Analyse de la fraction phénoliques des huiles d’olive …20... · La méthode de FC a été très utilisée pour le dosage des phénols dans les vins et les spiritueux mais aussi

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Annales des falsifications, de l’expertise chimique et toxicologique, 2ème Semestre 2004-N°965-pp.169-196

Article original Analyse de la fraction phénoliques des huiles d’olive vierges

Denis Ollivier1, Estelle Boubault1, Christian Pinatel2, Sylvie Souillol1, Michel Guérère1,

Jacques Artaud3 1Laboratoire de Marseille, Direction Générale de la Concurrence, de la Consommation et de la Répression des Fraudes, 146 traverse Charles-Susini, 13388 Marseille cedex 13 ([email protected]) 2Association Française Interprofessionnelle de l’Olive (AFIDOL), Maison des Agriculteurs, 22 avenue Henri-Pontier, 13626 Aix-en-Provence cedex 1 3Laboratoire de Chimie Analytique de l’Environnement, UMR CNRS 6171, IFR 112, Eutôpole de l’Arboit, Bâtiment Villemin, BP80 Aix-Marseille III. Titre abrégé : Phénols dans les huiles d’olive vierges Résumé : Ce travail est une mise au point bibliographique sur le dosage absorptiométrique dans le visible des composés phénoliques totaux selon Folin-Ciocalteu ainsi que des ortho-diphénols dans les huiles d’olive vierges. Nous avons étudié l’influence de certains paramètres analytiques sur ces dosages. Une détermination par chromatographie liquide des composés phénoliques d’huiles d’olive vierges a été réalisée pour caractériser des conditions de stockage de l’huile et des états de maturation des olives. Ce travail a été réalisé avec notamment le soutient financier de la Commission européenne (programme de recherche et développement « Qualité de la vie et management des ressources ») dans le cadre du programme européen OLIV-TRACK (QLK1-CT-2002-02386). Mots clés : Phénols, Folin-Ciocalteu, ortho-diphénols, huile d’olive vierge, chromatographie liquide. Title : Phenols analysis in virgin olive oils Abstract : This work focuses on the colorimetric determination of total phenols with the Folin-Ciocalteu and ortho-diphenols with bibliographic data. Different analytical methods by colorimetric determinations and liquid chromatography were developed to analyze the stability during olive ripening and the oil storage. This study has been carried out with financial support from the Commission of the European Communities, specific RTD programme "Quality of Life and Management of Living Resources", QLK1-CT-2002-02386, "Traceability of origin and authenticity of olive oils by combined genomic and metabolomic approaches (OLIV-TRACK)". Keywords : Phenols, Folin-Ciocalteu, ortho-diphenols, virgin olive oils, liquid chromatography. Introduction L’huile d’olive vierge est obtenue uniquement par des procédés physiques (lavage, broyage, malaxage, centrifugation, décantation...) dans des conditions notamment thermiques qui n'entraînent pas d'altération de l'huile. Ces procédés la différencient des autres huiles alimentaires qui, pour la grande majorité d'ente elles, sont raffinées. Les procédés mis en œuvre lui confèrent une composition originale avec environ 98% de triglycérides et 2% de composés mineurs. Ces derniers appartiennent à des familles très diverses telles que : hydrocarbures (avec une prépondérance du squalène de 0,3 à 1,2 g/100g), tocophérols, stéroïdes, alcools aliphatiques, composés volatils, composés phénoliques … Les composés phénoliques, improprement appelés souvent « polyphénols », sont responsables de la bonne stabilité à l’oxydation des huiles d’olive vierges. Outre leur propriété anti-oxydante, ils


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possèdent d’intéressantes propriétés nutritionnelles et organoleptiques. Les principaux composés des huiles d’olive vierges sont représentés dans les figures 1, 2 et 3. La détermination de la teneur en composés phénoliques des huiles d’olive devient une analyse importante bien que non réglementaire à ce jour. Elle fait cependant partie du cahier des charges de quelques huiles italiennes de dénomination d’origine protégée (DOP, équivalent à nos AOC ) avec une teneur minimale en phénols totaux à respecter. La teneur en composés phénoliques des huiles d'olive vierges dépend :

de la variété de l'olive ; du degré de maturité des olives (la teneur baisse avec la sur-maturation des olives) ; du niveau d’infestation des olives par la mouche Dacus oleae [1] ; du climat ; de la qualité du sol ; du procédé d'extraction utilisé pour séparer la phase huileuse de la phase aqueuse ; des conditions de conservation de l'huile…

Diverses techniques ont été mises en œuvre pour l’analyse qualitative et quantitative des composés phénoliques :

- l’absorptiométrie dans le visible selon la méthode de Folin-Ciocalteu (FC) [2] ; - la chromatographie en phase liquide (HPLC) avec détection spectrophotométrique ou

