Analyse des isomères de F2-isoprostanes par chromatographie liquide couplée … · 2020. 7. 30. · spectrométrie de masse en tandem pour le dosage de sept isomères de F 2-isoprostanes

Analyse des isomères de F2-isoprostanes par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de

masse dans la circulation maternelle en fin de grossesse

Mémoire

Jessica Larose

Maîtrise en physiologie-endocrinologie

Maître ès sciences (M. Sc.)

Québec, Canada

© Jessica Larose, 2013

III

Résumé

Un stress oxydatif survient lorsqu’il y a surproduction de dérivés actifs de l’oxygène par rapport aux

défenses antioxydantes. Ce déséquilibre est associé, entre autres, à la prééclampsie, une pathologie

de la grossesse. Les F2-isoprostanes regroupent soixante-quatre isomères issus de la peroxydation

de l’acide arachidonique. Ceux-ci sont reconnus comme étant les biomarqueurs les plus fiables du

stress oxydatif in vivo. Une méthode d’analyse par chromatographie liquide couplée à la

spectrométrie de masse en tandem pour le dosage de sept isomères de F2-isoprostanes dans des

échantillons de plasma, de sang et de membranes érythrocytaires a été mise au point et validée. Les

F2-isoprostanes dans le plasma ont été corrélés positivement avec plusieurs acides gras trans

plasmatiques au troisième trimestre de la grossesse. Contre toute attente, les F2-isoprostanes du

plasma, du sang et des membranes érythrocytaires sont moins abondants en prééclampsie par

rapport aux contrôles en fin de grossesse.

V

Abstract

An oxidative stress is defined as an imbalance between the production of reactive oxygen species

and antioxidant defenses of the organism. This imbalance has been associated with preeclampsia, a

pathology of the mid-to-late pregnancy. Peroxidation of arachidonic acid generates sixty-four isomers

of F2-isoprostanes. The latter are recognized as the most reliable biomarkers of oxidative stress in

vivo. A method using liquid chromatography tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) for the

determination of seven isomers of F2-isoprostanes in plasma samples, whole blood and erythrocyte

membranes has been developed and validated. The F2-isoprostanes correlated positively with

several trans fatty acids in plasma at end of the pregnancy. Unexpectedly, F2-isoprostanes were less

abundant in preeclampsia than in control pregnancies at the third trimester.

VII

Table des matières

Résumé .............................................................................................................................................. III

Abstract .............................................................................................................................................. V

Table des matières .......................................................................................................................... VII

Liste des tableaux ............................................................................................................................. XI

Liste des figures ............................................................................................................................... XI

Liste des abréviations .................................................................................................................... XIII

Remerciements ............................................................................................................................... XIX

Avant-Propos .................................................................................................................................. XXI

Chapitre 1 – Introduction .................................................................................................................. 1

1.1. Le stress oxydatif ...................................................................................................................... 1

1.1.1. Les prooxydants ................................................................................................................ 1 1.1.2. Les antioxydants ................................................................................................................ 3

1.2. Les lipides ................................................................................................................................. 9

1.2.1. Définitions et fonctions biologiques .................................................................................... 9 1.2.2. Digestion, absorption et transport dans l’organisme .......................................................... 9

1.2.3. Acide arachidonique ........................................................................................................ 12 1.2.4. Acides gras trans ............................................................................................................. 14 1.2.5. Acides gras et stress oxydatif .......................................................................................... 16

1.3. Les F2-isoprostanes ................................................................................................................ 19 1.3.1. Formation des F2-isoprostanes ........................................................................................ 20

1.3.2. Transport et métabolisme des F2-isoprostanes ................................................................ 22 1.3.3. Mesure des F2-isoprostanes ............................................................................................ 23 1.3.4. Effets biologiques des F2-isoprostanes ............................................................................ 25

1.4. Grossesse et désordre hypertensif avec protéinurie ............................................................... 26 1.4.1. La grossesse, un évènement oxydatif .............................................................................. 26 1.4.2. Désordre hypertensif avec protéinurie (prééclampsie) ..................................................... 27

1.5. Problématique et objectifs ....................................................................................................... 31 1.5.1. Problématique .................................................................................................................. 31 1.5.2. Hypothèses ...................................................................................................................... 32

1.5.3. Objectifs ........................................................................................................................... 32

Chapitre 2 – F2-isoprostanes analysis in plasma of pregnant women by HPLC-MS/MS using a column packed with core-shell particles.......................................................................... 35

2.1. Résumé .................................................................................................................................. 35

2.2. Abstract ................................................................................................................................... 37 2.3. Introduction ............................................................................................................................. 38 2.4. Material and methods ............................................................................................................. 39

2.4.1. Materials .......................................................................................................................... 39 2.4.2. Patient selection .............................................................................................................. 39 2.4.3. Blood collection and processing ...................................................................................... 40 2.4.4. Preparation of standards for F2-isoPs analysis ................................................................ 40

VIII

2.4.5. Extraction of F2-isoPs from plasma .................................................................................. 40 2.4.6. Chromatography .............................................................................................................. 41 2.4.7. Mass Spectrometry .......................................................................................................... 41 2.4.8. Method validation ............................................................................................................. 42 2.4.9. Statistical analyses ........................................................................................................... 42

2.5. Results .................................................................................................................................... 42 2.5.1. Analysis of F2-isoPs in plasma by selected reaction monitoring mass spectrometry ........ 42 2.5.2. Chromatographic separation ............................................................................................ 43

2.5.3. Method validation ............................................................................................................. 43 2.5.4. F2-isoPs in the plasma of pregnant women ...................................................................... 44

2.6. Discussion ............................................................................................................................... 44 2.7. Acknowledgments ................................................................................................................... 46

2.8. References .............................................................................................................................. 46 2.9. Figure legends ........................................................................................................................ 50

Chapitre 3 – F2-isoprostanes are correlated with trans fatty acids in plasma of pregnant women............................................................................................................................................... 57

3.1. Résumé ................................................................................................................................... 57

3.2. Abstract ................................................................................................................................... 59 3.3. Introduction ............................................................................................................................. 60 3.4. Material and methods .............................................................................................................. 61

3.4.1. Materials .......................................................................................................................... 61 3.4.2. Patient recruitment ........................................................................................................... 62 3.4.3. Blood collection and processing ....................................................................................... 62

3.4.4. F2-isoPs analysis by HPLC-MS/MS ................................................................................. 62

3.4.5. Determination of plasma fatty acid profile by gas chromatography .................................. 63 3.4.6. Statistical analyses ........................................................................................................... 63

3.5. Results .................................................................................................................................... 63

3.5.1. F2-isoPs in the plasma of pregnant women ...................................................................... 63 3.5.2. Analysis of plasma fatty acids .......................................................................................... 64 3.5.3. Relationship between F2-isoPs and trans fatty acids........................................................ 64

3.6. Discussion ............................................................................................................................... 64 3.7. Acknowledgments ................................................................................................................... 68 3.8. References .............................................................................................................................. 68

Chapitre 4 – Étude du stress oxydatif en prééclampsie ............................................................... 79

4.1. Introduction ............................................................................................................................. 79 4.2. Matériel et méthode ................................................................................................................ 80

4.2.1. Matériel ............................................................................................................................ 80 4.2.2. Sélection des patientes .................................................................................................... 80 4.2.3. Récolte et traitement des échantillons de sang ................................................................ 80 4.2.4. Préparation des standards pour l’analyse des F2-isoprostanes ....................................... 81 4.2.5. Extraction des F2-isoprostanes totaux contenus dans le plasma ..................................... 81 4.2.6. Extraction des membranes érythrocytaires ...................................................................... 81 4.2.7. Extraction des F2-isoprostanes totaux contenus dans les membranes érythrocytaires .... 81 4.2.8. Extraction des F2-isoprostanes totaux contenus dans le sang total ................................. 82 4.2.9. Analyse des F2-isoprostanes par HPLC-MS/MS .............................................................. 82

IX

4.2.10. Analyses statistiques ..................................................................................................... 82 4.3. Résultats ................................................................................................................................. 82

4.3.1. F2-isoprostanes dans le plasma ....................................................................................... 82 4.3.2. F2-isoprostanes dans le sang........................................................................................... 83 4.3.3. F2-isoprostanes dans les membranes érythrocytaires ..................................................... 84

4.4. Discussion .............................................................................................................................. 85 4.5. Bibliographie ........................................................................................................................... 87

Chapitre 5 – Discussion générale .................................................................................................. 89

Bibliographie .................................................................................................................................... 97

Annexe 1 ......................................................................................................................................... 109

XI

Liste des tableaux

Chapitre 1

Tableau 1. Caractéristiques des différents types de lipoprotéines ..................................................... 10 Tableau 2. Facteurs de risques pour la prééclampsie liés à la mère ................................................. 30

Tableau 3. Facteurs de risques pour la prééclampsie liés au père .................................................... 31 Tableau 4. Facteurs de risques pour la prééclampsie liés à la grossesse ......................................... 31

Chapitre 2

Table 1. Selected reaction monitoring parameters optimized for each classes of F2-isoPs ............... 51 Table 2. Results for the method validation of F2-isoPs. ..................................................................... 52 Table 3. F2-isoPs in the plasma of third trimester pregnant women. .................................................. 53

Chapitre 3

Table 1. F2-isoprostanes in the plasma of third trimester pregnant women. ...................................... 75 Table 2. Fatty acids of interest in plasma of third trimester pregnant women. ................................... 76 Table 3. Correlations between F2-isoprostanes and trans fatty acids in plasma of third

trimester pregnant women. .................................................................................................. 77

Chapitre 4

Tableau 1. F2-isoprostanes totaux mesurés dans le plasma de femmes au troisième trimestre d’une grossesse normotensive ou prééclamptique. .......................................... 83

Tableau 2. F2-isoprostanes totaux mesurés dans le sang entier de femmes au troisième trimestre d’une grossesse normotensive ou prééclamptique. .......................................... 84

Tableau 3. F2-isoprostanes totaux mesurés dans les membranes érythrocytaires de femmes au troisième trimestre d’une grossesse normotensive ou prééclamptique. ............................................................................................................... 85

Liste des figures

Chapitre 1

Figure 1. Cycle du glutathion. .............................................................................................................. 4 Figure 2. Système de la thiorédoxine. Adaptée de [24]. ...................................................................... 5 Figure 3. Exemples de petites molécules antioxydantes. .................................................................... 6 Figure 4. Structures des tocophérols et des tocotriénols. .................................................................... 7 Figure 5. Neutralisation du radical peroxyle en hydroperoxyde organique par l’α-tocophérol

qui est à son tour recyclée par la vitamine C (ascorbate). Adaptée de [31]. ......................... 8 Figure 6. Schémas général d'une lipoprotéine. Tirée de [41]. ............................................................ 10 Figure 7. Transport des lipides par les lipoprotéines. Tirée de [45]. .................................................. 12 Figure 8. Voies de synthèse des eicosanoïdes dérivés de l’acide arachidonique. Tirée de

[46]. .................................................................................................................................... 13 Figure 9. Conversion de l'acide linoléique en acide arachidonique. ................................................... 14

XII

Figure 10. Distribution des t-18:1 dans (A) l’huile végétale partiellement hydrogénée (margarine, n = 46 échantillons) et dans (B) le gras de lait de vache (n = 1765 échantillons). Adapté de [57]. ........................................................................................... 15

Figure 11. Mécanisme général de la peroxydation des lipides. .......................................................... 17 Figure 12. Structure des différents types d'isoprostanes dérivés de l'acide arachidonique.

Tirée de [9]. ...................................................................................................................... 18 Figure 13. Mécanisme général de la réaction d'isomérisation cis-trans induite par les

radicaux libres. X• représente n’importe quel radical capable d’induire cette réaction. Tirée de [22]. ...................................................................................................... 19

Figure 14. Structures de la Prostaglandine F2α (PGF2α) et du 8-iso PGF2α. ....................................... 20 Figure 15. Mécanisme de formation des F2-isoprostanes. Adaptée de [92]. ...................................... 21 Figure 16. Structure d’un peroxyde dioxolane-isoprostane (classe IV). R = -(CH2)3COOH................ 22

Figure 17. Structures du 2,3-dinor-8-iso-PGF2α et le 2,3-dinor-5,6-dihydro-8-iso-PGF2α. ................... 23 Figure 18. Dérivation chimique pour l'analyse des F2-isoPs par GC-MS. Tirée de [104]. .................. 24 Figure 19. Signalisation impliquant le 8-iso-PGF2α dans la fonction plaquettaire. Tirée de

[115]. ................................................................................................................................ 25 Figure 20. Invasion des artères spiralées par les cytotrophoblastes dans une grossesse

sans complications. Tirée de [130]. .................................................................................. 27 Figure 21. Invasion des artères spiralées par les cytotrophoblastes dans une grossesse

prééclamptique. Tirée de [130]. ........................................................................................ 29

Chapitre 2

Figure 1. Chemical structures of analytes investigated by LC-MS/MS. .............................................. 54 Figure 2. Mass chromatograms of a standard solution (A-F) and of a typical plasma sample

spiked with 50 pg of each internal standard (G-L). ............................................................. 55

Chapitre 5

Figure 1. Compétition entre la formation des F2-isoprostanes et des isofuranes ............................... 94

XIII

Liste des abréviations

11t-18:1 : Acide trans-vaccénique

1O2 : Oxygène singulet

9t-18:1 : Acide élaïdique

AA : Acide arachidonique

AA-CoA : Acide arachidonique estérifié à la coenzyme A

ALA : Acide alpha-linolénique

AMPc : Adénosine monophosphate cyclique

Asc•- : Radical ascorbyl

AscH- : Ascorbate

BHT : Hydroxytoluène butylé; butylated hydroxytoluene

CAT : Catalase

CCl4 : Tétrachlorométhane

CETP : Protéine de transfert des esters de cholestérol; cholesteryl ester transfer protein

CM : Chylomicrons

CoA : Coenzyme A

COX : Cyclo-oxygénases

Cu : Cuivre

CYP : Cytochromes P450

DHA : Acide docosahexaénoïque

DHAsc : Dehydroacscorbate

ELISA : Méthodes immuno-enzymatiques

F2-isoPs : F2-isoprostanes

Fe : Fer

GC-MS/MS : Chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse en tandem

GC-NICI-MS : Chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse en mode « ionisation chimique négative »

GPR : Glutathion réductase

GPx : Glutathion peroxydases

GSH : Glutathion réduit

GSSG : Glutathion oxydé

GST : Glutathion-s-transférase

H• : Hydrogène

XIV

H2O2 : Peroxyde d’hydrogène

HDL : Lipoprotéines de haute densité; high density lipoprotein

HELLP syndrome : Hemolysis, Elevated Liver enzymes and Low Platelets count syndrome

HL : Lipase hépatique; hepatic lipase

HO• : Radical hydroxyle

HOCl : Acide hypochloreux

HPLC-MS/MS : Chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem

IDL : Lipoprotéines de densité intermédiaire

isoFs : Isofuranes

isoP : Isoprostanes

ISR : Récepteur des isoprostanes

iTFA : Acides gras trans d'origine industrielle

L• : Lipide radicalaire

LA : Acide linoléique; linoleic acid

LCAT : Lécithin:cholestérol acyl transférase

LDL : Lipoprotéines de basse densité; low density lipoprotein

LOO• : Radical peroxyle de lipide

LOOH : Hydroperoxyde de lipide

LOX : Lipoxygénase

LPL : Lipase lipoprotéique

LPLAT : Lysophospholipide acyltransférase

Lp-PLA2 : PLA2 associée aux lipoprotéines

NADPH : Forme réduite du nicotinamide adénine dinucléotide phosphate

NO• : Oxyde nitrique

NO2• : Dioxyde d’azote

NOS : Synthétases d’oxyde nitrique

NOX : Nicotinamide adénine dinucléotide phosphate oxydase

O2 : Oxygène moléculaire

O2•- : Superoxyde

O3 : Ozone

OMS : Organisation mondiale de la santé

ONOO- : Peroxynitrite

PGF2α : Prostaglandine F2α

PL : Phospholipides

PLA2 : Phospholipase A2

XV

PUFA : Acide gras polyinsaturé; polyunsaturated fatty acid

R• : Radicaux alkyles

RIA : Méthodes radio-immunologiques

RO• : Radicaux alkoxyles

ROO• : Radicaux peroxyles

ROOH : Hydroperoxydes organiques

ROS : Dérivés actifs de l'oxygène; reactive oxygen species

RS• : Radicaux thiyle

RSH : Thiols

rTFA : Acides gras trans retrouvés dans les aliments dérivés des ruminants

SOD : Superoxyde dismutases

TAG : Triacylglycérol

TBA : Acide thiobarbiturique

TFA : Acide gras trans; trans fatty acid

TPR : Récepteur de la thromboxane A2

Trx : Thiorédoxine

TXA2 : Thromboxane A2

VLDL : Lipoprotéines de très basse densité; very low density lipoprotein

α-TO• : α-tocophérol oxydé

α-TOH : α-tocophérol

α-TTP : α-tocopherol transfer protein

XVII

«Tu ne traverseras jamais l’océan si tu as

peur de perdre de vue le rivage»

Christophe Colomb

XIX

Remerciements

Premièrement, j’aimerais remercier mon directeur de recherche, le Dr Jean-François Bilodeau, pour

son encadrement tout au long de ma maîtrise. Celui-ci m’a offert une occasion en or de découvrir ce

domaine passionnant qu’est la recherche dans le secteur médical. Il a également su faire preuve de

patience et de compréhension à mon égard puisque, étant chimiste, je n’étais pas très familière avec

les domaines de la physiologie et de l’endocrinologie. Malgré cela, le Dr Bilodeau a eu confiance en

mes capacités et m’a accordé beaucoup d’autonomie pour la réalisation de mon projet de maîtrise. Il

m’a également donné l’opportunité de présenter et d’assister à plusieurs congrès et conférences. J’ai

entre autres présenté mes résultats au Eastern Canadian Perinatal Investigators Meeting le 16

novembre 2012 à Toronto.

Ensuite, j’aimerais remercier la Dre Vanessa Moisan tant pour son support technique que moral. Son

aide a été particulièrement précieuse alors que j’avais de la difficulté à saisir certaines notions

enseignées pendant les cours que j’ai dû suivre dans le cadre de ma maîtrise et pour lesquels je

n’avais pas toutes les connaissances nécessaires pour comprendre.

Les conseils du Dr Pierre Julien ont été grandement appréciés. J’aimerais également remercier ce

dernier pour le dosage des lipides fait dans les échantillons sur lesquels j’ai travaillé ainsi que pour

les corrections apportées aux manuscrits des articles qui seront présentés dans ce mémoire.

Je suis reconnaissante envers le Fonds de recherche en santé du Québec (FRSQ) pour le support

financier accordé par l’entremise d’une bourse de formation de maîtrise ainsi qu’envers le Centre de

recherche en biologie de la reproduction (CRBR) pour la bourse À la poursuite de l’excellence.

Enfin, je tiens à remercier chaleureusement mes parents, Denise et Michel, mon conjoint, Sébastien,

ainsi que tous les autres membres de ma famille pour leur écoute et leurs encouragements. Leur

support a été très précieux tout au long de mes études.

