � ���%�3;&�������-����������������-����������������!������������������;�������6��������
E/(/>/D%�����������!�����>:()���������8%� E)�3#<��� ����!������������%� � 6�����:$���������/� 7��%�
������� ���%� 0�2%� $�������8� �� ���<��� 5��� 6�����:$������ ���/� 7��%� ������� ���%� 0�2%� $�������8/�
%����-���� �� ������� ��������� ()� �� ���������� ��� �������� ���������� -������������ ��������!��� ���
�������� (/(/(�!���� ��������!�����-���-��� !����� ��� ���� �������������������%�-�����-��� ��������
���������������������!����������������������/��
�
�������E�$�����>�����;������:������!������������������������������������������������� � ���������������������
"� ����� � ��>)?�
&����������� ���� ���������� ����:�������;�����������$�����>:��������;����������������������������
� ���%�������������������-������������������ �:�>�������������%�� �:;>������ �:;>:���>������/�
A�����%� ���� ����� ������ -��� ������� ��� �'���� �������� ����� &CE� ����� ������� ����.� 6������� 7���� ��������%�
��-������������%�&����%�0�2%�$�������8� ���������&�������5���������&�����6�&5&8��������������-����
>)7�6�<�8����������������/�������-�������-�����������������������.����(D�������C���-����E7���(������
����������� ����!���/� &��� ������ -��� -������ ���� ���� ������ �������� ��� ����� ���� �&5&�
�������������-����>�������������� 3&��6�������%� ���������������������%������:$���������/�7��%��������
���%�0�2%�$�������8���������!����������������D*���������������������������������������������/��&���
����������� �:�>%�� �:;>������ �:;>:���>���������������������������������������� � ���� -���
���������!���������������������3;&�������-����E)%��)%�>)����7�6�<�8����������������������E)�3#<���
����!������������%� �������������/�
�
6,/ '0�1� ��
6,/,� "������������� ��� B������� 9��� ������� �� ����9����� �������
#�������
�
%����-���� ���� ������������ ��� �������� ���������� ��������%� ��L����:���>%� ���%7$":������>%�
���%7$":�������>������������������� ��������� ���%7$":5<$����>� 6%����� E/>�!������������� E/(/>/>/>8�
����������������������������������!�������������-������������!����������������������������%7$"�
���� ����������������������2������!������������������������������������������������������� �����(?�&�
������6%�����E/D8/��3����������������������-���������%7$"���������������������������������������-����
���%7$"���>%� ���%7$":������>%� ���%7$":�������>� �� ���%7$"� 5<$� ���>� 6%����� E/D� �:�8/��
3������������������ ����������� -���� ���%7$"���>%� ���%7$":�������>��� ���%7$":5<$����>%����-���
���������� ��������� ��� ���������������������� ���������� ������ 6%����� E/D��%� !������%�.�������.�8�
���������������������������!������������������������������� ������5�&/�&�����������������������-�������
��������� ��� ������ ����������� -���� ���%7$":������>� 6%����� E/D� �8� ����������� ��� ��� ���� �������� ��
���������!����5�&/�
�
2������ !���� ��������� ��� �������� �������� ���� ������ ��� ������ ����������� -���� ���%7$"���>� ����
���%7$"�5<$����>����-���������α:%7$"���������������!���������������������>>).�������*E.����
110Dunning
Chapter 5 Adamts1 and Versican: Recombinant protein production and functional roles during in vitro oocyte maturation
Figure 5.4 Immunolocalisation and Western blot analysis of recombinant Adamts1 proteins.
p3xFLAG constructs containing Adamts1 were transfected into 293T cells and their expressionanalysed by immunohistochemistry using �-FLAG antibody (Sigma-Aldrich) and DAPI nuclear stain (a-d). Cell lysates and media were analysed by Western blot using �-FLAG antibody (e-h). Successfuldetection of FLAG immunoreactive proteins was seen for full length Adamts1 (p3xFLAGAts1) (a);catalytically inactive Adamts1 (p3xFLAG-E/A-Ats1) (b); �proAdamts1 (p3xFLAG�proAts1) (c) and �DisintegrinAdamts1 (p3xFLAG�DisAts1) (d) transfected cells. A band corresponding to a recombinantpro form of Adamts1, ~110kDa (black arrow heads, Russell et al, 2003), was present in the cell layer ofp3xFLAGAts1 and p3xFLAG-E/A-Ats1 transfected cells (e and f respectively). These transfectants alsoproduced a band corresponding to a mature recombinant Adamts1 (~85kDa, open arrowheads, Russellet al 2003) present in the media. Anti-FLAG immunoreactive protein was detected within cells ofp3xFLAG�proAts1 (c) however, no bands of predicted size were detected in either media or cell layersby Western blot (g). A band corresponding to the predicted size of 56kDa (calculated usingbioinformatics) was present in both cell and media layers of p3xFLAG�DisAts1 transfected cells (arrow,h).
�
a
b
c
d
e
f
g
h
p3xFLAGAts1
p3xFLAG�DisAts1
p3xFLAG�ProAts1
p3xFLAG E/A Ats1
�
�
�
������
e
f
g
h
75
50
�������E�$�����>�����;������:������!������������������������������������������������� � ���������������������
"� ����� � ��>>>�
��� ���� ����� ���� ������ ������ ������������ 6%����� E/D� �� ���� �8/� &����� !����� ��������� ��� ��M���
��������������:�����������������$�����>%�������������6��������������())��8���������������������:
$�����>��������������������������-�����������������������������������������/�&������%7$":������>�
���������-��� ���������������������������������������������!������$�����>���������������������!��
��� ������� ��M�� ��� ������ $�����>� ���������� ����� ������������ -���� ���%7$"���>� 6%����� E/>� !8/�
��������� ��������� ��� ������� ����!������ ������� ��� ������ ���� ����� �� ������ ������ ��� ���%7$":
������>������������������!��2������!����-����������������������������������������α:%7$"����������
������� -������ ����������� ������ !�� �������������������� 6%����� E/D� �� ���� �%� �����������8/� � 3�� -���
���������� ������������������ ��� ����������� �������� ������� ��� ���������������� ������ !�� ����������
�������������������������������������������������������/�
�
&��������������������%����%7$":�������>%�-����������������������������!������$�����>��������
��������������������&��>���������������������-��������������������������������6%�����E/>�!8/� . �
�������������� ��������� ���� ����!������ ���%7$":�������>�������� ��� !�� E@.��� �����M�/�$���:%7$"�
2������!�������������������%7$":�������>���������������������-�����������!����������������������
�����-���������������� ���������������M��6E@.��%�%�����E/D��%�*��8/�$�!����������������M�%�!������
���������������%�-����������������������������������6%�����E/D��%����8/�
�
&�������������������!������������������$�����>������������������!��α−%7$"�2������!����6%�����E/D�
�8�-������������-�������$�����>�����!�������������������������������������������������$�����>�
6α:$�����>:&&�%� ������� ������ α:$�����>:&�8� 6�������� �� ���� ())��8/� 3�� �������� 2������ !�����
������α:%7$"�����α:$�����>:&&������!����������>>)�����*E.���!�����-����������������������������
������ ������ ������������ 6%�����E/E��<!%� ������>�����(%�)���5������� �����.���8�!������� ���������
�����������-�������%7$":5;��������6%�����E/E��<!%�������������D������������8/��&����������������������
>>)� ���� *E.��� !����� ��� ����������� ��� ���� ��:� ���� ������ ����� ��� $�����>� �����������/� � $��
�����������α:$�����>:&&����������������!���%��������������EE:@).��������M�%�-�����������������
����� �������� ��� !���� ���%7$":���>� ���� ���%7$":5;� ����������� ������ ���� ���� !���� ���������
�������������������������!�������������������!�����:���������6��������������())��8/�$����������������
��:���������$�����>����������������������-���������������(?�&�����������������α:$�����>:&&��
����!���� ��� ���������� ������ ����������������� 6%����� E/E� !%� ������������ D8� ���� EE:@).��� ������� ���
�������������������:��������/�
�
112Dunning
Chapter 5 Adamts1 and Versican: Recombinant protein production and functional roles during in vitro oocyte maturation
Figure 5.5 FLAG tagged recombinant Adamts1 protein is immunoreactive with both �-FLAG and�-Adamts1 antibodies.p3xFLAG vector containing the entire coding sequence of Adamts1 (p3xFLAGAts1) or no insert(p3xFLAG EV; empty vector) were transfected into 293T cells and cell lysates (a and b, Lanes 1 & 3)and media (a and b, lanes 2 & 4) were analysed by Western blot using both �-FLAG (Sigma-Aldrich)(a) and �-Adamts1-MMP (b) antibodies. A band corresponding to a FLAG immunoreactive proAdamts1, ~110kDa (black arrow head), was present in the cell layer of p3xFLAGAts1 transfected cells(a, lane 1) and a mature Adamts1 band present in the media (~85kDa, open arrowhead, a, lane 2) .Bands of similar size were detected in the cell layer and media extract using the anti-Adamts1-MMPantibody (formally termed Anti-MP-ADAMTS-1, Russell et al, 2003). Similar sized bands were notdetected using either antibody in either the cell or media layer of empty vector transfected cells (a andb, lanes 3 and 4 respectively). Anti-Adamts1-MMP also detected a non-specific band of ~60kDa in thecell layer of both Adamts1 and empty vector transfected cells as seen previously (b, lanes 1 and 3,black arrow, Russell et al 2003).
a b
250
150
100
75
50
250
150
100
75
50
�-FLAG �-Adamts1-MMP
p3xFLAGAts1 p3xFLAG EV p3xFLAGAts1 p3xFLAG EV
1 1 2 3 42 3 4
�
�������E�$�����>�����;������:������!������������������������������������������������� � ���������������������
"� ����� � ��>>��
&���������������-����������!������������������������������������������������������$�����>����-����
��� �����:�������� ������ ��� ������������ �������� ��� ����������� ����������� (?�&� ������ ���� ���� !��
���������!�������%7$"����%�������������������������������������������������������!����������������
����������/��
�
6,/, �����������������9�����������������������)����
�
&������������������������� ��������!������������$�����>��������-������������!�����!��� ������������
� �:;>�������-���� �������%7$":@� ��:���>��������/� �&������������������������� ����;>� ����������
;������� 6E/(/>/�8/� %���� ������� ����!������ ;������� ���� ������ ����!������ $�����>� -���
���������������������� ��� ������������� ����� �:;>:���>� ����� ����%������� ���� α:;����������� α:%7$"�
����!������ 6%�����E/@�������!8/�&����������%���5$$5%����������!��$�����>�������������;�������
-��� ����� ��������� ��� ���� ������ ��� ���� � �:;>:���>� ����� ����� 6%����� E/@� �8%� ������������� ����
����������������������������������;�������!������!������$�����>/�
�
6,/,/ �#���������������9������������#����������
�
&�����!������������������������������!����������������@�� �������������!����������-��������������
����� �������%7$":��������������� ��������������������������!�����.������������������������� 6%�����E/>�
!%� �������� E/(/>/>/>8/����������������� ���� ������������ �������� ������� ����!������$�����>� ��������
-��� ���������� ������ ���������� ��� ���� ���%7$":@� ��:�������� ��������� 6%����� E/>� !8/� ������
��������� ���� 0�:����� -���� ���������� �������������� ��� �����M���%� ���������� ���� �E@.��� α:%7$"�
��������� !���� ������������ ��� ���� ��M�� ��� ����!������ �������� ������� ��� ���� ������������ ������
6%�����E/C��%����8����������!����-��������������������������������������������������-����0�:����/����
��������������!�����-������������ ���!����(E)�&�����E))�&� �����M������������� 6%�����E/C��%�,*�
�/@�*����6�������,/�/@@�*����6��%������������8/�%�������������-������-�������������������
!����� ������������ ��� ����!������ �������� ������� !�� 2������ !���� 6%����� E/C� �%� ,*� �/@�*�
���6�������,/�/@@�*����6��8����������������������������������������������������������������
!��������������6%�����E/C�!%�,*��/@�*����6�������,/�/@@�*����6��8/� �-�����������!������
������������� �������������� ����������������� ��� 5D����� 5E� -��� ����� >)7� ����� ����� ����� ��� ���� ������
�-FLAG �-JSCDPE
150
100
75250
350�
Med
ia
�-Versicana b c
Ce
ll
Me
dia
100
75
50
Me
dia
114Dunning
Chapter 5 Adamts1 and Versican: Recombinant protein production and functional roles during in vitro oocyte maturation
Figure 5.6 Recombinant Adamts1 is catalytically active.p3xFLAG vector containing the entire coding sequence of Adamts1 (p3xFLAG-6xHis-Ats1) was stablytransfected into a CHO-K1 cell line already stably expressing the V1 isoform of VERSICAN (Kinddonation by Prof. R. LeBaron. Cell lysates and/or Media were analysed by Western blot for full lengthVersican (a) using �-Versican antibody (Sandy et al. 2001); the pro and mature forms of recombinantAdamts1 using �-FLAG antibody (Sigma-Aldrich) (b); and the ectodomain DPEAAE generated byAdamts1 cleavage of VERSICAN using �-JSCDPE (previously termed anti-DPEAAE, Sandy et al.