électrochimique [3,4] ; - la chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse [5] ; - l’enzymologie [6] ; - la spectrométrie de masse avec ionisation chimique à la pression atmosphérique (ACPI-

MS) [7]. Le but du présent travail est de :

- réaliser une mise au point bibliographique sur le dosage absorptiométrique dans le visible des composés phénoliques totaux selon Folin-Ciocalteu ainsi que des o-diphénols présents dans les huiles d’olive vierges ;

- d’étudier l’influence de certains paramètres analytiques sur ces dosages ; - d’effectuer une étude en chromatographie liquide (CLHP) des composés phénoliques des

huiles d’olive vierges. Ce travail a été effectué avec notamment le soutient financier de la Commission européenne (programme de recherche et développement « Qualité de la vie et management des ressources ») dans le cadre du programme européen OLIV-TRACK (QLK1-CT-2002-02386). 1. Les composés phénoliques Les huiles d’olive vierges sont riches en composés phénoliques appartenant à diverses familles : (phénols et hydroxyphénols, acides et alcools phénols, sécoïridoïdes, lignanes, flavonoïdes, ....). Certains composés phénoliques confèrent aux huiles vierges une saveur amère et une sensation de piquant. L'oléuropéine et le ligstroside sont les sécoïridoïdes majoritaires de l’olive [8]. Leur aglycone, lipophile, sont présents dans l’huile d’olive. Leurs formules sont représentées figure 2. Au cours de la maturation du fruit, les glucosides sont hydrolysés pour donner des aglycones qui confèrent à l'huile d'olive sa saveur si particulière. Des phénomènes d’oxydation se produisent


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également lors de la trituration des olives et entraînent la formation de composés qui contribuent aux arômes et à la saveur de l'huile. En général, les huiles d'olives « fruité vert » obtiennent les notes les plus fortes en dégustation car elles ont des fruités plus intenses et des arômes plus complexes que les huiles « fruité mûr » et « fruité noir ». Ces caractéristiques sont dues à leur forte teneur en composés phénoliques, aldéhydes, alcools, alcènes… Cependant, une trop grande concentration en phénols donne une amertume excessive et déplaisante, généralement peu appréciée par les consommateurs bien qu’il s’agisse d’un critère de "qualité" pour l’huile.

Les alcools phénoliques

CH2-CH2-OH

OH

Tyrosol 2-(4-hydroxyphényl)-éthanol

CH2-CH2-OH

OHOH

Hydroxytyrosol 2-(3,4-dihydroxyphényl)-éthanol

Les acides phénoliques

OHOCH3

COOH

Acide vanillique acide 4-hydroxy-3-méthoxybenzoïque

OHOCH3

CH=CH-COOH

Acide férulique acide 4-hydroxy-3-méthoxycinnamique

CH=CH-COOH

OH

Acide p-coumarique acide para-hydroxycinnamique

OH

CH=CH-COOH

OH

Acide caféique acide 3,4-dihydroxycinnamique

Les flavonoïdes

HO

OH

O

O

OHOH

Lutéoline

HO O

O

OH

HO

Apigénine

Figure 1 : formules de quelques alcools, acides phénols et flavonoïdes


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O

COOCH3

OO

HOOH

OHHO

O

OHO

OH

O

O

OH

OHCOOCH3HO O

Oléuropéine aglyconeOléuropéine,

Composés lipophilesComposés hydrophiles

OO

O

OH

COOCH3HOO

COOCH3

OO

HOOH

OHHO

O

OHO

Ligstroside aglyconeLigstroside

fruits, feuilles huile

Figure 2 : Les sécoïridoïdes de l’olive, des feuilles et de l’huile.

O

O

R

OH

OMe

HO

OMe

R= H Pinorésinol R= OCOCH3 1-acétoxypinorésinol

Figure 3 : Les lignanes de l’huile d’olive

LLeess ccoommppoossééss pphhéénnoolliiqquueess eett llaa ssaannttéé hhuummaaiinnee [9, 10] • Activité antioxydante Les composés phénoliques de l'huile d'olive vierge ont des propriétés antioxydantes qui réduisent les risques de maladies cardiovasculaires. Ceci est surtout vrai pour les ortho-diphénols comme l'hydroxytyrosol et l'oléuropéine aglycone. Leurs propriétés antioxydantes sont dues à leur capacité à former une liaison hydrogène intramoléculaire entre l'hydrogène libre du groupement hydroxy et l'hydroxyle du radical phénoxy pour conduire à la formation d’une quinone [11]. • Interférence avec les enzymes L'oléuropéine aglycone agit sur l'activité immunitaire des macrophages [12]. En effet, il a un effet positif sur la formation de bactéricides et de l'enzyme oxyde nitrique synthétase. Cette enzyme joue un rôle d'anti-inflammatoire.