XXI

Avant-Propos

Dans le cadre de ma maîtrise, je devais développer et valider une méthode d’analyse des F2-

isoprostanes, des biomarqueurs du stress oxydatif, par chromatographie liquide couplée à la

spectrométrie de masse en tandem (HPLC-MS/MS). Je devais ensuite utiliser cette technique pour

étudier le stress oxydatif dans la circulation maternelle en fin de grossesse. Le présent mémoire

résume mes travaux effectués au cours des deux dernières années. Il contient cinq chapitres et une

annexe. Voici une brève description de chacune de ces sections :

Le premier chapitre met en place toutes les notions théoriques nécessaires à la

compréhension du reste du document.

Le deuxième chapitre est le manuscrit d’un article scientifique qui a été accepté pour

publication dans le Journal of Lipid Research en février 2013. En tant que première auteure,

j’ai mis au point et validé la technique d’analyse des F2-isoprostanes par HPLC-MS/MS. J’ai

ensuite procédé au dosage de ces molécules dans le plasma de femmes au troisième

trimestre d’une grossesse normotensive avec l’aide de la Dre Vanessa Moisan. Enfin, j’ai

analysé les résultats et rédigé l’article sous la supervision de mon directeur de recherche, le

Dr Jean-François Bilodeau. Le manuscrit a été révisé avant sa soumission au journal par ce

dernier ainsi que par le Dr Pierre Julien.

Le troisième chapitre est le manuscrit d’un article scientifique dont je suis la première

auteure et qui sera soumis sous peu dans le journal Biochimica et Biophysica Acta. J’ai

utilisé la méthode que j’ai mise au point pour le dosage des F2-isoprostanes. La mesure des

acides gras a été faite par Karine Greffard qui est professionnelle de recherche dans le

laboratoire du Dr Pierre Julien. J’ai analysé les résultats et rédigé ce manuscrit sous la

supervision de mon directeur de recherche. Le manuscrit a été révisé par celui-ci et par le Dr

Pierre Julien.

Le quatrième chapitre résume les résultats que j’ai obtenus suite au dosage des F2-

isoprostanes dans le plasma, le sang entier et les membranes érythrocytaires de femmes au

troisième trimestre d’une grossesse normotensive ou prééclamptique. Ces résultats n’ont

pas fait l’objet d’un article scientifique pour le moment.

XXII

Dans le dernier chapitre du présent mémoire, les résultats présentés précédemment sont

discutés.

L’article présenté en annexe a été publié en 2012 dans le journal Molecular Reproduction &

Development. Il traite de la voie des polyols dans l’oviducte bovin. En tant que première

auteure, j’ai optimisé une technique d’analyse des polyols par HPLC-MS/MS et j’ai ensuite

procédé au dosage de ces molécules dans des sections d’oviductes bovin. Ces travaux ont

été faits lors d’un stage effectué dans le laboratoire du Dr Jean-François Bilodeau alors que

j’étais encore étudiante au baccalauréat, mais la rédaction de l’article à laquelle j’ai participé

a été faite pendant ma maîtrise.

1

Chapitre 1 – Introduction

1.1. Le stress oxydatif

Les dérivés actifs de l’oxygène (ROS) sont des molécules chimiquement réactives contenant au

moins un atome d’oxygène. Plusieurs d’entre eux sont radicalaires, c’est-à-dire qu’ils possèdent un

électron non apparié sur la couche électronique externe [1]. Dans les conditions physiologiques

normales, les ROS occupent des fonctions biologiques importantes. Entre autres, ils agissent comme

seconds messagers dans différentes voies de signalisation [2, 3] et sont impliqués dans la défense

immunitaire [4]. Les ROS sont constamment produits dans l’organisme, mais étant donné leur très

grande réactivité, leurs niveaux sont contrôlés par des antioxydants enzymatiques et non

enzymatiques. Un stress oxydatif survient lorsqu’il y a surproduction de ROS par rapport aux

défenses antioxydantes de l’organisme [5]. Ce déséquilibre est observé dans le processus du

vieillissement ainsi que dans certaines situations physiologiques normales comme la grossesse [6,

7]. Il est également impliqué dans la physiopathologie de plusieurs maladies [8]. Par exemple, le

stress oxydatif est observé dans plusieurs maladies cardiovasculaires (ex. : athérosclérose,

insuffisance cardiaque), inflammatoires (ex. : arthrite, asthme) et neurodégénératives (ex. : maladie

d'Alzheimer).

1.1.1. Les prooxydants

Parmi les ROS figurent le superoxyde (O2•-), le peroxyde d’hydrogène (H2O2), le radical hydroxyle

(HO•), radicaux alkoxyles (RO•), les radicaux peroxyles (ROO•), les hydroperoxydes (ROOH),

l’oxygène singulet (1O2) et l’ozone (O3) [9].

Le superoxyde est principalement produit dans les mitochondries où le transfert des électrons entre

les différents constituants de la chaîne de transport des électrons n’est pas complètement efficace

[10]. Une faible proportion des électrons qui circulent dans cette chaîne peuvent s’échapper par les

complexes I et III et causer la réduction directe de l’oxygène moléculaire pour former le superoxyde.

Entre 1 et 2 % de l’oxygène consommé chaque jour est ainsi réduit dans les conditions

physiologiques normales [11, 12]. Outre les mitochondries, le réticulum endoplasmique constitue une

autre source majeure de la production du superoxyde dans la cellule. En effet, jusqu’à 25 % du

2

superoxyde produit dans une cellule pourrait provenir de cet organite [13]. Pendant le repliement des

protéines, la formation de ponts disulfures est une réaction d’oxydation et les électrons libérés

peuvent être récupérés par l’oxygène moléculaire et ainsi le réduire en superoxyde. Certaines

enzymes, comme les cytochromes P450, la xanthine oxydase et les nicotinamide adénine

dinucléotide phosphate (NADPH) oxydases (NOX) sont également responsables de la production de

ce ROS. Les NOX catalysent la production de superoxyde à partir de l’oxygène et du NADPH [14].

Ces enzymes sont impliquées dans la signalisation cellulaire et l’une d’entre elles, NOX2, est

retrouvée dans les cellules phagocytaires qui produisent le superoxyde après exposition à des

microorganismes étrangers ou à des médiateurs de l’inflammation afin de détruire l’élément étranger.

Le superoxyde est une espèce radicalaire hautement réactive, mais à cause de sa charge anionique,

il lui est impossible de traverser les membranes lipidiques. Sa dismutation, catalysée par les

enzymes superoxyde dismutases (SOD), forme du peroxyde d’hydrogène (H2O2). Cet autre ROS

peut également être généré par les oxydases des peroxysomes, par la xanthine oxydase [15], par les

monoamines-oxydases [16] et par la p66shc dans les mitochondries [17]. Le peroxyde d’hydrogène

peut circuler dans l’organisme sur de plus longues distances, car il ne porte pas de charge anionique,

ce qui lui permet de traverser les membranes lipidiques. De plus, cet oxydant est beaucoup moins

réactif que le superoxyde, car il n’est pas radicalaire. Cependant, en oxydant le fer (II) non chélaté

selon la réaction de Fenton (1), il forme le radical hydroxyle, une espèce encore plus réactive que le

superoxyde et qui a la possibilité de traverser les membranes lipidiques. Le superoxyde peut quant à

lui réduire le fer (III) non chélaté en fer (II) (réaction (2) plus bas). En combinant les réactions (1) et

(2), la réaction de Haber-Weiss (3) est obtenue et celle-ci démontre que les ions de fer non chélatés

agissent comme des catalyseurs dans la production du radical hydroxyle. D’autres ions métalliques

non chélatés, comme le cuivre, peuvent également servir de catalyseur dans cette réaction [18].

(Réaction de Fenton) (1)

(2)

(Réaction de Haber-Weiss) (3)

H2O

2 + Fe

2+

O2

•- + Fe

3+

O2

•- + H

2O

2

HO• + HO

- + Fe

3+

O2 + Fe

2+

HO• + HO

- + O

2

Fe3+

, Fe2+

3

La réaction des ROS avec d’autres constituants biologiques peut causer la formation d'autres

molécules réactives. Par exemple, la réaction du radical hydroxyle avec d’autres molécules

biologiques mène à la formation d'autres ROS (RO•, R-O-O•, R-O-O-H) ou encore d'autres espèces

radicalaires (R•, RS•). Le superoxyde peut quant à lui réagir avec l’oxyde nitrique (NO•), une espèce

radicalaire synthétisée par les synthétases d’oxyde nitrique (NOS) à partir de la L-arginine (réaction

(4)). Cette réaction mène à la formation du peroxynitrite, un autre prooxydant qui peut se

décomposer en radical hydroxyle (réaction (5)) [19]. L’acide hypochloreux (HOCl) peut aussi être

formé lors de la réaction entre un chlorure (Cl-) et le peroxyde d’hydrogène [20]. Finalement, si la

production de ROS n’est pas suffisamment ralentie dans l’organisme par les antioxydants, ils

peuvent induire de sérieux dommages aux différents constituants cellulaires (ex. : protéines, ADN,

glucides et lipides). La réaction des ROS avec les lipides se nomme la peroxydation lipidique [21].

Les acides gras insaturés sont particulièrement sujets à réagir avec les ROS et d’autres radicaux

libres. Certains radicaux libres tels que les radicaux thiyles (RS•) ont la propriété de catalyser leur

isomérisation cis-trans [22]. La peroxydation lipidique et l’isomérisation cis-trans seront deux

réactions traitées plus en détail ultérieurement.

(4)

(5)

1.1.2. Les antioxydants

Les ROS causent des dommages importants aux différents constituants cellulaires, mais l’organisme

peut compter sur l’action des antioxydants enzymatiques et non enzymatiques.

1.1.2.1. Les antioxydants enzymatiques

Plusieurs enzymes sont impliquées à différents degrés dans les la défense de l’organisme contre

l’assaut des ROS [23]. En première ligne, les superoxyde dismutases (SOD) catalysent la

dismutation du superoxyde en peroxyde d’hydrogène selon la réaction (6). Ces enzymes existent

sous trois formes. La SOD1, ou CuZn-SOD, est retrouvée dans le cytosol alors que la SOD2, ou Mn-

SOD, est retrouvée dans les mitochondries. Il existe également une SOD extracellulaire, la SOD3.

ONOO-

ONOO- + H

+

NO• + O

2

•-

HO• +

•NO

2

4

Le peroxyde d’hydrogène peut quant à lui être décomposé par la catalase (CAT) qui est retrouvée

dans les peroxysomes (réaction (7)) ou encore par les glutathion peroxydases (GPx). Il existe cinq

GPx qui utilisent le glutathion (GSH) comme réducteur afin de décomposer le peroxyde d’hydrogène

et les hydroperoxydes organiques (réactions (8) et (9)) [24]. Cependant, ces cinq GPx ne possèdent

pas la même spécificité pour chacun des substrats. Ainsi, GPx1 et GPx2 peuvent réduire le peroxyde

d’hydrogène ainsi que les hydroperoxydes organiques solubles (ex. : hydroperoxydes d’acides gras).

GPx3 et GPx4 peuvent réduire des hydroperoxydes organiques plus complexes, mais GPx4 est le

seul enzyme pouvant utiliser les hydroperoxydes de phospholipides, de cholestérol et d'ester de

cholestérol encore intégrés dans les membranes lipidiques, et cela sans aide des phospholipases

[25]. GPx5, quant à elle, est seulement retrouvée dans l’épididyme. Après avoir été utilisé par les

GPx, le glutathion oxydé (GSSG) est réduit par une glutathion réductase (GPR) avec NADPH comme

agent réducteur (réaction (10)) pour compléter le cycle du glutathion (Figure 1). Une autre famille

d’enzyme utilisant le glutathion, les glutathion-S-transférases (GST), sont également capable

d’éliminer les ROS de la même manière que les GPx [26].

(6)

(7)

(8)

(9)

(10)

Figure 1. Cycle du glutathion.

2 O2

•- + 2 H

+

H2O + O

2

2 H2O + GSSG

H2O + GSSG + ROH

GSH + NADP+

SOD

CAT

GPx

GPx

GPR

O2 + H

2O

2

2 H2O

2

H2O

2 + 2 GSH

ROOH + 2 GSH

GSSG + NADPH

ROOH 2 GSH NADPH

GPx GPR

ROH + H2O GSSG NADP

+

5

Les enzymes appartenant au système de la thiorédoxine (Trx) sont aussi impliquées dans la

détoxication directe des ROS (Figure 2) [24]. Brièvement, les thiorédoxine peroxydases (TrxP), aussi

appelées peroxyrédoxines, peuvent décomposer le peroxyde d’hydrogène et les hydroperoxydes

organiques. La thiorédoxine peroxydase oxydée (oxTrxP) est recyclée par la thiorédoxine (Trx), une

autre enzyme capable de réduire les ROS. Il se crée alors des ponts disulfures entre deux cystéines

situées dans la portion N-terminale de l’enzyme oxydée (oxTrx) qui peuvent être réduits grâce à la

thiorédoxine réductase (TrxR) qui utilise le NADPH comme agent réducteur. Cette dernière enzyme

participe également dans la détoxication des ROS et elle est capable de réduire la vitamine C oxydée

ainsi que l’acide α-lipoïque [20]. À noter, aucune enzyme n’est capable de réduire le radical

hydroxyle, les radicaux alkoxyles (RO•) et les radicaux peroxyles (ROO•) car ceux-ci sont trop réactifs

et endommageraient la protéine impliquée dans leur détoxication. Le système enzymatique tente

plutôt d’empêcher la formation de ces espèces hautement réactives en éliminant leurs précurseurs :

les peroxydes et le superoxyde.

Figure 2. Système de la thiorédoxine. Adaptée de [24].

1.1.2.2. Les antioxydants non enzymatiques

Les enzymes antioxydantes utilisent principalement les peroxydes ou le superoxyde comme

substrats. L’organisme a également recourt à de nombreuses petites molécules hydrosolubles et

liposolubles capables de neutraliser les ROS, dont les ROS radicalaires. Par exemple, le glutathion,

l’acide urique et la vitamine C (acide ascorbique) sont des antioxydants hydrosolubles alors que

ROOH

Vitamine C oxydée ROOH

ROOH TrxP oxTrx TrxR NADPH

ROH + H2O oxTrxP Trx oxTrxR NADP

+

Acide α-lipoïque

6

l’ubiquinone (Coenzyme Q), l’acide α-lipoïque, les caroténoïdes (β-carotène, la vitamine A), et les

vitamines E sont des antioxydants liposolubles (Figure 3 et Figure 4).

Figure 3. Exemples de petites molécules antioxydantes.

Les vitamines E sont produites par les plantes et regroupent huit molécules de structures similaires,

c’est-à-dire quatre tocophérols (forme α-, β-, γ-, et δ-) et quatre tocotriénols (forme α-, β-, γ-, et δ-)

[27]. Ces molécules possèdent toutes un noyau chromanol et une longue chaîne latérale de 16

carbones (Figure 4). Pour les tocophérols, cette longue chaîne est saturée et compte trois centres

chiraux. Ces carbones asymétriques sont retrouvés seulement dans la configuration R dans la

nature. Pour les tocotriénols, cette chaîne contient trois liaisons doubles et le seul carbone

7

asymétrique est en configuration R dans la nature. Les huit types de vitamine E sont absorbés par

l’intestin, mais une fois acheminées dans le foie, la α-tocopherol transfer protein (α-TTP) favorise la

sécrétion de l’α-tocophérol (α-TOH) dans le plasma par le biais des lipoprotéines de très basse

densité (VLDL) et cela au détriment des autres formes de vitamines E [28]. Il en résulte que l’α-

tocophérol est la vitamine E la plus abondante dans les tissus et dans le plasma alors que les

tocotriénols sont les moins abondants [29]. C’est également la forme de tocophérol la plus efficace

comme antioxydant in vivo, suivi par les formes β-, γ-, et finalement δ- [27].

Figure 4. Structures des tocophérols et des tocotriénols.

À cause de sa nature hydrophobe, l’α-tocophérol est retrouvé dans les membranes lipidiques qu’il

protège contre la peroxydation. Cette molécule est capable de donner son hydrogène (H•) phénolique

aux différents ROS radicalaires (HO•, RO•, ROO•, O2-•) afin de les convertir en espèces moins

réactives (Figure 5). Elle empêche ainsi de façon très efficace la propagation de la réaction

radicalaire en chaîne qu’est la peroxydation lipidique. En effet, le radical peroxyle réagit 1000 fois

plus rapidement avec l’α-tocophérol qu’avec les acides gras polyinsaturés [30]. L’α-tocophérol

radicalaire (α-TO•) obtenu est moins réactif que les ROS, car le radical est délocalisé par résonnance

dans la molécule et donc moins accessible pour réagir. Cependant, ce radical peut être prooxydant

s’il n’est pas rapidement neutralisé [27]. Étant confiné dans les membranes lipidiques, il peut initier

de nouvelles réactions radicalaires (réactions (11) et (12)). L’α-tocophérol et l’α-tocophérol oxydé

8

peuvent également réduire les ions métalliques tels que le fer (III) (réactions (13) et (14)), favorisant

ainsi la réaction de Fenton (1).

(11)

(12)

(13)

(14)

Figure 5. Neutralisation du radical peroxyle en hydroperoxyde organique par l’α-tocophérol qui est à

son tour recyclée par la vitamine C (ascorbate). Adaptée de [31].

La vitamine C (ou ascorbate, AscH-) est une petite molécule hydrosoluble qui a la capacité de

neutraliser directement les ROS radicalaires (HO•, RO•, ROO•, O2-•). Cependant, sa principale

fonction comme antioxydant est de recycler l’α-tocophérol oxydé (Figure 5) [31]. Le radical ascorbyl

formé (Asc•-) peut ensuite être réduit soit par dismutation (réaction (15)), soit grâce à la thiorédoxine

réductase (Figure 2). Le dehydroacscorbate (DHAsc) formé lors de la dismutation de Asc•- peut être

réduit grâce à la DHAsc réductase dépendante du GSH (réaction (16)).

α-TO• + RH

α-TO• + ROOH

α-TOH + Fe3+

α-TO• + Fe

3+

α-TOH + R•

α-TOH + ROO•

α-TO• + Fe

2+ + H

+

α-TO+ + Fe

2+

ROOH ROO•

α-tocophérol

Radical ascorbyl Ascorbate

9

(15)

(16)

1.2. Les lipides

1.2.1. Définitions et fonctions biologiques

Les lipides sont de petites molécules hydrophobes ou amphiphiles divisées en huit catégories : les

acides gras, les acylglycérols, les glycérophospholipides (ou phospholipides), les sphingolipides, les

stérols (ex. : cholestérol, esters de cholestérols), les prénols, les glycolipides et les polycétides [32].

Ils occupent d’importantes fonctions biologiques [33]. Les phospholipides (PL) et le cholestérol sont

des constituants majeurs des membranes biologiques alors que les triacylglycérols (TAG) servent à

emmagasiner de l’énergie. En effet, l’oxydation complète de 1 g d’acides gras génère environ 38 kJ.

De plus, les cellules adipeuses sous-cutanées riches en TAG servent d’isolant thermique. Certains

lipides ou dérivés de lipides sont également impliqués dans la signalisation cellulaire.

