BIOCHIMIE, 1974, 56, 315-317

A propos de la ddlipidation des lipoprotdines par la technique l'alcool-dther.

P i e r r e REBEYROTTE et F r a n c i s TAYEAU.

Laboratoire de Biochimie de l ' Ins t i ta t d ' lmmunolog ie de I 'INSERM-U 20, Hdpital Broussais, 7567~ Paris Cedex 1~

et laboratoire de Bioehimie Mddicale A de l 'Unipersitd de Bordeaux 11.

INTRODUCTION.

Depuis que lques ann6es, divers au t eu r s se sont a t taeh6s h l 'dtude des apoprot6ines des l ipoprot6ines et pa r t i eu l i6 rement h l ' ident i f ieat ion des sous - f rac t ions polypept id iques qui les const i tuent . Cette en t repr ise n 'a g6n6ra lement pu ~tre men6e h son t e rme qu 'apr6s 61iminat ion des l ipides de la f ract ion.

P lu s i eu r s t echn iques ont 6t6 propos6es pour la d61i- p ida t ion des s6 rums et leurs f rac t ions sans d6na tu ra - t ion des prot6ines [1, 2, 3, 4] ; celle de Hardy et Gardi- ner [1] m e t t a n t en ,oeuvre Fact ion eonjugu6e de l 'aleool et de l '6 ther h basse t emp6ra tu re a reeueil l i le max i - m u m de suffrages. Cette m6thode a 6t6 l a rgemen t u t i - lis6e dans le domaine de l ' i m m u u o e h i m i e : elle a per.- ntis j ad i s de m o n t r e r q u ' u n i m m u n s 6 r u m pr6eipi tant perdait , une fois d61ipid6, la prop~i6t6 de pr6cipiter en pr6senee de l ' an t ig6ne eor respondant , tou t en eonser- r a n t ses propri6t6s irr~,munologiques [5, 6] : il est d 'a i l leurs possible, dar~s eer ta ins cas, de res t i tuer les propri6t6s f loeulantes par un s imple t r a i t emen t ehi- m iqu e [7], ce qui pe rmet de eons ta te r que la teeh- n~.que de d61ipidation n ' a ni alt6r6, ni m~me part iel le- merit 61imin6 les ant ieorps.

Cette eons ta ta t ion , valable pour les f rac t ions globu- l in iques ant icorps, ne s au ra i t eependant ~tre 6tendue h toutes les f rac t ions l ipoprot6iques que r en fe rme le s6rum. C'est a ins i que Seanu [8], puis Ayrau l t - Ja r r ie r , Lastra , Past ier , Burd in et Polonovski [9] out not6 que les ex t ra i t s aleoolo-6th6r6s en t r a lna i en t avee eux des t races non 6gligeables de prot6ines (2 p. cent de l ' ex t ra i t see) (*). A l 'oecasion d 'une 6rude su r les modi - fications des prot6ines s6riques au eours de l ' ineuba- t ion [11], nous avons 6t6 amen6s h f o r m u l e r une re- m a r q u e ident ique. Nous avons alors 6tudi6 le ph6no- m6ne et le r6su l ta t de uos exp6rienees fair l 'objet de la pr6sente note.

PARTIE EXPERIMENTALE.

Technique de ddlipidation.

1 vo lume de s6rum m a i n t e n u h + 2°C est addi t ionn6 de 15 vo lumes d ' un m61ange, eon t enan t 4 par t ies d 'aleool absolu et I part ie d '6 ther anhydre , et pr6- s en t an t une t emp6ra tu re de --20°C. Apr6s agi tat ion, le m61ange est m a i n t e n u une heure h --20°C, puis cen- t r i fugd h 10 000 t o u r s / m i n u t e , h une t emp6ra tu re ne d6passan t pas --15°C. Le su rnagean t est reeueilli . Le r6sidu es t repris dans les m~mes condi t ions une

(*) Nous av ions signal6 jad is que l ' ex t ra i t aleoolo- 6th6r6 p rovenan t de l ' 6pu i sement d ' un s6rum pro- t6olys6 r e n f e r m a i t des subs tances azot6es non lipi- d iques [10].

deuxi6me fois, puis une t ro is i6me fois. II est entin 5puis6 par l '6 ther anhydre . Apr6s 61imination des sol- van t s organiques , il se d i ssou t p a r f a i t e m e n t dans l ' eau physio logique et cons t i tue le s6 rum d61ipidC

Toutes les phases aleoolo-6th6r6es sont 6vapor~es h basse press ion et h la t emp6ra tu re a mb ia n t e (Rotava- por Biichi). Le r6s idu l ip idique est 6puis6 h t ro is re- pr ises par le ch lo roforme avan t d'6tre d i ssou t dans une so lu t ion de ehlorure de sod ium 0,15 M, t a mponn6 h pH 7,2. Cette so lu t ion sera ut i l is6e dans la seconde s6rie de nos exp6riences.

RESULTATS.

Nous rappor tons ici deux s6ries d 'exp6rienees. La premiere consis te h compare r le d i a g r a m m e i m m u n o - dleetrophor6tique b id imens ionne l d ' un s6rum d ' H omme et de eelui du m~me s6rum pr6a lab lement d61ipid6 par la technique expos6e c i -dessus (fig. 1 et 2). La tech- n ique ut i l is6e pour l ' immuno61ect rophor6se h deux di- m e n s i o n s est celle de Ressler [1'2], perfect ionn6e par l 'un de nous [13].