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2. Dosage des phénols La quantification des composés phénoliques est le plus souvent réalisée par absorptiométrie dans le visible ou par chromatographie en phase liquide (HPLC) avec une détection spectrométrique dans l’ultraviolet. La méthode absorptiométrique est facile à mettre en œuvre mais n’est pas spécifique et ne permet pas une analyse fine des différents composés phénoliques présents dans l’huile. En revanche, la chromatographie en phase liquide est sensible, spécifique mais demande un appareillage coûteux et se heurte à l’absence de composés commerciaux de référence pour les identifications. 2.1. Méthode de Folin-Ciocalteu Récemment, Singleton et al [13] ont réalisé une mise au point importante sur le dosage des phénols selon Folin-Ciocalteu (FC). La méthode de FC a été très utilisée pour le dosage des phénols dans les vins et les spiritueux mais aussi dans divers substrats dont les huiles d’olive. Les échantillons de composés phénoliques, traités avec le réactif de FC (hétéropolyphosphotungstates-molybdates) (mélange d’acides phosphotungstinique et phosphomolybdique) (réactif commercial, Prolabo ref : 31 360.264), en milieu alcalin (carbonate de sodium), développent une coloration bleue dont l’absorption est mesurée à 760 nm. La température et le temps de réaction influent sur le développement de la coloration. Les conditions expérimentales proposées par différents auteurs [13, 14] sont données ci-dessous : « 1 ml d’échantillon (de blanc ou d’étalon) est ajouté à au moins 60 ml d’eau distillée dans une fiole jaugée de 100 ml. Ajouter 5 ml de réactif de FC et mélanger. Après une minute et avant huit minutes, ajouter 15 ml de carbonate de sodium à 20 %. Ajuster le volume à 100 ml. Mesurer l’absorbance de la solution au bout de 2 heures à environ 23°C (760 nm ; cuve de 1 cm) ». La préparation de l’échantillon peut se faire en diminuant les quantités d’un facteur 5 : « 2 ml d’un échantillon dilué au 1/10 ;10 ml de réactif de FC dilué au 1/10 ; 8 ml de carbonate de sodium (7,5 g/100 ml d’eau) pour un volume final de 20 ml ». Les mesures sont effectuées par rapport à un composé de référence qui pour l’analyse des phénols dans les vins est le plus souvent l’acide gallique. Une liste de composés, susceptibles d’interférer sur les mesures d’absorbance, est donnée [12] avec leur absorptivité molaire. L’huile d’olive La teneur en composés phénoliques totaux dans les huiles d’olive a été très souvent déterminée en utilisant la méthode de FC (Tableau 1). Blekas et al. [14] indiquent que dans l’huile d’olive, il n’y a que peu de composés susceptibles d’interférer sur les mesures (absence de sucres réducteurs, d’acide ascorbique, d’ions ferreux ou zinc). Les résultats sont exprimés par rapport à une substance de référence qui varie selon les auteurs (Tableau 1). Il est donc très difficile de comparer les résultats en raison d’une part des différences d’absorptivité des composés de référence utilisés et d’autre part de la variation des conditions expérimentales dans lesquelles la réaction de FC est réalisée. Pour le même échantillon, les valeurs extrêmes trouvées pour les phénols totaux avec 12 étalons différents, varient de 70 mg/kg pour l’acide 3,4-dihydroxyphénylacetique à 380 mg/kg avec l’acide p-hydroxybenzoïque [14]. Les valeurs [14] sont respectivement de 92 et 105 mg/kg avec l’acide caféique et l’acide gallique qui sont les étalons les plus utilisés (Tableau 1). La méthode manque de spécificité, le dosage ne permettant pas de distinguer les phénols simples des phénols complexes [15, 16, 17, 18]. Les résultats obtenus par absorptiométrie selon FC diffèrent de ceux obtenus par chromatographie en phase liquide [17, 19, 20].


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La stabilité à l’oxydation, évaluée par le test de Swift avec le Rancimat, ne serait pas corrélée avec la teneur en composés phénoliques pour Pirisi et al. (18) ce qui est contraire aux résultats d’autres auteurs qui trouvent que la stabilité des huiles est bien corrélée avec la teneur en phénols totaux [21, 22]. Malgré ces problèmes et les divergences de la littérature, Blekas et al. [14] considèrent que le dosage des phénols des huiles d’olive selon FC constitue une bonne analyse de routine. Tableau 1 : Étalons, λ de mesure, domaine de variation