1.2.2. Digestion, absorption et transport dans l’organisme

Les lipides représentent environ 35% de l’énergie quotidienne fournie par une diète américaine

typique [34]. Les TAG sont les principaux lipides ingérés. Les PL, le cholestérol et les esters de

cholestérol sont également retrouvés dans la diète, mais en quantité beaucoup plus faible. La

digestion et l’absorption des lipides se font dans l’intestin grêle où ils sont mélangés à la bile qui est

composée entre autres de sels biliaires, de phospholipides et de cholestérol [35]. Les TAG sont

hydrolysés en 2-monoacylglycérols et en acides gras grâce à la lipase pancréatique alors que les

phospholipides sont hydrolysés en 2-lysophospholipides et en acides gras grâce à une

phospholipase A2 (PLA2) [36, 37]. Les esters de cholestérols sont hydrolysés par la cholestérol

estérase [38-40]. Les acides gras, le 2-monoacylglycérol, le 2-lysophospholipide et le cholestérol

entrent ensuite dans les entérocytes principalement par diffusion passive où ils sont réestérifiés puis

assemblés pour former des chylomicrons, un type de lipoprotéine. Les lipoprotéines sont des

2 Asc•-

DHAsc

AcsH- + DHAsc

AscH-

DHAsc réductase

dépendante du GSH

10

particules sphériques dont la surface est composée d’apolipoprotéines, de PL et de cholestérol et

dont le cœur est composé de TAG et d’esters de cholestérol (Figure 6). Outre les chylomicrons (CM),

il existe trois autres types de lipoprotéines : les lipoprotéines de très basse densité (VLDL), les

lipoprotéines de basse densité (LDL) et les lipoprotéines de haute densité (HDL). Ces particules

diffèrent par leur densité, leur composition lipidique (Tableau 1) ainsi que par le type et la quantité

d’apolipoprotéines qui y sont associées (Figure 7).

Figure 6. Schémas général d'une lipoprotéine. Tirée de [41].

Tableau 1. Caractéristiques des différents types de lipoprotéines

CM VLDL LDL HDL

Densité (g/mL) < 0.94 0.94 - 1.006 1.006 - 1.063 1.063 - 1.210

Lipides (g/100 g lipoprotéine) 98 – 99 90 – 92 75 - 80 40 – 48

Acylglycérols (g/100 g lipides) 81 – 89 50 – 58 7 - 11 6 – 7

Esters de Cholestérol (g/100 g lipides) 2 – 4 15 – 23 47 - 51 24 – 45

Cholestérol (g/100 g lipides) 1 – 3 4 – 9 10 - 12 6 – 8

Phophoslipides (g/100 g lipides) 7 – 9 19 – 21 28 - 30 42 – 51

Adapté de [42]

La principale fonction des lipoprotéines est le transport des lipides dans l’organisme (Figure 7) [41,

43]. Le transport des TAG d’origine alimentaire vers les tissus est fait par les chylomicrons. Ceux-ci

sont formés dans les entérocytes puis sécrétés dans la lymphe avant de rejoindre la circulation

sanguine au niveau du canal thoracique. La lipase lipoprotéique (LPL) endothéliale hydrolyse les

11

TAG contenus dans ces particules en acides gras. Ceux-ci traversent ensuite l’endothélium et entrent

dans les cellules sous-jacentes où ils seront réestérifiés et entreposés sous forme de TAG ou encore

oxydés pour produire de l’énergie. Au cours de l’hydrolyse des TAG, la taille du chylomicron diminue

et le surplus de phospholipides, de cholestérol et de protéines retrouvé à sa surface est transféré aux

particules de HDL. Les résidus de chylomicrons sont captés et dégradés par le foie où les acides

gras obtenus sont soit oxydés, soit réorganisés en TAG, en PL et en esters de cholestérol pour être

sécrétés sous forme de VLDL. Les VLDL sont également constituées de lipides provenant des acides

gras emmagasinés dans les cellules adipeuses ou encore des acides gras synthétisés par le foie.

Tout comme les chylomicrons, ces lipoprotéines assurent le transport des TAG vers les tissus où ils

sont hydrolysés par la LPL alors que les PL, le cholestérol et certaines protéines membranaires sont

transférés aux HDL. Les VLDL résiduelles se nomment lipoprotéines de densité intermédiaire (IDL).

Certaines IDL sont éliminées par le foie alors que d’autres sont converties en LDL en interagissant

avec la lipase hépatique (HL), une enzyme capable d’hydrolyser les TAG et, à plus petite échelle, les

PL [44]. Les LDL sont des lipoprotéines enrichies en esters de cholestérol et assurent le transport de

ces lipides dans le sang vers les tissus jusqu’à ce qu’elles soient éliminées par le foie. Le transport

inverse du cholestérol des tissus vers le foie est quant à lui pris en charge par les HDL. Ces

dernières lipoprotéines sont assemblées dans les hépatocytes et les entérocytes et finissent leur

maturation dans le sang en captant le cholestérol non estérifié provenant des membranes cellulaires

et des autres lipoprotéines. Elles captent également les PL et les protéines larguées lors de la

lipolyse des chylomicrons et des VLDL. Le cholestérol situé à la surface des HDL est estérifié grâce

à la lécithin:cholestérol acyl transférase (LCAT) puis introduit à l’intérieur de la particule. Les esters

de cholestérols ainsi formés sont soit acheminés au foie ou transférés vers les autres lipoprotéines

grâce à la protéine de transfert des esters de cholestérol (CETP).

12

Figure 7. Transport des lipides par les lipoprotéines. Tirée de [45].

1.2.3. Acide arachidonique

Certains lipides et dérivés de lipides jouent un rôle dans la signalisation cellulaire. C’est le cas de

l’acide arachidonique (AA), un acide gras polyinsaturé (PUFA) oméga-6 de 20 carbones (20:4ω6)

précurseur d’un très grand nombre de molécules bioactives faisant partie de la famille des

eicosanoïdes (Figure 8) [46]. Ces molécules régulent de nombreux processus physiologiques et sont

impliquées de près dans l’inflammation [47]. Trois voies enzymatiques contribuent à la synthèse des

eicosanoïdes: celle des cyclooxygénases (COX), celle des lipoxygénases (LOX) et celle des

cytochromes P450 (CYP). Pour initier ces voies de biosynthèse, l’acide arachidonique doit d’abord

être libéré des phospholipides par une PLA2. Il existe également une voie non enzymatique menant à

la formation d'autres eicosanoïdes appelés les isoprostanes (isoPs). Cette dernière sera décrite plus

en détail ultérieurement. L’acide dihomo-gamma-linolénique (20:3ω6) et l’acide eicosapentaénoïque

(EPA, 20:5ω3) sont également des précurseurs des eicosanoïdes.

13

Figure 8. Voies de synthèse des eicosanoïdes dérivés de l’acide arachidonique. Tirée de [46].

Une partie de l’AA retrouvé dans les tissus et en circulation dans le sang est fournie directement par

la diète (entre 100 et 300 mg AA/jour) [48]. L’organisme peut également synthétiser cet acide gras à

partir de l’acide linoléique (18:2ω6, LA), un acide gras essentiel qui ne peut être synthétisé chez

l’humain et qui doit donc absolument être fourni par l’alimentation. Dans une diète occidentale, entre

10 et 20 g de LA est consommé chaque jour, ce qui représente plus de 85 % des acides gras

polyinsaturés ingérés [48, 49]. La conversion de cet acide gras en AA est faite dans plusieurs tissus,

mais principalement dans le foie grâce aux enzymes Δ6-désaturase, élongase et Δ5-désaturase

(Figure 9) [50]. Il a été estimé qu’environ 677 mg AA/jour peuvent être synthétisés de cette façon

lorsque 20 g LA/jour sont ingérés dans une diète américaine typique [51]. L’acide arachidonique

provenant de la diète ou synthétisé à partir de LA est ensuite acheminé aux tissus par le biais des

lipoprotéines. Pour parvenir aux tissus moins accessibles par ces dernières, il est transporté en étant

lié à l’albumine soit sous forme de 1-lyso-2-arachidonyl-phospholipide soit sous forme d’acide gras

non estérifié [48, 52].¸

La catégorie de lipides qui contient la plus forte proportion d’AA est celle des phospholipides [53]. En

effet, dans le plasma, l’AA représente 8.3 mol% des acides gras contenus dans les phospholipides

alors qu’il représente 5.1 mol% des acides gras estérifiés au cholestérol et 0.8 mol% des acides gras

dans les TAG. L’intégration de ce PUFA en position sn-2 des phospholipides se fait principalement

lors de leur remodelage (cycle de Lands) plutôt que lors de leur synthèse de novo (voie de Kennedy)

14

[54-56]. Pour ce faire, l’acide gras en position sn-2 d’un phospholipide quelconque doit préalablement

avoir été hydrolysé par une PLA2 avant que le 1-acyl-2-lyso-phospholipide obtenu soit réacétylé avec

l’AA estérifié à la coenzyme A (AA-CoA) grâce à une lysophospholipide acyltransférase (LPLAT).

Figure 9. Conversion de l'acide linoléique en acide arachidonique.

1.2.4. Acides gras trans

Les désaturases sont des enzymes qui insèrent des liaisons doubles dans la chaîne aliphatique des

acides gras. Chez l’humain, ces nouvelles liaisons doubles sont seulement retrouvées en

configuration cis. Des acides gras insaturés contenant au moins une liaison double en configuration

trans (acides gras trans, TFA) sont toutefois présents dans les différentes classes de lipides de

l’organisme. Ceux-ci proviennent majoritairement de la diète. Ils sont retrouvés naturellement dans

les produits laitiers et la viande provenant de ruminants. Ils y représentent 2 à 5 % de tous les acides

gras [57]. Ce sont des bactéries situées dans le rumen de ces animaux qui sont responsables de la

production des TFA lors de la biohydrogénation partielle des acides gras insaturés. Les TFA sont

également produits industriellement lors de l’hydrogénation partielle des huiles végétales. Avant les

années 2000, les TFA d’origine industrielle pouvaient représenter entre 40 et 65 % de tous les acides

gras contenus dans la margarine et le shortening [58, 59]. Le profil d’isomères de TFA retrouvé dans

les aliments dérivés des ruminants (rTFA) diffère beaucoup de celui retrouvé dans les huiles

végétales partiellement hydrogénées (iTFA). Dans les deux cas, les acides gras mono-insaturés

trans comptant dix-huit carbones sont les plus abondants [60]. Cependant, les rTFA sont

principalement composés d’acide trans-vaccénique (11t-18:1) alors que l’isomère le plus abondant

Acide linoléique

(18:2ω6, LA)

Acide γ-linoléique

(18:3ω6, GLA)

Δ6-désaturase

Acide arachidonique

(20:4ω6, AA)

Δ5-désaturase

Acide dihomo-γ-linoléique

(20:3ω6, DGLA)

Élongase

15

parmi les iTFA est l’acide élaïdique (9t-18:1), suivi de près par le 10t-18:1 et le 11t-18:1 (Figure 10)

[57, 60, 61].

Figure 10. Distribution des t-18:1 dans (A) l’huile végétale partiellement hydrogénée (margarine, n =

46 échantillons) et dans (B) le gras de lait de vache (n = 1765 échantillons). Adapté de [57].

Il a été démontré par de nombreuses études que la consommation d’une grande quantité de TFA

augmente les risques de maladies cardiovasculaires [62-68]. En effet, ils altèrent le profil lipidique du

sang (ex. : augmentation du cholestérol associé aux LDL et diminution du cholestérol associé aux

HDL, augmentation du rapport cholestérol total sur HDL-cholestérol) et modifient le niveau

d’apolipoprotéines. Ils provoquent également une réponse inflammatoire systémique ainsi que la

dysfonction de l’endothélium. Plusieurs études cliniques ont également démontré qu’une

consommation plus importante de TFA est associée à une augmentation du stress oxydatif [69-71].

Jusqu’à maintenant, les études portant sur l’impact de la consommation de TFA sur la santé n’ont

pas réussi à démontrer clairement si les rTFA (ex. : 11t-18:1) et les iTFA (ex. : 9t-18:1, 10t-18:1, 12t-

18:1) sont aussi nuisibles les uns que les autres. En fait, il semble plutôt que les effets néfastes

observés sur la santé sont plus liés à la quantité ingérée qu’à l’origine des TFA. Si les rTFA semblent

moins dommageables pour la santé, c’est qu’ils sont consommés en moins grande quantité que les

iTFA [62, 72, 73]. Cependant, les t-18:2 semblent plus nocifs pour la santé que les t-18:1 alors que

les t-16:1 semblent n’avoir aucun impact sur les facteurs de risque des maladies cardiovasculaires

[64, 68, 74].

Il a été estimé qu’au milieu des années 1990, les Canadiens consommaient en moyenne 8.4 g

TFA/jour, dont 81 % provenait des iTFA [58, 60]. À cause des préoccupations émises au sujet des

impacts néfastes de ces gras sur la santé, il est devenu obligatoire à partir de décembre 2005 au

B A

16

Canada d’inscrire la quantité de TFA contenu dans les aliments sur leur emballage [75]. L’étiquetage

nutritionnel obligatoire ainsi qu’une plus grande sensibilisation de la population canadienne ont fait

diminuer à 4.9 g/jour leur consommation moyenne de TFA en 2005 [58]. Cependant, cette valeur

était nettement supérieure à la quantité recommandée par l’Organisation mondiale de la santé

(OMS). Selon l’OMS, les gras trans ne doivent pas représenter plus de 1 % de l’apport énergétique

quotidien. C’est-à-dire que pour une diète de 2000 kCal/jour, la quantité maximale de TFA pouvant

être ingérée est de 2 g/jour. Afin d’atteindre cet objectif de consommation, un groupe d’étude sur les

gras trans a été créé en 2005 par Santé Canada. Celui-ci a remis en juin 2006 son rapport final dans

lequel il recommande de limiter la teneur totale en acides gras trans à 2 % de la teneur totale en

graisses pour les huiles végétales et les margarines molles et tartinables et de limiter cette teneur à 5

% pour tous les autres aliments, y compris les ingrédients vendus aux restaurants [75].

1.2.5. Acides gras et stress oxydatif

Les radicaux libres générés en période de stress oxydatifs sont hautement réactifs et ils peuvent

induire de sérieux dommages aux différents constituants cellulaires comme il a été expliqué

précédemment. Les acides gras insaturés sont particulièrement susceptibles à réagir avec eux. Deux

réactions sont possibles : la peroxydation lipidique et l’isomérisation cis-trans.

1.2.5.1. Peroxydation lipidique

La peroxydation lipidique est une réaction radicalaire en chaîne initiée lorsqu’un radical (HO•, RO•,

ROO•, ONOO-) vient arracher un hydrogène situé sur la chaîne aliphatique d’un acide gras ou d’un

ester d’acide gras (ex : TAG, PL, ester de cholestérol, etc) pour former un lipide radicalaire (L•)

(Figure 11) [1, 9, 21]. Les hydrogènes les plus susceptibles d’être arrachés sont les hydrogènes bis-

allyliques et allyliques puisque le nouveau radical obtenu est stabilisé par résonnance. L’énergie de

liaison d’un hydrogène allylique étant plus élevée de 10 kCal/mol en comparaison à celle d’un

hydrogène bis-allylique, ce dernier réagira donc plus rapidement [76]. D’ailleurs, plus le nombre

d’hydrogènes bis-allyliques est important dans un acide gras ou dans un ester d’acide gras, plus il

sera susceptible à être peroxydé [77]. Ainsi, la peroxydabilité d’acides gras communs décroit selon

l’ordre qui suit : acide docosahexaénoïque (DHA, 22:6ω3) > acide eicosapentaénoïque (EPA,

20:5ω3) > acide arachidonique (AA, 20:4ω6) > acide linoléique (LA, 18:2ω6). Le lipide radicalaire, L•,

se combine ensuite avec l’oxygène moléculaire (O2), un diradical, pour former un radical peroxyle de

lipide (LOO•) qui pourra à son tour arracher un hydrogène sur un autre acide gras ou ester d’acide

17

gras et ainsi propager la réaction radicalaire. La réaction est arrêtée grâce aux défenses

antioxydantes de l’organisme. Par exemple, l’α-tocophérol retrouvé dans les membranes lipidiques

est un inhibiteur de radicaux libres très efficace. En effet, comme mentionné précédemment, LOO•

réagit 1000 fois plus rapidement avec l’α-tocophérol qu’avec les acides gras polyinsaturés qui

l’entoure [30].

La peroxydation lipidique génère un vaste éventail de produits pouvant perturber l’organisation des

membranes lipidiques, leur fluidité ainsi que leur perméabilité. En effet, L• et LOO• peuvent se

réarranger, se fragmenter, se réduire, se cycliser ou encore réagir avec d’autres molécules de leur

environnement (ex. : protéines). Parmi les produits issus de la peroxydation lipidique figurent de

nombreux hydroperoxydes et aldéhydes (ex. : malondialdehyde (MDA)) [1, 9]. La cyclisation est un

processus particulièrement important pour les LOO• comptant trois doubles liaisons et plus [21].

Ainsi, la peroxydation de l’acide arachidonique peut mener à une série de produits cycliques

semblables aux prostaglandines, les isoprostanes (isoPs, Figure 12) et d’isofuranes [9].

Figure 11. Mécanisme général de la peroxydation des lipides.

18

Figure 12. Structure des différents types d'isoprostanes dérivés de l'acide arachidonique.

Tirée de [9].

1.2.5.2. Isomérisation cis-trans

Les TFA retrouvés dans les différentes catégories de lipides proviennent principalement de la diète.

Cependant, il a également été démontré qu’ils peuvent être générés in vivo en présence de stress

oxydatif. Ce phénomène a, entre autres, été observé dans les membranes érythrocytaires et les reins

de rats âgés nourris avec des aliments ne contenant pas de TFA et exposés au tétrachlorométhane

(CCl4), un inducteur de stress oxydatif [78]. En fait, certains radicaux libres catalysent, selon un

mécanisme d’addition-élimination, l’isomérisation d’acides gras cis vers la configuration trans qui est

thermodynamiquement plus stable (Figure 13). Plusieurs radicaux sont capables de réagir de cette

façon et les plus importants retrouvés in vivo sont les radicaux thiyles (RS•) et le dioxyde d’azote

(NO2•) [78-80]. Par contre, selon les données cinétiques disponibles, les RS• semblent plus efficaces

que le NO2• pour isomériser les acides gras insaturés [79]. Les RS• sont produits en période de

stress oxydatif à partir des thiols (RSH) retrouvés en abondance dans l’organisme (ex. : glutathion).

Ces derniers sont des inhibiteurs de la peroxydation lipidique à cause de leur facilité à donner un

hydrogène (H•) [22]. NO2• provient quant à lui de sources exogènes (ex. : fumée de cigarette, smog)

19

et de sources endogènes (ex. : oxydation de NO•, oxydation des nitrites (NO2-), décomposition du

peroxynitrite selon la réaction (5) à la page 3) [81]. Outre l’isomérisation cis-trans, ce radical est

également capable de causer la peroxydation et la nitration des lipides [81]. La réaction favorisée

dépend beaucoup des conditions du milieu.

