Agilent 1120 Compact LC の性能特性一般的な HPLC 分析に適した一体型 LC システム

要旨

Agilent 1120 Compact LC は分析スケールの分析に最適な、使いやすく、高性能で、信頼性の高い一体型LCシステムです。Agilent 1120 Compact LC

は、化学、環境、食品、医薬品などの広範囲のアプリケーションに適しています。機器コントロールは Agilent EZChrom Elite Compact ソフトウェアから行います。Agilent 1120 Compact LC の特長は次の通りです。• 保持時間とピーク面積の優れた再現性• 正確なグラジエント組成• 優れた S/N 比

技術概要

アジレント機器:

• 1120 Compact LC• EZChrom Elite Compact ソフトウェア

アプリケーション分野:

• 環境分析• ファインケミカル• 食品品質管理• 石油・石油化学• 医薬品分析

緒言

Agilent 1120 Compact LC は、5 種類のシステムコンフィグレーションから構成されています。すべてのコンフィグレーションに、機器コントロール、データ解析、レポート作成を行うAgilent EZChrom Elite Compactソフトウェアと、Agilent ラボ診断用ソフトウェアが含まれています。内径3.0 ～ 4.6 mm のカラムと流量0.5 mL/min 以上の一般的なアプリケーションに最適なコンベンショナルHPLC です。

この資料では、Agilent 1120 CompactLC が備える性能特性について説明します。• 保持時間とピーク面積の精度• グラジエント性能• 検出器ノイズとドリフト

テストでは、混合化合物、グラジエント組成、溶媒を変えながら、基本性能について考察を行いました。

実験

装置• デガッサ内蔵のグラジエントポンプ、100 バイアルトレイ付きオートサンプラ、カラムオーブン、可変波長 UV-Vis 検出器から構成される一体型 Agilent 1120 CompactLC (図 1)

• Agilent EZChrom Elite Compactソフトウェア

結果と考察

性能特性解析のための測定項目HPLC システムの性能を、複数の測定項目を用いて評価します。システムの構成要素の一部のみが関係する項目もあります。たとえば、直線性と検出下限は検出器、ディレイボリュームと溶媒組成の精度はポンプ、キャリーオーバーはオートサンプラの精度に影響を受けます。それに対し、ベースラインノイズや保持時間とピーク面積の精度などの特性は、システム全体の影響を受けます。この資料では、各モジュールについて、以下の項目の測定結果を説明します。• ポンプ - 溶媒組成の真度、精度、脈動、保持時間の精度、ディレイボリューム

• オートサンプラ - ピーク面積の精度、直線性、キャリーオーバー

• 検出器 - ベースラインノイズ、ドリフト、うねり、直線性、感度

モジュールごとにテスト項目を記載しましたが、テスト結果には複数のモジュールが関係しています。

ポンプの性能

ディレイボリュームと溶媒組成の精度ディレイボリュームは、溶媒混合点とカラムの間の容量として定義されます。ディレイボリュームに影響を及ぼすパラメータには、ポンプ、ミキサー、インジェクタ、各モジュールを接続するチューブやフィッティングなどが含まれます。ディレイボリュームが大きいとグラジエントの正確さに影響を与え、その結果、分析の選択性にも影響を及ぼします。また、特に低流量では分析時間が長くなります。ディレイボリュームは背圧によって異なり、実際にグラジエント分析を行って測定しました。Agilent 1120 Compact LC のディレイボリュームは、約 850 µL です。図 2 に、グラジエント精度の評価に使用した 0 ～ 100% (10% 刻み) のステップグラジエントを示します。図 2では、シグナルのトレースとプログラムされたステップグラジエントを重ね書きしています。2 つのトレースはよく一致しています。

2

図 1Agilent 1120 Compact LC

グラジエント精度と混合ノイズグラジエント分析で再現性の高い分離を実現するには、溶媒を正確かつ精密に混合することが重要です。水と0.1%のアセトン水溶液を用いた0～100% のステップグラジエントを行い、263 nm のシグナルでモニターして、グラジエント正確さと混合ノイズを測定しました。カラムの代わりに抵抗管を使用しています。図 3 は 3 回のステップグラジエント結果の重ね書きです。高精度なグラジエントが可能であることが証明されています。混合ノイズは、%B の単位で表される各ステップのピーク間ノイズとして計算しました。全体にわたり、ノイズの変化は100% Bのステップに対して 0.05%未満でした。

図 2ポンプディレイボリューム、混合ノイズ、グラジエント正確さを測定したステップグラジエント

Minutes0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130

mA

U

-25

0

25

50

75

100

125

150

175

200

225

250

mA

U

-25

0

25

50

75

100

125

150

175

200

225

250VWD: Signal A, 263 nmStep gradient: 10 %

Gradient pump: Solvent Ratio BStep gradient: 10 %

3

分析条件:カラム: リストリクションキャピラリ（抵抗管）移動相: A: 水、B: 水 + 0.1 % アセトングラジエント: 10 % 刻みで 0 ～ 100 % B

