Analyse de liaison, dose-Analyse de liaison, dose-effeteffet

2 sites différents, coopérativité positive?

Of Cours 3Slide 2

Of Cours 3Slide 3

Courbes dose-effet, courbes Courbes dose-effet, courbes de liaisonde liaison

Of Cours 3Slide 4

Of Cours 3Slide 5

Calcul de la ECCalcul de la EC5050 et de la IC et de la IC5050

Of Cours 3Slide 6

Of Cours 3Slide 7

Conclusion:Conclusion:

•La EC50 dépend uniquement du dénominateur, qui décrit Rtot

•La IC50 dépend uniquement du dénominateur, qui décrit Rtot

•Si on mesure dans les mêmes conditions d’incubation la courbe de liaison et la courbe dose effet, EC50 et IC50 doivent être identiques.

Of Cours 3Slide 8

Liaison ligand-récepteur : Liaison ligand-récepteur : rappelrappel

• Compétition: • Saturation:

[ ]50 *

*(1 )i

D

LIC K

K= +

[ ][ ]

[ ][ ]

50

0 50

100%%

oB IB

IC I

IBB IC I

=+

æ ö÷ç =÷ç ÷ç ÷ +è ø

[ ][ ]

[ ][ ][ ] [ ] [ ]

[ ][ ]

[ ]

0

0

0

0

**

*

* * * *

**

*

* 1( *)

*

D

D

D

D

R FB

K F

B F B K R F

BK R B

F

BR B

F K

=+

+ =

= -

æ ö÷ç = -÷ç ÷çè ø

Of Cours 3Slide 9

Liaison « coopérative »Liaison « coopérative »

. n n nn H R R H

[ ][ ]

[ ][ ]

50

0 50

100%%

no

nn

n

nn

B IB

IC I

IBB IC I

=+

æ ö÷ç =÷ç ÷ç ÷ +è ø

Of Cours 3Slide 10

Correspondance ICCorrespondance IC5050-EC-EC5050 absolue?absolue?

•Voir fichier « Excell »! (« Binding-Effet.xls »)

Structures des récepteurs et Structures des récepteurs et activationactivation

Une ou plusieurs conformations actives?

Of Cours 3Slide 12

Familles de récepteursFamilles de récepteurs

• Transmembranaires:o Canaux ioniques contrôlés par les ligands

Signalisation très rapide, plusieurs Sous Unités(4-5),plusieurs TM (4-5 par sous unité)

o G-protein coupled receptors Signalisation rapide (msec), 7 TM, vraisemblablement dimères

o Récepteurs à activité enzymatique ou recrutant des enzymes

1TM dimères ou multimères

• Nucléaires et cytoplasmiques Protéines solubles, Homo- or hétéro-dimères

Of Cours 3Slide 13

Canaux: Au moins 3 “super Canaux: Au moins 3 “super families” avec plusieurs families” avec plusieurs

hélices TMhélices TM

Vraisemblablement: 3 Sous Unités 4 Sous Unités 5 Sous Unités

Récepteurs canaux ioniquesRécepteurs canaux ioniques

2 (ou 3) états:OuvertFerméDésensibilisé

Of Cours 3Slide 15

Récepteurs de l’acetylcholine Récepteurs de l’acetylcholine (nicotinique):(nicotinique):

•Canal Na+, ouvert en réponse à la liaison d’ AcetylCholine

•5 Sous-Unités, chacune 4 hélices TM

Of Cours 3Slide 16

Liaison, effet biologiqueLiaison, effet biologiqueR AcCh R Glycine

Of Cours 3Slide 17

Deux ou trois états?Deux ou trois états?

(α7-AcChR-L247T) (α7-AcChR-wt)

Of Cours 3Slide 18

Effecteurs allostériques?Effecteurs allostériques?

Reconnaissent de préférence état ouvert et le stabilisent

Reconnaissent de préférence état désensibilisé et augmentent l’ouverture

Effet sur la liaison d’agoniste?

Of Cours 3Slide 19

1 234

2

22

2

Of Cours 3Slide 20

Extracellular ring

Central ring(selectivity filter)

Intermediate ring

Gate

D

E/Q

S

L

E/Q

Intracellular ring

2 2

22

2

Of Cours 3Slide 21

Acetylcholine Binding Protein: empty or antagonist-bound

Of Cours 3Slide 22

Acetylcholine Binding Protein: empty or agonist-bound

Of Cours 3Slide 23

Structure 3-D Récepteur AcChStructure 3-D Récepteur AcCh

Of Cours 3Slide 24

Of Cours 3Slide 25

Acetylcholine Binding ProteinAcetylcholine Binding Protein

AcChol

AcChol

AcCholAcChol

AcC

ho

l

Of Cours 3Slide 26

Activation of acetylcholine RActivation of acetylcholine R

Of Cours 3Slide 27

Conclusion:Conclusion:

•Nombre limité de conformations: ouvert, fermé, désensibilisé

•La conformation ouverte est « sur le chemin » entre la conformation fermée et désensibilisée.