Ref. Auteurs Étalons λ mesure nm

Teneurs en phénols en mg/kg d’huile

[22] Singleton, (1965) Ac gallique 765 FC [23] Montedoro, (1969) Gallotanin 76-442 FC [24] Montedoro, (1972) Ac gallique 765 FC [25] Ragazzi, (1973) Tyrosol 34,90-271,04 mg/l FC [26] Vazquez, (1978) Ac caféique 50-500 FD [27] Gutfinger, (1981) Ac caféique 725 44-157 FC [28] Cortesi (1983) 180-454 [29] Solinas, (1987) 260-665 [30] Nergiz, (1991) selon [21] Ac caféique 725 35-355 FC [3] Montedoro, (1992) Ac gallique 765 50-1000 FC [15] Tsimidou, (1992) Ac caféique 725 18,7-242,5 FC [31] Favati, (1994) Tyrosol 98-458 FC [32] Stefanoudaki, (1995) Ac caféique 725 153-400

190-500 FD

[21] Baldioli selon [3], (1996) Ac gallique 765 FC [33] Poiana selon [3], (1996) Ac gallique 765 85-195

110-180

[19] Cioni, (1998) Ac gallique 765 119-139 [34] Caponio (1999) Ac gallique 765 175-490 FC [35] Ranalli (1999) Ac caféique 725 99-203 FC [36] Beltran (2000) Ac caféique 725 100-904 [37] Capannesi (2000) Ac gallique 765 [38] Giacometti (2001) Ac caféique 725 52-356 FC [39] Lo Curto 2001) Ac caféique 725 59-255 FC [40] Pellegrini selon [22], (2001) Ac gallique 765 73-265 FC [41] Ranalli Ac caféique 115-159 [42] Salvador (2001) Ac caféique 725 19-380 FC [43] Tasioula selon [27] Ac caféique 725 FC [14] Blekas (2002) Ac caféique 725 20 à 339 FC [44] Gimeno (2002) Ac caféique 765 42-124 FC [45] Gomez-Alonso (2002) Ac caféique 725 130-170 FC [46] Psomiadou (2002) Ac caféique 98-209 FC [47] Bendini (2003) Ac gallique 750 FC : Folin-Ciocalteu ; FD : Folin-Denis [13] Protocoles expérimentaux Les tableaux 2 et 3 résument les différents protocoles expérimentaux décrits dans la littérature en ce qui concerne l’extraction des phénols et les conditions expérimentales de réalisation de la réaction de FC.


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Tableau 2 : Extraction des phénols Réf.

Huile

g Solvant / ml Solvant extraction

v/v Tween 20

g Lavage

ml [27] 10 Hexane/50 3x20ml ;MeOH/H2O; 6/4 non - [3] 10 non 3x10ml ;MeOH/H2O; 8/2 oui -

[15] 50 Hexane/50 3x30ml ;MeOH/H2O; 6/4 non Hexane 3x50 [19] 2 Hexane/1 3x2ml ;MeOH/H2O; 6/4 non Hexane 2x2 [37] 2,5 Hexane/2,5 3x2,5ml ;MeOH/H2O; 8/2 non - [38] 50 Hexane/50 3x30ml ;MeOH/H2O; 6/4 non Hexane 3x50 [39] 40 non 20ml ;MeOH/H2O; 8/2 non - [14] 30 Hexane /30 3x30ml ;MeOH/H2O; 6/4 non Hexane 1x50 [48] 10 non 2x10ml ; MeOH/H2O; 8/2 0,2 Hexane* 10

puis 2x5ml *Hexane saturé en MeOH/H2O (8/2) Tableau 3 : Conditions de la réaction de Folin-Ciocalteu

Réf. Prise essai Folin Na2CO3 V. final Temps λ

Huile départ g

Volume final Extrait MeOH ml ml min nm

[27] 10 1ml 100µl 0,5 1ml ; 35% 10 60 725 [3] 10 np np np np np np np [15] 50 5ml 2ml 0,5 1ml ; sat 25 60; obs 725 [19] 2 100µl 100µl 2,5 5ml ; 7,5% 50 - 765 [37] 2,5 np - 2,5 5ml ; 7,5% 50 1 nuit 765 [38] 50 - - 0,5 1ml; saturé 25 60 725 [39] 40 200µl 200µl 10ml à 10% 8ml ; 7,5% 20 60 725 [14] 30 aliquote 5ml/25 puis

2ml 0,5 1ml ; 35% 25 60 725

[48] 10 50 ml 2ml 1,0 5ml ; 10% 20 90, obs 750 np : non précisé; obs : obscurité La très grande diversité des conditions d’extraction et des conditions de réactions sont probablement une des causes de la variabilité des teneurs en phénols données dans le tableau 1. Il devient donc nécessaire de définir avec précision l’ensemble des conditions expérimentales du dosage pour évaluer les teneurs en phénols dans les huiles d’olive. 2.2. Dosage des ortho-diphénols Les o-diphénols sont les anti-oxydants les plus puissants (hydroxytyrosol, acide caféique…). Différents étalons ont été utilisés en fonction des auteurs. Le tableau 4 donne les étalons utilisés, la longueur d’onde de mesure et le domaine de variation des teneurs. Tableau 4 : Étalons, λ de mesure, domaine de variation