Figure 13. Mécanisme général de la réaction d'isomérisation cis-trans induite par les radicaux libres.

X• représente n’importe quel radical capable d’induire cette réaction. Tirée de [22].

Un peu comme pour la peroxydation lipidique, plus le nombre d’insaturations est important dans un

acide gras et plus celui-ci sera facilement isomérisé [82]. Les TFA obtenus rigidifient les membranes

lipidiques et diminuent leur perméabilité. Ils peuvent également modifier le métabolisme des lipides et

influencer différentes réactions enzymatiques [79]. Afin de limiter ces effets néfastes, l’organisme

peut compter sur des inhibiteurs d’isomérisation tels que la vitamine A, les caroténoïdes et l’α-

tocophérol. Ce dernier est cependant moins efficace que les deux autres [83].

1.3. Les F2-isoprostanes

Afin d’étudier le rôle des ROS dans la physiopathologie de plusieurs maladies, l’utilisation de

biomarqueurs est essentielle. En effet, mesurer directement les ROS in vivo est impensable à cause

de leur haute réactivité et de l’instrumentation inadaptée. Les lipides sont des cibles faciles pour ces

petites molécules et c’est donc pourquoi différents produits issus de la peroxydation lipidique sont

utilisés comme marqueur du stress oxydatif. Pendant longtemps, la méthode la plus utilisée a été le

dosage du malondialdehyde (MDA) à l’aide de l’acide thiobarbiturique (TBA). Cependant, malgré sa

simplicité, cette technique manque de spécificité pour le MDA puisque le TBA peut réagir avec

d’autres composés dont plusieurs sont générés lors du traitement des échantillons, menant ainsi à

des résultats erronés [84-86]. En 1990, Morrow et son équipe démontrent que la peroxydation non

enzymatique de l’acide arachidonique mène à la formation in vitro et in vivo de composés analogues

à la prostaglandine F2α (PGF2α) (Figure 14) [87]. Ces composés, nommés les F2-isoprostanes (F2-

20

isoPs), sont des biomarqueurs très fiables du stress oxydatif comme l’a mis en évidence une étude

réalisée en 2005 au cours de laquelle différents biomarqueurs potentiels ont été mesurés dans le

plasma et l’urine de rats exposés au tétrachlorométhane (CCl4) [88]. En effet, les F2-isoPs possèdent

de nombreuses qualités leur permettant de jouer ce rôle. Ils sont produits spécifiquement par la

peroxydation lipidique, ils sont stables chimiquement et détectables dans tous les tissus et fluides

biologiques même en condition non pathologique. De plus, leur concentration augmente en réponse

à un stress oxydatif [89]. L’isomère de F2-isoPs le plus utilisé jusqu’à maintenant comme

biomarqueur du stress oxydatif est le 8-iso-PGF2α (Figure 14) [8].

Figure 14. Structures de la Prostaglandine F2α (PGF2α) et du 8-iso PGF2α.

1.3.1. Formation des F2-isoprostanes

Lors de l’initiation de la biosynthèse de PGF2α par la voie des cyclooxygénases (COX), l’acide

arachidonique est d’abord libéré des phospholipides par une PLA2. Bien que les F2-isoPs possèdent

une structure très similaire à ce médiateur lipidique et qu’ils dérivent eux aussi de l’acide

arachidonique, les étapes menant à leur synthèse in vivo sont très différentes et n’impliquent pas

d’enzymes (Figure 15). Premièrement, la synthèse de ces composés se fait in situ sur les

phospholipides et débute par l’abstraction d’un des hydrogènes bis-allyliques de l’acide

arachidonique par un ROS [90]. La probabilité d’abstraction de ces hydrogènes situés sur les

carbones C7, C10 ou C13 est à peu près la même [9]. Selon l’hydrogène arraché, un radical peroxyle

(ROO•) conjugué est ensuite formé par l’addition d’une molécule d’oxygène sur l’un des carbones

suivants : C5, C8, C9, C11, C12 ou C15. L’oxygène peut également s’additionner sur les carbones

C7, C10 ou C13 et ainsi former un ROO• non conjugué, mais ce composé est instable. En effet, la

constante de vitesse pour l’élimination de la molécule d’oxygène nouvellement additionné (kβ = 1.9 x

PGF2α

8-iso-PGF2α

21

106 s-1) est beaucoup plus grande que celle mesurée dans le cas des ROO• conjugués (kβ = 70 s-1)

[89]. L’étape suivante de la formation des F2-isoPs consiste en une cyclisation 5-exo du ROO•

conjugué alors qu’une deuxième molécule d’oxygène est additionnée pour ultimement mener à la

formation d’un bicycloendoperoxyde (Figure 15, avant dernière rangée de molécules). Dans le cas

des ROO• où l’oxygène est situé sur les carbones C5 ou C15, le mécanisme de cyclisation est un

peu plus complexe, car ces derniers ne peuvent pas cycliser directement. L’oxygène doit d'abord se

détacher de la molécule puis se réadditionner sur les carbones C9 ou C11, respectivement, pour que

la cyclisation 5-exo soit possible [91]. Finalement, le bicycloendoperoxyde est réduit et un F2-isoPs

est obtenu.

Figure 15. Mécanisme de formation des F2-isoprostanes. Adaptée de [92].

ROS ROS

ROS

O2 O

2 O

2 O

2

O2 O

2 O

2 O

2

7

13 10

5 9 8 12

15 11

5

12 8

15

Acide arachidonique

22

La peroxydation de l’acide arachidonique peut générer 64 isomères de F2-isoPs subdivisés en quatre

classes de régioisomères qui contiennent chacune 8 diastéréoisomères racémiques [89]. Les

isomères de classe IV et V sont les moins abondants de tous, car leur précurseur

bicycloendoperoxyle peut s’oxyder davantage et mener à la formation de peroxydes dioxolane-

isoprostane (Figure 16) [93]. Ceux de classe VI sont les plus abondants, suivis par ceux de classe III

[94]. Parmi les isomères de classe III figurent le populaire 8-iso-PGF2α et la PGF2α d’origine non

enzymatique [91]. Par contre, la formation de la PGF2α n’est pas favorisée, car les chaînes latérales

de cet isomère sont en configuration trans par rapport au cyclopentane alors que c’est la

configuration cis qui est privilégiée lors de la synthèse des F2-isoPs [91]. Malgré cela, la PGF2α

retrouvée chez l’humain provient d’avantage de la peroxydation lipidique que de la synthèse

enzymatique par le biais des COX [9].

Figure 16. Structure d’un peroxyde dioxolane-isoprostane (classe IV). R = -(CH2)3COOH.

1.3.2. Transport et métabolisme des F2-isoprostanes

Les F2-isoPs sont générés in situ en position sn-2 sur les phospholipides (PL) et peuvent être

hydrolysés par l’action de certaines PLA2 dont la PLA2 associée aux lipoprotéines (Lp-PLA2) [90].

D’ailleurs, les PLA2 retrouvées dans le venin de serpent préfèrent cliver les lipides oxydés,

protégeant ainsi les membranes lipidiques des dommages causés par la peroxydation lipidique [95,

96]. Malgré cela, les F2-isoPs circulent principalement estérifiés au PL des HDL dans le plasma [97].

En effet, ils sont quatre fois plus abondants sous forme estérifiée au PL des lipoprotéines que sous

forme libre dans le plasma [98]. La Lp-PLA2 est plus active en présence des LDL, ce qui fait de ces

lipoprotéines de moins bons transporteurs d’isoprostanes [97].

La demi-vie du 8-iso-PGF2α libre, le F2-isoPs le plus étudié jusqu’à maintenant, est d’environ 16

minutes chez l’humain [8]. Ce composé, tout comme les autres isomères formés lors de la

peroxydation de l’acide arachidonique, est filtré tel quel par les reins et excrété dans l’urine où il est

23

retrouvé en très grande quantité. Il peut également être métabolisé par le foie. Les principaux

métabolites du 8-iso-PGF2α formés sont le 2,3-dinor-8-iso-PGF2α et le 2,3-dinor-5,6-dihydro-8-iso-

PGF2α (Figure 17) [99]. Ces derniers composés sont également retrouvés en très grande quantité

dans l’urine.

Figure 17. Structures du 2,3-dinor-8-iso-PGF2α et le 2,3-dinor-5,6-dihydro-8-iso-PGF2α.

1.3.3. Mesure des F2-isoprostanes

Les F2-isoPs sont retrouvés dans tous les tissus et fluides biologiques. Le plasma et l’urine sont les

deux matrices biologiques les plus utilisées pour évaluer le stress oxydatif in vivo, car leur collection

est facile et peu ou pas invasive. Certaines précautions doivent être prises lors de l’entreposage et

de l’analyse des échantillons de plasma afin d’éviter la peroxydation ex vivo des lipides qu’ils

contiennent [98]. En effet, ces échantillons doivent être conservés à -80°C en présence d’un

antioxydant comme le hydroxytoluène butylé (BHT) [100]. L’ajout de BHT n’est pas nécessaire pour

les échantillons d’urine, car ce liquide biologique ne contient qu’une quantité négligeable lipides.

Dans le plasma, les F2-isoPs sont principalement retrouvés estérifiés aux PL et en une plus faible

proportion sous la forme libre [98]. Afin d’évaluer le stress oxydatif, les F2-isoPs libres peuvent être

mesurés, mais aussi les F2-isoPs totaux, c’est-à-dire la somme de ces composés libres et estérifiés.

Dans ce cas, les F2-isoPs doivent être hydrolysés des PL soit par hydrolyse alcaline, soit par

hydrolyse enzymatique à l’aide d’une PLA2 [101]. Dans l’urine, une telle hydrolyse n’est pas

nécessaire. Par contre, en plus des F2-isoPs, mieux vaut y mesurer aussi leurs métabolites dans le

but d’évaluer la peroxydation lipidique endogène réelle puisque cette information peut être faussée

par la production locale de F2-isoPs dans les reins [102]. Les concentrations mesurées sont

normalisées en fonction de la quantité de créatinine contenue dans l’urine.

2,3-dinor-8-iso-PGF2α

2,3-dinor-5,6-dihydro-8-iso-PGF2α

24

De nombreuses méthodes ont été mises au point pour mesurer les F2-isoPs dans les différentes

matrices biologiques. La première technique à avoir été développée utilise la chromatographie en

phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse en mode « ionisation chimique négative » (GC-

NICI-MS) [101, 103]. Pour être mesurés par cette technique, les F2-isoPs estérifiés sont hydrolysés

des PL puis extraits de la matrice biologique avant d’être soumis à une dérivation chimique afin de

les rendre compatibles avec la chromatographie gazeuse (Figure 18). Cette méthode très sensible

mesure les F2-isoPs, c’est-à-dire le 8-iso-PGF2α et les autres F2-isoPs qui coéluent avec ce composé

[104]. L’utilisation de la chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse en

tandem (GC-MS/MS) est possible afin d’améliorer la sélectivité de la méthode [105, 106]. Dans le but

de simplifier la préparation des échantillons, des méthodes utilisant la chromatographie liquide

couplée à la spectrométrie de masse en tandem (HPLC-MS/MS) ont été mises au point. Ces

méthodes ne nécessitent pas la dérivation chimique des F2-isoPs. De plus, elles permettent de doser

simultanément les quatre classes de regioisomères et de doser séparément plusieurs

diastéréoisomères dans une même classe [107, 108]. Finalement, des méthodes immuno-

enzymatiques (ELISA) [109] et radio-immunologiques (RIA) ont également été mises au point [110].

Ces méthodes ne nécessitent pas l’utilisation d’instruments dispendieux comme les GC-MS et

HPLC-MS/MS, mais elles sont moins spécifiques à cause des réactions croisées de l’anticorps avec

d’autres eicosanoïdes apparentés.

Figure 18. Dérivation chimique pour l'analyse des F2-isoPs par GC-MS. Tirée de [104].

25

1.3.4. Effets biologiques des F2-isoprostanes

Les F2-isoPs ne sont pas que des biomarqueurs du stress oxydatif, ce sont également des molécules

bioactives. La plupart des études en lien avec la bioactivité des F2-isoPs ont été faites à l’aide du 8-

iso-PGF2α. Il a été démontré que ce composé est vasoconstricteur dans la plupart des tissus, dont

l’aorte, le cerveau, les reins et le poumon [111-113]. De plus, il induit la prolifération des cellules

musculaires lisses [114]. Il exerce ces actions biologiques principalement en interagissant avec le

récepteur du thromboxane A2 (TPR). 8-iso-PGF2α est également un médiateur dans la fonction

plaquettaire [115]. Cette molécule stimule l’agrégation des plaquettes en interagissant avec le

récepteur TP mais il peut également inhiber cette agrégation en interagissant avec un récepteur

inconnu (ISR, récepteur des isoprostanes) jusqu’à maintenant qui implique l’adénosine

monophosphate cyclique (AMPc) (Figure 19) [115, 116]. Enfin, le 8-iso-PGF2α possède d’autres

activités biologiques et entre autres, il peut induire la synthèse de TXA2 dans certains lits vasculaires

tels que les microvaisseaux du cerveau de porc [117].

Figure 19. Signalisation impliquant le 8-iso-PGF2α dans la fonction plaquettaire. Tirée de [115].

26

Les études concernant l’activité biologique des autres F2-isoPs sont limitées. Une étude faite chez le

porc sur des microvaisseaux cérébraux et rétiniens a démontré que d’autres isomères de la classe

III, c’est-à-dire 8-iso-15(R)-PGF2α, ent-8-iso-PGF2α et ent-8-iso-15(S)-PGF2α, sont également des

vasoconstricteurs comme le 8-iso-PGF2α. Il en va de même pour les deux isomères de la classe V

qui ont été testés. Cependant, deux des trois isomères de la classe VI testés (iPF2α-VI et 5-iPF2α-VI)

ne possèdent pas d’effets vasomoteurs alors que le ent-iPF2α-VI cause une faible vasoconstriction.

Ces résultats confirment ce qui avait déjà été démontré dans des vaisseaux sanguins humains

concernant le iPF2α-VI et le 5-iPF2α-VI [118].

1.4. Grossesse et désordre hypertensif avec protéinurie

1.4.1. La grossesse, un évènement oxydatif

Le placenta est un organe hémochorial qui se développe pendant la grossesse et qui lie la mère à

son enfant par le biais du cordon ombilical. Il occupe plusieurs fonctions essentielles au bon

développement du fœtus [119]. Premièrement, il assure le transport de l’oxygène, de l’eau et des

nutriments de la mère vers le fœtus et expulse le dioxyde de carbone de même que les autres

déchets métaboliques vers la circulation maternelle. Ensuite, il protège le fœtus contre les infections

et maladies maternelles ainsi que contre certains xénobiotiques. Enfin, il occupe également une

fonction endocrine puisqu’il relâche autant dans la circulation sanguine maternelle que fœtale

différents types d’hormones dont des œstrogènes, de la progestérone, des facteurs de croissance,

des cytokines et des eicosanoïdes.

Le développement du placenta débute 6 à 7 jours après la fécondation de l’ovule [120]. Lors de la

placentation, les cytotrophoblastes d’origine fœtales envahissent les artères spiralées utérines où ils

remplacent les cellules endothéliales maternelles et détruisent les cellules musculaires lisses sous-

jacentes jusqu’au premier tiers du myomètre (Figure 20) [120, 121]. Ces artères ainsi remodelées ont

un diamètre au moins quatre fois plus large qu’initialement et ne répondent plus aux stimuli

vasomoteurs [121]. Ces nouvelles caractéristiques permettent au placenta de recevoir, à partir du

deuxième trimestre de la grossesse, un haut débit sanguin non pulsé et de faible pression [7, 122].

Pendant le premier trimestre, les artères spiralées sont obstruées par un bouchon de

27

cytotrophoblastes et le placenta se développe dans un environnement pauvre en oxygène [7]. Dix à

douze semaines après le début de la grossesse, le sang maternel commence à circuler dans le

placenta à partir de la périphérie de celui-ci et la pression partielle en oxygène y passe de moins de

20 mm Hg (8e semaine) à plus de 50 mm Hg (12e semaine) [7, 123]. Cet évènement est à l’origine

d’un choc oxydatif [124, 125]. Ensuite, plus la grossesse avance plus la mère est soumise à un

stress oxydatif placentaire et systémique [126, 127]. En effet, afin de soutenir la croissance rapide du

fœtus, le métabolisme du placenta nécessite beaucoup d’oxygène et par conséquent ce tissu est

riche en mitochondries, une source majeure de ROS [125]. La grossesse est également associée à

une réponse inflammatoire systémique qui se manifeste principalement par le biais de l’activation de

monocytes et de granulocytes ainsi que de l’endothélium [128]. L’activation de ces cellules mène à la

production de ROS pouvant contribuer au stress oxydatif maternel. Le stress oxydatif atteint son

paroxysme au moment de l’accouchement vaginal alors que les contractions de l’utérus coupent par

intermittence l’apport en sang du placenta (ischémie-réperfusion). Ce phénomène amplifie la

production de ROS par les mitochondries et les xanthines oxydases [123, 129].

Figure 20. Invasion des artères spiralées par les cytotrophoblastes dans une grossesse sans

complications. Tirée de [130].

1.4.2. Désordre hypertensif avec protéinurie (prééclampsie)

La prééclampsie est un syndrome pouvant être observé après la 20e semaine de grossesse chez

l’humain et qui est associé à une tension artérielle élevée (pression diastolique > 90 mm Hg) et à une

28

protéinurie (plus de 0.3 g de protéines par jour dans un échantillon d’urine collecté sur 24h) [131]. Le

seul traitement efficace est l’accouchement [132]. Elle complique entre 3 et 5 % des grossesses dans

le monde et est une cause majeure de mortalité et de morbidité maternelle et fœtale [133]. Parmi les

complications maternelles probables de la prééclampsie figurent l’éclampsie, le syndrôme HELLP

(Hemolysis, Elevated Liver enzymes and Low Platelets count), l’insuffisance rénale, l’œdème

pulmonaire, l'hématome rétroplacentaire et la mort [132]. Aux États-Unis, 20 % des décès reliés à la

grossesse sont dus à ce syndrome [134]. De plus, les femmes qui ont souffert de prééclampsie ont

plus de chances de développer des maladies cardiovasculaires plus tard dans leur vie [135, 136].

Parmi les complications fœtales probables figurent la restriction de croissance intra-utérine,

l’asphyxie périnatale et la mort [132]. Comme le seul traitement à la prééclampsie est

l’accouchement, ce syndrome est la cause de nombreuses naissances prématurées. Selon le degré

de prématurité, les conséquences pour le bébé peuvent être importantes. Finalement, un bébé né

d’une grossesse prééclamptique est plus à risque de développer certaines maladies à l’âge adulte,

par exemple des maladies cardiovasculaires (hypothèse de Barker) [132, 137].

1.4.2.1. Physiopathologie de la prééclampsie

Les causes exactes de la prééclampsie sont inconnues. Toutefois, il est possible d’expliquer la

physiopathologie de ce syndrome grâce à un modèle en deux étapes.