各ステップを 10 分間保持流量: 1 mL/min注入量: 0 µLカラム温度: 36 °C検出: 263 nm、ピーク幅 >0.025分、レスポンスタイム 0.5秒

図 3グラジェント精度を測定したステップグラジエントの重ね書き（n=3)

Time [min]0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130

-25

0

25

50

75

100

125

150

175

200

225

Abs

orba

nce

[mA

U]

VWD: シグナル A、263 nmステップグラジエント:10 %

分

吸光度

[mA

U]

時間 [分]

グラジエントポンプ: 溶媒比 Bステップグラジエント:10 %

リニアグラジエントの性能グラジエント分析において一貫したデータを得るためには、グラジエントは正確かつ精密である必要があります。図 4 には、リニアグラジエントのプログラムと実際の分析結果の重ね書きを示しています。ポンプの優れた精度を示しています。図 5 に示した3 回のリニアグラジエント分析の重ね書きからも、ポンプ精度が優れていることがわかります。

4

図 4プログラムしたグラジエントとリニアグラジエント分析の重ね書き

Time [min]0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30

0

200

400

600

800

1000VWD: Signal A, 263 nm

Gradient pump: Solvent ratio B

Abs

orba

nce

[mA

U]

分析条件:カラム: リストリクションキャピラリ（抵抗管）移動相: A: 水、B: 水 + 0.5 % アセトングラジエント: 20 分間で 5 ～ 95 % B流量: 1 mL/min注入量: 0 µLカラム温度: 36 °C検出: 263 nm、ピーク幅 >0.025分、レスポンスタイム 0.5秒

図 5リニアグラジエント分析の重ね書き（n=3)

Time [min]0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30

0

200

400

600

800

1000

吸光度

[mA

U]

時間 [分]

時間 [分]

VWD: シグナル A、263 nmグラジエントポンプ: 溶媒比 B

保持時間の精度保持時間の精度は、定性および定量結果に影響を及ぼす重要な特性です。精度は、ポンプやデガッサの性能とカラム温度の安定性により異なります。標準サンプルを複数回注入し、保持時間の相対標準偏差を計算して精度を測定しました。ポンプは優れた保持時間精度を示しました。評価したサンプルのクロマトグラムを、イソクラティック分析とグラジエント分析について、それぞれ 図 6 と 7に示します。イソクラティック分析での保持時間精度は 0.1% RSD 未満で、グラジエント分析での精度は0.05% RSD 未満でした。

5

図 6保持時間精度を測定するためのイソクラティック分析

図 7保持時間精度を測定するためのグラジエント分析

Time [min]0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

0

100

200

300

400

1

5 67

84

3

2

Abs

orba

nce

[mA

U]

分析条件:サンプル: イソクラティック標準試料

(フタル酸ジメチル、フタル酸ジエチル、ビフェニル、o-テルフェニル) 1:5 希釈カラム: Agilent HC-C18(2)、4.6 x 150 mm、5 µm移動相: 水/アセトニトリル、30:70流量: 1.5 mL/min注入量: 3 µLカラム温度: 40 °C検出: 254 nm、ピーク幅 >0.0025 分、レスポンスタイム 0.06 秒

分析条件:サンプル: 1. ビタミン C

2. 没食子酸プロピル (PG)3. 2,4,5-トリヒドロキシ-ブチロフェノン(THBP)

4. モノ-t-ブチル-ヒドロキノン(TBHQ)

5. ブチル化ヒドロキシアニソール(BHA)

6. 4-ヒドロキシメチル-2.6-ジ(t-ブチル) フェノール (innox 100)

7. ブチル化ヒドロキシトルエン(BHT)

8. パルミチン酸アスコルビル(ACP)

カラム: Agilent HC-C18(2)、4.6 x 150 mm、5 µm

移動相: A: 水 + 0.05 % TFAB: アセトニトリル + 0.045 % TFA

グラジエント: 15 分間で 10 ～ 95 % B流量: 1.5 mL/min注入量: 5 µLカラム温度: 40 °C検出: 260 nm、ピーク幅 >0.0025 分、

レスポンスタイム 0.06 秒

吸光度

[mA

U]

時間 [分]