Réf. Référence Étalons λ mesure nm

Teneurs en o-diphénols (mg/kg)

[27] Gutfinger, 1981 Ac. caféique 350 5-15 [49] Ranalli 1997 Ac. caféique 61-194 [50] Mateos, 2001 370 [51] Salvador, 2001 Ac. caféique 370 7,8 ± 5,5 [14] Blekas, 2002 (méthode A) Ac. caféique

Ac. 3,4-di OHPhénylAcé 350 450

7-24 42-168

[14] Blekas, 2002 (méthode B) Ac. caféique Ac. 3,4-di OHPhényl Acé

350 450

12-186 6-87

[45] Gomez-alonso, 2002 Ac. caféique 370 6,45-9,07 [47] Bendini, 2003 Ac. gallique 370 66,7-90,0


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Les deux méthodes les plus utilisées ont été étudiées. Ces méthodes d’après la littérature seraient spécifiques des o-diphénols. La méthode A est basée sur la formation de complexes entre les o-diphenols et les ions molybdate, Les o-diphénols réagissent avec le molybdate pour former un complexe jaune. La méthode B est basée sur la nitration des o-diphénols avec le nitrite de sodium en présence d’ions molybdate. Ces derniers augmentent l’intensité de la couleur des dérivés nitrés probablement par formation de complexes. Le tableau 5 rassemble les différentes conditions analytiques de ce dosage. Tableau 5 : Conditions de la réaction de dosage des o-diphénols. Réf. Huile

départ g

Extrait MeOH

ml

Prise essai ml

Eau

ml

Phosphate pH=6,5

0,1 M, ml

Na2MoO45% ml

TempsMin

λ

nm [27] 10 1 0,2 1 1 2 15 350 [49] np [50] 2,5 101 4 1 15 370 [51] 370 [14] 30 22 0,2 1 1 2 350 [14] 3 30 22 0,2 1 450 [45] 370 [47] 370

1MeOH/H2O (1/1) ; 22ml fraction polaire dans 5 ml méthanol puis ajusté à 25 ml avec H2O 3 méthode B différente basée sur la nitration en présence de molybdate 3. Matériels et méthodes 3.1. Les échantillons Les analyses ont porté sur :

- Une huile d’olive vierge d’origine espagnole ; - Une huile monovariétale de Picholine a été conservée au laboratoire à différentes

températures (- 18°C, +4°C et T°C ambiante) depuis 2001 et à l’abri de la lumière, les analyses ont été effectuées après 36 mois de stockage;

- Quatre huiles issues d’olives de la variété Tanche à des états de maturité différents ; - Deux huiles mono-variétales (Bouteillan et Salonenque) en vue de déterminer des profils

spécifiques. 3.2. Dosages absorptiométriques

Extraction des composés phénoliques 10 g d'huile d'olive (à 0,01 g près) et 10 ml de solution méthanolique (méthanol/eau; 80/20, v/v) sont placés dans un tube à centrifuger. On agite pendant 10 minutes au Vortex. Après centrifugation, pendant 15 min à 3800 rpm, la phase méthanolique est récupérée et transférée dans une fiole jaugée de 50 ml. L’opération est reconduite 2 fois et on complète au trait de jauge avec la solution méthanol/eau (80/20).

Dosage absorptiométrique Folin-Ciocalteu Une solution mère de tyrosol (Extrasynthèse, 4834) à 1mg/ml dans le mélange méthanol/eau (80/20, v/v) est utilisée pour préparer des solutions filles à 10, 20, 80 et 200 µg/ml. À 2 ml de solution extraite sont ajoutés 5 ml d’eau distillée, 1 ml de réactif et 5 ml d’une solution aqueuse de Na2CO3 (à 10%, p/v). Après agitation, la solution est laissée à l’obscurité avant la mesure de l’absorbance à 750 nm. Des quantités de réactifs de 1 à 5 ml de réactifs ont été utilisées, des temps de contact de


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30, 60 et 90 min ont été utilisés. Le dosage a été ensuite réalisé avec 2 autres étalons l’acide syringique (Fluka, 86230) et l’acide 4-hydroxyphénylacétique (Fluka, 56140).

Dosage absorptiométrique des ortho-diphénols à partir de la méthode A [14, 50] Une solution mère d’acide caféique (Extrasynthèse, 6018) à 2,617 mmol-1 dans le mélange méthanol/eau (1/1, v/v) est utilisée pour préparer des solutions filles comme définies dans le tableau 6. À 2 ml de solution extraite sont ajoutés 0,5 ml d’une solution de molybdate de sodium dihydraté (à 5%, p/v, dans un mélange éthanol/eau, 1/1, v/v). Le mélange est agité vigoureusement et après 15 minutes, l'absorbance des solutions phénoliques est mesurée à 370 nm. On observe une coloration jaune plus ou moins intense.