•Le passage direct entre la conformation fermée et la conformation désensibilisée semble (généralement) très improbable. (forte barrière énergétique?)

Récepteurs cytosoliques et Récepteurs cytosoliques et nucléairesnucléaires

Conformation dépendante du ligand(“Main dans un gant”)

Of Cours 3Slide 29

GR

HSP90

HSP90

p59

Protein synthesis

Preinitiationcomplex

GR

GR GR

GR

Of Cours 3Slide 30

Structure modulaire:Structure modulaire:

Of Cours 3Slide 31

PCAF

CBP/p300

Sp1 Sp1c-Junc-Fos

RNAPII

TBP

TFIIF

TFIIA

TFIIBTFIIE

TFIID

TFIIH

RNAPII

TBP

Two mechanisms of ERtranscriptional activation

Direct(Binding to ERE)

Indirect(Binding to other TF’s)

ERE

AP1 GC TATA

TFIIF

TFIIA

TFIIBTFIIE

TFIID

TFIIH

TATA

ER

ER

Of Cours 3Slide 32

DNA Binding?DNA Binding?

Minor groove

Major groove

Of Cours 3Slide 33

DNA Binding domain:DNA Binding domain:

Of Cours 3Slide 34

Ligand Binding Domain:Ligand Binding Domain:

Of Cours 3Slide 35

Estrogen-receptor recognition:Estrogen-receptor recognition:

Of Cours 3Slide 36

Laszlo Nagy and John W.R. Schwabe, TRENDS in Biochemical Sciences Vol.29 No.6 June 2004

Empty, inactive and active ligand-bound receptorsEmpty, inactive and active ligand-bound receptors

Of Cours 3Slide 37

Cinétiques de liaison?Cinétiques de liaison?Courbes dose-effet?Courbes dose-effet?

Albers et al, JBC 2006

Of Cours 3Slide 38

Conclusion:Conclusion:

•Il y a autant de conformations « actives » que de ligands

•L’activité biologique de chaque ligand dépend de l’affinité relative des coactivateurs et des corépresseurs pour le complexe ligand-récepteur.

•Un composé peut être agoniste partiel soit parce qu’il reconnaît les coactivateurs avec une mauvaise affinité, soit parce qu’il reconnaît également coactivateurs et coinhibiteurs

Récepteurs de l’insulineRécepteurs de l’insuline

Tyrosine kinase, 1 TM helix;Coopérativité négative,

Relations liaison – activation?

Of Cours 3Slide 40

Surinya, K. H. et al. J. Biol. Chem. 2002;277:16718-16725

Courbes de compétition, de Courbes de compétition, de saturationsaturation

1 site ou 2 sites ?1 site ou 2 sites ?

Of Cours 3Slide 41

Surinya, K. H. et al. J. Biol. Chem. 2002;277:16718-16725

Cinétique de dissociation avec Cinétique de dissociation avec ou sans excès d’insulineou sans excès d’insuline

Of Cours 3Slide 42

S S

Y1146

Y1151

Y960

Y1316

Y1322

Kin

as

e

Y1150

SS

Y1146

Y1151

Y960

Y1316

Y1322

Kin

as

e

Y1150

SS

Insulin Receptorα – Binding β – tyrosine kinase

Of Cours 3Slide 43

Insulin: two binding sitesInsulin: two binding sites

Of Cours 3Slide 44

SNIINS

InsulinR InsulinR αα subunit subunit

Of Cours 3Slide 45

Insulin

INSULIN RECEPTOR

Of Cours 3Slide 46

Insulin

INSULIN RECEPTOR

Of Cours 3Slide 47

Insulin

INSULIN RECEPTOR

Of Cours 3Slide 48

Dose-effetDose-effet

[Insuline] (log M)-10 -9 - 8 -7 -6 -5

[Physiologiques]

Of Cours 3Slide 49

pY699ST

AT

5

Insulin Receptor SignalingEffects on gene expression

Y1146

Y1151

Y960

Y1316

Y1322

Kin

as

e

Y1150

Y1146

Y1151

Y960

Y1316

Y1322

Kin

as

e

Y1150

SH2

PTB

PH

RAS

Y699

ST

AT

5B

STAT 5B pathway

Y

Y

IRS-1/2

pY

pY

pY

PH

ST

AT

5

pY699

pY699ST

AT

5 ST

AT

5

pY699

RAF

AP-1

Insulin

S SSS S

S

TCFFOXO1

PPProlinerich

PKB mTORPDK

p70S6K GSK3β

BAD

Caspase 9

p27KIP

NFκB

IKK

CRE

SOSPP GRB2

PI3K

MEK1/2

ERK1/2

aPKC

Of Cours 3Slide 50

ConclusionConclusion

•2 états du R insuline:o Au repos, en l’absence d’insuline: hélices TM

mal placées donc TyrKinase inactive,o En présence d’insuline: Tyr kinase active,

autophosphorylation, recrutement de protéines de signalisation.

•Liaison: Possibilité de liaison simultanée de 2 insulines/R. Coopérativité négative entre les deux sites de liaison.