オートサンプラの性能

ピーク面積の精度ピーク面積の精度は注入量により異なり、定量に影響を及ぼす重要な特性です。低い注入量では精度は低下します。そのため、注入量を変化させて測定する必要があります。注入量はサンプルの濃度により異なります。さまざまな濃度のサンプルを扱うためには、オートサンプラの注入量範囲が広い方が適しています。高性能なオートサンプラでは、注入量範囲全体にわたり良好な精度を示すことが重要です。Agilent1120 Compact LC オートサンプラでは、計量ループを変更せずに、0.1 ～ 100 µL の注入が可能です。除草剤を用いて、面積精度をテストしました (図 8)。表 1 には、ピーク面積の精度データを示します。

直線性オートサンプラの注入量直線性を1 ～ 80 µL の範囲で測定し、結果を図 9 に示しました。優れた注入量直線性を示しています。25 µg/mL のカフェイン標準品を使用し、注入量は 1、3、5、10、40、80 µL でテストを行いました。分析はイソクラティック条件で行いました。このテストの相関係数は 0.999998 でした。

6

ピーク 化合物 1:100 希釈液注入量 5 µL (注入あたりの ng) RSD 面積1 メタミトロン 16.5 0.192 クロリダゾン 12.5 0.173 シマジン 12.5 0.124 シアナジン 18.5 0.105 プロメトリン 24 0.396 クロルトルロン 48 0.267 ジウロン 10 0.348 プロパジン 23 0.169 テルブチラジン 29 0.33

表 1分析した除草剤と使用濃度

図 8ピーク面積精度を測定するための除草剤の分析

Time [min]0 2 4 6 8 10 12 14

0

10

20

30

40

1

24

5

3

6

87

9

図 90.99999 以上の注入量直線性

0

5

10

15

20

25

30

0 20 40 60 80 100Injection volume [µL]

Are

a x

106 [c

ount

s]

分析条件:カラム: Agilent HC-C18(2)、4.6 x 150 mm、5 µm移動相: A: 水、B: アセトニトリルグラジエント: 15 分間で 10 ～ 90 % B流量: 1.5 mL/min注入量: 5 µLカラム温度: 40 °C検出: 225 nm、ピーク幅 >0.0025 分、レスポンスタイム 0.06 秒

分析条件:サンプル: カフェイン標準、25 µg/mL

(部品番号 8500-6762)カラム: Agilent ZORBAX SB C18、

3.0 x 100 mm、3.5 µm移動相: 水/アセトニトリル、85:15流量: 0.8 mL/minカラム温度: 36 °C検出: 272 nm、ピーク幅 >0.05 分、

レスポンスタイム 1.0秒

時間 [分]

注入量 [µL]

面積

x 10

6[カウント

]

キャリーオーバーサンプルのキャリーオーバーが生じると、ピーク面積の精度が低下する可能性があります。Agilent 1120 CompactLC オートサンプラでは、フロースルー設計によりキャリーオーバーを防ぎます。サンプルと接触するインジェクタの部品は移動相で洗い流されます。洗浄バイアルや複数のバイアルで、ニードルの外側を洗浄することも可能です。テスト化合物としてカフェインを用いて、Agilent 1120 Compact LCのキャリーオーバーをテストしました。5 µL に 2.5 µg を溶かした溶液を 3 回注入した後、純水 5 µL を注入しました。キャリーオーバーは 0.03% 未満でした (図 10)。

検出器の性能

ノイズレベルとドリフトノイズレベルとドリフトは、LC 検出器の性能を測るための特性です。低濃度の化合物を分析する際には、ノイズが低いことが特に重要です。ドリフトは積分の精度に影響を及ぼします。検出器のノイズとドリフトは、ASTMに従い、移動相として水を用いてシステム全体のノイズを測定しました。(「ASTM E-1657-94: 液体クロマトグラフで使用される可変波長型吸光度検出器テストの標準方法」) 表 2 に、可変波長 UV-Vis 検出器のノイズとドリフトの測定値結果を示します。

図 10テスト化合物のカフェインに対して 0.03 % 以下のキャリーオーバー

Minutes0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.25 2.50 2.75 3.00

mA

U

-2.5

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

17.5

20.0

mA

U

-2.5

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

17.5

20.0VWD: Signal A, 272 nmpermanent carry

VWD: Signal A, 272 nmpermanent carry

7

分析条件:サンプル: カフェイン標準 500 µg/mL、部品番号 8500-6762カラム: Agilent ZORBAX SB C18、3.0 mm x 100、3.5 µm移動相: 水/アセトニトリル、85:15流量: 0.8 mL/min注入量: 5 µLカラム温度: 36 °C検出: 272 nm、ピーク幅 >0.05 分、レスポンスタイム 1.0秒