Au cours de la première étape, qui se déroule avant la 20e semaine de grossesse, la placentation est

inadéquate. L’invasion des artères spiralées par les cytotrophoblastes est limitée à la décidue (Figure

21) [138]. De plus, 30 à 50 % des artères échappent totalement au remodelage imposé par la

grossesse [139]. Ces vaisseaux sanguins conservent donc leur petit diamètre et leur rigidité. Ils

demeurent également sensibles aux molécules vasoactives. Le débit sanguin résultant est par

conséquent irrégulier (ischémie-réperfusion), pulsé et de forte pression. La pression élevée du débit

sanguin est susceptible de causer des dommages hydrostatiques aux villosités placentaires alors

que l’ischémie-réperfusion est responsable de la production accrue de ROS [121, 122]. En fait, la

prééclampsie est associée à un stress oxydatif et à une réponse inflammatoire systémique plus

importants que ce qui est observé au cours d’une grossesse normale [140, 141].

29

Figure 21. Invasion des artères spiralées par les cytotrophoblastes dans une grossesse

prééclamptique. Tirée de [130].

Le stress oxydatif joue un rôle important dans la transition vers la deuxième étape de la

physiopathologie de la prééclampsie, c’est-à-dire vers l’apparition des symptômes maternels. Ces

symptômes sont principalement associés à la dysfonction de l’endothélium [142-145]. Dans ses

conditions non pathologiques, l’endothélium agit entre autres comme une barrière sélective pour

empêcher la diffusion de macromolécules de la lumière artérielle vers l'espace interstitiel. Ce tissu

joue également un rôle dans la régulation du tonus vasculaire, dans la modulation de l'inflammation,

dans la promotion, ainsi que dans l'inhibition de la croissance vasculaire et dans la modulation de

l'agrégation plaquettaire et dans la coagulation [146]. Les ROS peuvent directement induire la

dysfonction de l'endothélium et ainsi causer l’hypertension et la protéinurie caractéristiques à la

prééclampsie [146]. Ils peuvent également provoquer la dysfonction de l’endothélium indirectement

en favorisant l’inflammation systémique observée en prééclampsie. En effet, les ROS peuvent

favoriser l’inflammation de diverses façons notamment en activant NF-κB, en produisant des

biomolécules oxydées pro-inflammatoires (ex. : LDL oxydées) ou encore en provoquant la nécrose

des cellules [2, 147]. De plus, les ROS activent les leucocytes [148] ainsi que de la production de

cytokines inflammatoires (ex. : Tumor Necrosis Factor-α (TNF-α), interleukine-1β (IL-1β), IL-6) en

prééclampsie [2, 130, 149-152]. Ces cytokines sont susceptibles de causer la dysfonction de

l’endothélium, tout comme les facteurs antiangiogéniques (ex. : soluble vascular endothelial growth

factor receptor-1 (sFlt-1) and soluble endoglin) libérés par le placenta en ischémie-réperfusion [130,

153].

30

1.4.2.2. Facteurs de risque

De nombreux facteurs de risques sont connus pour la prééclampsie. Ils sont résumés dans les

tableaux suivants (Tableau 2, Tableau 3, Tableau 4). Ils peuvent être séparés en trois catégories :

ceux liés à la mère, ceux liés au père et ceux liés à la grossesse. Outre ces facteurs, le statut

socioéconomique de la mère peut également influencer ses chances de développer ce syndrome au

cours d’une grossesse. En effet, plus son statut socioéconomique est faible, plus le risque est élevé

[154]. Il semble que la diète, le mode de vie et l’environnement contribuent à l’augmentation des cas

de prééclampsie dans les pays pauvres [155]. Curieusement, les fumeuses ont 30 à 40 % moins de

chances d’avoir une grossesse prééclamptique [156, 157]. Par contre, ce bénéfice est annulé par

l'effet négatif substantiel du tabagisme sur la croissance du fœtus, le risque de décollement

placentaire, et la santé en générale. [158].

Tableau 2. Facteurs de risques pour la prééclampsie liés à la mère

Facteurs liés à la mère Risque relatif

Réf.

Âge maternel > 40 ans (primipare) 1.681 [159]

Âge maternel > 40 ans (multipare) 1.961 [159]

Nulliparité 2.911 [159]

Prééclampsie lors d’une grossesse précédente 7.191 [159]

Intervalle entre les grossesses 1.12/année2 [160]

Antécédents familiaux de prééclampsie 2.901 [159]

Hypertension artérielle préexistante (diastolique > 80 mm Hg) 1.381 [159]

Diabète de type 1 3.561 [159]

Obésité 2.471 [159]

Thrombophilie n.d. [161]

Maladies rénales n.d. [159]

Maladies auto-immunes chroniques 6.91 [159]

Syndrome des antiphospholipides 9.721 [159]

n.d. : non disponible 1Risque relatif non-ajusté (intervalle de confiance à 95%) 2Rapport des cotes (odds ratio) (intervalle de confiance à 95%)

31

Tableau 3. Facteurs de risques pour la prééclampsie liés au père

Facteurs liés au père Risque relatif

Réf.

Exposition limité au sperme (0 à 4 mois) 7.81 [162]



Exposition limité au sperme (12 mois et plus) 1.01 [162]

Père impliqué dans une grossesse prééclamptique antérieure 1.82 [163] 1Risque relatif non-ajusté (intervalle de confiance à 95%) 2Odds ratio non-ajusté (intervalle de confiance à 95%)

Tableau 4. Facteurs de risques pour la prééclampsie liés à la grossesse

Facteurs liés à la grossesse Risque relatif

Réf.

Diabète gestationnel n.d. [158]

Grossesse gémellaire 2.931 [159]

Mole hydatiforme n.d. [164]

Anomalies chromosomiques n.d. [158]

n.d. : non disponible 1Risque relatif non-ajusté (intervalle de confiance à 95%)

1.5. Problématique et objectifs

1.5.1. Problématique

Le stress oxydatif est impliqué dans la grossesse en tant qu’événement physiologique normal [165].

Cependant, la prééclampsie, une pathologie de la grossesse, est associée à un stress oxydatif plus

important que celui qui est observé au cours d’une grossesse dite « normale » [140].

Plusieurs biomarqueurs ont été utilisés afin d’évaluer le stress oxydatif in vivo. Depuis quelques

années, les F2-isoprostanes, des produits de la peroxydation de l’acide arachidonique, sont reconnus

comme étant les biomarqueurs les plus fiables du stress oxydatif [88]. Bien qu’il existe 64 isomères

de F2-isoprostanes, le plus étudié est un isomère de la classe III, le 8-iso-PGF2α (Figure 14) [8]. Cet

32

isomère a été mesuré dans plusieurs matrices biologiques (placenta, plasma, urine, salive) afin

d’étudier le stress oxydatif en prééclampsie [166-178]. Certaines études ont démontré une

augmentation du niveau de 8-iso-PGF2α en prééclampsie [166, 171], d’autres non [169, 179]. Une

seule étude s’est attardée à mesurer un autre F2-isoprostane que le 8-iso-PGF2α. En effet, Regan et

al. ont mesuré le 8,12-iso-iPF2α-VI dans des échantillons d’urine de femmes prééclamptiques et

normales obtenus à différents moments de la grossesse, mais ils n’ont pas trouvés de différences

significatives entre les deux groupes [180]. Aucune étude ne s’est penchée sur la mesure d’autres

isomères que le 8-iso-PGF2α dans le sang, le plasma, et les membranes érythrocytaires de femmes

au troisième trimestre d’une grossesse normale ou prééclamptique.

1.5.2. Hypothèses

Les F2-isoprostanes de la classe VI sont généralement les plus abondants de tous les F2-

isoprostanes. Ceux-ci pourraient être de meilleurs biomarqueurs du stress oxydatif durant la

grossesse sans complications et en prééclampsie que le 8-iso-PGF2α.

Les acides gras trans peuvent provoquer un stress oxydatif in vivo et le stress oxydatif peut

induire la formation d’acides gras trans. Des corrélations positives entre les F2-isoprostanes

et les acides gras trans pourraient donc être observées dans le sang de femmes ayant eu

une grossesse sans complications.

1.5.3. Objectifs

Développer et valider une méthode d’analyse par HPLC-MS/MS permettant le dosage

simultané de plusieurs F2-isoprostanes.

Mesurer les F2-isoprostanes totaux (estérifiés aux phospholipides + libres) dans le plasma, le

sang total et les membranes érythrocytaires de femmes au troisième trimestre de la

grossesse par HPLC-MS/MS.

Étudier la relation entre les F2-isoprostanes et les acides gras trans dans le plasma de

femmes au troisième trimestre de la grossesse par HPLC-MS/MS.

33

Mesurer les F2-isoprostanes totaux (estérifiés aux phospholipides + libres) dans le plasma, le

sang total et les membranes érythrocytaires de femmes au troisième trimestre d’une

grossesse prééclamptique par HPLC-MS/MS.

Comparer le niveau de chaque F2-isoprostane mesuré dans les trois matrices biologiques

(plasma, sang total et membranes érythrocytaires) entre les grossesses contrôles et

prééclamptiques.

35

Chapitre 2 – F2-isoprostanes analysis in plasma of

pregnant women by HPLC-MS/MS using a column

packed with core-shell particles

2.1. Résumé

Les F2-isoprostanes contenus dans le plasma sont des biomarqueurs fiables du stress oxydatif. Il

existe 64 isomères de F2-isoprostanes pouvant être générés par la peroxydation de l’acide

arachidonique estérifié aux phospholipides. Analyser individuellement et rapidement ces isomères

représente un défi technique. Nous avons développé une méthode d’analyse par HPLC-MS/MS pour

la détermination simultanée de sept F2-isoprostanes dans le plasma, c’est-à-dire le 8-iso-15(R)-

PGF2α, le 8-iso-PGF2α, le 15(R)-PGF2α, le iPF2α-IV, le iPF2α-VI, le 5-iPF2α-VI et le (±)5-8,12-iso-iPF2α-

VI. Cette méthode a été validée et utilisée pour le dosage de ces molécules dans le plasma au

troisième trimestre de grossesse (n = 20). Les échantillons de plasma ont été soumis à une

hydrolyse alcaline puis les F2-isoprostanes totaux ont été isolés par extraction liquide-liquide. Ils ont

été séparés et analysés par HPLC-MS/MS en 16.5 minutes grâce à une colonne chromatographique

C18 remplie avec des particules partiellement poreuses. Les F2-isoprostanes de la classe VI sont les

plus abondants à avoir été mesurés dans les échantillons, représentant 65 % de tous les F2-

isoprostanes mesurés par la méthode HPLC-MS/MS. Le 15(R)-PGF2α est le plus abondant parmi les

isomères de la classe III dans le plasma des femmes enceintes.

36

F2-isoprostanes analysis in plasma of pregnant women by HPLC-MS/MS using a column

packed with core-shell particles

Jessica Larose1, Pierre Julien2,4 and Jean-François Bilodeau1,3,4*

1Axe reproduction, santé de la mère et de l'enfant, et Centre de Recherche en Biologie de la

Reproduction (CRBR), Centre de recherche du CHU de Québec, Québec, Canada G1V 4G2.

2Axe endocrinologie et néphrologie, et Centre de Recherche en endocrinologie moléculaire et

oncologique et génomique humaine (CREMOGH), Centre de recherche du CHU de Québec,

Québec, Canada G1V 4G2.

3Département d'Obstétrique, Gynécologie et Reproduction.

4Département de Médecine, Faculté de médecine, Université Laval, Québec, Canada G1K 7P4.

Running title: F2-isoPs separation using core-shell particles technology

*Correspondence and reprint request:

Centre de recherche du CHU de Québec

Axe reproduction, santé périnatale et santé de l'enfant, Local T-1-49

2705 Boulevard Laurier

Québec (Qc) G1V 4G2

Tel: (418) 525-4444 x 46153

Fax: (418) 654-2765

Email:[email protected]

Publié dans J lipid Res, février 2013

37

2.2. Abstract

Plasma F2-isoprostanes (F2-isoPs) are reliable biomarkers of oxidative stress. Several possible F2-

isoPs are generated by the oxidation of arachidonic acid esterified in phospholipids. The separation

of these isomers represents a technical challenge for rapid and selective determination. We have

developed a HPLC-MS/MS method for the simultaneous determination of seven plasma F2-isoPs,

namely 8-iso-15(R)-PGF2α, 8-iso-PGF2α, 15(R)-PGF2α, iPF2α-IV, iPF2α-VI, 5-iPF2α-VI and (±)5-8,12-

iso-iPF2α-VI. We have validated this method in plasma of pregnant women, a mild physiological

oxidative stress known to increase F2-isoPs. Thus, plasma samples of women collected at the third

trimester of pregnancy (n = 20) were subjected to alkaline hydrolysis followed by liquid-liquid

extraction in order to extract total F2-isoPs. The F2-isoPs were separated within 16.5 min using a

column packed with core-shell particles. The class VI isomers were the most abundant, accounting

for 65% of the total level of all quantified F2-isoPs in plasma of pregnant women (p < 0.05). The

15(R)-PGF2α was the most abundant of the class III isomers quantified. This method allowed fast and

selective separation of seven isomers from three different classes of F2-isoPs regioisomers.

Supplementary keywords: oxidative stress, pregnancy, mass spectrometry, 8-iso-PGF2α.

Abbreviations: F2-isoP, F2-isoprostane; IS, internal standard; LLOD, lower limit of detection; LLOQ,

lower limit of quantification; PGF2α, prostaglandin F2α; PLA2, phospholipase A2; ROS, Reactive

oxygen species;

38

2.3. Introduction

Oxidative stress is an independent risk factor for coronary heart diseases (1, 2) and is a feature of

many other pathologies (3) including hypercholesterolemia (4), inflammatory diseases (5) and

endothelial dysfunctions (6, 7). F2-isoPs found in tissues and biological fluids are reliable biomarkers

of oxidative stress (8, 9). F2-isoPs result from the free radical-mediated peroxidation of arachidonic

acid esterified in phospholipids. This reaction potentially generates 64 isomers of F2-isoPs divided

into four classes of regioisomers, each composed of eight racemic diastereoisomers (10). Once

formed, these compounds can be released from phospholipids by the phospholipases A2 (PLA2) or by

the platelet activating factor acetylhydrolase (PAF-AH or lipoprotein (Lp)-PLA2) (11). The F2-isoPs

exert their biological activity, such as vasoconstriction, in their free form in plasma and are excreted

in urine (12).

The 8-iso-propstaglandin F2α (PGF2α) has been the most studied isomer known as an in vivo

biomarker of oxidative stress (3). Urinary level of F2-isoPs is a good indicator of oxidative stress but

rely on other factors such as the rate of hydrolysis of F2-isoPs from phospholipids, their metabolism

as well as their excretion (13). However, valuable information could be obtained from the

simultaneous analyses of the plasma concentrations of several isomers of F2-isoP as they may be

formed and eliminated differentially according to the physiological state or disorder (14-17).

Several methods have been developed to measure F2-isoPs including enzyme immuno-assays and

gas or liquid chromatography coupled to mass spectrometry. The methods using HPLC-MS/MS are

usually the most selective for F2-isoPs regioisomers and diastereoisomers (18). Generally, a C18

stationary phase composed of fully porous particles were used in these methods (18-22). However,

new chromatographic columns packed with core-shell particles improve separation efficiency for

several analytes in comparison to classical porous particles (23, 24). The benefits of these new

columns for F2-isoPs analysis were not demonstrated so far to our knowledge.

Thus, the aim of this study was to develop a rapid and specific method to quantify F2-isoPs isomers in

plasma by HPLC-MS/MS using a column filled with core-shell particles. To test this new method, the

plasma total levels (esterified + free) of several F2-isoPs isomers were determined in women at the

third trimester of pregnancy. In order to detect a wide range of physiologically produced F2-isoPs

39

isomers above the baseline, we chose to use plasma of pregnant women since pregnancy is a mild

oxidative stress known to increase the levels of 8-iso-PGF2α (25-28).

2.4. Material and methods

2.4.1. Materials

The 8-iso-15(R)-PGF2α, 8-iso-PGF2α, 8-iso-PGF2β, 11β-PGF2α, 15(R)-PGF2α, 5-trans-PGF2α, PGF2α,

iPF2α-IV, (±)5-iPF2α-VI, (±)5-8,12-iso-iPF2α-VI and their deuterated counterparts 8-iso-PGF2α-d4,

PGF2α-d4, iPF2α-IV-d4, iPF2α-VI-d4, (±)5-iPF2α-VI-d11, and (±)5-8,12-iso-iPF2α-VI-d11 were

purchased from Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, USA). Butylated hydroxytoluene (BHT) was

bought from Sigma-Aldrich (Oakville, ON, Canada) and sodium chloride was obtained from

Laboratoire Mat (Québec, QC, Canada). All other reagents and solvents were HPLC grade and were

purchased from VWR International (Ville Mont-Royal, QC, Canada).

2.4.2. Patient selection

We recruited twenty normotensive pregnant women at the Centre Mère-Enfant du Centre Hospitalier

Universitaire de Québec. The institution approved the protocol and informed consents were obtained

from all pregnant women participating to the study. Normotensive pregnancy was defined as a

pregnancy in which the mother had normal blood pressure (≤140/90 mm Hg), absence of proteinuria

and absence of other medical complications such as thrombocytopenia (platelet count <

100000×109/L), oliguria (< 500 mL/d), pulmonary edema, elevated liver enzyme levels, severe

nausea and vomiting, frontal headache, visual disturbances, persistent abdominal pain in right upper

quadrant, chest pain or shortness of breath, suspected abruption placentae, hemolysis, elevated liver

enzymes syndrome, intrauterine growth retardation and oligohydramnios. Patients presenting any

pre-existing medical conditions such as chronic hypertension, diabetes mellitus, obesity (body mass

index > 30 prior to pregnancy), kidney diseases, inflammatory intestinal diseases and blood clotting

disorders or any concurrent medical obstetrical complications, such as gestational diabetes, were

excluded. Other exclusion factors were age (< 18 years old or > 40 years old) and the intake of

anticoagulant drugs or drugs affecting lipid metabolism. No patient had symptoms associated with

40

gestational hypertension with proteinuria (preeclampsia) as it is defined by the Canadian

Hypertension Society Consensus (29). All women were non-smokers.

2.4.3. Blood collection and processing

Twenty mL of blood were collected in heparinized tubes before the active phase of labor. The

processing of blood samples was made within 2 hours. Five hundred µL of whole blood was

immediately frozen on dry ice and kept at -80°C for further analysis. The remaining blood was

centrifuged at 180 x g for 10 minutes at 20°C. The supernatant (plasma) was recentrifuged at 1300 x

g for 25 min to remove platelets from plasma, which was kept at -80°C for further analyses.

2.4.4. Preparation of standards for F2-isoPs analysis

A solution of internal standards (IS) containing 50 ng/mL of each deuterated analyte (8-iso-PGF2α-d4,

PGF2α-d4, iPF2α-IV-d4, iPF2α-VI-d4, (±)5-iPF2α-VI-d11, and (±)5-8,12-iso-iPF2α-VI-d11) in 0.01 %

acetic acid was prepared to be added to samples and standards. A stock solution containing 1 µg/mL

of each compound (8-iso-15(R)-PGF2α, 8-iso-PGF2α, 15(R)-PGF2α, 5-trans-PGF2α, PGF2α, iPF2α-IV,

(±)5-iPF2α-VI and (±)5-8,12-iso-iPF2α-VI) was prepared in 0.01 % acetic acid. This last solution was

used to prepare two sets of working solutions with concentrations ranging from 2 ng/mL to 80 ng/mL

in 0.01 % acetic acid for the preparation of the standard curve, quality control and method validation.