Tableau 6 : Solutions étalons E1 E2 E3 E4 E5

Sol. mère d'acide caféique (ml) 0,4 1 2,1 3,2 4,2 Volume fioles jaugées (ml) 20 20 20 20 20

Sol. méthanolique (1:1) Compléter au volume Concentration en acide caféique

(10-3 mmol.l-1) 52,33 130,83 274,75 418,67 549,51

3.3. Dosage par chromatographie liquide

Extraction des composés phénoliques [50] On introduit 2,5 g d'huile dans un ballon auquel on ajoute 200 µl de chaque solution étalon (acide para-hydroxyphénylacétique dans MeOH à 4,64.10-2 mg/ml et/ou de l’acide syringique à 9,6.10-3 mg/ml). On évapore au rotavapor à une température inférieure à 40°C le solvant de l’étalon. On reprend le résidu dans 6 ml d'isooctane pour passage sur SPE.

Extraction sur phase solide (SPE) [50] L’extraction est réalisée avec une cartouche de phase diol Supelclean LC-DIOL (500 mg/3ml) SUPELCO (greffage polymérique: 2,3-dihydroxypropoxypropyl (7% C)). On conditionne les cartouches avec 6 ml de méthanol puis 6 ml d'isooctane. On élue l’extrait précédent, puis on lave une 1ére fois avec 2×3 ml d'isooctane, puis une 2e fois avec 4 ml d'un mélange d'isooctane/acétate d'éthyle (90/10, v/v). L’élution des composés phénoliques s’effectue avec 10 ml de méthanol que l'on transfère dans un ballon conique. On évapore à sec à une température inférieure à 40°C. Le résidu est extrait avec 100 µl de méthanol/eau (1/1, v/v) à 40°C. On injecte 10 µl de la solution obtenue.

Analyse par chromatographie liquide [52] L’analyse de la fraction phénolique est réalisée sur une chaîne Lachrom (MERCK). Le solvant d’élution est un gradient binaire A= H2O/ CH3COOH (98/2, v/v), B= CH3OH/CH3CN (50/50, v/v) suivant un gradient dont les conditions sont reprises dans le tableau 7. L'appareil utilisé est un système avec un détecteur spectrophotométrique UV2000 (Spectra-Physics) fonctionnant à 2 longueurs d’onde. Le système de séparation est un ensemble de deux colonnes ChromolithTM Performance RP-18e MERCK (4,6 mm x 100 mm) montées en série précédé d’une pré-colonne ChromolithTM Guard Cartrridge RP-18e MERCK (4,6 mm x 5 mm). L’analyse est réalisée a un débit constant de 4 ml/min.


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Tableau 7 : Gradient d'élution Temps A (en %) B (en %)

0 95 5 6 90 10

30 60 40 35 50 50 37 0 100 40 0 100 42 95 5 45 95 5

4. Résultats-Discussion 4.1 Étude des conditions expérimentales du dosage absorptiométrique selon Folin-Ciocalteu 4.1.1 Influence du temps de contact et des quantités de réactifs La figure 4 montre la variation de l’absorbance d’un étalon de tyrosol en fonction du temps de contact avec le carbonate de sodium en présence de 0,5 ml de réactif de Folin et 1 ml de Na2CO3 (à 7,5%, p/v).

Figure 4 : Variation de l’absorbance à 765 nm en fonction du temps de contact des réactifs Le complexe coloré est vert. On constate qu’il n’y a pas linéarité des réponses en fonction de la teneur en tyrosol et cela quel que soit le temps de contact à l’obscurité avec le carbonate de sodium. La figure 5 montre la variation de l’absorbance d’un étalon de tyrosol en fonction du temps de contact avec le carbonate de sodium et une augmentation de la quantité des réactifs à savoir 1 ml de réactif de FC et 5 ml de Na2CO3 (à 7,5%, p/v). L’augmentation de réactifs permet d’obtenir la linéarité de la réponse à partir d’un temps de contact de 60 min Cette durée correspond au temps moyen de la plupart des méthodes décrites dans le tableau 3.

Etalonnage TYROSOL

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0 50 100 150 200T eneur en p p m

T = 3 0 min

T = 6 0 min

T = 9 0 min


11

Figure 5 : Variation de l’absorbance à 765nm en fonction du temps de contact et après augmentation de la quantité des réactifs. 4.1.2 Influence du choix de l’étalon pour établir la courbe de calibration