Fro. 1 . - lmmunodlec trophor~se bi -dimensionnel le d 'un s~rum d 'Homme normal. Anticorps : ant i sdrum de Lapin anl i -Homme.

316 P. Rebeyrotte el F. Tayeau.

Les i m m u n s d r u m s ut i l is6s sont des i m m u n s 6 r n m s Behr ing an t i -p ro t6 ines tota les , p r @ a r ~ s su r Lapin , el les immuns6 rum, s mo.no.spdcifiques co r r e spondan t s .

g lycoprot6ines , la p l u p a r t des f r ac t ions son t en r6alit~ p r6sen tes dans l ' ex t ra i t alcooto-6th~r6.

Vo.ulant p.r6ciser ces fa i l s et m o n t r e r que ces modi - f icat ions ex i s t a i en t dans t ous les cas, nous avons effec- tu6 des exp6riences d ' immnno-~ lec t ropho r~se avec cinq ex t ra i t s l ip id iques diff6rents, p r i s au h a s a r d p a r m i nos n o m b r e u x 6chant i l lons . Cette immuno-61ec t ropho- rbse m o r m d i m e n s i o n n e l l e [153 a dr6 r6alis~e, c o m m e celle h deux d imens ions , avec l ' I n d u b i o s e A 37 IBF ( so lu t ion ~ 1 p. cent), en t a m p o n v6ronal - lac ta te : ~ : 0 ,03; pH 8 ,6 ; dur6e de l '6 lec t rophor6se : 90 mi- nu tes avec 90 volts. La co lora t ion a m~is en j eu

Fro. 2. - - lmmunodlec trophor~se bi -dimensionnel le ident ique & celle de la f igure 1, mats dans laquelle le sdrum d 'Homme a ~ld soumis & la d~lipidation.

L ' e x a m e n c o m p a r a t i f des deux d i a g r a m m e s met en 6vidence le fa i t que la d61ipidation a provoqu6 la dis- p a r i t i o n d 'une pa t t i e de l ' a lbur~ine , de la p lus grande par t ie des ~z l ipopro i6 ines et de la t r a n s f e r r i n e et de la total i t6 des ~ l ipoprot6 ines . Nous avons r6alis6 plu- s ieurs exp6riences ident iques , qui on t tou tes condui t aux m6mes cons ta t a t ions .

Vou lan t pr6eiser ce p r e m i e r r6sul ta t , n o u s avons cffectu6 une seeonde s6rie d 'exp6r iences cons i s t an t a n a l y s e r l ' ex t ra i t l ip id ique prdpar6 su ivan t la tech- n ique d6crite c i -dessus. Tou t d ' abord , nous avons app l iqu6 h l ' ana lyse de l ' ex t ra i t la t echn ique d 'Ouch- t e r lony [14] en m e t t a n t en oeuvre d ivers S6rums m o n o - sp6cifiques. Les sehdmas de la figure 3 m e t t e n t en 6vi- dence nos r6sn l t a t s et m o n t r e n t qu 'h l ' except ion des

I q

FIo. 3. - - Schemas montranl , au moyen de sdrums monospdci f iques (l & 6), que l'on retrouve la majeure partie des protdines dans la phase d 'extract ion d'un s~rum h u m a i n (putt central).

A gauche : 1 : i m m u n s d r u m de Lap in ant iprot f i ines to ta les ; 2 : a n t i p r 6 - a l b u m i n e ; 3 : a n t i a l b u m i n e ; 4 : ant i ch a n t i t r y p s i n e ; 5 : ant i al g lycoprot4ine ; 6 : an t i ~: l ipoprot6ine .

A droite : 1 : an t i - t g to ta les ; 2 : an t i a~ g lycopro- tdine ; 3 : an t i fi l ipopro t6 ine ; 4 : a n t i - t r a n s f e r r m e ; 5 : an t i rB~ glycoprot6ine 1 ; 6 : an t i [~: g lycoprote ine II.

BIOCH1MIE, 1974, 56, n ° 2.

5T

1 2 3 4

5

SD

ST

FIG. 4. - - lmmunodlec t rophorbse ; put ts : divers extrai ts l ipidiques ; goutti6res : i m m u n s d r u m de Lapin anti-protdines totales d 'Homme.

ST : s6 rum h u m a i n to ta l ; SD : s~ rum h u m a i n to ta l d6lipidd. 1 h 5 : ex t r a i t s l ip id iques p r o v e n a n t de divers s6 rums h u m a i n s .

l ' amido-sch 'warz . Dans les put ts , son t dispns~s les divers 6chant i l lons , t and i s que les go u t t ibres re- ~oivent l ' i m m u n s 6 r u m de Lap in an t i -p ro t6 ines to ta les d 'Homme .

L ' e x a m e n des d i a g r a m m e s (fig. 4) m o n t r e qu ' en p lus de l 'albt~mine, on rrote dans tous les cas la p~6sence d ' au t r e s f r ac t ions p ro t6 id iques et p ,ar t icul i6rement la trarLsferrine, qni se t rouve t o u j o u r s en a b o n d a n t e quant i t6 .

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