The first set of working solutions was diluted to obtain the standard curves for each analyte (10 µL of

working solution, 10 µL of internal standard, 80 µL of water containing 10% (v/v) acetonitrile and

0.01% (v/v) acetic acid). The second set of working solutions was diluted the same way to obtain

quality controls.

2.4.5. Extraction of F2-isoPs from plasma

F2-isoPs were extracted from plasma using a modified version of the method described by Taylor

(19). Ten µL of a BHT solution (1% in ethanol) and 10 µL of the internal standard were added to 250

µL of freshly thawed plasma. Samples were completed to 500 µL with water. Then, 500 µL of

hydrolysis solution (1 mL of 50% (w/w) KOH, 1 mL of water and 10 mL methanol) were added. The

resulting mixture was vortexed and incubated at 37°C for 60 minutes. The reaction was stopped with

100 µL of formic acid 0.05% (v/v) and acidified with 90 µL of hydrochloric acid 5 N. The tubes were

then extracted twice with 1.5 mL of hexane. The organic phase was discarded. The aqueous phase

41

was then extracted three times with 1.5 mL of 3:1 ethyl acetate:hexane. The resulting organic phase

of the three extractions were combined and evaporated to dryness under nitrogen and reconstituted

to 100 µL in 10% (v/v) acetonitrile and 0.01% (v/v) acetic acid in water.

2.4.6. Chromatography

The chromatography was carried out using a Shimadzu Prominence system (Columbia, MD, USA). A

Kinetex XB-C18 100 Å column (100 x 3.0 mm, 2.6 µm) was used preceded by a 4.0 x 2.0 mm C18

SecurityGuard Cartridges. Both were from Phenomenex (Torrance, CA, USA). The column oven

temperature was controlled at 30°C. The injection volume was 40 µL. The separation was done

using a gradient of three solvents at a flow rate of 0.45 mL/min. Solvent A was composed of 0.01 %

(v/v) acetic acid in water, solvent B consisted of 0.01 % (v/v) acetic acid in acetonitrile and solvent C

was composed of 0.01 % (v/v) acetic acid in methanol. First, solvent B was held at 17% for 1 min

while solvent C was at 33%. The latter was followed by a linear gradient for over 8.9 min to 13.5% of

B and 58.9% of C. The next step was a linear gradient over 0.5 min to 47.5% B and 47.5% C

respectively. The previous conditions were maintained for 1.6 min and the solvent B and C were

decreased to 17% and 33% in 0.1 min respectively. This last condition was maintained for an

additional 4.4 min to complete the 16.5 min run.

2.4.7. Mass Spectrometry

The HPLC was coupled to a 3200 QTRAP® LC/MS/MS system from AB Sciex (Concord, ON,

Canada) through a Turbo VTM ion source using the electrospray ionization probe. The mass

spectrometer was operated in negative mode. Curtain gas (CUR), collision gas (CAD), ion source

gas 1 (GS1) and ion source gas 2 (GS2) were set at 37, 7, 45 and 55 respectively. The ions spray

voltage (IS) was set at -4100 V and source temperature was set at 700°C. Class III F2-isoPs and their

internal standard, 8-iso-PGF2α-d4 and PGF2α-d4 (class III-d4), were monitored in the multiple-reaction

monitoring (MRM) mode using the transitions 353.3 → 193.2 and 357.3 → 197.2 m/z respectively.

Class IV F2-isoPs and their internal standard, iPF2α-IV-d4 (class IV-d4), were monitored using the

transitions 353.3 → 127.0 and 357.0 → 127.0 m/z. Finally, class VI F2-isoPs and their internal

standard, (±)5-iPF2α-VI-d11, and (±)5-8,12-iso-iPF2α-VI-d11 (class VI-d11), were analyzed using the

transitions 353.0 → 115.0 and 364.6 → 115.0 m/z respectively. Quantification was performed using

Analyst® 1.4.2 Software (AB Sciex).

42

2.4.8. Method validation

The lower limit of quantification (LLOQ) was defined as the concentration to which the signal-to-noise

ratio was higher than 5 with a precision below 20% and an accuracy of ± 20% of the nominal

concentration (30). Determination of intra-day precision was done by analyzing a pool of plasma

samples from three nonpregnant women (Innovative Research, Novi, MI) spiked with 10 µL of

working solutions containing either 0 ng/mL, 7 ng/mL and 20 ng/mL of each analyte (n = 4 per

concentration). This validation procedure was carried out on three consecutive days in order to

evaluate inter-day precision (n = 12 per concentration). Accuracy and recovery was determined using

plasma samples spiked with the 7 and 20 ng/mL working solutions. The recovery was evaluated by

comparing signal obtained for plasma spiked before extraction with signal obtained for plasma spiked

after extraction with the corresponding working solutions. Matrix effects were evaluated by

postcolumn infusion at 10 µL/min of a solution containing 100 ng/mL of each following molecules: 8-

iso-PGF2α, 8-iso-PGF2α-d4, iPF2α-IV, iPF2α-IV-d4, (±)5-iPF2α-VI, (±)5-iPF2α-VI-d11. During

postcolumn infusion, an extract of plasma was injected concomitantly using the described HPLC-

MS/MS method above.

2.4.9. Statistical analyses

Statistical analyses were performed with SigmaPlot 12.3 (Systat Software, Inc., 2011, San Jose,

USA). The normality was tested using the Shapiro-Wilk test. The Kruskal-Wallis one-way ANOVA

was used to compare levels of F2-isoPs. All pairwise multiple comparisons were done according to

Student-Newman-Keuls’ method. In all cases, a p-value lower than 0.05 was considered significant

and a p-value between 0.05 and 0.1 was considered a tendency.

2.5. Results

2.5.1. Analysis of F2-isoPs in plasma by selected reaction monitoring mass spectrometry

Compound-dependent mass spectrometric parameters were optimized for each class of regioisomers

using split infusion at conditions close to the chromatographic separation. The 8-iso-PGF2α was use

to optimize class III F2-isoPs parameters (transition 353.3 → 193.2 and 357.3 → 197.2 m/z for

43

deuterated standard respectively). The iPF2α-IV was used to define which parameters to employ for

class IV F2-isoPs. The (±)5-iPF2α-VI was used to determine parameters for class VI regioisomers. It

was not possible to measure class V F2-isoPs because no commercial standards were available.

Declustering potential (DP), entrance potential (EP), collision energy (CE), collision cell entrance

potential (CEP) and collision cell exit potential (CXP) for each transition are shown in Table 1.

2.5.2. Chromatographic separation

HPLC conditions were optimized to obtain a baseline separation of all F2-isoPs in plasma (Fig. 1).

Mass chromatograms are shown for a pure standard solution (Fig. 2 A-F) and for a typical plasma

sample (Fig. 2 G-L). All class III isomers were well resolved (Fig. 2A) except for the 8-iso-PGF2β. This

last isomer, as well as the 11β-PGF2α isomer, were not detected in the plasma of third trimester

pregnant women (Fig. 2G). The peak observed at 7.78 min (Fig. 2G) was considered an unknown

plasma compound since it has the same retention time as the 5-trans-PGF2α, but eluted

inconsistently under different chromatographic conditions (data not shown). The 8-iso-15(R)-PGF2α,

8-iso-PGF2α, 15(R)-PGF2α and PGF2α were measurable in all plasma samples analyzed. The iPF2α-IV

was well separated from impurities (Fig. 2I), but was not always detectable in our samples. Both

iPF2α-VI and 5-iPF2α-VI were found in equal proportion in the (±)5-iPF2α-VI bought from the supplier.

The iPF2α-VI-d4 (transition 357.0 → 115.0 m/z) was used to identify corresponding unlabeled

isomers (data not shown). All class VI isomers were well resolved in pure standard solution and were

all detected in the plasma samples analyzed (Fig. 2E, K). Both, iPF2α-VI and 5-iPF2α-VI are well

separated from plasma impurities (Fig. 2K). Only the (±)5-8,12-iso-iPF2α-VI barely coeluted with an

unknown compound.

2.5.3. Method validation

Quantification of F2-isoPs was done using the ratio of peak area of each analyte to the peak area of

corresponding internal standards. Class III isomers, 8-iso-15(R)-PGF2α, 8-iso-PGF2α and 15(R)-

PGF2α, were quantified using 8-iso-PGF2α-d4. The iPF2α-IV was calculated using iPF2α-IV-d4. The

iPF2α-VI-d11, 5-iPF2α-VI-d11 and (±)5-8,12-iso-iPF2α-VI-d11 were used to measure respectively the

iPF2α-VI, 5-iPF2α-VI and (±)5-8,12-iso-iPF2α-VI. The calibration curves for each F2-isoPs covered 0.2

ng/mL to 8 ng/mL and were linear throughout this range (r2 > 0.99). Lower limits of quantification

(LLOQ) ranged between 11.3 and 21.0 pg injected on column (Table. 2). At these concentrations, the

44

precision was < 20 % (% coefficient of variation (CV)) and accuracy was below ± 20 % of the nominal

concentration. Mean intra-day coefficients of variation (% CV) fluctuated from 2.6 to 5.2 % and mean

inter-day CVs varied between 3.4 and 8.2 %. Mean intra-day and inter-day accuracy were below ± 15

% of the nominal concentration except for the 8-iso-PGF2α. The extraction recovery was also

evaluated and ranged from 57.9 to 73.3 %. No matrix effect was detected at the retention times of F2-

isoPs except for 8-iso-PGF2α, which showed low ionic suppression (data not shown).

2.5.4. F2-isoPs in the plasma of pregnant women

The plasma from twenty non-smoking women was retrieved at an average of 40.6 weeks of

pregnancies before the active phase of labor. The total F2-isoPs were extracted from plasma by

liquid-liquid extraction and measured by HPLC-MS/MS using the new validated method described

above. The respective plasma median levels for 8-iso-15(R)-PGF2α, 8-iso-PGF2α, 15(R)-PGF2α, iPF2α-

IV, iPF2α-VI, 5-iPF2α-VI and 5-8,12-iso-iPF2α-VI are shown in Table 3. Statistical analyses indicated

that class VI isomers were the most abundant, accounting for 65 % of the total level of quantified F2-

isoPs (p < 0.05, Table 3) and (±)5-8,12-iso-iPF2α-VI is the most abundant of all isomers (35 % of the

total level). The 15(R)-PGF2α is the most abundant of the class III isomers quantified. However, no

significant differences were observed between 8-iso-15(R)-PGF2α, 8-iso-PGF2α and iPF2α-IV. No

significant differences were observed between iPF2α-VI and 5-iPF2α-VI as well.

2.6. Discussion

F2-isoPs found in tissues and biological fluids are reliable biomarkers of oxidative stress (8, 9). We

have developed a new HPLC-MS/MS method for the simultaneous determination of seven F2-isoPs

isomers, namely the 8-iso-15(R)-PGF2α, 8-iso-PGF2α, 15(R)-PGF2α, iPF2α-IV, iPF2α-VI, 5-iPF2α-VI and

(±)5-8,12-iso-iPF2α-VI in plasma. The liquid chromatography coupled to mass spectrometry offers

many advantages over immunoassays, allowing the analysis of many compounds in complex

matrices with excellent selectivity, sensitivity and dynamic range. The simultaneous analysis of

several isomers of F2-isoPs can better characterize the oxidative stress of specific pathologies or

physiological conditions. Indeed, in a comparative study, more than eight F2-isoP isomers were

45

increased in urine of hypercholesterolemic patients, while only three isomers, including the 8-iso-

PGF2α, were found to be increased in cases of congestive heart failure (17).

Several methods using HPLC-MS/MS have already been published for the determination of F2-isoPs

(15, 18-22, 31, 32). Most chromatographic columns reported in these methods used a C18 stationary

phase although, other types of stationary phases have also been used such as C8 or porous

graphitic carbon. However, all columns used in previous methods were filled with fully porous

particles. Our method is the first to use a chromatographic column filled with core-shell particles. This

type of particles offers better efficiency than fully porous particles. In fact, as shown by the Van

Deemter equation, many parameters contribute to peak broadening in HPLC, namely the longitudinal

diffusion, the eddy dispersion and the solid-liquid mass transfer resistance. Those three parameters

are reduced when core-shell particles are used instead of the fully porous particles of about the same

diameters (the eddy dispersion being the most affected) (33). This allowed us to achieve a better F2-

isoPs separation in only 16.5 minutes without loss of precision and accuracy. To our knowledge, the

present chromatographic separation is the fastest among previously published methods.

The HPLC conditions were optimized in order to obtain a baseline separation of F2-isoPs for each

class of regioisomers. The separation was performed using a gradient of three solvents, namely

water, methanol and acetonitrile, each containing 0.01% of acetic acid. The methanol allowed for a

better selectivity of the F2-isoPs separation, but the use of acetonitrile was essential in order to avoid

co-elution between 8-iso-PGF2α and iPF2α-VI. Indeed, it is important to prevent co-elution of isomers

from class VI with isomers of the class III since class VI isomers, when fragmented in the collision

cells, produce both the main daughter ion 115 m/z, known to be specific to class VI, and the daughter

ion 193 m/z that characterizes class III F2-isoPs. The signal for the 193 m/z ion represents about 10%

of the signal of the 115 m/z ion produced from class VI fragmentation (22). That is why the proportion

of acetonitrile in the eluent was higher at the beginning than at the end of the gradient.

In this study, we reported, the total levels of the seven F2-isoPs isomers in the plasma of twenty

healthy women at the end of third trimester of pregnancy. The 8-iso-PGF2α is the most studied isomer

used to characterize oxidative stress in vivo (3). The median level of 8-iso-PGF2α found in our study

was 195 pg/mL of plasma. Literature values for total level of 8-iso-PGF2α in plasma from healthy

subjects ranged between 40 and 170 pg/mL (34, 35). Our measurement is slightly higher but this was

expected since pregnancy, per se, is known to be a mild oxidative event (3, 25-28, 36). The class VI

46

isomers were the most abundant by two to three folds when compared to the 8-iso-PGF2α. The class

IV and VI may be underestimated marker of oxidative stress. This the first study that quantified a

wide array of F2-isoPs in blood of pregnant women. This is why, except for 8-iso-PGF2α, it is not

possible to compare our results with other studies.

In sum, we have developed a new HPLC-MS-MS method using a C18 core-shell column for the

determination of seven F2-isoP isomers among classes III, IV and VI in blood plasma. This new

method has many advantages over the previously published method for the determination F2-isoPs

such as speed and selectivity.

2.7. Acknowledgments

This work was supported by a grant from the Canadian Institutes of Health research (CIHR, grant#

MOP-84219 to J.-F.B). Jessica Larose is a recipient of a Fonds de Recherche en Santé du Québec

(FRSQ) award.

2.8. References

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2.9. Figure legends

Fig. 1. Chemical structures of analytes investigated by LC-MS/MS.

Fig. 2. Mass chromatograms of a standard solution (A-F) and of a typical plasma sample spiked with

50 pg of each internal standard (G-L). Peak identification (see Figure 1 for structure): 1 = 8-iso-15(R)-

PGF2α; 2 = 8-iso-PGF2α; 3 = 8-iso-PGF2β; 4 = 11β-PGF2α; 5 = 15(R)-PGF2α; 6 = 5-trans-PGF2α; 7 =

PGF2α; 8 = 8-iso-PGF2α-d4; 9 = PGF2α-d4; 10 = iPF2α-IV; 11 = iPF2α-IV-d4; 12 = iPF2α-VI; 13 = 5-

iPF2α-VI; 14 = (±)5-8,12-iso-iPF2α-VI; 15 = iPF2α-VI-d11; 16 = 5-iPF2α-VI-d11; 17 = (±)5-8,12-iso-

iPF2α-VI-d11; ? = unknown compounds. IS = deuterated internal standards.

51

Table 1. Selected reaction monitoring parameters optimized for each classes of F2-isoPs

F2-isoPs Transitions

(m/z)

DP

(V)

EP

(V)

CEP

(V)

CE

(V)

CXP

(V)

Class III 353.3 → 193.2 -50.0 -7.0 -20.0 -34.0 -4.0

Class III-d4 357.3 → 197.2 -50.0 -7.0 -20.0 -34.0 -4.0

Class IV 353.0 → 127.0 -45.0 -7.0 -17.0 -33.0 -2.0

Class IV-d4 357.0 → 127.0 -45.0 -7.0 -17.0 -33.0 -2.0

Class VI 353.0 → 115.0 -47.0 -7.0 -21.0 -30.0 -2.0

Class VI-d11 364.6 → 115.0 -47.0 -7.0 -21.0 -30.0 -2.0

DP : declustering potential; EP : entrance potential; CEP : collision cell entrance potential; CE :

collision energy; CXP : collision cell exit potential

52

Table 2. Results for the method validation of F2-isoPs.

Intraday4 Interday5

LLOD

(pg inj.) LLOQ

(pg inj.) Recovery1

(%) Precision2

(% CV) Accuracy3

(%)

Precision (% CV)

Accuracy (%)

8-iso-15(R)-PGF2α

9.1 13.8 62.6 3.1 -3.9 4.7 -5.8

8-iso-PGF2α 10.6 16.1 71.1 4.6 -21.6 5.3 -22.6

15(R)-PGF2α 11.0 16.6 73.3 2.9 1.6 4.1 0.3

iPF2α-IV 7.5 11.3 59.1 2.6 -2.6 3.4 -4.6

iPF2α-VI 9.2 13.9 58.4 5.2 1.5 8.2 2.3

5-iPF2α-VI 8.2 12.4 57.9 3.4 1.8 6.5 0.1

(±)5-8,12-iso-iPF2α-VI

13.8 21.0 71.2 4.1 9.2 8.1 4.1

LLOD, lower limit of detetion; LLOQ, lower limit of quantification; inj., injected.

1Recovery was expressed as the mean value of data obtained from plasma samples spiked with 10

µL of working solutions containing 7 ng/mL or 20 ng/mL of each analyte.

2Precision is expressed as the mean value of data obtained from plasma samples spiked with 10 µL

of working solutions containing 0 ng/mL, 7 ng/mL or 20 ng/mL of each analyte.

3Accuracy is expressed as the mean value of data obtained from plasma samples spiked with the 7

or 20 ng/mL working solutions.

4n = 4 per concentration.

5n = 12 per concentration.

53

Table 3. F2-isoPs in the plasma of third trimester pregnant women.

F2-IsoPs levels1

(pg/ml plasma)

Class III

8-iso-15(R)-PGF2α 177 [150, 839]a

8-iso-PGF2α 195 [164, 551]a

15(R)-PGF2α 338 [285, 1758]b

Class IV

iPF2α-IV 137 [102, 984]a

Class VI

iPF2α-VI 416 [358, 4159]c

5-iPF2α-VI 393 [245, 5598]c

(±)5-8,12-iso-iPF2α-VI 879 [487, 2643]d

1Values are medians and quartiles [Q1, Q3] (n = 20).