Figure 6 : Influence du choix de l’étalon

La figure 6 montre l’influence du choix de l’étalon sur la réponse. Les réponses diffèrent en fonction de l’étalon choisi. La tendance actuelle des négociants est de demander une valeur minimale en phénols totaux aux producteurs. Cette étude montre que cette exigence doit être associée à un protocole précis d’analyse de la teneur en phénols spécifiant la nature de l’étalon utilisé Nous proposons d’utiliser le tyrosol comme étalon car d’une part il donne une réponse satisfaisante avec le réactif de FC et d’autre part parce qu’il est un des constituants de la fraction phénolique dans les huiles d’olive alors que celles-ci ne contiennent ni l’acide 4-hydroxy phényl acétique ni l'acide syringique. 4.2 Analyse chromatographique La figure 7 montre un chromatogramme de la fraction phénolique d’une huile d’olive vierge. L’identification des différents pics a été réalisée à l’aide de composés de référence (tyrosol, vaniline, ac. vanillique, ac. caféique, ac. p-coumarique, ac. férrulique, quercétine, lutéoline) et par rapport aux données de la littérature [45, 47, 50, 53,54]. Certains composés n’ont pas été identifiés

Etalonnage TYROSOL

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

0 50 100 150 200T eneur en p p m

T = 3 0 min

T = 6 0 min

T = 9 0 min

Courbe d'Eta lonna ge Ré a ctif de FOLIN-CIOCALTEU

y = 0,0059x - 0,0159

y = 0,0038x + 0,0054

y = 0,0061x + 0,0309

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 50 100 150 200

Te ne ur e n m g/l

Abs

orba

nce

A cid e S yring iq ue

Tyro s o l

A c id e 4 -hyd ro xyp hényla cé t iq ue


12

tandis que d’autres n’ont pas une identification certaine en raison de l’absence de composés de référence.

Figure 7 : Chromatogramme de la fraction phénolique d’une huile d’olive vierge d’origine espagnole (étalon 1 : ac. syringique, étalon 2 : ac. 4-hydroxy phényl acétique) 4.2.1 Influence des conditions de stockage sur la teneur en phénols d’une huile d’olive (Picholine) La figure 8 montre les variations des principaux phénols d’une huile de Picholine conservée à trois températures différentes pendant 36 mois.

0.00

10.00

20.00

30.00

40.00

50.00

60.00

70.00

80.00

90.00

Tene

ur e

n m

g/K

g

Hydroxytyrosol

Tyrosol

C D+E+F

G Quercétine

K Lutéoline

(+)-pinorésinol

N O + Apigénine

R + SW

T ambiante

4°C

-18°C

Figure 8 : Évolution de la composition phénolique d’une huile de Picholine en fonction des conditions de stockage, détermination effectuée par HPLC. Les phénols évoluent différemment suivant leur nature : - L’hydroxytyrosol et le tyrosol augmentent en fonction de l’élévation de la température de

stockage ; - Les phénols complexes (C et D notamment) diminuent lorsque la température de stockage

augmente.


13

Lors du vieillissement des huiles, les phénols complexes (secoïridoïdes…) se décomposent en libérant de l’hydroxytyrosol et du tyrosol. L’hydroxytyrosol est un anti-oxydant qui protège l’huile de l’oxydation. Dans une huile fraîche et non dégradée, les teneurs en hydroxytyrosol et en tyrosol sont très faibles car ils se trouvent principalement sous forme complexe (secoïridoïdes) et très faiblement sous forme libre. Les phénols totaux des trois échantillons de l’huile de Picholine, déterminés par la méthode de FC et par HPLC, sont comparés figure 9. La méthode de FC donne des résultats toujours très supérieurs à la méthode HPLC. Les deux méthodes donnent des résultats qui varient peu avec la température toutefois la figure 8 montre des variations quantitatives entre les différents phénols. En conclusion, si l’analyse des phénols totaux permet d’approcher le potentiel anti-oxydant d’une huile, seule une analyse par HPLC permettra d’évaluer sa capacité à la résistance à l’oxydation.

0

100

200

300

400

500

600

Tene

ur e

n ph

énol

s to

taux

en

mg/

kg

Tamb 4°C -18°C

Folin-CiocalteuHPLC/UV

Figure 9: Évolution de la teneur en phénols totaux en fonction des conditions de stockage et de la méthode de dosage. 44..22..22 IInnfflluueennccee ddee llaa mmaattuurriittéé ddeess oolliivveess ddee llaa vvaarriiééttéé TTaanncchhee ssuurr llaa tteenneeuurr eenn pphhéénnoollss ddeess hhuuiilleess La figure 10, montre les résultats des dosages des phénols totaux selon FC et des o-diphénols déterminés par absorptiométrie sur quatre échantillons d’huiles provenant d’olives de la variété Tanche. Ces résultats sont comparés aux teneurs en phénols totaux et en ortho-diphénols déterminés par HPLC. En ce qui concerne les phénols totaux, déterminés selon FC, les quatre échantillons présentent des teneurs qui varient en sens inverse de celles déterminées par HPLC. Les variations observées peuvent être dues à la différence de maturité des olives. Plus la maturité des olives augmente, plus la teneur en phénols déterminée par HPLC diminue ce qui est en accord avec la littérature. Le fait que la teneur en phénols, déterminée par FC, augmente montre qu’il y a formation de composés secondaires d’oxydation qui réagissent avec ce réactif dans les conditions précédemment décrites. En ce qui concerne les o-diphénols, les dosages par absorptiométrie ou par HPLC donnent des teneurs faibles mais du même ordre de grandeur. Ces déterminations qui présentent peu de variation, ne sont pas très significatives pour évaluer l’état de maturité des olives.


