Cytologia 50: 311-318, 1985

Action du Sulfate de Vindesine sur l'Ultrastructure

de Chromosomes Metaphasiques

Lymphocytaires Humains

M. F. Turchini, O. Mathe, P. Malet et J. P. Turchini

Laboratoire d'Histologie-Embryologie-Cytogenetique U. E. R. de Medecine, 28, place H. Dunant 63000 Clermont-Ferrand Cedex France

Approuve le 23 novembre 1983

Poison mitotique, derive semi-synthetique de la vinblastine, alcaloide extrait de la pervenche Vinca rosea (Beer 1955), la vindesine est le desacetyl vinblastine amide. Sa molecule comporte deux noyaux indolique et dihydroindolique relies

par un pont C-C. La formule brute de l'Eldisine* (sulfate de vindesine) est C43H35N5H2SO4. Sa presentation par la firme Lilly est faite en flacon de poudre lyophilisee dosee a 4mg avec excipient mannitol 20mg.

La formule est la suivante:

Mode d'action

La drogue affecte l'appareil

mitotique a l'instar de la colchicine,

des podophyllo toxines, de la

griseofulvine et des autres vincaalcaloides.

Elle bloque les cellules en

metaphase. Elle inhibe la forma

tion du fuseau par empechement

de la polymerisation des sous

unites de tubulines des structures

microtubulaires. La drogue est

depourvue de mutagenicite mail peut amener de l'aneuploidie.

Experimentation

Les cultures de lymphocytes humains sont bloquees par la vindesine 2 heures

avant l'arret des cultures a des doses de 50ƒÊg/ml en place de la colchicine. Des

cultures temoins sont conduites en parallele avec de la colchicine.

Resultats

Apres blocage des cultures par le sulfate de vindesine, on note d'abord un

accroissement du nombre des mitoses en metaphase par rapport aux temoins

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colchinises (35% contre 21%). De plus, on peut observer de notables changements dans la disposition et l'etat de compaction des chromosomes metaphasiques. C'est ainsi que peuvent apparaitre des images de couronnes chromosomiques (Planche 2, Figure 2), tres rarement vues dans les experimentations courantes de toxiques divers et probablement en rapport avec une situation d'inertie fusoriale.

Planche 1. Fig. 1, 2, 3, 4, metaphases avec chromosomes spiralisbs et chromomerises.

De la meme facon, les chromosomes peuvent etre dans un etat d'extension inhabituelle (Planche 2, Figure 1) ou de spiralisation et chromomerisation accrue

(Planche 1, Figures 1-4). Ces modifications sont egalement vues en microscopie electronique (Planche 3, Figures 1-6). Enfin, peuvent survenir des lesions de la fibre chromosomique (Planche 4, Figures 1-3) dont certaines sont sous forme d'halos perichromosomiques partiellement analogues aux aspects obtenus apres extraction saline ou polyanionique avec residu "scaffoldique" (Planche 4, Figure 4).

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Discussion

Le sulfate de vindesine est donc stathmocinetique. Il donne d'ailleurs un test des micronoyaux positifs avec anaphases multipolaires et chromosomes retardes. Avec divers poisons, l'arret des mitoses peut se faire a toutes les phases (Wilson and Bryan 1974). L'action de blocage en metaphase de la Vindesine est semblable a celle du VLB (sulfate de vinblastine) et de l'Oncovin* (ou sulfate de vincristine). A faibles doses, la vinblastine donne des post-metaphases avec "midbodies" et

Planche 2. Fig. 1, metaphase avec extension inhabituelle des chromosomes. Fig. 2, metaphase en couronne.