Medians with different superscript letters (a-d) are statistically different (Kruskal-Wallis test followed

by Student-Newman-Keuls, p < 0.05).

54

Figure 1

55

Figure 2

5 ?

57

Chapitre 3 – F2-isoprostanes are correlated with

trans fatty acids in plasma of pregnant women

3.1. Résumé

Le stress oxydatif peut induire l’isomérisation cis-trans des acides gras insaturés cis et ainsi mener à

la formation d’acides gras trans in vivo. Les F2-isoprostanes (F2-isoPs) contenus dans le plasma sont

des biomarqueurs fiables du stress oxydatif in vivo. Nous avons émis comme hypothèse que le léger

stress oxydatif associé à la grossesse pourrait à la fois augmenter le niveau des F2-isoPs et celui des

acides gras trans. Des échantillons de plasma obtenus au troisième trimestre de grossesse (n = 21)

ont donc été soumis à une hydrolyse alcaline puis les F2-isoPs totaux ont été isolés par extraction

liquide-liquide. Sept isomères de F2-isoPs (8-iso-15(R)-PGF2α, 8-iso-PGF2α, 15(R)-PGF2α, iPF2α-IV,

iPF2α-VI, 5-iPF2α-VI et (±)5-8,12-iso-iPF2α-VI) ont été mesurés par HPLC-MS-MS. Les acides gras

trans dans les phospholipides du plasma ont été mesurés par GC-FID. Plusieurs corrélations

positives ont été trouvées entre certains F2-isoPs et certains acides gras trans tels que le 6t-18:1, le

9t-18:1 et le 9c,12t-18:2 (r > 0.442; p < 0.045). Le 9c,12t-18:2 était l’acide gras trans qui corrèle le

plus avec les F2-isoPs malgré sa faible concentration dans les phospholipides du plasma. Aucune

corrélation n’a été observée entre les F2-isoPs et le 9t-16:1 ni entre les F2-isoPs et le 11t-18:1. Cette

étude a démontré un lien entre les acides gras trans et les marqueurs du stress oxydatif, les F2-

isoPs, pendant la grossesse. Cela suggère aussi une compétition entre la peroxydation lipidique et

l’isomérisation cis-trans des acides gras cis.

58

F2-isoprostanes are correlated with trans fatty acids in plasma of pregnant women

Jessica Larose1,2, Karine Greffard3,5, Pierre Julien3,4,5 and Jean-François Bilodeau1,2,4,5,*

1Axe reproduction, santé de la mère et de l'enfant, Centre de recherche du CHU de Québec,

Québec, Canada G1V 4G2.

2Centre de Recherche en Biologie de la Reproduction (CRBR), Université Laval, Québec, G1V 4G2.

3Axe endocrinologie et néphrologie, Centre de recherche du CHU de Québec, Québec, Canada G1V

4G2.

4Département d'Obstétrique, Gynécologie et Reproduction, et Département de Médecine, Faculté de

médecine, Université Laval, Québec, Canada G1K 7P4

5Centre de Recherche en endocrinologie moléculaire et oncologique et génomique humaine

(CREMOGH), Université Laval, Québec, G1V 4G2.

Running title: F2-isoprostanes correlated with trans fatty acids

*Correspondence and reprint request:

Centre de recherche du CHU de Québec

Axe reproduction, santé périnatale et santé de l'enfant, Local T-1-49

2705 Boulevard Laurier

Québec (Qc) G1V 4G2

Tel: (418) 525-4444 x 46153

Fax: (418) 654-2765

Email: [email protected]

59

3.2. Abstract

Trans fatty acids (TFA) can be formed by oxidative stress through cis-trans isomerization. Plasma F2-

isoprostanes (F2-isoPs) are reliable biomarkers of oxidative stress. We hypothesized that the mild

physiological oxidative stress found in pregnancy could increase both, F2-isoPs and TFA accordingly.

Thus, plasma samples of women collected at the third trimester of pregnancy (n = 21) were subjected

to alkaline hydrolysis followed by liquid-liquid extraction in order to extract total F2-isoPs. Seven

plasma F2-isoPs (8-iso-15(R)-PGF2α, 8-iso-PGF2α, 15(R)-PGF2α, iPF2α-IV, iPF2α-VI, 5-iPF2α-VI and

(±)5-8,12-iso-iPF2α-VI) were measured by HPLC-MS-MS. TFA levels in plasma phospholipids were

measured by GC-FID. Several positive correlations were found between specific F2-isoPs and TFA,

such as 6t-18:1, 9t-18:1 and 9c,12t-18:2 (r > 0.442; p < 0.045). The 9c,12t-18:2 was the mostly

correlated TFA with F2-isoPs despite its low level in plasma phospholipids. No correlation was

observed between F2-isoPs and 9t-16:1 or 11t-18:1. This study demonstrated a link between TFA

and oxidative stress markers, F2-isoPs, during pregnancy and also suggested a competition between

lipid peroxidation and cis-trans isomerisation of the cis precursor fatty acid.

Supplementary keywords: conjugated linoleic acid, elaidic acid, oxidative stress, pregnancy, mass

spectrometry, vaccenic acid, F2-isoprostanes, 8-iso-PGF2α.

Abbreviations: 9t-16:1, palmitelaidic acid; 9c,12c-18:2, linoleic acid; 9c,12t-18:2, cis-9, trans-12

octadecadienoic acid; 9t,12t-18:2, linolenelaidic acid; 9t-18:1, elaidic acid; 11t-18:1, vaccenic acid;

F2-isoP, F2-isoprostane; GC-FID, gas chromatography coupled to a flame ionisation detector; IS,

internal standard; iTFA, industrial trans fatty acids; PGF2α, prostaglandin F2α; PLA2, phospholipase

A2; ROS, Reactive oxygen species; rTFA, ruminant trans fatty acids; TFA, trans fatty acids.

60

3.3. Introduction

Trans fatty acids (TFA) are unsaturated fatty acids containing at least one non-conjugated carbon-

carbon double bond in the trans configuration. Unsaturated fatty acids are synthetized only in the cis

configuration in human but a small amount of TFA are provided naturally from the diet. Indeed, TFA

are produced by bacteria in the rumen of ruminants and account for 2-5% of total fatty acids content

of their meat and milk (1). Before 2005 in North America, most dietary TFA were produced artificially

by partial hydrogenation of vegetable oil and were found in bakery products, deep-fried and frozen

food, packaged snack, margarines and crackers (2). Some partially hydrogenated vegetable oils

could contain up to 40–65% TFA as a percent of total fat (3, 4).

The distribution of TFA isomers from ruminants (rTFA) differs clearly from TFA of industrial sources

(iTFA). The iTFA are mainly represented by 9t-18:1 (elaidic acid) (5), while 11t-18:1 (vaccenic acid) is

the predominant rTFA (6). Consumption of iTFA has adverse effects on cardiovascular health by

altering blood lipid profile (increase of total to HDL cholesterol ratio, increase in LDL-cholesterol,

decrease in HDL-cholesterol), by modifying apolipoprotein levels, and by promoting systemic

inflammation as well as endothelial dysfunction (7-13). It is not clear yet whether rTFA induced similar

adverse effects as iTFA. Nevertheless, the outcomes of TFA on health seem more related to the

amount consumed than to their origin since rTFA are generally not consumed in sufficient quantity to

alter health (7, 14, 15). The various isomers of TFA may have different biological and physiological

effects in function of the length of the carbon chain, the number and the position of the carbon-carbon

double bonds. The trans-18:2 isomers seem more harmful for health than the trans-18:1 isomers

while the trans-16:1 isomers appeared to have no effect on risk factors for cardiovascular diseases

(8, 13, 16). Beside ingested TFA, there is also a possibility for TFA to be generated indirectly from

oxidative stress as shown by liposomes exposed to γ-radiation (17).

F2-isoprostanes (F2-isoPs) are reliable markers of oxidative stress that were associated to coronary

heart diseases (18, 19), hypercholesterolemia (20), inflammatory diseases (21), endothelial

dysfunctions (22, 23) and even pregnancy (24-27). The 8-iso-PGF2α has been the most studied

isomer so far (28). However, there exist more than 64 isomers of F2-isoPs divided into four classes of

regioisomers. They can be generated from the oxidation of arachidonic acid esterified to

phospholipids (29). F2-isoPs can be freed from phospholipids by the phospholipases A2 (PLA2) to

61

induce vasoconstriction in blood vessels (30, 31). The concomitant assessment of several F2-isoPs

can provide information on the balance between generation and elimination according to the

physiological state or the disorder studied (32-35).

The exact link between oxidative stress and TFA remains to be elucidated. However, we know that

TFA may elicit inflammation known to involve reactive oxygen species (ROS) (13, 16). Few controlled

dietary trials have been conducted in order to understand the link between TFA intake and levels of

urinary 8-iso-PGF2α. Generally, consumption of TFA was shown to increase excretion of the latter

(36-40). Urinary level of F2-isoPs is a good indicator of oxidative stress but rely on other factors such

as the rate of hydrolysis of F2-isoPs from phospholipids, their metabolism as well as their excretion

(41). However, valuable information could be obtained from the simultaneous analyses of the plasma

concentrations of several isomers of F2-isoPs.

Dietary intake of TFA can be estimated based on the TFA levels in plasma phospholipids (40, 42-45).

Thus, the aim of this study was to assess the relationship between the plasma concentrations of TFA

in phospholipids and the total (esterified + free) levels of several F2-isoPs isomers from women at the

third trimester of pregnancy, knowing that mild oxidative events have been shown to increase the

levels of 8-iso-PGF2α (24-27).

3.4. Material and methods

3.4.1. Materials

The 8-iso-15(R)-PGF2α, 8-iso-PGF2α, 8-iso-PGF2β, 11β-PGF2α, 15(R)-PGF2α, 5-trans-PGF2α, PGF2α,

iPF2α-IV, (±)5-iPF2α-VI, (±)5-8,12-iso-iPF2α-VI and their deuterated counterparts 8-iso-PGF2α-d4,

PGF2α-d4, iPF2α-IV-d4, iPF2α-VI-d4, (±)5-iPF2α-VI-d11, and (±)5-8,12-iso-iPF2α-VI-d11 were all

purchased from Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, USA). Butylated hydroxytoluene (BHT) was

bought from Sigma-Aldrich (Oakville, ON, Canada) and sodium chloride (ACS grade) was obtained

from Laboratoire Mat (Québec, QC, Canada). All other reagents and solvents were HPLC grade and

were purchased from VWR International (Ville Mont-Royal, QC, Canada).

62

3.4.2. Patient recruitment

Twenty-one normotensive (blood pressure ≤140/90 mm Hg) pregnant women were recruited at the

Centre Mère-Enfant du Centre Hospitalier Universitaire de Québec. The institution approved the

protocol and informed consents were obtained from all pregnant women. Exclusion factors were age

(<18 years old or > 40 years old), intake of anticoagulant drugs or drugs affecting lipid metabolism,

chronic hypertension, diabetes mellitus, obesity (body mass index > 30 prior to pregnancy), kidney

diseases, inflammatory intestinal diseases, blood clotting disorders and gestational diabetes.

3.4.3. Blood collection and processing

Twenty mL of blood were collected in heparinized tubes before the active phase of labor. The

processing of blood samples was made within 2 hours. Five hundred µL of whole blood was

immediately frozen on dry ice and kept at -80°C for further analysis. The remaining blood was

centrifuged at 180 x g for 10 minutes at 20°C. The supernatant (plasma) was recentrifuged at 1300 x

g for 25 min to remove platelets from plasma, which was kept at -80°C for further analyses.

3.4.4. F2-isoPs analysis by HPLC-MS/MS

The F2-isoPs were extracted from plasma using a modified version (46) of the method originally

described by Taylor (47). The HPLC-MS/MS analysis of F2-isoPs was described by us previously

(46). Briefly, the chromatography was carried out using a Shimadzu Prominence system (Columbia,

MD, USA) coupled to a 3200 QTRAP® LC/MS/MS system from AB Sciex (Concord, ON, Canada)

operated in the negative mode. A Kinetex XB-C18 100 Å column (100 x 3.0 mm, 2.6 µm) was used

preceded by a 4.0 x 2.0 mm C18 SecurityGuard Cartridges. Both were from Phenomenex (Torrance,

CA, USA). The injection volume was 40 µL. The separation was done using a gradient of 3 solvents

(water, acetonitrile and methanol, each containing 0.01 % (v/v) acetic acid) at a flow rate of 0.45

mL/min (46).

The class III F2-isoPs and their internals standards, 8-iso-PGF2α-d4 and PGF2α-d4 (class III-d4), were

monitored in the multiple-reaction monitoring (MRM) mode at the transitions 353.3 → 193.2 and

357.3 → 197.2 m/z respectively. The Class IV F2-isoPs and their internal standard, iPF2α-IV-d4 (class

IV-d4), were monitored at the transitions 353.3 → 127.0 and 357.0 → 127.0 m/z. Lastly, class VI F2-

isoPs and their internals standards, (±)5-iPF2α-VI-d11, and (±)5-8,12-iso-iPF2α-VI-d11 (class VI-d11),

63

were analyzed at the transitions 353.0 → 115.0 and 364.6 → 115.0 m/z respectively. Quantification

was performed using Analyst® 1.4.2 Software (AB Sciex).

3.4.5. Determination of plasma fatty acid profile by gas chromatography

Plasma fatty acids were isolated according to a method previously described (48). Briefly, a solution

of chloroform:methanol (2:1, by volume) was used to extract lipids from plasma. Then, phospholipids

were separated by thin layer chromatography using a mix of isopropyl ether:acetic acid (96:4) as

eluant and phospholipid fatty acids were methylated following a transesterification reaction using a

mix of methanol:benzene (4:1) and acetyl chloride. Methylated fatty acids were finally analysed by

gas chromatography coupled with a flame ionisation detector (GC-FID) as explained elsewhere (49).

3.4.6. Statistical analyses

Statistical analyses were performed with SigmaPlot 12.3 (Systat Software, Inc., 2011, San Jose,

USA). The normality was tested using the Shapiro-Wilk test. The Kruskal-Wallis one-way ANOVA

was used to compare levels of F2-isoPs and of fatty acids. All pairwise multiple comparisons were

done according to Student-Newman-Keuls’ method. The Spearman's rank correlation coefficient was

used to study relationship between variables. In all cases, a p-value lower than 0.05 was considered

significant and a p-value between 0.05 and 0.1 was considered a tendency.

3.5. Results

3.5.1. F2-isoPs in the plasma of pregnant women

The F2-isoPs from twenty-one women, retrieved at the end of their pregnancies before the active

phase of labor, were separated from plasma by liquid-liquid extraction and measured by HPLC-

MS/MS. The plasma median levels for 8-iso-15(R)-PGF2α, 8-iso-PGF2α, 15(R)-PGF2α, iPF2α-IV, iPF2α-

VI, 5-iPF2α-VI and 5-8,12-iso-iPF2α-VI are reported in table 1. The statistical analysis revealed that

class VI isomers are the most abundant (p < 0.05, Table 1) and (±)5-8,12-iso-iPF2α-VI is the most

abundant of all isomers. The 15(R)-PGF2α is the most abundant of the class III isomers quantified.

64

3.5.2. Analysis of plasma fatty acids

Determination of plasma phospholipid fatty acids profile was done by GC-FID. This method allowed

for the determination of a large number of fatty acids. The median concentrations of trans fatty acids

of interest and of their corresponding cis isomer are presented in Table 2. The cis isomers are

generally found in greater quantities than trans isomers except for the 7c-18:1 + 6c-18:1, which level

was about the same as the 6t-18:1 (p > 0.05). The 9c,12c-18:1 (linoleic acid) is the most abundant of

all unsaturated fatty acids measured while 9c-18:1 is the most abundant of all monounsaturated fatty

acids, representing respectively 36 and 18 % of total unsaturated fatty acids (data not shown).

Monounsaturated trans fatty acids (6t-18:1, 9t-18:1 and 11t-18:1) are present in greater amounts than

the trans isomers of linoleic acid (9c,12t-18:2, 9t,12c-18:2 and 9t,12t-18:2). Among the

aforementioned trans isomers of linoleic acid, only the concentration of 9c,12t-18:2 was high enough

to be detected in the pregnant women.

3.5.3. Relationship between F2-isoPs and trans fatty acids

Spearman's rank correlation coefficient was used to study relations between F2-isoPs and fatty acids

(Table 3) in plasma of healthy women at the third trimester of pregnancy. Many positive and

significant correlations were found between F2-isoPs isomers and trans fatty acids. A correlation was

found between the 6t-18:1 and the 8-iso-PGF2α (r = 0.456, p = 0.038) and strong tendencies for

similar correlations were also observed for this fatty acid with the 5-iPF2α-VI (r = 0.419, p = 0.058)

and with the (±)5-8,12-iso-iPF2α-VI (r = 0.426, p = 0.053) respectively. The 9t-18:1 correlated

positively with both, the 5-iPF2α-VI (r = 0.461, p = 0.035) and the (±)5-8,12-iso-iPF2α-VI (r = 0.483, p =

0.026). The 9c,12t-18:2 correlated with 15(R)-PGF2α (r = 0.576, p = 0.006), iPF2α-IV (r = 0.442, p =

0.045) and iPF2α-VI (r = 0.469, p = 0.032) respectively. Of note, no correlation was found between F2-

isoPs and cis fatty acids, the 11t-18:1 or with the 9t-16:1.

3.6. Discussion

We recruited twenty-one healthy women at third trimester of pregnancy and measured the total levels

of the seven F2-isoPs isomers in their blood plasma. The median level of 8-iso-PGF2α, the most

studied isomer, was 184 pg/mL of plasma. Literature values for total level of 8-iso-PGF2α in plasma

65

from healthy subjects ranged between 40 and 170 pg/mL (50, 51). This slightly higher level was

expected since pregnancy can be considered as a mild oxidative event (24-28, 46, 52). The class VI

isomers were the most abundant by two to three folds when compared to the 8-iso-PGF2α. We

reported similar results for the seven F2-isoPs isomers in pregnant women recently (46).

Fatty acids associated to plasma phospholipids were also measured for each of the pregnant women.

The plasma fatty acids profile is known to be influenced by dietary habits (43). The 9t-18:1/11t-18:1

index can be used to evaluate whether the diet is high in iTFA or in rTFA. This ratio is reduced by

high dairy fat intake (53). A previous study in lactating women demonstrated the effect of a change in

diet on the fatty acid composition in different plasma lipid fractions (44). Thus, when women

consumed more butter, the 9t-18:1/11t-18:1 index in phospholipids was 0.5. If they consumed low-

TFA margarine, this ratio was lowered at 0.23 but, if they consumed regular margarine (high-TFA),

this ratio rose to 0.78. In our cohort, the 9t-18:1/11t-18:1 index was 0.39. Taken together, these

results suggest that the women in our cohort had a diet rich in rTFA, and/or low in TFA (44).