14

0

50

100

150

200

250

300

Tene

urs

en m

g/kg

Ech 1 Ech 2 Ech 3 Ech 4

Phénols parFolin-Ciocalteu

Phénols totauxpar HPLC

O -diPhénols parcolorimétrie

O -diPhénols parHPLC

Figure 10 : Évolution des différentes fractions phénoliques en fonction de la maturité des olives (Tanche). 44..22..33.. CCaarraaccttéérriissaattiioonn dd’’uunnee hhuuiillee ppaarr ssoonn pprrooffiill cchhrroommaattooggrraapphhiiqquuee La figure 11 montre l’analyse de la fraction phénolique par HPLC d’une huile de la variété Bouteillan qui a une teneur en phénols totaux importante (349 mg/kg). Cette teneur a été déterminée par étalonnage interne en chromatographie liquide. On constate que cette huile a un fort potentiel de conservation. En effet, c’est une huile qui possède un important pouvoir anti-oxydant car elle contient beaucoup de phénols dits « complexes » (temps de rétention des composés entre 16 et 32 min).

Figure 11 : Chromatogramme de la fraction phénolique d’une huile d’olive vierge de la variété Bouteillan. D’autre part, cette huile est peu oxydée car les teneurs en tyrosol et en hydroxytyrosol sont faibles ( temps de rétention entre 1 et 6min). En revanche, nous pouvons remarquer sur la figure 12 que l’huile de la variété Salonenque analysée, a subi une oxydation importante puisque sa teneur en phénols totaux est faible (118 mg/kg)


15

Salonenque

Phénols totaux:

117,90 mg/kg

Figure12 : Chromatogramme de la fraction phénolique d’une huile d’olive vierge de la variété Salonenque. De plus, les teneurs en tyrosol et hydroxytyrosol sont importantes par rapport aux taux des phénols complexes. Cette huile peut être issue d’olives trop mûres, d’un stockage des olives avant trituration trop important ou de mauvaises conditions de stockage de l’huile. Conclusion Les méthodes absorptiométriques d’analyse de la fraction phénolique des huiles peuvent apporter des informations sur le potentiel anti-oxydant aux producteurs, aux négociants à des coûts intéressants. Il convient de prendre avec circonspection les résultats issus de ces mesures tant que ces méthodes ne seront pas normalisées tant d’un point de vue méthodologique que d’un point de vue de l’expression des résultats. Les résultats préliminaires concernant le dosage de la fraction phénolique par HPLC permettent de montrer qu’en plus d’une teneur totale en phénols, on peut observer le "potentiel antioxydant de l’huile" par la présence de phénols dits complexes alors que souvent le potentiel anti-oxydant d’une huile n’était évalué qu’à partir de composés simples comme le tyrosol et l’hydroxytyrosol qui sont en fait des composés secondaires, anti-oxydant, déjà issus d’une dégradation de l’huile. Remerciements à Frédérique Franceschi et Muriel Richard pour leurs collaborations techniques. Bibliographie [1] Evangelisti F. Zunin P. Dacus olea infestation and its consequences on the phenolic compounds in virgin olive oil. Riv. Ital. Sostanze Grasse (1984), 71,507-511. [2] Folin O., Ciocalteu V., J. Biol. Chem. (1927), 37,627. [3] Montedoro G.F., Servili M., Baldioli M and Miniati E., Simple and hydrolysable phenolic compounds in virgin olive oil. 1. Their extraction, separation, and quantitative ans semiquantitative evaluation by HPLC. J. Agric. Food Chem. (1992), 40, 1571-1576. [4] Mannino O S., Cosio M.S., Bertulocci M., High performance liquid chromatography of phenolic compounds in virgin olive oils using amperometric detection. Ital. J. Food Sci. (1993), 2, 150-157. [5] Angerosa F., d’Alessandro N., Konstantinou P., di Giacinto L., Characterization of phenolic and secoiridoid aglycons present in virgin olive oil by gas chromatography-chemical ionization mass spectrometry. J. Agric. Food Chem. (1995), 43, 1802-1807. [6] Mosca L. de Marco C., Visioli F., Canella C., Enzymatic assay for the determination of olive oil polyphenolcontent. Assay conditions and validations of the method. J. Agric. Food Chem., (2000), 48, 297-301.


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Analyse de la fraction phénoliques des huiles d’olive …20... · La méthode de FC a été très utilisée pour le dosage des phénols dans les vins et les spiritueux mais aussi