2001) (c). A band, approximately 350kDa in size, corresponding to full length Versican was detected inthe media (a, black arrow). The pro (~110kDa, black arrow head) and mature (~85kDa, open
arrowhead) forms of recombinant flag tagged Adamts1 were present in the cell layer and mediarespectively (b). The ectodomain DPEAAE generated by Adamts1 cleavage of Versican was detected inthe media (c, ~70kDa, open arrow).
115Dunning
Chapter 5 Adamts1 and Versican: Recombinant protein production and functional roles during in vitro oocyte maturation
Figure 5.7 Optimisation of recombinant Adamts1 protein purification.
p3xFLAG-6xHis-�DisAts1 was transfected into 293T cells and the media collected for purification.Purification was carried out by nickel affinity chromatography utilising the introduced C-terminal6xHistidine tag. Optimisation of purification involved binding of the recombinant protein present in theconditioned media, 2 washes of the resin with buffer containing 10mM imidazole (W1 and W2) followedby serial elutions with increasing concentrations of imidazole (E1-E5). Anti-FLAG Western blotting wasused to determine which fraction the recombinant Adamts1 began to elute in (a) and an identical silverstained SDS-PAGE gel to determine the purity of each fraction (b).
a
�-FLAG
Silver Stain
b
Adamts1 and Versican: Recombinant protein production and functional roles during in vitro oocyte maturation
�-FLAG
�������E�$�����>�����;������:������!������������������������������������������������� � ���������������������
"� ����� � ��>>@�
������������������ 6%�����E/C�!%�,*��/@�*� ���6��%�,/�/@@�*� ���6����������� �����������8�
������������������������!�������������-�����������������������������������������������������������/�
$������!���������������������������������-��.������>))�&������M����������������������E)�&�6%�����
E/C��8%�-���������������������������-���������������-������ ���� ����������� ���E)�&� �����M���� �����
-�������� ����� ������������� ���� ������������������� ����'����!��������� ���� ��������� -������� ������
�����������������������������������������������/���
�
$�� �������� ��� ���� ������������ ��� ����!������ $�����>� ������ ���� ���������� ����������� ��� ���-�� ���
%����� E/*/������������������������������ ��������� �������������������� ���%7$":@� ��:����%� -���
�����������α:%7$"�������!������������������������6%�����E/*�������!%������������%���������!������
���������E/(/>/E�����E/(/>/@8/�$�������!�������������������������$�����>�6�*E.��8�-���������� ���
�������������������� �������� �����������������6%�����E/*��%����8/�$��������!����������������M��-���
�������������������!�������������������������-���%�!������-������������������������������>:��6%�����E/*�
�%� 7�� ���� ,��,J8/� ������� !����� ��������� ��� ��������� >:�� ������ α:%7$"� ������!�������� -��� �����
��������� !�� ������ ������ 6%����� E/*� �� ���� !%�,�:,J8� ������������� ���� ����� ������ ��� ����!������
������$�����>/�
�
6,/,3 �#��������#����������������9�����4�������#�������
�
���������������� ���������������� �������� ��� ����!������">�;�������-���������������������!���
�!���� ���$�����>/�&�������������!��������������������������������� ���� ���������� ���$�����>=����
����!������ ">� !����� ��� ������ ��� �� ������������� ��� E)�&� �����M���%� ������ �)�&� -��� ����� ���
-������������'����!������������ 6E/(/>/D8/�$������������� �������������� ���������������;�������">� ���
���-�� ���%�����E/?/� �&��� ����!������">� ��������-������������� ��������� ����;������� ��������
��������� !�� $�����>� ��������� -����� � ������������� ����������� �C).��� 6������������ ())>=�
�������������� ())��8/�2����������� ����� ���� ����!������">��������-����� !����������������/E.���
��������� ��� ���� ��������������� ���� ��!���� �������� @� ���������������%7$"� ����� 6��� �CD.��8/� A��
2������!���%� �-��α:%7$"� ����������������������-������������ ��� ���������������������������-���
������������� CE:*).��� ���� @E:C).��� ��� ��M�� 6%����� E/?� �%� ���8/� &��� ">� ����!������ �������
������������������������������������������������������%�����������������������-���������������������
��� !�� ����!������ ">� -���� ����������� ��������� ������������ ���� ���� ��-�� ��� ���� �-�� !����� 6�@E:
117Dunning
Chapter 5 Adamts1 and Versican: Recombinant protein production and functional roles during in vitro oocyte maturation
Figure 5.8 Optimised purification of recombinant Adamts1 protein.
p3xFLAG vector containing the entire coding sequence of Adamts1 (p3xFLAG-6xHis-Ats1) wastransfected into 293T cells and the media collected for purification of mature recombinant Adamts1.Purification was carried out by nickel affinity chromatography utilising an introduced C-terminal 6xhistidine tag and optimised washing and elution conditions as determined by Figure 5.7. Anti-FlagWestern blotting was used to verify that a protein of approximate predicted size was eluted (a) and anidentical silver stained SDS-PAGE gel to determine the purity of each elution (b). An �-FLAGimmunoreactive band corresponding to the approximate predicted size of mature Adamts1 protein(~85kDa) was detected in elutions 1, 2 and 3 (a, E1-E3, black arrowhead). A protein of similar size,presumed to be mature Adamts1, was the predominant band detected by silver stain in these sameelutions (b, E1-E3, black arrowhead).
a
b
�-FLAG�-FLAG
Silver Stain
Adamts1 and Versican: Recombinant protein production and functional roles during in vitro oocyte maturatio
118Dunning
Chapter 5 Adamts1 and Versican: Recombinant protein production and functional roles during in vitro oocyte maturation
Figure 5.9 Optimised Purification of Recombinant Versican G1 protein.
p3xFLAG vector containing the coding sequence of the G1 domain of Versican (p3xFLAG-6xHis-G1)was transfected into CHO-KI cells and the media collected for purification of the recombinant protein.Purification was carried out by nickel affinity chromatography utilising the introduced C-terminal 6xhistidine tag and optimised washing conditions. Anti-Flag Western blotting was used to verify that aprotein of approximate predicted size was eluted (a) and an identical silver stained SDS-PAGE gel todetermine the purity of each elution (b). A strong band was detected in elutions 1 and 2 (a, E1 and E2).A predominant band of similar size was detected by silver stain in these same elutions (b, E1 and E2).
a
�-FLAG
Silver Stain
b
mts1 and Versican: Recombinant protein production and functional roles during in vitro oocyte maturation
�-FLAG
�������E�$�����>�����;������:������!������������������������������������������������� � ���������������������
"� ����� � ��>>?�
C).��8�-������/� &���������������">�-������������������������� ��� ���� ���-� ������� �������� �����������
��������������������������������������������������������">���-���������������������������������������
�����.��-�� 6%�����E/?��%�(��.� ������8/�&���������� �-��!�����-������������ ������������>�����(%�
��-������������������">��������-������������������������������!�������������6%�����E/?��%�,������
,�8/� � A�� ������ �����%� ��������� >� ���� (� ���������� �� ����������� !���� ��� ������������� CE:*).���
�����������������������!����������������">������������������!��������!��������6%�����E/?�!%�,��
���� ,�8/� $���������� ������� !����� -��� ��������� ��� ������ ��������� !��� ��� ����� ��-�� �����������%�
����������������������!������">�-�������������������������������������������������/�
�
&�����������������������������������������;�������">��������-������������!�������������������������
����!������;�������"�/�&����������������������������������">��������������� ���������������������α:
%7$"� ���������������������������������������M�����"��6������������-�8/�$�����������������'������
����������������������������������������������������������������!��������������������������������������
���%�-�����-����������!�!������� ��������� ��� ����������������� ���� ��������������������������� ���
�������� ���� "�� ��������/� &��� ��������������������� ���� ������!��� �������� ��� ������� ������ !�������
��������� ��� �������.��� ����� �����-��������������������!�� �����M���/�5�&$� ��������������������!��� ���
��������������!�������������!������������������.���������������������������/�2����������������!�����
����������E)�&�5�&$���������������������������������������M��6D>.��8�-�������������������������-��
���������!��α:%7$"� ������!��������6%�����E/>)��%�,������,��������������������E/(/>/D8/�$�!�������
���������M��-������������!�������������� ��� ����������� �-����������� 6%�����E/>)�!%�,������,�%�)���5�
����.���8/� �-��������!���������������������������!������"���������-����������������������
!�����������������������������-��������������������!���������'��������������������������������������
����������������������������-��������������!���������������!�������������6%�����E/>)�!%�,������,�8/�
�
;%&%(%% 6�� ���� ������������������� ���
�
&�������������������3;&��������-��������!������;�������������������� �:;>���������������������
����� ������� ������������ �������� ��� �� ������������ �������� ��� ���� �������� ���������� ������ 6�53� U<:�
�/5/&/8��������� ����������-���� ������������6�A�%�#� 8/� �&���������53�-����������������� ����� �����
����������-���������-����������� ������������������5�����%� �6�P)/)E%�%�����E/>>��8%���-���%�
��������������������!���'����!����/� �2���� �����������������������������������-����������%������
Figure 5.10 Purification of recombinant Versican G3 protein.
p3xFLAG vector containing the coding sequence of the G3 domain of Versican (p3xFLAG-6xHis-G3)was transfected into 293T cells and the media collected for purification of the recombinant protein.Purification was carried out by nickel affinity chromatography. Sequencing revealed the C-terminalhistidine tag coded for 7 and not 6 histidine amino acids due to a nucleotide error in the reverse primer,resulting in strong affinity for and binding to the nickel resin. Elution of recombinant G3 was achievedusing 50mM EDTA. Anti-Flag Western blotting was used to verify that a protein of approximatepredicted size was eluted (a) and an identical silver stained SDS-PAGE gel to determine the purity ofeach elution (b). A band of approximate predicted size (~41kDa, predicted using bioinformatics) wasdetected in elutions 1 and 2 (a, E1 and E2). A band of similar size was detected by silver stain in thesesame elutions (b, black arrowhead, E1 and E2). Other contaminating proteins of similar intensities werealso present in these fractions.
120Dunning
Chapter 5 Adamts1 and Versican: Recombinant protein production and functional roles during in vitro oocyte maturation
Silver Stain
a
�-FLAG
b
n: Recombinant protein production and functional roles during in vitro oocyte m
�-FLAG
121Dunning
Chapter 5 Adamts1 and Versican: Recombinant protein production and functional roles during in vitro oocyte maturation
Figure 5.11 Purified Versican induces cumulus oocyte complex expansion.Degree of cumulus expansion (+/-SEM) scored following 20 h of in vitro maturation. Cumulus oocytecomplexes (COCs) were cultured in the presence of no stimulus (None), a 1:20 dilution of Versican(purified by size exclusion chromatography), Egf (3ng/ml) or FSH (50mIU/ml) (a). In b, individual COCscores were graphed for each of the treatments. Data is expressed as mean +/- S.E.M. (n27 COCs).Significant difference (P<0.05) represented by different characters.
a
b
a
b
cc
�������E�$�����>�����;������:������!������������������������������������������������� � ���������������������
"� ����� � ��>((�
��������-�����������������������������������)%�����������������������������������������������������
����������%���>%�������������������������������������������������������������-��������������.���
�����������������6%�����E/>>�!%�#� 8/�$�������������������������������������������������������-���
���������������������-����;������=������(����������������)�����%�������������������>%�-�����*�
�����������(���������6%�����E/>>�!8/�&������������������������-����������������������������
-��������!������;�������-����!������������������������������� � ���%�!����������������������������
��������� ����� �53� ������� ���� �� �������� ������ ��� ���� ���������� ��� ����� �������� -���� ����
;������%�-��������������������������������������������������������������/��
�
�������� ���������� � ���� -��� ����� �������������� ��������� !�� ��������� ����������� ����� ���
������������ ������ 6�&8� ����������� ����� ������� ����!������ ;������� ���� ���� � �:;>� ����� �����
�������� ��� �����53�����������������-��������'���� ���������������������������� ���� ������������
� �:�>����������/��&����������������-�����������������������������������������;�������������������
!����������/� �&��������-����E)%��)���>)7��&� ��������� ����������������� ����������53��������� ���
������� � �:�>� �&� ��������� ���� ���� ����� �53� ��� ����� ������������� ��� ;������� -��� ����
�������������� ��������� ���� ����� ����� ��� %� � ������� ��������� ������� 3;&� �������/� � %�������%�
����!������ ;���������������� ��� ���!�������� -���� $�����>� ����������� �������� ;������� 6%�����
E/@8���������������������������������������������� ����������53�������������������� �:�>��&/��$��
-���� ;������� �����%� �����53� �������� !�� E)%��)� �� >)7� ;������U$�����>� ������������������ -���
�'��������� ��� ����� �������� !�� E)�3#� %� � 6�P)/)E%� %����� E/>(8/� � &��� �53� ����� ��� E)7�
;������U$�����>�������������������-����������������������� ����� ����� ��������!�� ����������������
���;������������/� 3�����������53�������-����������� ���������� ���� �������� ����������������� ���
%� ����� ����E)7��&� ���������/�&��������-����E)�3#�%� � ������������������ ������������-������
!���� �������� ���������-����� ���������-����E)7�� �:�>��&� ���� ���������������� ����� �������� ���
������� ���!������������� ��������� 6%����� E/>(� !8� �������� ��� �������������� ��������� -������� ���������
6%����� E/>>%�#� 8/� � &�������� -���� ;������� �������� ��� ������������53� �������������� -����� ����
�������� ��� $�����>� �������� ;������� 6%����� E/>(� !8� �������� ��� �'������ ����������� �������� �53�
���������D/��
�
123Dunning
Chapter 5 Adamts1 and Versican: Recombinant protein production and functional roles during in vitro oocyte maturation
Figure 5.12 Recombinant Versican and Adamts1 cleaved Versican are able to induce cumulusoocyte expansion.Degree of cumulus expansion scored following 20 h of in vitro maturation. (a) Cumulus oocytecomplexes (COCs) were cultured in the presence of FSH (50mIU/ml) or media supplemented with 50,30, 10 or 3% conditioned media from untransfected CHO-KI (Control), or CHO-KI cells stablytransfected with Versican alone (pECE-V1) or Versican (pECE-V1) and full length Adamts1(p3xFLAGAts1, Versican + Adamts1). In b, individual COC scores were graphed for the FSH treatmentand the Control, Versican and Adamts1 + Versican treatments of 50% conditioned mediasupplementation. Data is expressed as mean +/-S.E.M. (n= 5-11 COCs). Significant difference (P<0.05)represented by different characters.