時間 [分] ASTM ノイズ [mAU] ドリフト [mAU/h]6–7.1 0.0087–8.1 0.0038–9.1 0.005

9–10.1 0.00412–13.1 0.00319–20.1 0.003

0–20 0.088

表 2可変波長 UV-Vis 検出器のノイズおよびドリフト

分析条件:カラム: Agilent ZORBAX SB C18、3.0 mm x 100、3.5 µm移動相: 水流量: 1 mL/minカラム温度: 36 °C検出: 254 nm、ピーク幅 >0.2 分、レスポンスタイム 4.0秒

図 115 ～ 2,250 mAU の範囲にわたる検出器の直線性

0

2

4

6

1.953

13.9

063

7.812

5

15.62

531

.25 62.5

125

250

500

1000

Concentration [µg/mL]

Res

pons

e fa

ctor

分析条件:サンプル: カフェイン標準カラム: Agilent HC-C18(2)、

4.6 x 150 mm、5 µm移動相: 水 + 0.05 % TFA

(トリフルオロ酢酸)/アセト-ニトリル+ 0.045% TFA、85:15

流量: 1.5 mL/min注入量: 5 µLカラム温度: 40 °Cストップタイム: 5 分検出: 272 nm、ピーク幅>0.05 分、

レスポンスタイム1.0秒

VWD: シグナル A、272 nmキャリーオーバー

VWD: シグナル A、272 nmキャリーオーバー

分

濃度 [µg/mL]

レスポンスファクター

本文書掲載の機器類は薬事法に基づく登録を行っておりません。また、本文書に記載の情報、説明、製品仕様等は予告なしに変更されることがあります。

© 2008 Agilent Technologies, Inc.

Printed in Japan, April 1, 20085989-7459JAJP

検出器の直線性検出器の直線範囲は、測定物質の感度が特定の変動範囲内 (通常±5%) に収まる濃度範囲を意味します。直線性は、定量結果に影響を及ぼす重要な特性です。直線性は化合物の種類や波長設定によっても異なります。検出器の直線性は、対象範囲について、濃度を徐々に高めた標準物質を用いて測定します。5 mAU ～ 2,250 mAU の範囲にわたり、濃度の異なるカフェイン標準を注入することで、検出器の直線性を測定しました。図 11 に直線性プロットを示します。これは、2 ～1,000 µg/mL の範囲の濃度に対する検出器レスポンスファクター (濃度/面積カウント) を示しています。検出器の直線性範囲は、直線性プロットが水平線の±5% の間にある濃度範囲です。面積と高さの相関係数は0.99995 より良好でした。

検出下限注入量 20 µL で低濃度の除草剤を注入して、検出下限を測定しました。データレートは 14 Hz です。S/N 比(Peak-to-Peakノイズ) から、検出下限を計算しました。14 Hz のデータレートで、検出下限は 150 pg 未満でした。表 3 に、検出下限測定の結果を示します。図 12 に、スパイクした水サンプルとブランク水サンプルのクロマトグラムおよび標準クロマトグラムの重ね書きを示します。図 12の標準の注入量は、表 3 に記載しました。

まとめ

Agilent 1120 Compact LC は、化学、環境、食品、医薬品の一般的なアプリケーションに対して優れた性能を発揮し、高品質な分析結果を提供します。• イソクラティックポンプおよびグラジエントポンプは高い精度を有し、優れた保持時間再現性を実現します。保持時間の相対標準偏差は通常 0.1% 未満です。

• オートサンプラは、信頼性の高い定量結果を可能にします。面積の相対標準偏差は通常 0.5% 未満です。

• 可変波長 UV-Vis 検出器は、中～低ピコグラムの範囲の化合物の高感度分析に最適です。

www.agilent.com/chem/jp

分析条件:カラム: Agilent HC-C18(2)、4.6 x 150 mm、5 µm移動相: 水/アセトニトリルグラジエント: 15 分間で 10 ～ 90 % B流量: 1.5 mL/min注入量: 20 µLカラム温度: 40 °C検出: 225 nm、ピーク幅 >0.0025 分、レスポンスタイム 0.06 秒

図 12標準試料とスパイクした水サンプルの重ね書き:上の線 - 1:10,000 希釈原液、中央の線 - スパイクした飲料水サンプル、下の線 - ブランク飲料水サンプル

Time [min]0 2 4 6 8 10 12 14

-2

-1

0

1

2

3

4

Abs

orba

nce

[mA

U]

1

2

43

5

9 6

78

ピーク 化合物 標準試料の S/N = 3、ピーク間ノイズ注入量 [ng] 0.02 mAU での LOD [pg]

1 メタミトロン 0.66 1322 クロリダゾン 0.5 503 シマジン 0.5 504 シアナジン 0.74 495 プロメトリン 0.96 1446 クロルトルロン 1.920 1287 ジウロン 0.4 348 プロパジン 0.92 349 テルブチラジン 1.160 37

表 3除草剤の検出下限

時間 [分]

吸光度

[mA

U]