chromosomes apparents (Palmer et al. 1960); la vincristine des metaphases a chromosomes compacts et fuseaux contractes; la vindesine des fuseaux agrandis et des chromosomes disperses; De plus, la vindesine est trois fois plus efficace que la vincristine, dix fois plus que la vinblastine pour 1'obtention d'un blocage a 15 des cellules en mitose. Elle est equivalente a la vincristine et trois fois plus puissante que la vinblastine pour un blocage a 50% (Bayssas and Barral 1978). Les derives vinca donnent une accumulation des metaphases sans changement dans le pourcentage des cellules en prophase et avec peu de stades post-metaphasiques; a des fortes concentrations, ils font apparaitre des cellules multinucleees a noyaux plurilobes et chez les vegetaux, des stathmocineses (C mitose) ou merostathmocineses (C mitose incomplete) (Segawa 1979). La podophylline a un effet prononce en prophase et donne une desorientation des chromosomes a la metaphase; ces chromosomes sont "diplo" et les chromatides soeurs se deplacent ensemble vers les

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points d'attache fusoriaux (Sullivan and Weschler 1947). La griseofulvine arrete exponentiellement la croissance des cellules en metaphase; a fortes doses pendant 18 heures, elle supprime les mitoses et diminue le nombre des microtubules cytoplasmiques. Dans l'oeuf en segmentation, les poisons de type colchicine, vinblastine, podophylline, provoquent la destruction de l'appareil chromatique sans interruption du cycle chromatinien; les centrioles sont intacts, les centrospheres visibles, les chromosomes sont alteres; la reduction de l'activite des asters a lieu

Planche 3. Fig. 1, 2, 3, 4, 5, chromosomes spiralises et chromombrises en microscopic electronique .

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avant faction sur le fuseau et la cytodierese et stoppee avant la mitose. Les blastomeres sont bi- ou plurinuclees et plusieurs mitoses peuvent survenir dont la derniere est bloquee en metaphase . Il n'y a pas d'obstacle a la subdivision des

chromosomes en chromatides d'ou polyploidie (Sentein 1969).

Planche 4. Fig. 1, 2, 3, lesion de la fibre chromosomique en microscopic electronique. Fig. 4, halo perichromosomique en microscopic electronique.

L'essentiel de l'activite de ces substances s'exerce donc sur l'appareil cellulaire achromatique. Des lors, sans pouvoir titre exhaustif, ni vouloir sortir du sujet directement envisage ici, il pourrait titre rappele quelques donnees recentes relatives a la structure de cet appareil et ce, pour une approche dans la comprehension de mecanisme d'action de drogues a son endroit. Les cellules possedent, on le sait, des elements microtubulaires cylindriques creux dont la paroi est formee par la

juxtaposition d'unites protofibrillaires proteiques (13 en moyenne) de tubulines organisees coaxialement. Ces tubulines resultent de l'alignement de sous-unites bivalentes polypeptidiques, homo ou heterodimeriques de tubulines I et II. On peut distinguer dans les cellules proliferantes deux systemes morphofonctionnels

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microtubulaires: un complexe microtubulaire cytoplasmique interphasique (CMTC), un complexe microtubulaire d'appareil mitotique (CMMA) (Cox et al. 1979). Le CMTC se dissocie et disparait lors meme de la progression vers la mitose et le

passage correlatif des cellules d'une forme aplatie vers des contours globuleux ovoides pour titre remplace et restitue dans les elements du CMMA. La formation de microtubules fusoriaux s'elabore du reste en association avec les centres d'organisation microtubulaire (MTOC), les kinetochores des chromosomes prometaphasiques et les paires centriolaires polaires, riches en sous-unites monomeriques reveles en immunofluorescence. Les mecanismes d'assemblages des MT fusoriaux et cytoplasmiques sont peu connus. Les MT des deux systemes sont morphologiquement semblables, mais n'ont pas la meme affinite pour les drogues. Dans l'oeuf, par exemple, celles-ci agiraient preferentiellement sur les microtubules

polaires, mais non sur les microtubules juxtacentromeriques (Sentein 1978, 1983).En outre, diverses classes de proteins restent liees en permanence a la char

pente microtubulaire. Or des ensembles combines microtubulaires et microfilamenteux (ceux-ci souvent contractiles) constituent un cytosquelette dynamique et assurent diverses fonctions primordiales: maintenance de la forme cellulaire, mouvements mitotiques et intracytoplasmiques de secretion, de liberation, des contenus lysosomiaux, d'exocytose, d'endocytose, de regulation de surface, de l'ancrage des recepteurs membranaires, etc... Or, deux classes de drogues affectent ces ensembles:

1. Les drogues type colchicine avec les derives de la vinca, la podophyllotoxine, la rotenone, la maytansine ainsi que divers agents physiques: basses temperatures, pression hydrostatique, D2O, N2O, le xenon, l'argon, inhibent l'assemblage microtubulaire ou se lient specifiquement a la tubuline pour s'opposer aux polymerisations microtubulaires,

2. Les drogues a tropisme microfilamenteux telle la cytochalasineEn rapport plus direct avec notre objet, le mouvement des chromosomes

semble requerir d'avantage que la simple polymerisation de microtubules; mail leur deplacement peut titre initie par des associations et dissociations des sous-unites, a elles seules capables de fournir de l'energie sans implication immediate de proteines contractiles actomyosiniques (ATP asiques). Au surplus, des ponts lateraux intermicrotubulaires existent pour assurer le parallelisme partiel des microtubules fusoriaux. A cet egard, d'ailleurs, les interactions moleculaires microtubulesmicrotubules sont encore mal cernees. Elles sont dues vraisemblablement aux MAP (proteines associees aux microtubules), objectivees sous l'aspect de fins filaments "en moustache" (immunofluorescence). Les MAP paraissent titre justement la cible du N2O, protoxyde d'azote. Enfin une proteine "dyneine-like" ATP asique de haut poids moleculaire vient d'etre recemment decrite comme composante du fuseau.

Elle apparait sous forme de bras courts inseres sur les subtubules A et serait indispensable pour parfaire les mecanismes de glissement tubulaire a l'origine des mouvements chromosomiques.

Pour aller plus avant dans l'elucidation des modes d'action propres a la vindesine, on peut rappeler sa capacite de se Tier a la tubuline a la peripherie des

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tubules (Ouellen 1977); elle agirait au surplus en competition aver certains acides amines du metabolisme. Une preuve en serait l'attenuation de ses effets par l'apport d'acide glutamique. Ces interferences se feraient par inhibition de la synthese des tRNA et de la formation de leurs complexes avec les amino-acides (Segawa 1978); subsidiairement, elle s'opposerait a la synthese du DNA (de Graeve 1979) et a l'incorporation de H3-thymidine, au contraire des derives podophylliques (Stahelin 1979). Mais it n'existe cependant pas de preuve de sa combinaison avec le DNA et elle n'occasionne que rarement des echanges chromatidiens. Les lesions chromosomiques induites par son utilisation sont d'ailleurs indirectes et resultent des anomalies fusoriales. A cet egard, les seuls reports, sauf erreur, avec les notres, sur les effets de type clastogene des vincaalcaloides sont ceux de Segawa relatifs au sulfate de vinblastine. C'est ainsi qu'au sein de cultures de cellules de Hamster traitees par la vinblastine, on observe: une augmentation des metaphases pour de basses concentrations et des temps courts d'action; un maximum d'aberrations avec 10 heures de contact; un accroissement du nombre des noyaux; diverses lesions chromosomiques: chromosomes metaphasiques de forme allongee et parsemes de zones de spiralisation, des C metaphases, du "stickiness", des endoreduplications, des lacunes, ruptures, echanges des anneaux (Segawa 1978).

En tour cas, l'analyse de l'action de la vindesine sur les chromosomes meta

phasiques devrait etre menee plus avant, par exemple par l'exploration systematique des dosages efficaces ou par 1'examen de l'effect d'association sulfate de vindesinecolchicine, a doses reduites.

Summary

Action of Vindesine Sulfate on the Ultrastructural Aspect of Human Metaphasic Lymphocytes Chromosomes

The vindesine sulfate substituted to colchicine in human lymphocytes cultures induces a growing number of cell divisions with modified patterns of the metaphasic

plates. Chromosome spiralization and alteration of the chromosomic fiber are observed in photonic and electronic microscopy.Key-words: Vindesine sulfate, cultures, chromosomes, ultrastructural aberrations

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