c,d
a,ba
a
a
cc c
a
d
c,d
b,c
a
Control VersicanVersican +
Adamts1
a
b
�������E�$�����>�����;������:������!������������������������������������������������� � ���������������������
"� ����� � ��>(D�
6,3 %"��1��"�$��
&����������������������������������������������������������������������������������/�3���������-��
�������������������������������������������6����8�������� � ����63;&8��������������$�����>������
;������%����������!������� ��� � �������������� 6��������������())C�������������8/�$�����>�
����;�������������������������������������%�-�����������������������������������������������������
���������� �� ������� ���������/� 3�� ���� ��� ������ ���� ���� ��� ������ ������������� ��������� ������%� 3�
����������������� ����� ������������������$�����>�����;�����������������������������������������
����������������������������������������������������������������/�
�
6,3,� 0�#����������#����������������9���������������4�������
�
&��������� ��� ���� ��:������� ��� $�����>� ��� ��� �������� ��� ������� ��������������� ������� ��������
6���%7$":@� 3�:������5��������� ������ ������������������������6%�����E/D��8/�3�� ������������������
������:�����������$�����>� ��� �'�����.������� ���� �������� ����� ������������������������������� ���
�����������������������������������������������M�����6&�����������>???=�����������()))=��������
����())E8/� 3��������!��'�������!�������-�� ����� ���������������� ����!������$�$&&�?� ������������
�����-������������������ ������:��������6����������())C8/�&�����������������������������������-��
���� ��� ��� ��������� -���� ���� $�$&&�?� �����%� ��-���%� $�$&&�?� ������� -��� ��������� ��� �����
�������%�-������������������-�����������6%�����E/D��8�6����������())C8/�&����-�����$�$&&�?���:�
������� ������� ��������� ��� ��������� ��� ������� �������� ����� ���� ��:� ������� ��� $�����>� ���
���������������M������������������������������������������/��3�����������������3����������������������
��� ���� ��������� ���������� ��������� �������%� -����� ���� ���� �������� ���� ��������������� �������
����������������������������������!����������������6%�����E/D��8/�3��������������$�����>%�����������
����� ���� ��:� ������� ��� ���������� ��� ������ ���������� ���� ������������ ��� ���������� �����������
�������������������!�������������/�
�
��������������������������� �����������-���� ����� �������$�����>�6���%7$":@� ��:����8����������������
�����<�������$�����>�-���� ������� ��������������� ��� ����������������6%�����E/E8/� �&����������������
������ -��� ����� ��� �� ������ ��� ������� $�����>/� � ������������ ��� �:���������� @�� ���������� �������
�������E�$�����>�����;������:������!������������������������������������������������� � ���������������������
"� ����� � ��>(E�
����!������������������������������������������������-����������������������������������������������
�������������������������������!�������������6%�����E/*�����%�����E/?8/������������������������-���
������������������������������������-�������������������������;�������"��6���%7$":@� ��:"�8�-�����
������������������������������������������������������������������%�����������������������������������������
����!�����������������������.�������/�5������������������!�����������!�����������������������.��������
���� ���������������� �����-���� ��������������������������%�5�&$�6%�����E/>)8/�&������������������
������� ;������� "�� ��������� ����������� @� ���������� ������� ��� ���� �:�������� ���� ���� ������� ����
�����������%� ��� ������������������ ����!�������������-������������ ��� ���������� �����-���� ������������
��������������!���������������������������������������6������������-�8/�3��-����������������������"��
����������;�������!����������������5�&������������<������������������������������!��������������
�������6$��!���������>??C=������������())>=�2��������())(=�2��������())E8/�&�����������!�������
����������"��������������������!����������������������������!��������5�&����������������������������
62��������())E!8������������������� ��� ���� ��-� ���������� ����!���������������������� ��� ���������/�
%�������������������������������������!������"�������������!����������������������!������������
�����!���������������������������������������������������!���������������������������������������������������
���������/�$�����������%� ���� !����������"�� ��� ���� 5�&����������������������� ������� !�� ���������
������������������������!�����������������������������������������"��-����5�&����������������������/�
$������������������������������������������������!������������������������������!�����������������
����5�&�!���������������������������������!������������������������������������������!����������
!�������������������%�������������-����������������������-����������62��������())(8/��������������
����������������������������3�-������!�����������������������������������������!������"��;������/�
�
6,3, ����)��������4������������������������������#������
�
$�� -�� -��� �!��� ��� ������������� �������� ����!������ ;����������� $�����>� ����� -��� ��������������
������%� ���� �������� �������� ;������� ��� ������� 6%����� E/@8%� -�� ��������� ���� ��������� ��� ������
�������� ������ �������� ���������� � ����� �������������� -��� ������� !�� ���������������� -����
����!������$�����>�����;�����������-�����������������3;&������������6��������8/�;��������������
�������������������������� � ����-������������������������������������������������������������/��
%����%�������������;�������!����:���������$�����>����������������������������/�&���������������
��������;�������������� ��� �����������-��� ��������!�� ����������!��������� ������������������� ��������� �����
�������E�$�����>�����;������:������!������������������������������������������������� � ���������������������
"� ����� � ��>(@�
�����������/��$��������������������������������������������.�����������������������������������������
���������� ��� ���� ��������� � �/� 3�����������%� �������!�������-�� ����� ����!����������;������� ��� $����
������ ��� ������������������ 6��������������())�!8%� ������� ��������������� ������������� �����%�!��� ���
��������� !�� ����������� ������������� ������������ 6�������� �� ���� ())@8/� A������� ��� $� ��� �������
��������� -���� ����������� ���!��� ��� ;������� ���������� ������ ����������� ����������/� 3�� ����
��������-�������� ������������� $� ����������������5��:��.����������������;������%�������������-�����
���������������������������-���������������-��������-������������������ $�������!��!��������������!���
;������� ��� ���� ������������� �������� -��� ���� ����������� ��� �������� ���������� ��� ���� ����� �����
����������� ��������������������� ��� ������ ��-�����/� � &����!�����������!��������� ��������� ��� ����
;������� -��� ����������� -���� ����� ������/� � ����������� !������� ����������� -��� ���� ��� ;�������
������������ ����� ���� ������ ��� �� ��-� ����� ���� ����� ����� ���!���� �������� ���������� ��� �������
������������-���������������������������/�
�
#���� � �� ����������� �� ��������� ��������������� ���������� !�� �������� �������������� ����������
���������������-����;���������������������������/����!��'�������;�������!�����������������������
�������������������������������������������������/��&����������������������5�����!��;�����������!��
��������� ��� ������ ���������� ��������������������������������������� �����-���� ����������� !�� ���� 7 �
�������������������������������$����������%�5�������������A�����������/�
�
������������ ;������� !�� $�����>������� ��� �������� 6�������� ())�8��������� 3� ������ ����� ��������
;���������������������������������������������������;������������/��3�����������%�������������
�����������;�������-������������������������������6%���E/>(�8�-�����$�����>���������;�����������
���-������������������������������������������������/� &���� �������������������-�����������������
!�����������������;�������-���!�������������-���� $���������������������;��������������-�����������
���%�-����� ������������;����������-���������������������� ����������� �����������!�� $� ������������
��������������������� $:!�����������5��:��.���������!��������������/�
�
&����!���������;�������������������������������������������-�.��������������������-��������������:
��������5��:��.������������;����������������5��� �������� 65����8� 6L�����������())@8/�&����;�������
���� ��������� -���� ����� 5��:��.�� ������� ���������� ��� ���� �������� ������ � �� ����������� ��������
������������������������������/� $�����>����� ����������� ��� ���������������� ;������%��������������
!���� �������� ��� !�� ������������������� ����� ���������� ����� 5��:��.�� �������� 6$������ �� ���� ())*8/�
�������E�$�����>�����;������:������!������������������������������������������������� � ���������������������
"� ����� � ��>(C�
;�������� ����������� ��� 5����� ���� ������������� ��� ���� ������������ ������������� �������%� ���� ����
��������������������%�������������������������������������������������������������������/��
�
%����� ����������� -��� ��������� ���� ��������� ��� ������� ����� ���� "�� ������� ��� ;������� -���
�������!�����������������������������������������!��������������������"������!������������=���-����
���� ��� ������������������������������������� ������������ ���������!������������%� �����-������������!��/��
%������������������� �������������������"��;������������������������� ����������� �����������������
�����������������5������������������������������������������������������������������/�
�
3��������%� ���� ����������-������ ��������� ����� ���� ���������������;�����������$�����>� ����� ����
��������� ������������������ � �������!���� ��� ��������������������������/� &���� ��� ��� ��.���� �����
$�����>� ���� ;������� �������� �������� ��� �������� ����� ���������� ���� �������� ������
�������<�������������������� ���.��� ������������������������������������������/�$��������������
� �������������������$�����>���;��������������6��������8%������������������!�����������;�������
����$�����>���������������������������6����������!�������������������8%������!���������������
������������������!�� 6��� ������ ������8� �������!��� ��� ���� ��-������������������������������ 3;&�
�������/� 3�� ��������� � ���� ������� ����� ��� ���� �������� ��� ���� ����������� ������� ��� ��������
;������%� -����� ������� ��� ����� �� ���'��� ���� ��������� ���%� ������!��� ���� ����������� ��� ���� 5����
����-��%����������������������������� � �/��
�
$� ������ ������������� ��� ���� ���� ����� ;������� ���� $�����>� ����� ��� ���� ����������� ��� �������
���������� ������ !�� ���������� ����� �������� 3;&� ����������/� ������������������� ������ 3;&�������
-��������!������;����������������!���$�����>�������������!����������������������������������
�����������������-������������������������������������������������������������������/�
�������@�����������������%����������������
"� �� � ��>(?�
),� �"-$"�"��$�0��$%���"$"����'0�04�$�0���
3�� ��� -������ ��.��-������� ��������������� ��������������� � ���� ��� ��� ��-�� '������� ����� ������
������� � �%���-����-���� �����������%� 3;&������������������������� ������� �����������/� � 3��
��������� 3;&����� ������� ��������������������������������������� �������������6$�&8� ������������-����
����������� ����� ������ ������� �������������� !���.�%� ��� ������ -���� ����������� ������� ��������
6����8/� $�����������%� -��������� ������ ����������� ��� ���� ������ ��� ��������%� 3;&� ������� ���� ��.� ���
������������ �������������� ���� ��� �� ����� ���������� ����������/� �-���%� ���� ��� ���� ��-��
�������������� ���������� ��� 3;&� �������� �������� ��� ����� � ��������� ����������%� 3;&� ��� ����
��������� ����� ��� ��������� �������/� �������� �������� ����������� ��� ������� 3;&� ����������� �������
����������������������������%���������������������������������������������-��������������������������
����������� �������������%� ��� ��������������������������������� 6�������������())E=�����������())E=�
������:&���-����������())E=����������%���������())@=��M�-��������())*8/�0������%������������
������� ��� �� ������� ��������� Q�����F� ����������� ����!������� ���� ����������� !�� ���� ���������� ������
��������������������/� �-���%�������������������������������-���������������������������������
��������� ����� ����� ��� �!����� ������ 3;&� -���� ���� ������� �����%� ���������� ��� ���� �!������ ���
�������������������������������������������������/�&����������������!�������������������������-�
����� �������� 3;&� ����������� ������ ��� ������� ����� ���������� �������� ���� ������ ������������ ���
���������������������� ��� � ����������������/�&������������������������������!�������������
��������� ��� ���� ����������������/� &��� �!������ ��� ���� �������������� ��� ���� ����� !���������� !���� ���
�������������������������������������������������������������3;&���������������������������������������
��,���/�&����-�.�������������������������������������������������������������������������������
��������������������������������������������3;&���������/�
�
�
), �� '"#� %0�"�"0$�"0�� "$� 40� "$� 4" '�� �1�1�1�� ���/ 0�
���,�0#���
5������������������������$���� ���0$�������������!��������-���������� ������� ��� 3;&%�����
�������� ������� ������������ �������� ��� �������� ������ -��� ��������� !�� �!���� ���������� �������/�
�������@�����������������%����������������
"� �� � ��>�)�
2����� � ��������������������������-������"����-��������������������������������%�������������
$���� ���� @����������"%����� ������������� ������������@� ��� >(��%�����������-��� �������� ��� 3;&�
�������/�3�����������-������������%�����!��'�������������������������������������������3;&�����
� ������������������� �����������������������$���� ������� �����������������������������
����� 3;&�6A��-������������������� ������������8/� 3�������� ���������%��"�* ,������$,-,.��#����
�������� ��������� ��� !���� �������� ���� ����� ��������� �����%� ������������� ����� ����������
�����������������������������������������������������������/�2�������"�* ,������$,-,.��#�
��� �������������������� 3;&� �'����� ������ �������������/� �����������������-������������!��� ���
��� ��!������ ��� 3;&� ��� ���� ������� ��� �� ��������� !�� ��� ��������� �����!�����/� � 3�� -��� ����������
������������������������������������������$���� � � ��-��������������������"���������������
���������!�� �������� 6��!.��������()))=���������������())�!8/� �2������ ����� ����� �����������������
������������ ����������� ����"�%�!�����������������������!����������������$���� � ��������������
��������������������� � �/�&���%�-����������������$�����>�����;������������������������������
���������"���!���������������������������� � �/�&�������������%���������������������������
�!����� �����-���� 3;&�� &���� ������������ ����������������� � ���� ��� ���� ������� �������������
������������������� � �������������������.��������������������������������!����.������������������
���������/�
�
),/ �� 0'0%� F�''"0'� �1$� "�$�� "$� 40� "$� 4" '�� �� 1'0%�
�1�1�1�����/ 0����,�0#���
%����������'�������������������������������!����������������������������/��%����-�������������������
-����!������ ���������������������������������������� ����� ����������%� ���������������������������� ����
���������������������������/��3����������%������������������������������������������������������������
��������������������������<������������������������������������������/��������������������������%�
����������������������.����������������� ����������� !�� ����������� -��� ��������� ������ -���� ��������
�������/� � �-���%��������������������������� ��������!��������.����� ����������������.��!��
�������������������������������%����������������� �����������������������������!���� ���������������
������������������� ������������������/�$���� 3;&%� �����-�������������������� ��� ����������������
�������������������������!�����������!���������������������������!������������������������ � ��
�������@�����������������%����������������
"� �� � ��>�>�
��������������/�$�����������������������$�����>�����;������%��������������������������������������
3;&�������������������-����������������������������������������������/�
�
��������������������������������������� ����������������������������������� -���� .��-������������
������%����������������������������.��-�����!������������������������������%���������������������
����� �����������������������!���� ����������������������������������������������� �������������
���������/��&����������$�����>������������������-����������������!����������������������������������
����.�������������������������������������������/��������������������������-�������������$�����:
<:���������������������������������M����������������������������$�����>������!�!��������������������
�����!���� ��� ����� ��������/� �-���%� ����������!���������������� � ����������������� ��� 3;&�
����� ������������ ����� ����� ��������� ��� ���� ������� ���� ��� ��������� ���������� !��� ����� ��� ��� �����
������������� ��������������������������%���������������� ����������/�;������� ��� ��.���� ���!����.��%�
!��� ���� ����������� ���� ����� �����!���� ��� ���� �!������ ��������� ���������� ������� ��� ���� � ��
������������/��&�����������!���������������������!���������������������������������3;&���������
-����;������/�
�
&��������������������������������������������������������������������������������������������������
�����������!������ ������������������������!������� ��� ����������/� &������!����������� ������������������
�������������������������������������!���������������� �������������������!��������������������������
������������� ����-���� ���������� ����!������ ��� �������� !�� �������� ������ ��� �������� ��!������� ���
�������������� �������������� $�����������-���������!������������������������������ �������������
��������������� ��������������� ���������������������������� ����������/�7�.�-���%�������%������������
�������������������������������!������!������/��7�����������������������������3;&�����%�-�����������
�������������������������%��������������������������������������������������������3;&��������/�
&���� ������������������!������������� ��������� ��� ������������������������-��� ������/� �5�������
������������������� �������� ��������� �������� ����������� ����� �������!������� -���������������� ����
�������� ��������� �����/� � 7����� ���������� ��� 5��:7����� ������� �������� ��-��� ������� ��� ���������
����������������������������������������������������������������������������������/��%�������%����
�������.��-����-������'����������������������������������":������<��$���������������������������
����������!����������<�������������������"5(�������������'��������������������������%� <7 �����������/��
&�����������������������������������������������������������!��������������������������������������
���������������������5(��������������������������������������������������������������!��������������
�������@�����������������%����������������
"� �� � ��>�(�
����������� �������/� � &��� ������������� ��������� ��� ���� ���� ������ ��� �������� ��������� ��� ������
�������������������'������������������������/�
�
),3 '0� �'"$-� 40� %0�"�"0$ � "$� 4" '�� �� 1'0%� �� '"#� B" 4�
40'�"��$��$%��%�� ����
�����!������;�������-�������!������ ��������������������������� � ����-�����������������������
��������������������� �����������������-�������������!��$�����>/��������� ����������������������������
����������������!��������������:��������5��:��.�������������;�������������������5�����������6L�������
���� ())@8/� &���� ;������� ���� ���� ��� �� ������� ������ ��� ���� 5��:��.�� �������� -����� ������� ����
������������������������������� � �� ������������������5��:�/�������������;�������!��$�����>�
-������ ���� ������������������������ �������� ����������� ��� ���� 5��:��.�� �������� -���� ����� �������
�������/�&����;���������������������������������������������������������������������������������
5��:�����������������������!����������������������������������������������������������'������������
����� ��������� �������� ��� �������� ������ ����� ���� ��������� ��������� ���������� ����������� �����
�����������������/�������������%����������������������������������������������������������������
�������������������3;&���������-����$�����>�����;��������������������������������������������
�������3;&��������/��
�
),6 �%%" "�$��� ,� 0$ "��� �� "�$�� ��� 40'�"��$� �$%� �%�� ���
%1'"$-����/ 0��� 1'� "�$��
$����������.��-���������������$�����>�����;����������������!��������������������������/�;�������
������������-��������:�������������������62��������())D8%�-�����$�����>���������������������������
��-��������������������;5"%�%�%"%������5��:��.���������67�'���������())�=�7���������())E=��������
����())@8/������������;��������������������� �������������������� ��� ��������������� ���������������
�������� 6���8� ��� ������� 62�� �� ���� ())E8/� &�� ��������� -������ ;������� ��� ����!��� ��� ����������
������������������ ����������� ��������������������������� 3;&%� ����������������������������� ���
������� -������ ����!������ ;������� ���������������� ��� �!��� ��� ������������ ���� ���� ��������
���������/�
�������@�����������������%����������������
"� �� � ��>���
�
),) �1���'/��$%��1 1'0�%"'0� "�$���
&���������������������� � ������ � ������������������������������������������������������
���� ������������������� ������������������������ ���!���������������/������������-�����������������
�����3;&��������������-������������������������������%������������������%������������������������
����� ����������� ��������� -��������� �������%� ��� ���%� -��� 3;&� �������� ��� ��� ����� '������/� �������
�����������������������%�����������3;&����� � ������������������%�!���������������������%�
�������������������%�-����� ����� �����������������������������-� ��������������� ��������-�3;&�
������!���������/�3�����-���������������������������������������������������������������������������
����������������������%���-������-�����������������������������!�������������/����-�.�������������
���������������������������������������������������������������������������������������������-������
���������������������!�������������������������������������-����3;&/�
�
�������C�A�!����������
"� �� � ��>�E�
�$�!�������%%����!�������&%�A��������5%����!������&H�6())>8���������!��������������������������������������������������������/�-�������� �� �%�@DC:E�/��
$��-���� $5%� $�!������ �%� 6>??�8� &������� ���������� ��� �������� !������ �������� ��� ������������ !�������������������������������������.������/�" �B����6=%�>)>:>(/��
$��� 7�%� I����� B%����� 7%� B���� A7%� B����� A%� �������%� 7��� ;%� $����� �%� B���� AA� 6>???8� ;���������������� ����������� ��� ����������� ������ ���� ������� ����� ��������� ������� ���� ">� ������/� G�#����������,���#�����6=%�E?C:@)E/��
$��.���M�� %�����L%�&�������%������.��&%�������&%�&������$� 6())E8�5����������-��� ������ ����������!��:��������������������������������������������/�, ���� �������3)%�CC:*D/��
$��!��� $%� &���� �%� A���������� �%� �������.�� &%� �������� �%� ��������� &%� ���������� 5%�B���������B�6>??C8�&����:��������������������������������%�������������������������������������������������������%�!������������:��!��������:������������������������������������!��������������/������#���������,��0�,���83%�>)>>@:(>/��
$������&%�������3%�$���$%� �����&%�$��������%������������%������&$�6())*8�3���������������������������&�.������������������������5�������� ���A��������������������&������-����%�������:������������ ���������<�����!���&��������$�������3��;���/�B���-����/��
$����$%�%��������%����������;%�&��:$������6())E8�&������������������������,����������������������!��-����������������������!�������������������������������������/�*���-�����" �8�%��E*:@C/��
A�����&%�A�-��$%�������7%���������� �%�7����%�0���.��0%�2��������$��6())�8�&����������:����������������:���������������������������/�,������)=%�>)??:>)E/��
A����"�%�7��!�����&7%�7��M��2%�$���7%�A�������A�%�%����07� 6>?*�8�%��������������������������� ������������������������!�����������������������/�B���-����� =%�C>C:(E/��
A�����%7%���������$%�&�������H%�2�����%�2������7%�&�������$�6>??@8����������������!���������������:��������������������������/�(����,����)6%�>>E>:@/��
�������C�A�!����������
"� �� � ��>�@�
A������ H�%� 2����������� �"%� �������� ��� 6>?@C8� &��� ������� ��� ����������!������ ��� ���������������������M�����/������#���������,��0�,���6=%�E@):C/��
A�������� �$%� ������ �$%� $����� $�� 6())C8� &��� �������������� ���� ��������� ���������� ��� ����������������!���������������/�*���B������/%�@)*:>?/��
A��!�����%����������7%���������H�%�������H�6())�8����������������������������������$�$&&�:>�6������������� ���� ����������������� -���� ����!��������:��.�� ������:>8� ���� ����������� ������� !���������������������������������'�������������������������/�G�*���, ���� ���/�%�DC�:*E/��
A������&%����������7%����-������&%����������7%�I�����.�:2������&A�6())D8������������������������������������%�!����������������%� ������������������� ����������-�������������������������/�B���-�����8�%��@@:C�/��
A����MM�� A%� ;����:������� ;$� �� ���� 6>??C8� &������� ��������� ���� ������� ����������� !�� ���� �������������� �&L�/� ������������ ���� ����������� -���� ���� ����� �����������:�������� ������� ���� ������������������������/�G�B������� 8 %��(*>C:(�/��
A�-�� &%� �������� ��%���!.�� �7%���������&%� �������� �7� 6())@8� ��'�������� ��� $�$&&�:>� ��������������������� ����������������������� ��������������������� �����������������/�" �B���/@@%�@??:C)?/��
A��.��� "%� A���� �$������� 6>??�8� ���������������� ��������� �����������%�����:����������� �����������������������������������������������������������������!���/�-���=%�>*�:())/��
A��.���"%�"������ H%� ������:��!������&%����������%����������&� 6())�8������������ ������:��������� �����!������ ��� ������������ ������ ������������%� ��������� ���� ��������:�� ��� ���� ��������������������������/�G�����#���� ��� )%��C:E)/��
A�������� �%� �������� $�%� 5����� HH� 6>??)8� 3����������� !��-���� �������� ������ ���� ���� �����������������������������������/�B���-�����3/%�ED�:C/��
A�.���.��$%������ &&%� 2���������� H%��������&�� 6>??�8��������� ���������������� �������M����������������������������������������������������������%������������:���������������������������/�B���-�����3=%�>�@C:*(/��
�������C�A�!����������
"� �� � ��>�C�
����H%� ���-��M�&%��������%�A�����2%%�I��.����6()))8�&��������������������������!���������>:������ ����������������� ����� ��� ��� ������������� ��������� -���� ��������� ��� ����� -���� ������������'������������:>������/�G�B������� 86%�(?@D*:E�/��
������� �%� 0������ �;%� ���� $H%� A��.��� $%� 7����� 2H� 6())>8� &�":@� ��� ������������ ��� �������������������������������������������������������� ������� ������������� ����:�����:����!����!������/�B���-�����)6%��)>:*/��
��������� "&%� &��������� �&� 6>??�8� ��!����� �������� ��� !������ 5�%� 6�����������:������ ���!���M���������6�88/� $� ����������� �������� ������������ -���� ��������� ��� ������ 3� ������ �� 6����:�����:�����������!����8/�(,B,�2���/�=%�(?(:@/��
�������� H7%� ����������%� A��.��� $"%� �������� "&� 6())*8� ����� �������� �������� ��-� ����������������3;&/�����-����� /%��C:DE/��
�����7%�&����H%�7�����2H� 6>??(8� 3������������������� ������ ��� ������!����������� ��������!���M��� �����������������������������/�$�������������!�������������:�����:�����������!����������/�G�B������� )8%�>(�*):@/��
�����7%�&����H%�&�7����7�%���-����2%�7�����2H�6>??D8��������������������:�����:�����������!��������������!���M��������������������������������������������������!�������-������������������/�G�B������� )8%�(*(*(:C/��
����� 7%� �������� �&%� 7����� 2H� 6>??�8�%���������� ���������������� ������������������ ��� ���������:����������������������������������������������������-����������������������/�*���-�����" �/3%�*C:?�/��
�����7%�I����� %���-����2%����������&%�7�����2H�6>??@8�������������.����!��-�����������������������:�����:����!���� �������������������������� ������������!���� ��������������!����������������/�G�B������� 8�%�>?D)?:>D/��
���� "0%� B����� $3%� ���M� �%� 6>??)8������M������ ��� ���� ������ �������� 5�����������&����:� $� ���������:"�����������"���-�����&��������������$�������������������/�" �����-��.���9�"�����/ %��E�:�@E/��
�������C�A�!����������
"� �� � ��>�*�
������ %%� A������ &$%� $�������� �%� �������� $%� ������ "%� "�������� %� 6())C8� $����������� !��-���� ���������������������������������������������������� ����������������������������/�-�������� ��/3%�@DE:E)/��
��������$%�������"&%���-����&�6())(8�$������������������������������������������!���������/�B���-�����)8%�(():�>/��
���!�������&%���.�����.�0$%�����-�.���%�$�!�������%�6())(8�$���������������������������������������������������:�������������������������/�����-������8%�>))@:>@/��
���!�������&%�%�������$%�$�!�������%%�����-�.����6())E8�3��������������������������������������������������������������:�����������:�������������������������������/�����-����� @%�>�D?:E*/��
����� $0%� ��!������ $ %�&����� &%�������&7%� 3������ ��%� �M������ A7%� ������ "�� 6())D8� ;�������������� ������� ��������� �0$� ���������� ��� ������ ������ $�������� ������� ���� ��������������/�-�����������4������5�3/%�?@?:C(/��
�����%�������%����������%�&������7%��������$&%�5�-����H7�6())E8�&������������������������������ !������ �������� ������ ���� �:���������� ��� ����������:� �������� ��� ���������%� ������������� ������!��'�������!����������������������/�-�������� �� 8%�>?:(@/��
����� 0$%���������.����� �%� H�.����� 0%�%�-���� $%� �����%�%� A������ �H%� 5������7� 6())E8� &������������������������������$�$&&�:>%�:D%�:E%�:?%�����:>E%�����&3&�:��!��&"%!���>�����������������:���������������������������������;������/���������)/%�(@?:CE/��
��.����� �%� A��M������� 3%�&������ "%� ;���� 5%� �����: �������%� 7���������� A%� 5��������!:������ #�6())C8�3�����������������������������������:������������������������������������������������������������������������������������������/�����-����� %�*>E:(*/��
�������"%�7��������%�������M��$%� 3������&%�A������&%����������6())E8�5��������������:������������������!�����������!������������������������������/�-�����"������ ��3@%�?�:C/��
������AH%�7�������5%�7����$%�&����� %%�&������"%�2������2�%�7�����!������6>???8�$����������������������������:(:�������������������������!���������������5(������������.��:>!���/�, ���� �������3@%�(@*E:?E/��
�������C�A�!����������
"� �� � ��>�?�
��� 7�� %������ �%� �4A���� &H%� 5����� HH� 6>???8� 5�������� ��-��� ������ ��������� ����������������������������������������������������������������/�����-������3%��)@):*/��
��������� $%� ��M��!��� �� 6())(8� 5���������������� ��������������������������������������������6� ��8:�������-/�����-�����0�����=%�EE?:CC/��
����� H%�����.�� 7�%� �������� �H%� 7������!���� �$%�������� �H%� 2����� �� 6>???8�&�������������:��������� ������� ������� ��������� ��������� ���������� ������� ���� ��������� ��-��� ������ ������/������#���������,��0�,���8)%�@(�E:D)/��
����:I��������� &&%� I��������� ��� 6>??D8� $� ������ ������������������ ����������� ����������������������-�������������������������������������;������/�G�B������� )8%��(??(:*/��
��-����&�6>?*?8���������������������������-����������������������������������������������������������������������������/�B���-�����3�%��C>:?/��
������ �&%� �������� �7%� ������� ;%� �������� H�� 6())D!8����������� ��������������� ���� $�$&&�:>������!���������M��������������������������������/�*���, ���� ����=%�(D@�:C*/��
���������$%�������7H%������M��H%�$�����%%�$��������&%�"���������A�6())E8���������������:����������-������������������������?��������������������������������������������/�, ���� �������3)%�(C?*:*)@/��
��������7%�7�A�����"%����������H��6>??E8�$��������������;�������-���������������������� ���������������������������������������������������������/�G�. ���"��������@6%�D(@:�>/��
�������� ��%� 7����&%� A�-�� &%� B����%� ��!.�� �7%� �������� �7� 6())C8� $������ ��������������� �����������:�������������������������������������������������������/�����-����� %�(*D(:E)/��
5����!����&%�&�:������3�6>???8�����������������������������M��«�B������� �%�()�:>)/��
5�����H$%����.�$&%�2�����%�2�������0&%�&��M�.�&&�6>???8����������������������-�����������������������:?����������������������/�*���, ���� ����/%�>)�E:D*/��
�������C�A�!����������
"� �� � ��>D)�
5����� H� 6())E8�&����� �������� �����������!����� ��:����������� !��-���� �������� ���� �������� �����/�-�����(����" ��8%�>:(/��
5����� HH� 6>?C?�8� %� � ����������� ���������� ����� ���������� !�� ������:�������� ����� ���������� ������������������������������/�#����� =�%�D*�:D/��
5����� HH� 6>?C?!8� "����������� ��������������� ����������������� ��������������� ��������� ��������:���������������������������������������/�G�,���H���� @=%�>>>:()/��
5�����HH�6>?*)8�����������������������������������������!��������������� ������������ �������/�B���-����� /%�EDE:E(/��
5����� HH� 6())>8� ������� ������� ��� ������� ���������� ������������ ���� ��������� ��� �������/�-�������� �� %�*(?:�*/��
5�����HH%�%������%�2��:A�������%%�������M��&�6>?*�8�3���!��������������������������������������:������������������$&�%���������������%�������������������������:����!����� �����/�" �B����@@%��?:D?/��
5�����HH%�2������-�����%���������%%� ����B�6>??C8�&�����������������������������������������M����������������������������!��������������!����������������/�B���-�����6)%�?C@:*D/��
5����� 77%� B�����.�� �%� �������� �7%� ��!.�� �7%�%�,��� �%� �������� H�� 6()))8���������������������������������� ���� ����������������� -���� ����!��������� ������� ������ ���������� ��� ���� �����������:����������������/�B���-�����) %�>)?):E/��
5���.����%�$�������H�%�2�����&0�6>???8�%����������� ��������:�����;������:������������������������ �'����� ��� ���������������������������� ���������������������������/����������� ����)�$����B����8%�>))D:>�/��
%����� 3%� ���,��.� %%� 7������.� H%� ����� �%� 0������� %� ����������� �%� �����.��M� �%� ������ �&%�"��������� 6())@8�&�������������%%:&$�������������������:������������������������%� �������������������������������������������/�H������3%�>*?:??/��
�������C�A�!����������
"� �� � ��>D>�
%�������� "%� ;�������� �%� 0������� �$%� ������ &%� &����� "%� $������ �%� I���� 7%� &����� �&� 6>??@8� ������������ �����!������ ��� ��!�������%� ��������:�%� ���� �������� �������������� �������� ��� �����������:����������������������������������������������3;%:5&���������::������������������������������� ��� ��������� ��!�����������:� ��� �������������������� ������ ������ ��������� ��������� ������������������������������/�*���-�����" �3/%��?(:D)(/��
%����H�%�7������&�%�7������#A�6>??C8� ��������:����������%������!�����%���������������������/�G�. �� �*�� 3 %�(C:��/��
%������� �%� A��:$��� 3%� ������� $%� ���:5�� �%� $�������� $� 6())D�8� 5"%:��.�� ������ ���������� ��������������������������������������!��������������<�$&���������������������������������/�B�����B������-������� �/ 3%�*(?:�D/��
%��������%�A��:$��� 3%� ���� 7%��������$%� ������� �%�$��������$� 6())D!8����������������� ��������������:��������������������:������ ��������:� !���.����������������������������� �����������������������������!�����������/�B���������������)=%�?*?:?@/��
%����� �%� ������� �;%� 7�� B%������ H&%� �������� $%������� A�%� "����� &&%� ������� ;�� 6>??C�8� ���������'�����%�����:���������������������������������������������������&0%:����������������@�������������������������������!������������������������:����������������/�- � @ %�?E:>)(/��
%����� �%� �������� $%� ������� ;�� 6>??C!8� ������� ��'������ ��� �� ��������� ��������� �������������������������������������������������������:��������������/������B�����B������//8%�(@>:@/��
%������%��M������$������� 6())�8� 3�������������������������������� ���������������� ��� ������������������:��������������:@���������������/�" ���� ���/@%�((E�:@>/��
"������%%�A��������%�"������&%�&�������%�������M:������H5�6())�8�������������������������#D*@�����������������������������������������������������������������������/�B���-�����)8%�??:>)E/��
"������5%����.��;%�$�����3%�"��������%����M���B%�����:$!���������%�"�����3%�2���������5%���.���0� 6())*8�������:��������������������� ��������D�������� ������:7���� ������� ������ ��� ��!��������� ��������������/�" �B���/�/%�>:>(/��
"���������A%�&��������H"�6())C8�����������������:����������������������������������������������������������������������������/� ���� ������)8%�@:>E/��
�������C�A�!����������
"� �� � ��>D(�
"���� $%� H������,��� &%� ������ ��� 6())D8� $�������� ������� ���������� ���� ���������� ��� �������������� ��������������������������:������������� ����!���������������������������������������/�*���, ���� ����=%�?C:>)D/��
"������ 0A%� 5�������&7%� A���� 2 � 6>?C*8� ����:��:����� �������������� ���� ���������/� $� ������ ��� �����������:��������������/�G�����B���8=%�E*:CE/��
"�������"�6())(8��������������������������������!���������/�*�������, ���� ����=)%�>D?:E�/��
"�����&%�"����$�%�N�����%�7������ %�;������5����H%�����������%�������&�6>??*8�3�:������������������ ������ �������� �������� ������ �������:� ���� ��� �������� ������ ���� ��������� ��-��� ������ ��� �����������������/�����-������/%�>@�*:DD/��
"������"%�A�����%%�A�M��� H%�"����0� 6>???8� 3������������������������ �������M����������� ������%������:����!��%� ���� ��������� ��� �������� ��� ���������� ��-��%� ������� ������ �����%� ���� �������������������������������������������������/�B���-�����)@%�>>():C/��
"�������� B%� "��������%� "����� �%� ����� �%� ������� �%� 7������ "� 6())@8� ��������� �������� ���������������������� �������������� ������� � $&&:��������� �3��:���������� ��������������/������ ����-��8 %���?:D*/��
"����� 3%���.���0�6>??D8�����������������������������������������:D������������� ,���������������������������!���������M����������/�G�B������� )8%��)E)(:?/��
"����&%�L����%���������� %� �������� 6>?*C8� 3���������������������� �������� ����������!������������������������������������������/�G�. �$����(���,�)���� �� ���3%�(*>:E/��
"��������%� ������ & %�&�.�:0������� �%��������� H7%� ������ �� 6()))8� ���������������������� ����������������������!���������:����������������/�����-������6���##��6%��:>)/��
������� �� 6())E8� ¬������� ���� ��!��� '������:� ��� ����� ���������� �� ����� �������«/� G�-� �����)����B���-�����4����5�/3%�E��*:E�D>/��
�������C�A�!����������
"� �� � ��>D��
�������� ��%� %��� �%$� �� ���� 6())C8� &��� ��������� �������� ��DD� ���� ������ 6��>@*8� ��������������-����5��>%(�������������������!�����������������!����������������/�G�B������� = %�>@@@C:*)/��
�����5%�$������� 3%�7����� H%�"�������"%�������� &� 6())C8���!������������!������!���������������������������������������-���������/�-�������� ��/3%�D>E:(D/��
����� 2%� ��������� $%� 2���� �%� A���� �%� "������ H%�&����&%� �������!���� $%� A��.��� "� 6>???8��������� ������� �������������� ��� ���� ���������� �������� ���/>!� ��!����� ��� ����������������������!�������������������������������!�������������������������/�B�� �-��=3 %�>E:(?/��
����������%�&������0%�B������&%� 3���� �6()))8�5��������������������������������������� ���������������������������������������������������������!���������������������������������������:������������������������������������������������������������������������/�*���-�����" �6)%�E():@/��
������M:"��M���M�3%�"��M���M:��!�����3%���������&%�2������&%���������$%�2�����7%���������H��6())@8�"��������������������������������������������������������������������������������������������������������������������:������������:��������������������������������������������������«�*���, ���� ��� @%�>�)):(>/��
�����$%������7%�7�����2H�6>??*8�&����������!��������������!�������!���������:�������M�:�����������������/�B���-�����6=%�C)E:>>/��
��.���&5%�&�������7%�$�����%%�������7H%�0������H%�"���������A%�$��������&�6())E8�$�����������������������������������������������:���������������������-������������������������?�������������������������/�B���-�����8/%�*(E:�(/��
��.����7%������!����2%�7���������%���.���5%�����������&%���������25%�7������6())D8���������������� ��� ����� �������� ������ �����:���������� ��M���<$�$&>C� ��� ���� ��������� ��� ���� �����������-��� ������ ������� ������� ������:� ���� ,�������!���� ����.� ���������� ��������� ����������/� G�B������� 88%�(D>C?:**/��
�M�.�� %������5$�������6>???8�$!����������������������������������� ����������������� �������� ���.���������������������5����������!�����5�6(8/������#���������,��0�,���8)%�>)E)>:@/��
�����H%��������%�7����%%�&���H&%� ����%�B�����2��6())D8�5���!����������������������:�������������������������������������������������������������!���������������������/�����-������8%�>E@(:?/�
�������C�A�!����������
"� �� � ��>DD�
�
���� 5%� "�!������� $%� 7�����!��� �%� �����:H������ �� 6())(8� $��������� ��� ������ �������� ������ ����������� ��� M���� ���������� ����.����� ��������%� ���������� �����%� ���� ��������� ��� ���� �����������������������������������������������,������/�(����,����88%�E>>:E/��
����� &%� ������ &� 6())E8� ":������:�������� ������� ���������� ���� ���� 5"%� ���-�.� ��� ����������������/� � ���, ���� ���*��)��)%��():@/��
�� B�%� 2���� � $� �� ���� 6())D8� ��!��������� ���� ���������� ����������������� ��� ������� ����� ���.������������������/������#���������,��0�,����@�%�>>()?:>D/��
��M���&�%���������2�6>?**8� �������������!�������:���������������������/�� ���-�� @%���C:E@/��
3����:$�����&7%�����M���%�7�'���$�6())�8�$�$&&�>:������������������������-�������������!�������������/�� �#�:������,��886%�>*�:?)/��
3����� 0%� ������� �� 6>??@8�&�������� �������� ��� ������ ��������� ��������/� B�����B������-������� � %�*>@:()/��
3����� 0%� ��-��� &$� �� ���� 6>???8� &���� �������� ��� ���������� ��������� ���������� ����� �����������M���������������/�G�B������� 83%�(E)*E:?(/��
3��� �%� ��������� &%� I�.�� &%� #,���� &%� ������� �� 6>??E8� &�������� ����� ��� ������ �":&%� �� ���������������������������������������������!���������������������/�G�B������� 8@%�?E*:@E/��
H������5%�7�����H�%����������� A%��������H%�������,���%��������� �.��%�2��������H%�&����������%�%�����A��6())D8�$!���������������������������������������������������������������������������������/�*���, ���� ����=%��)E):@�/��
H��������&%�"��'�����$A%�0������H�%� ���������A� 6())@8�%��������������������������������������������������!�����������:�������!������������/�"�)�������38%�(()):?/��
�������C�A�!����������
"� �� � ��>DE�
H��������&%� ���������A�6())�8�"����������M����������������������������������������������������������������������:�����������M����/�G����,���#�������3%�>CE@:@E/��
H������&5%������7�6())�8���������������������������������������������@�6&�":@8������������������������:�����:�����������!������� ���������������������������������/�-�������� �� 6%�(C:�>/��
H�����3&%���������%7%��4A����&%�5�����HH�6())>8���������������������������:���������������������(�����������!���������������������������������������������������������������/�, ���� �������3 %��>*C:?C/��
�������� H�%� �4A���� �%� 2���� H&%� �������� �%� 7��!��� H5%� ����!���� 3�%� ���� $H� 6()))8�7�������������������������������������� ��������:!����������������������.������������������&�":@/�,��������=%�C@�:CD/��
����.��&%������� %�&����&%�������&%�0�.������%� ����&�6()))8� �������������� ����!�������������� ������������������������DD/�G�������-�����- ���8%�>@(:C/������������&%����������B%���������&%������ %�3���&�6())�8�7��.������!�����������������!������ ����������������������������������������-��������������������������/�����-������=%�>>C?:*D/��
��-������� %� �����&%� ����� H%� 0���.�!�� �%� ������ $ %�&�����.��&� 6()))8� A������� ��� �� �����������������������<���������������������������%�;������%����7:��������%��:��������%�������DD/�G�B������� 86%��EDD*:E@/��
�����A%� 0���� �$%� &�������� ��%� $������ 2�%�%����� �5%� ������ 7%� ������� �%�&�.-���� ��%�&,�������� � � 6())C8� ;������� ����������� ��������� ���������� ��������� ������ ������-� ����������������/�" �"� � /)%�@C>:*�/��
����A�%�7�����%������H%� ���� %�����H �6()))8�3����������������%�������������%���������������������������������������������������������������������������������/�(����,����83%�>>E�:*/��
������ 0%� ������� B%� &����.�-�� �%� ����� 5� 6())C8� �������� ���� ��������� ������� ������ ����������������� ��� �������:� ���������� ��� �������:������� �������� ������ ���� ����������� ����-�������������������������������/�,���-�����(����,�����)/%��(C:D(/��
�������C�A�!����������
"� �� � ��>D@�
������0%�������B%�&��������%�&��������� %������5�6())(8�5������������ �������������������������DD�����������0$�� �����������������:����������������������� �����������������/�B���-�����))%�C)C:>C/��
���������A%���������2�6>??�8� ��������:!�����������������������������%�������������������%������������/�(��)�G�8%�>(��:D>/��
��!������� %� ���� "2%� �������� B%� &���� &� 6>???8� 3�������������� ��� ���.� ������� ������ ����������������������������������������������������/�, ���� �������3@%��*�E:D(/��
����A %�7������H&%�������������%�$��������H�%�7������%�$�������6())C8���������������$�$&&�?����������������M����������������!���������������/�G�B������� = %�>@>D@:ED/��
��������6>??E8�3�������������������������������������������-��<�����!��������������������������������-������������������������������������:���������������������������������/�B���-�����6 %�>D(@:�E/��
�������7�6())D8�&��������������������'���������������������/�G�� ��,��= �07��##�%�5>D:(�/��
������%��������0%�0�.�������5%�%�,�.��%%� 3�������%%�&������������ 6>??C8�&���������������������������������������-�������������������������:�������������������������-��������!��������������������������������������������������/�G�B������� 8 %�EE@:@(/��
����� �%� &���������� �� 6>??*8� $�$&&�:>� ������� ������� ��� ���� ������������ ������ ������� ��������!��������������3�����������������������������/�G�B������� 8/%�>�?>(:C/��
������%��.����B%���-������� %�0�.����� %�&�����.��&%������ %�&������������6()))8�$�$&&�:>�������������������������������%��������/�(,B,�2���38=%�(D>:E/��
������%�&��������B%�&������������6>???8�$�$&&�:>������������������������������������������-�������������������������/�G�B������� 83%�>**(>:@/��
7���L%�"����.���%�������&%� &��!����� 6()))8�$��������� ���������������������� ����������� !��-����������� 6&�����������������8�������:���������������������� ������������������������/�B���-�����) %�EC?:**/��
�������C�A�!����������
"� �� � ��>DC�
7������ ��%� 7��� �B%� 7�� �I%� L��� BI%� I����� 7%� ������ 2%� ����� I%� B���� AA� 6())C8� &��� �!������ ���;������������������������������������������������������������������/��� ���-��)8%�DCD(:E)/��
7�����2H%�2����5%�A�����"��6>?*@8�$����������������������������������,���������������������-��������������������!��.��-���������������/�" �B�����/%�E>C:(>/��
7������&��6>??E8�$����������.�������������������-����/�B����������68%�C:>D/��
7������&�%�%����H��6>??(8� ��������/�(��)�G�)%�(�?C:D)D/��
7�����$%��������3H$�������6())E8�3�����������������������������������������������������������������-�����������������������������:�����%��������������/�����-����� @%�D():D/��
7�A�����"%�I�����������%�����������5�6>??(8� ����������!�������������������;������/�G�B������� )8%�>)))�:>)/��
7����%�����������%������%�������%�"������;7%�&����������2�6())D8�5��������� ����������������� �����������������������������������!�������'���������������������������������������/�*�������B��� 3%�*?)C:>@/��
7�����%�H���A�%�0��BH%�B����&�%������� %�����22�6())>8������������������������������������������������������'�������������������������������������3;%:5&/�G�������-�����- ���=%�D?):*/��
7����� H%�A�����$&�6>?*E8����������������������!������������������������������/�G�,���H���� /3%�(�>:@/��
7������ H%�5�������0&%�"��� 3%�&�.��M��%�����$H%� ������� 6())(8� ��������� !������� ����������������DD��������������������������.�����������&�":@/�G�B������� 88%�(@@)):*/��
7��� %������A�%�������%�������.�H5%�7�����!�����%�&M��.��� H&%�������� 6>??C8�&�������� ��������������������������������������������(:��������������/�����8�%�>?C:()*/��
7��� BH%� L�� B%� B�� N� 6())E8� %���:������� $�$&&�:>� ���� ���� $�$&&�:>� ��������� �������� ��:� ���������������������������%������������/�� ��� /�
�������C�A�!����������
"� �� � ��>D*�
�
7��� BH%� L�� B%� B�� N� 6())@8� %���:������� $�$&&�:>� ���� ���� $�$&&�:>� ��������� �������� ��:� ���������������������������%������������/�� ��� � 6%�(DE(:@C/��
7���.��H%������������&��6())>8�$����������� �������������������������������������:�����'������������������������(6:�������������6&88�&�����/�*������ 6%�D)(:*/��
7�����.��0�%�N���& %�%�������5%�&�����7%���������%%�������$%�7������6>???8�&���������������������������5"%�����������������������������������������������5"%�������������������������������������������������/�" ���� ��� )%�(C�?:E)/��
7�'���$%�����M����%� 3����:$�����&7�6())�8�$�$&&�><&5& >� ����!���������������������������������!��������!�������������'�������������;5"%>@E/�G�B������� 8=%�(�@E@:@E/��
7������ "�%� ���.������� 7%� A��.���� A"� 6>??@8� 3���������� ��� !������ ��!��� ���������� ��� ����� !�������������:�����������������������/�*���-�����" �3/%�D�C:D�/��
7�����H�%���&����%H%�%��.���%�&������%� ������$�%�&����������$%�H/%����������"%�����������&%� �4&������ A2� 6>??E8� &���� ���.���� ����������� ������� ����!��� ����������� ������������!����������/�- ��" �8%�((@@:C*/��
&������%�A�������H%�������&%�A��������$"%���,�����������%�%������H5%�&������������6())�8�5��������� ������������ �0$� ��� $�$&&�� ��!������ �������� ��� ���� ������������ ��������� ����� ������������������������������������������������������������������������/�B���-�����)8%�>E)@:>D/��
&���� A�������7%� "��������%�&���� $%� A����� &%� ��� BN%� 5����� HH� 6())D8�&������:���������������������������������������3��������������33���������������������������������������������������������������������������������������/�B���-�����8@%�>DE*:@D/��
&��������� �%� ��������&%� "��&%� �����M�� �%� ��������� &%� ������� �%� 2�����!�� � 6())�8� �����������������������;������<�":&�-���� ����������������.�������/�G�B������� 8=%�D>()E:>(/��
&����"%� ������� H%�$�������&�%����'�����$%�&����.��-��M�5%�&����&%� &�!�!M������%��������0"�6())*8� &��� ��������� ����� ������� M��������������������� ���� ��������� ���������� ��E$�������� �������������������������������!������/�G�B������� =/%�(�C�:*D/�
�������C�A�!����������
"� �� � ��>D?�
�
&���!��&� 6>?C(8�&������������������������������������� �������������������������������������������:��������������/�$���������������������������������������!���������������������������/�B�����G�� 8%�(D?:E�/��
&����M���7H%���������$%��������$%���������5%����������%�A�����H5%�$������%�&��M�.�&&�6())D8� ����� �������� ��������� ����� ����� ���������:� �� �������� ��� ������������� ���� ��!��� ���������� ���-���������������3;%/�����-������8%�(*@?:CD/��
&�����%�������H2�6>?�D8�&������������������������������������/�G�B��������@8%�@(?:@�D/��
&�����&5%�7������M��&$$������� 6>???8������������'������������������ �'����� ��� ����������������������������������������������:�����:������������M����6&$�58/�G�B������� 83%��)E@�:C)/��
&����M� 7%� �������� �7%� 2������ &%� A������&%� &.�������� H%� ����������� 7$%� ��M��� �H%� ��������&$�6())D8�$�����:>���������������������������������������������������������������������/�B���-�����8@%�>)?@:>)E/��
&���� �%� $��!��� $%� 5������ 3&%� ������� �%� ������� �7%� ���������� 5%� B��������� B� 6>???8� &��������������� �������������� !������������������������������������������ ���������������������/� G�B������� 83%�>>D�>:*/��
&,��������� %�B������� %���������$$%�&�����%�&�.-�������6>??*8�&�������(�����%���������������������������%�����'������������������������!���������������������������������/�" �B��� @ %�E@:@@/��
&��-�.�� &%� A��.��� &�%� ������� �%� A��.��� "%� $����� &� 6())D8� ����������� ����� ������������������������������������������/�,���#������==%��)?:>E/��
&���.���&�6>??D8�%�����������������������������/�,���G�B����� �8%�C>�:(E/��
&�.�����������%�$����$%������&�%�����$H%�%�������6())D8��������������������������������������:�������� ������� @:��������� ������ ������ ������� ���� ����:�����:������� ����!���� ��� ��������:��������������������������!�����������������������������������/�G�B������� 88%�>>>>?:(*/��
�������C�A�!����������
"� �� � ��>E)�
&�.�����������%� �������;�%�����$H%���������$%�%������� 6())>8�&-�������������������������� ������������� �����:���������������:@�������� ��� ����������������������������������������������������:����������������/������B�����B������/83%�>C�:*>/��
0������� 5%���������� $%� �����M.�� �%� �������� $� 6())D8���������� ���������������� ���������� ����:�����:������� ����!���� ������� �������� ��� ��������� ��� ��� ��������� ��� �������������� �������������:�����������������/�B���-�����8�%�>*�*:D�/��
������� �$%� �������� �7%� ���� $H%� A���� �&%� �������� H�� 6())�8� ��������� ���������� ��� ������������� �����:�����:����������������@� �������������������� ������������������:(�����5�(����������/�, ���� �������33%�>))*:>?/��
���� �7%� A������� �H� 6>?C�8� 5""� �������� ���� ���� ���!���� ������� ��� ���� �!!��� �������� ���������������������������/�(����,���� 3%�(?(:�))/��
�������$"%��������&%�6>?@>8�5����������������������������������������������������������-�����������/�G���������6)%�@C:CD/��
�����0%������� %���M���.��&%�&�.�������&%�3���&&%�������&%�0�.������%� ����&�6>???8�5��������������DD� ��� ������ �������� ���� ����� ��������� ������ ��� ����������� ��������� ��� ��:����� ���������������������/�*�������-�����6%�((:*/��
�����$3%�&�������&%�����.��&%�&������%� ���������%�$��!���$� 6())>8�&����������������������������;��������������-�.��-���� ��!����:(� ������� ����� ��������������!������/�G�B������� 8)%�>(E�:@>/��
�M�-��&%�0�����&$�������6())*8�����������!��-����������������:���!����:>:�������������������%� �������� ,�����������������������%� 7 :����������������%���������������������������������:������������������������/�*���-�����" �86%�*EC:@@/��
������.������5"%���MM�!����%�����!����.���5&%�������&%�&������� %�%������ &%�;��������������$%� ������� �� 6())@8� 3��������� ���� ���������� ��� ������� ���������������� �������� ��� -��������������������������:��������������������������� ���������������������������/�(����,����=6%�>>(:()/��
��.�HB%����BN%�$����&%�7�-�5%�H����7%�������&� 6())D8�5"%:��.����-��� ����������������������7 ��������������������������������/�,� ��/@/%�@*(:D/�
�������C�A�!����������
"� �� � ��>E>�
�
�������� �%� ������� A%� ������%� ����������� 6>?E>8� A����������� ���� �������������� ��������������� ����������������������������������������/�333/�&�����������������������������!�����������������!������0���������������/�B�����B�����������8%�()C:>�/��
��������� "� 6()))8�7����������������������������������� �������� ��� ������� ������� �������/�������������������6%�>(@>:C)/��
�����L�%� �����$H%�7��������%�A,������7%�0��&� 6>??>8�7��������������� �������M����������� ���������������� �!������������������������ ��������������� ������������ ����������������������������������/�, ���� ������� 8%��()):C/��
������&%�&�7����&$%�A��������7%�0��-���-�.���%�&�������6>??D8��������������������������-�����������������������������"���������������!���������������������������������33!�!�����%�������;�!����������������E�!����>��������������������������!�����/��������������� � %�D?>:E)>/��
���������� 7 %� ���-��M� 0A� 6>?*D8� ��!�������� ������������� ��� ����������� ����������� �������������������������/�G�B������� 68%�E)>C:(�/��
������%����.�3&%�����.����7%�5�-�������6())E8�&���$�$&&�������������������/�B�����G�/=)%�>E:(C/��
��-����2%������7%����������&%�7�����2H�6>??E8�"����������:������������������������!����:���������!����������������!�������������/����G�������� )8%�5(?):*/��
������ #%� ���-��������� &%� H������ 2%� ��!��� %� 6>???8���DD:��������������� �������� �������� -�����������������!��������������������������������������������!����/�G�.��� ����)/%�D?>C:(�/��
���.����� $�%� 2����� �%� &�������� 7%� ��������� �H� 6())>8� ������������ ���������� ���� ���������� ��� �����������������������������������������������%�������������������������������������/�B�����G�/63%�>C:(D/��
����!������7%�A��.����2�6())*8� 3����������������� ������������-���������������������������/�,� �-�����*�� )%�>(>:@/��
�������C�A�!����������
"� �� � ��>E(�
���������%��������2%�;��.� %�����I��������&$%������5�!��.�&"�6())C8�&�������������������������:������������%����������%������������M�����/��������������363%��DE:E?/��
����������&%� �����%������%�%��������"�6())E8������������������������������������������������������:��������������������������/�.����G�� ���,�)�������@%�(>?:(D/��
�������������%����������7%�2����&�%�&������%���-�-����%�A�����%�&�������;�%�&������2�%� ��������H� 6())C8� %�������� ��� ��������:� ���� ;������:���� ����������� ������ !�� �������� ������ ���������������������������/�G�B������� = %�>)*>D:(E/��
��������H�%� ������M:"��M���M�3$�������6())E8������������������������$�$&&������������!��������������������������������������������:����������������������������������������������������������/�B���-�����8 %�>(D>:EE/��
��������H�%����������7%���������%�5�����77�6())(8����������:���-������������������-����������������������������:��.���������/�� ��- ��������)3%�@?:?(/��
����M�� 7%� #!����� %&$� �� ���� 6())*8� ������������� ������������� 33� ������ ����������������� ��� 3��3��������/�(����,���/��
��M����%�2���%%��������%�A������&�%�7���������6())(8������'����������!����������������������%�����������������������!��������������� ��� ����� ������ ��� ����:� ������������� ��� !���������� ����������!����������'������/�*���-�����" �)�%�(�D:D*/��
��!����%�"������%�7������ H"%�A���'�����%�A�����%7%������&$� 6())�8������������7 � ���������0$� ��� ��������� ������ ��� �� ���������� ��.�� ��� ������� �������������� ����������� ��������������������������!����������������������/�-�������� �� 6%�D�C:D@/��
��!.���7%����������7%�5�����77%�7�����H�%��4&������A2%���������H��6()))8�����������:��������������� ��� ��������������������:�$�$&&�:>���������������7���������/������#���������,��0�,���88%�D@*?:?D/��
�������M:&��M���'��� H�%� &�������-�.�� $A%� ������ 5�%� 7����� �%� 3����:$����� &7� 6()))8�������������������&5& :><$�$&&�>������������������ �-������������������ ����/�G�B������� 86%���DC>:?/��
�������C�A�!����������
"� �� � ��>E��
������%�%��������� �6())@8�3�����������������������������������������������������������D*�����������������������%��������!���������D���(<�������A�.�����/�� ��-�����,��8 %��(>:��/��
����� &�%� 2������ $�%� &�.���������� �%� ������� ;�%� %���� 5%� %����� �%� &����� �&%� ���� $H� 6())E8�����������������������������������!��-����&�":@���������:�����:����!������������������������������������������������������������������������� ��������/�G�B������� =@%�(E@CD:*@/��
����������5%�B���������B�6>??>8��������������������������������-�������������������/�����)3%�*@C:?/��
�������� �7%� ������ �&%�������� �$%� ������ H�%� �������� H�� 6())��8� ���������� ���� ����������������$�$&&�:>����������������������������;��������������������������������������������������/�G�B������� 8=%�D(��):?/��
���������7%���������$%� �����&%�&�������%���������H��6())�!8� �����:���������������������������������������;������������������������/�, ���� �������33%�>)():�>/������������7%���������&%�A�-�� �6())E8�������������������������������� �������:�&��� ������������������������%�����������������������������������������������������/��B���-����%��#,�"��,��"%�>>):>>)/���
���������7%���!.���7�6())C8�&�������������������������������:���:���������� ������� �������������������/�����-�����0������/%�(*?:�>(/��
���������7%���������$�6())@8�5�������������������� �����������:��������������/�,� �-�����*�� 3%�(>C:(C/��
������ �5%� H���!�� 0�� 6())D8� ������������ ��� L������� ������� ������� ���������� !�� ������:!���:�����������/�B���-�����8@%�>@*E:?(/��
������ %�����.��&%�&�.�������&%���-��������%�������&%� ����&�6()))8� ��������������������������������������������������������/�(����,����83%�>>D*:E(/��
������ &%� ���� &%� ����� &� 6>??D8� ������������ ��� �������� �����M������ �������� ��� ������� �������� ���������������������!������������/�B���-�����6@%�(@@:C)/��
�������C�A�!����������
"� �� � ��>ED�
��..��$H%��������������%�&������%���-�-����%�7�A�����"%�&�������;�%�&������2�%� ��������H�6())�8�&����������������������������������������������������!��;������/��� ���-��)/%�DC*@:?>/��
������ H�%��������%��������M�"%��������&� 6>??@8�&��� ����:�����:����!���� ������:� ������������ ������������/�B�����G�/�6�3�,���5%�>:?/��
��������$%�"��������$�������6())D8��&L����������.�������������������M��������������������������������������������������������������������������/�" ���� ���/�%�>ECC:*@/��
�������� $%� B����������� &%� ������� ;�� 6>?*?8� ���������� ���� ������������� ��� ���������� ����� ����������������� ��� ���������� �������� ����:������� �������� ������ ��������:������������������:��������������������/�G�B������� )3%�>�*D):C/��
��������$%�B�����������&%�#���������A%�7������&�%� �������;�� 6>??(8�7�������������������������������������������������������������������������������������������������������������������/�" �B����6�%�ED>:E>/��
������H�%�2��������H$�������6())>8�;�������;>�����������������������������������������������"��DD>:$��DD(� !���%� �� ����� ����� ��� �������� !�� ����!������ $�$&&�:>� ���� $�$&&�:D/� G�B������� 8)%�>��C(:*/��
��������� �2%������� %� ;�����.���� I%� &�������� 3A%� 5������� HH� 6())E8� &��� &�":@����� 3������� 3���������������������� ��������������������������� ����������:�����������������:������� 6�"�8�����:���./�G�B������� =@%�>>?�@:D(/��
����� %� ��,�.�-�� �$� �� ���� 6())>8� 3������� ��������� ��� ������� ����� ���.���� ������ ������� ����!���/�B�����B������-������� � =�%�>>ED:@)/��
����������7%����������$$������� 6())C8��&L�� ���������-���� ����:�����:������� ����!���:� ������������� ��� ��������������M�����������������������������������/�G�B������� = %��)>@>:C)/��
�������� �%� %������ H$� �� ���� 6>??C8���DD� ��������� �������������� ��������� �����!�����%� �����������������%������������������/�B�����8@%�((>C:��/��
�������C�A�!����������
"� �� � ��>EE�
������������ &%� 5��������� �� 6())�8� 5��������� ��� ��������� ���������� ���� ������������ ���������������������������������������������������������������������������/�B���-�����)8%�(@?:CC/��
��.�������&%�&�M������&%�B�������%���,������&%�B�M�-��&%�B�������&%�&����������6())D8�5����������������������������������������������������/�G�*���, ���� ���//%�(*>:?>/��
����:$!�������� �%������� 5%� "������� �%� ��.��� 0� 6())E8�&������:���������� ������� .����������������������M����������:��������!��.��-��������������������������������������������������������������/�, ���� �������3)%�>(�@:DD/��
��������0&%�����$H%�$������$�6())@8�5�������������������� ������:�:���������������� ������������!��-��������">:����������;����������������������� ������������������������/�*�����B��� 6%�>D:?/��
������ 2%� 2���� "$������� 6())E8� &��� �������� ;������� ;>����� ;(� �������� �������� �������������������������/�*���B��������)%�>��):D)/��
�������� &%� B����� B%� �.�M�.�� &%� 0���� 0%� ��-������� 3%� &��� &%� �������� H�� 6())*8� ���������������������������!������:�����������������������������������.���<�����.����������������������&7�(� ���� &7�D� ����-��� ��� �������� ������ ��� ��������� ����%� -����� ���� �������� ������������/�" ���� �/��
������� &%� ������� $� �� ���� 6()))8� $�$&&�:>:� ������������������:����������� ���������� ��� ��������-��%���������%��������������������������������/�G��� �. ����@6%�>�DE:E(/��
��������� &%� 0������� B%� 3��� �%� ������� �� 6>??�8� ��0$� ����������� �":&%� �� ����� ����������� ��������������������������������������������������������.����!�!���/�$��������������������������������":&��������������������������;������/�G�B������� )=%�>DD@>:?/��
���������&%�I�.��&%� 3����%�#,����&%����������6>??E8�&�������������������������M����������������":&%��������������������������������������/�"�������!��.������������������������������������":&����������/�G�B������� 8@%�>)�(*:��/��
���,���$&%� �������%�A������5�%�B�������&%�A��.���&H�6>??@8�%��������������������� ������0$� ����������� �����������������/�G�B������� 8�%�(��?E:?/��
�������C�A�!����������
"� �� � ��>E@�
����� &$%� ������� %%� A������� �%� ��!��� �� 6())@8� �����!������ ��� ���� ������� ��� ��!��� '������/� ���� ������)6%�>(@:�@/��
������ H%� �������� H�� 6>??(8� ������������ ���� ��������������� ��� �� �����%� ��������� ������� ���������������������������������������������!�������������������������������������������������������������������������/�G�B������� )8%�@�*(:*/��
�������&%�&�������B�6>?*)8�5�������������������������������������������� �������/�G�-�����(����)@%���>:*/��
�������&%���.������%��������$%�3-������&%�%����������%������$A%������5%�0�����&�6())D8��������������!��-���� ���� ������������� �������� ��� �������� ����������� ���� ���� .�������� ��� ������� ������������������������������������������� ��� ������������������������� �����������������/�*���-�����" �)=%�D*D:?>/��
������$�%�&�������� H$� 6>??*8�������������������������������������������� ����!���� �����������������������������/�G�B������� 8/%�>?(�:�(/��
������ $�%� �������&%$������� 6>??C8������������ ���������������� �������������������� �����������������������/�- �����3�%�D?�:C/��
�����.:���M���� &%� 7������&$$������� 6>??D8� �����:����������������M���������%"%����������� ����������!������%"%�������������M�����%�����������%���������������������/�����88%�>)>E:(D/��
���BN%���������%�2������-�����%��4A����&H%�$��������H�%���������$%�&��M�.�&&%�5�����HH�6())*8�������� �����������������!������������������ !��-�����������������������������������:�A&�>E�����"�%?�������������������!����������������������������/�" ���� ���/6%�>>>:(>/��
���BN%�2��L%��4A����&H%���������%7%��������H0%�&��M�.�&&%�5�����HH�6())D8��������������������A&�>E�����"�%?����������������������������������������������:����������������������������:������������������������������:���������������������������/�" �B��� 8)%�@D:C�/��
����� $%� �.���� %� &���� &� 6())@8� L������� $�$&&�>� ����������� ���������� %"%� ����������������������������������������������������/�" �B��� 86%�(@:�?/��
�������C�A�!����������
"� �� � ��>EC�
��������%���������%7%�5�����HH�6())E8����������������������!������������������!��-����������������������������������������:�����������!�����/�" �B��� 88%�():�)/��
����"2%���!������� %���M�.��&%����������0%�&����&�6())(8�7��.�������������������������������������:������������������������/�*���-�����" �)/%�((�:�>/��
���� "2%� ��!������� %� ��M�.�� &%� ��������� 0%� &���� &� 6())�8� %�������:������������ ������� �����������:��.�� ��-��� ������ 3� ��������������� ������� ��:���������� ��� ��������� ���.� ������� 6���>8� ��������������������������������������:����������.�����<$.�� ��� �����������������/�, ���� �������33%�C?�:*)>/��
������� &7%� "�������� �A%� &�������� H"� 6())�8� 5������� ��� ��:����� ���� ��:����� ������������ ��� ��������!��������� �����������:������������������� ���� ������������������������������������������/�����-�����0�����8%��E:D*/��
������:&���-����&7%�"���������A%�&��������H"�6())D8�������������������������������������������!��!�������������:����������������������� �����������������:����� �������������������������������������:������������������/�-�������� �� =%��>�:?/��
������:&���-���� &7%� "�������� �A%� &�������� H"� 6())E8� 5������ ��� �������� ���� �������������������������������� !������������������������������������ ��� ��������������� ��������������� ���������������������/�-�����(����" ��8%�D)C:>E/��
������:&���-����&7%�&��������&%���������%��������"%�����������&%�7����&%�"���������A%�&��������H"�6())@8� "����������� ���������������� ������ ��� ����� ���������� ����!���� ��!��'����� ��!��������������:������!��� ������� �������������������-�������� �����������������������������������/�B���-�����83%�**>:*/��
�M������ &%� �����M���.�� &%� &�!��-�.�� I� 6())�8� 3������������������� ������������� ��� ����������������������������/�(����������������)���3�%�E?:@D/��
�M��������� �%� "���� H%� ��:�M�!�� "%� ���� �7%� I����� B%� &��� H�%� ��������� �H� 6())(8� &������������������ ��� ;������� ���� ���� �������� ��� ������ �������� ��������� ���� ��������!��� ����/� G��������-�� @%�(EC:@@/��
&���.��B%�$������ %� �!������%� ����� %����!�������#%����-���6>??�8�&:����������������������!�������������:����!���M�������.����&3�:>�!���/�#�����/)�%�C?:*(/�
�������C�A�!����������
"� �� � ��>E*�
�
&��������H"%�"�������%�������$%�&�&������2 %�&����� ��6>??E8�7��!�!����-������������������!���������������������M��������� ��� ����� ��:����������������������������������!���/�B���-�����6/%�>�*E:?>/��
&�������� H"%� 7����&%� "�������� �A� 6())C8�&���!������ ��� ���� !������ �������:������� �������� �������������������!��'�����������������������������/�,���-�����(����,�����)3%�>C?:?)/��
&�����5%��4$�����������%� �������;�%���������"%���������$�6>??C8� �������������������!���������������� ������ ��� ��������� !�� ������������ !��-���� ��������:������������ ������� 6�� ��������� ��-��������8�����������!����������������6���������������-���������!���>8/�G�B������� 8 %�DC*C:?D/��
&�����%� ����������%�0�.��.���$%����������%%�2�������%�&�������HA%�A�������&H%�&�����5$�6())@8������:<:���!�!������������������������DD:���������5��>%(��������������������%�����������������������.���-���������/�G�����B����86%�>)>C:(*/��
&�������$%�$������M��%�H�����"�6())>8�&�������������������������������������������������������������������/�-�������� �� �%�E>:CE/��
&������H&%������.�;%�������H %�2������%�&���������%���.��&"�6())E8�&����������������������������������!����������3�>D)�������!����������������������������������������/�, ���� �������3)%�D>(C:�C/��
#,���� &%� ��������� &%� 3��� �%� ������-�� B%� ������� �� 6>??D8� 5��������� ���� !������� ��������� ��� ������!����:������������������ �������������������":&%��� �����������������������������������/�G�B������� )8%�(C@)�:?/��
#�����B%�%�,�����B%�&�����%������� %�B�������5%�B�����.��$%� ������%���M�.��&%�&��������6>??D8�$�(*� .��:������� -���� ����������:��.�� �������� 6,�������:�8� �������� ���� A������� ,������ ����������!������������:�����$��:���������������������������/�B�����B������-������� � @�%���>:?/��
;��� ����� $%� &������ �%� ��� ���-� 3%�&���� �%���� ����� $� 6())(8�%����������� ���� ����������������!�������������������������������������/�-�����"������ ��/8%�>DD:E>/��
�������C�A�!����������
"� �� � ��>E?�
;����������A�%�������H%�A���������%�5����� HH� 6>??)8��������������� ���������� ���������������������������������:���!����� ������!�������������������� ���� ��������������� ����������������������������������������/�" �B����3@%��)C:>C/��
;������%�5�����H$%�B����%���&����H%���&����%H%� ����� %%�A����&�%�&��M�.�&&�6())(8�����.������� ����������%�����-������� �����������-������������������ �����:?%� ������� ������� ��!��������/�*���, ���� ����)%�>>ED:@C/��
;�M'��M�%%� ��������"%�������&$%�7����&%%���.������%�7��!����&%�3����:$�����&7�6>???8�&5& :>%��������������������$�$&&�:>%�����&5& :(�������!����������-�������������������-���������:����!�������������/�G�B������� 83%�(��D?:EC/��
2����N%�����NB�6())C8�5��������������������'������:�������������%������������������������������/�-�����(����" ��8%�>:>(/��
2����2 %�"����H�6())D8�3����������������������������������������������������������/�*������*���B��� 6/%�(�E:E�/��
2������� %� �������;�%�&�����&�6>??C8� ������������������/�G�B������� 8 %�>�??C:D)))/��
2��������A%�&������6>?ED8�&�������������������!����������������������������������������!����������/�G��������,���8)%�>CE�:>CEC/��
2������%�7����������"%�����-����3%�$���H���!��&%�&���������%���.��&�6()))8�&�������������������:����������>�6�3�>D)8��������������������������������/�#���*��)%�>�@*:CD/��
2�����&0%�&�������&H�6())D8��������������������������������������������:�.�����������;������/�����-��83%�>>E*:@C/��
2����!���&"%�2�����H&�6>??@8�$�$&���������������������������������/�" �B����=@%��*?:D)>/��
2���� 2B%� �������� H�� 6>??(8� 3������������ ������������� � ��������� ��� ��� ����������� ���������� !�������������:���������������/�, ���� �������/@%��E>(:(>/��
�������C�A�!����������
"� �� � ��>@)�
2�� B%������ 7%����� 7%� ������ 2%� B���� AA� 6())D8����������������� �����:�������� �":&<;�����������������������-�����������������!�������������������������������!��-���������������-��������������������!���>:�������/�G�����,����8%�(((C:�C/��
2�� B%������ 7%� I����� ��%� B���� AA� 6())(8� !���� >:3������:��������� ������� ����� ��������� ���� ����������:��������������������� ��������� !�� !������� ��� ���:������������������ �":&<;������/� G�B������� 88%�>((?D:�)>/��
2��B%�2��H%�7����B%�B���$%�����7%�I�����B%��������%�B����AA�6())E�8�;����������������������������������������:�����������������/�*�����B��� 3%��:>�/��
2��B%�I�����B$������� 6())>8� 3����������������� ���������� ���;�������"��������� ���������������������:����������������������������������������������������������!������;��������������������!������/�G�B������� 8)%�>D>C*:*@/��
2�� BH%� 7�� ����� ��%� 2�� H%� B��� $H%� B���� AA� 6())E!8� &��� �������������� ;������� -���� ���� !�������������/�����-���6%�D*�:?D/��
L�����BB%������ %�2���B%�7��H%�B���$%�B����AA%�7��2B�6())@8�;�������"���������������������������-��� ���� ��������� ������������ ��� ������������ ������� !�� ����������� ��� ��������� ��-��� ������������/�G�B������� =�%�>?�E*:@*/��
B��������&%�������%������&%�A��������&%���������� 6>??�8����������������!��������������������������� ����� �������� ��� ����������� ������ ��� �������� ��!�!�����/� 3������������ ��� ����� ����� ��� ����:��!���������������/�G�����,���@)�3�,���5%�EE:@E/��
B�������� &%� ��M�.�� �%� $.������ ��%� B������ �&%� ������� �� 6>?*?8� ����������� ��� ����:��!���������������!�������������������!���M��������������������!������/�G�B������� )3%�*)>(:*/��
B���������B�6()))8�7��������:������M����������!���������������������/�����*���2��,��68%�(C@:*?/��
B����A7%�I�����B%�����7%�B����AA�6>???8���������������������������������������� ������� ����">�����������;������/�G�����B�����8 %�(>):()/��
�������C�A�!����������
"� �� � ��>@>�
B�.���&%�&�����������B%�0��������&%�������0%�������� %������5�6())(8�3�������������������������������:!������� �������� ���� ����� ����������� ��� ������� �������:������� ���������� ������ ��� ��������������/�B���-�����)8%�>>@E:C>/��
B�����.�� �%�������� �%� �������� �7%� #,��.�� &%�%�,��� �%� �������� H�%� 5����� 77� 6()))8� 5����������������� �������� �����:����������� ����:@� ��� ���� ��� ����� ��� �������� ��� ��� ��������� ����� ��������������/�, ���� �������3�%�D>>D:?/��
B����BN%�;��������$%�7����H7%���-����H%�;���I������$%���������$%���������7H�6())E8�$�������������������� �����%� !��� ���� ��� �������%� ���� ���������� !������ ��!������ �������������� ����������/� ���� ������)/%�(>DC:@�/��
B�����$3%�����"0%����M��%�6>?**8����������������������������������M�������������� ��� �����������������:�����-����-��������������������-����������:������������������������������/����� ����-�� 6�%�EEE:@D/��
I�.��&%����������&%�#,����&%�3����%����������6>??E8�5�������������":&6;�8%���������������������������������":&�-��������������������������������������� ��� ������ ������������������� �������/�G�B������� 8@%��?>D:*/��
I����� L%� H����� 0%� A����� �A%��������� 5%�&�����&%���M�� ��� 6())E8��������������������������� �����������������������������������������������������!�����.������������'������/�(����,����=/���##���%�>>@?:C?/��
I�����B%�����7%�B����A7%�B����AA�6>??*8�&���"������������;�������������������������������������������������-��������:��.��������/�G�B������� 8/%�(>�D(:E>/��
I����&%�B������&%��������B%��������%�3-���� %�����.��B%����������6>??E8�5������������������������!����������� $�%���������������������:�����:�����������!���%���� ��������/�G�B������� 8@%�(@@EC:@�/��
I����7%�B������&%�I����&%�B��������2%�B�������0%�������-��B%���-������%���M�.��&%����������6())>8�������� ���� $�: ������������������������������������� ����������/�$�������!�� ��������������������!�.�����������������/�G�B������� 8)%�C@?�:@/��
I�����������%�����������5� 6>?*?8�&������������������� ���� ����� ��!�!����������������%�;������/�,�)��G�=%�(?CE:*>/�
Dunning, K.R., Lane, M., Brown, H.M., Yeo, C., Robker, R.L. and Russell, D.L. (2007) Altered composition of the cumulus-oocyte complex matrix during in vitro maturation of oocytes. Human Reproduction, v.22 (11) pp. 2842-2850, November 2007
NOTE: This publication is included in the print copy of the thesis
held in the University of Adelaide Library.
It is also available online to authorised users at:
http://dx.doi.org/10.1093/humrep/dem277