We studied in depth the relation between the seven F2-isoPs isomers measured in plasma and the

fatty acids content from the plasma phospholipids. Several significant and positive correlations were

found, demonstrating a clear link between oxidative stress and TFA in vivo. However, not all

measured F2-isoPs isomers correlated with a given TFA. This shows the importance of measuring a

large number of F2-isoPs isomers. Also, this indicates that F2-isoPs formation and elimination in vivo

differs from one isomer to another. Many controlled dietary trials have shown a relation between 8-

iso-PGF2α and higher consumption of TFA (36, 38, 39). Indeed, one study showed a 20% increase in

the level of urinary 8-iso-PGF2α in healthy subjects after three weeks of diet rich in iTFA in

comparison to the control diet (36). In contrast, another report showed no effect for of a 16-week diet

containing iTFA on the level of urinary 8-iso-PGF2α in fifty-two healthy overweight postmenopausal

women (37). Two other studies using a 1:1 mixture of 11t-18:1 (rTFA) and 12t-18:1 supplemented to

the daily diet, over a 6-week or a 9-day period, showed an increased level of urinary 8-iso-PGF2α in

healthy subjects. However, it was not clear from which TFA isomer was associated to the increase of

8-iso-PGF2α (38, 39). A dietary intervention study done to understand the effect of 11t-18:1 showed

no differences on urinary 8-iso-PGF2α level among twenty-two young men receiving a test diet for 5

weeks compared to twenty young men receiving the control diet (40). These two diets differed by the

amount of 11t-18:1 and of the cis isomer, 9c-18:1. This difference may explain the apparent lack of

66

effect of a higher consumption of 11t-18:1 on the 8-iso-PGF2α level. The previously mentioned

studies were all done on a limited time period (from 9 days to 16 weeks) and did not investigate the

consequences of trans-16:1 and trans-18:2 isomers on oxidative stress. Therefore, the relation

between 11t-18:1 and oxidative stress in these studies remains unclear. Furthermore, only urinary 8-

iso-PGF2α was used as biomarker of oxidative stress. Its level may depend on other factors than

oxidative stress such as the rate of hydrolysis of 8-iso-PGF2α from phospholipids, its metabolism and

its excretion. In our study, plasma 8-iso-PGF2α correlated exclusively with 6t-18:1. The use of a single

biomarker of oxidative stress would not have properly assessed the link with TFA.

Our study has shown that each TFA is differentially linked to oxidative stress. Both, the 6t-18:1 and

the 9t-18:1 are iTFA related to oxidative stress in our cohort. This is in accordance with results

obtained by most of the dietary trials discussed earlier. The 9c,12t-18:2, a trans isomer of linoleic

acid, is the TFA that present a higher number of tendency or correlations with F2-isoPs isomers than

any other TFA. Thus, among all TFA considered in our study, the 9c,12t-18:2 is clearly associated

with oxidative stress despite its very low level in plasma phospholipids. The trans-18:2 isomers have

generally been associated with a higher relative risk of cardiovascular diseases than trans-18:1

isomers (8, 54) but their impact on oxidative stress was unknown before the present study.

The 9t-16:1 is not associated to markers of oxidative stress in our work. Most studies that have

questioned the effects of trans-16:1 on the risk of cardiovascular disease, systemic inflammation or

endothelial dysfunction have shown that these TFA had no adverse effects on health (8). The

oxidative stress and 11t-18:1 were not associated either in our study. It has first been believed that

rTFA, such as 11t-18:1, were not harmful. However, a clinical and controlled nutritional study has

shown that a high intake of rTFA by healthy men induced deleterious changes in their plasma lipid

profile, just like a high intake of iTFA, while a moderate intake of rTFA had no effect (14). Another 3-

week study performed in healthy subjects has shown that both industrial and natural TFA affected the

cardiovascular risk factors in a sex-specific manner (55). A significant elevation was observed in total,

LDL- and HDL-cholesterol exclusively in women consuming rTFA rather than iTFA. Thus, according

to these studies, rTFA can modify the lipid profile as well as iTFA. This likely may also affect oxidative

stress. It appeared that the pregnant women in our cohort did not consume an amount sufficient of

11t-18:1 to induce an oxidative stress even if the 11t-18:1 is the most abundant TFA measured.

67

Several studies have shown that high consumption of both industrial and natural TFA causes

oxidative stress and induces the formation of F2-isoPs as discussed earlier, but discrepancies

remains. This suggests that free radicals formed during a typical pregnancy are able to induce the

formation of TFA in vivo via cis-trans isomerization of their cis precursor. This specific phenomenon

of increased TFA has been observed in erythrocyte membranes and kidney of aged rats fed with food

containing no TFA and exposed to carbon tetrachloride, as an oxidative stress inducer (56). It has

also been demonstrated that trans-arachidonic acid may originate from the NO2-mediated AA

isomerization in human (57). An in vitro study has shown the competition between lipid peroxidation

and isomerization (17). This competition could explain, at least in part, why correlations are observed

between 9t-18:1 and F2-isoPs but not with 11t-18:1 in our work. The cis precursor of 9t-18:1, the 9c-

18:1, is the most abundant monounsaturated fatty acid measured in the plasma phospholipids of third

trimester pregnant women. It accounts for 8.55% of total fatty acids content while 11c-18:1 accounts

for only for 0.24%. Thus, the 9c-18:1 fatty acid is more likely to be isomerized by free radicals than

11c-18:1. Same observation can be drawn from 9c,12t-18:1, which precursor, linoleic acid (9c,12c-

18:2), is the most abundant of all unsaturated fatty acids in our cohort, accounting for 19.26% of total

fatty acids. Knowing that polyunsaturated fatty acids are more easily isomerized than

monounsaturated (58), a stronger link between 9c,12t-18:2 and F2-isoPs was expected. However,

according to the in vitro study showing the competition between lipid peroxidation and isomerization

(17), the major trans isomer of 9c,12c-18:2 formed in liposomes is 9t,12c-18:2. However, we did not

detect this specific isomer in our cohort, neither for the 9t,12t-18:2. This suggests that the in vivo

oxidative stress is more complex and differs from that induced in vitro by γ-irradiation.

In sum, this is the first in vivo demonstration of the link between the levels of TFA and oxidative

stress markers, F2-isoPs, in the plasma of normal third trimester pregnant women, a condition

involving a mild, but physiological oxidative stress. The dietary TFA found in biological membranes

can induce oxidative stress. Also, TFA can be formed in vivo by the oxidative stress since ROS

generated can react with the unsaturated fatty acids to cause either a cis-trans isomerization, or a

peroxidation reaction yielding to F2-isoPs. These two pathways most likely explained the link between

TFA and F2-isoPs in the present report. In perspective, it would be of interest to investigate the profile

of the F2-isoPs isomers in pathophysiological conditions involving much higher oxidative challenges,

such as hypertension, preeclampsia and diabetes.

68

3.7. Acknowledgments

The authors would like to thank Ms. Line Berthiaume and M. François Cadelis for their help with the

extraction of fatty acids. This work was supported by a grant from the Canadian Institutes of Health

research (CIHR, grant# MOP-84219 to J.-F.B). Jessica Larose is a recipient of a Fonds de

Recherche en Santé du Québec (FRSQ) award.

3.8. References

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75

Table 1. F2-isoprostanes in the plasma of third trimester pregnant women.

Isoprostanes levels1

(pg/ml plasma)

Class III

8-iso-15(R)-PGF2α 173 [143, 760]a

8-iso-PGF2α 184 [149, 537]a

15(R)-PGF2α 322 [250, 1724]b

Class IV

iPF2α-IV 132 [98, 957]a

Class VI

iPF2α-VI 402 [330, 3885]c

5-iPF2α-VI 335 [241, 5594]d

(±)5-8,12-iso-iPF2α-VI 766 [480, 2440]e


Medians with different superscript letters (a-e) are statistically different (Kruskal-Wallis test followed

by Student-Newman-Keuls, p < 0.05).

76

Table 2. Fatty acids of interest in plasma of third trimester pregnant women.

Fatty acids levels 1

(µg/mL plasma) (%)

Total trans fatty acids2 15.25 [12.40, 19.16] 0.90

9t-16:1 2.93 [2.24, 3.49]a 0.16

6t-18:1 4.36 [2.42, 5.05]b 0.26

9t-18:1 2.11 [1.40, 2.97]c 0.11

11t-18:1 5.40 [3.79, 6.77]d 0.30

9c,12t-18:2 1.72 [1.38, 1.90]e 0.08

9t,12c-18:2 n.d. n.d.

9t,12t-18:2 n.d. n.d.

Total cis fatty acids3 916.87 [876.43, 1003.23] 51.78

9c-16:1 10.26 [8.58, 15.27]f 0.61

7c-18:1 + 6c-18:1 3.87 [3.07, 5.23]b 0.23

9c-18:1 168.49 [151.91, 182.95]g 8.55

11c-18:1 23.74 [21.58, 26.02]h 0.24

9c,12c-18:2 340.83 [304.29, 374.75]i 19.26


Medians with different superscript letters (a-i) are statistically different (Kruskal-Wallis test followed by

Student-Newman-Keuls, p < 0.05).

n.d. = not detected.

2Total trans fatty acids = 9t-14:1 + 9t-16:1 + 6t-18:1 + 9t-18:1 + 11t-18:1 + 9t,12t-18:2 + 9t,12c-18:2 +

9c,12t-18:2 + 9t,12t,15t-18:3

3Total cis fatty acids = 9c-14:1 + 9c-16:1 + (7c-18:1 + 6c-18:1; coelution) + 9c-18:1 + 11c-18:1 + 12c-

18:1 + 13c-18:1 + 9c,12c-18:2 + 6c,9c,12c-18:3 + 9c,12c,15c-18:3 + 8c-20:1 + 11c-20:1 +

6c,9c,12c,15c-18:4 + 11c,14c-20:2 + 8c,11c,14c-20:3 + 11c,14c,17c-20:3 + 5c,8c,11c,14c-20:4 +

13c-22:1 + 8c,11c,14c,17c-20:4 + 13c,16c-22:2 + 5c,8c,11c,14c,17c-20:5 + 13c,16c,19c-22:3 + 15c-

24:1 + 7c,10c,13c,16c-22:4 + 4c,7c,10c,13c,16c-22:5 + 7c,10c,13c,16c,19c-22:5 +

4c,7c,10c,13c,16c,19c-22:6

77

Table 3. Correlations between F2-isoprostanes and trans fatty acids in plasma of third trimester pregnant women.

9t-16:1 6t-18:1 9t-18:1 11t-18:1 9c,12t-18:2

8-iso-15(R)-PGF2α ns ns ns ns r = 0.394

(p = 0.076)

8-iso-PGF2α ns r = 0.456

(p = 0.038*) ns ns

r = 0.404

(p = 0.068)

15(R)-PGF2α ns r = 0.395

(p = 0.075) ns ns

r = 0.576

(p = 0.006*)

iPF2α-IV ns ns ns ns r = 0.442

(p = 0.045*)

iPF2α-VI ns ns ns ns r = 0.469

(p = 0.032*)

5-iPF2α-VI ns r = 0.419

(p = 0.058)

r = 0.461

(p = 0.035*) ns

r = 0.419

(p = 0.058)

(±)5-8,12-iso-iPF2α-VI ns r = 0.426

(p = 0.053)

r = 0.483

(p = 0.026*) ns

r = 0.397

(p = 0.074)

Values (r) are Spearman correlation coefficients (n=21).

ns = non-significant (p > 0.1).

*p < 0.05 is considered significant. 0.05 < p < 0.1 is considered a tendency.

79

Chapitre 4 – Étude du stress oxydatif en

prééclampsie

4.1. Introduction

La prééclampsie est un syndrome complexe de la grossesse caractérisé par une tension artérielle

élevée (pression diastolique > 90 mm Hg) et par la présence de protéines dans l’urine (protéinurie;

plus de 0.3 g de protéines par jour dans un échantillon d’urine collecté sur 24h) [131]. Elle complique

entre 3 et 5 % des grossesses dans le monde et est une cause majeure de mortalité et de morbidité

maternelle et fœtale [133]. Bien que les causes exactes de ce syndrome sont inconnues, un modèle

en deux étapes a été proposé pour expliquer sa physiopathologie [181]. La placentation inadéquate

entraine le rejet par le placenta de plusieurs facteurs pouvant induire la dysfonction de l’endothélium

maternel, ce qui conduit à l’apparition des symptômes caractéristiques à la prééclampsie après la 20e

semaine de grossesse. Le stress oxydatif semble jouer un rôle central dans l’évolution de ce

désordre [148].

Plusieurs biomarqueurs ont été utilisés afin d’étudier le stress oxydatif dans le contexte de la

prééclampsie et selon ces biomarqueurs, la prééclampsie est associée à un stress oxydatif plus

important qu’ au cours d’une grossesse normale [140]. Depuis quelques années, les F2-isoprostanes,

des produits de la peroxydation de l’acide arachidonique, sont reconnus comme étant les

biomarqueurs les plus fiables du stress oxydatif [88]. Le niveau de 8-iso-PGF2α a été mesuré dans le

placenta, le plasma, l’urine et la salive de femmes ayant une grossesse prééclamptique et comparé à

celui mesuré chez des femmes ayant une grossesse normotensive sans complications [166-171,

173-179]. En général, le niveau de 8-iso-PGF2α libre dans le plasma est plus élevé en prééclampsie

[166, 169-171, 173, 174]. Cependant, les résultats concernant le niveau total (libre + estérifié) de cet

isomère dans le plasma diffèrent d’une étude à l’autre. Une étude a démontré que ce niveau est plus

élevé en prééclampsie alors qu’une autre n’a trouvé aucune différence significative entre les deux

groupes [166, 179]. Enfin, une seule équipe s’est attardée à mesurer un autre F2-isoprostane que le

8-iso-PGF2α. En effet, Regan et al. ont mesuré le 8,12-iso-iPF2α-VI dans des échantillons d’urine de

femmes prééclamptiques et normales obtenus à différents moments de la grossesse, mais ils n’ont

pas trouvés de différences significatives entre les deux groupes [180].

80

Aucune étude n’a mesuré d’autres F2-isoprostanes que le 8-iso-PGF2α dans le plasma, le sang total

et les membranes érythrocytaires en prééclampsie. Le but de la présente étude était donc de

mesurer simultanément par HPLC-MS/MS le niveau total (libre + estérifié aux phospholipides) de

sept isomères de F2-isoprostanes dans ces trois matrices chez des femmes au troisième trimestre

d’une grossesse normale ou prééclamptique.

4.2. Matériel et méthode

4.2.1. Matériel

Le matériel utilisé était le même que celui du chapitre 2 (section 2.4.1, page 39).

4.2.2. Sélection des patientes

Les patientes au troisième trimestre d’une grossesse normale ont été recrutées selon les mêmes

critères que ceux énoncés dans le chapitre 2. Les patientes au troisième trimestre d’une grossesse

prééclamptique ont été sélectionnées selon les critères énoncés dans le rapport de la Canadian

Hypertension Society Consensus Conference (pression diastolique > 90 mm Hg et plus de 0.3 g de

protéines par jour dans un échantillon d’urine collecté sur 24h) [131]. Les patientes prééclamptiques

avec les conditions médicales préexistantes suivantes ont été exclues : obésité, hypertension

chronique, diabète, maladies du rein, maladies inflammatoires chroniques intestinales, troubles de la

coagulation sanguine. Les femmes ayant d’autres complications de la grossesse ont également été

exclues. Les autres facteurs d’exclusions étaient l’âge (< 18 ans ou > 40 ans), la prise de

médicaments anticoagulants ou encore affectant le métabolisme des lipides. Les échantillons ont été

prélevés avant la phase active du travail. Les caractéristiques des patientes au moment du

recrutement ont été publiées dans l’article de Roland et al. [182].

4.2.3. Récolte et traitement des échantillons de sang

Voir le chapitre 2 (section 2.4.3, page 40).

81

4.2.4. Préparation des standards pour l’analyse des F2-isoprostanes

La solution de standard interne, la solution stock et les solutions de travail ont été préparées comme

dans le chapitre 2 (section 2.4.4, page 40). La courbe standard et les contrôles de qualité pour la

mesure des F2-isoprostanes dans le plasma ont été dilués comme ceci : 10 µL de solution de travail,

10 µL de solution de standard interne et 80 µL d’eau contenant 10% (v/v) d’acétonitrile et 0.01 %

(v/v) d’acide acétique. La courbe standard et les contrôles de qualité pour la mesure des F2-

isoprostanes dans les membranes érythrocytaires et le sang total ont été dilués comme ceci : 10 µL

de solution de travail, 6 µL de solution de standard interne et 94 µL d’eau contenant 10% (v/v)

d’acétonitrile et 0.01 % (v/v) d’acide acétique.

4.2.5. Extraction des F2-isoprostanes totaux contenus dans le plasma

Voir le chapitre 2 (section 2.4.5, page 40).

4.2.6. Extraction des membranes érythrocytaires

À 250 µL de sang total a été ajouté 10 µL d’une solution de BHT (1 % dans l’éthanol) et 750 µL de

H2O HPLC. Les échantillons ont été mélangés au vortex et après 5 minutes d’attente, ils ont été

centrifugés à 21 000 g pendant 15 minutes. Ensuite, le surnageant a été jeté et 1 mL d’une solution

de NaCl 0.9 % (m/v) a été ajouté à l’échantillon. Celui-ci a été mélangé de nouveau puis centrifugé à

21 000 g pendant 12 minutes. Ce lavage avec la solution de NaCl a été refait une autre fois. À la fin,

le surnageant a été éliminé et 250 µL d’H2O HPLC ont été ajoutés aux membranes. L’échantillon

final a été congelé à -20°C jusqu’à l’extraction des F2-isoprostanes totaux.

4.2.7. Extraction des F2-isoprostanes totaux contenus dans les membranes érythrocytaires

La méthode d’extraction des F2-isoprostanes totaux contenus dans les membranes érythrocytaires

était très semblable à celle utilisée pour le plasma. Au lieu du 250 µL de plasma, la totalité de

l’échantillon obtenu suite à l’extraction des membranes érythrocytaires a été utilisée. Par contre,

comme la solution de BHT a été ajoutée avant cette extraction, celle-ci n’a pas été rajoutée. De plus,

6 µL de solution de standard interne ont été utilisés au lieu de 10 µL.

82

4.2.8. Extraction des F2-isoprostanes totaux contenus dans le sang total

La méthode d’extraction des F2-isoprostanes totaux contenus dans le sang total était très semblable

à celle utilisée pour le plasma. Par contre, lors de la préparation initiale de l’échantillon, 350 µL d’eau

ont été utilisés au lieu de 250 µL, 6 µL de solution de standard interne au lieu de 10 µL et 150 µL de

sang ont été utilisés au lieu de 250 µL de plasma. Ensuite, l’extraction avec l’hexane n’a été faite

qu’une seule fois au lieu de deux fois pour le plasma. Après la reconstitution de l’échantillon avec

100 µL d’eau contenant 10% (v/v) d’acétonitrile et 0.01 % (v/v) d’acide acétique, celui-ci a été filtré

grâce à des Nanosep MF GHP 0.45 µm (VWR International, Ville Mont-Royal, QC, Canada).

4.2.9. Analyse des F2-isoprostanes par HPLC-MS/MS

L’analyse des F2-isoprostanes par HPLC-MS/MS dans les trois matrices biologiques (plasma,

membranes érythrocytaires et sang total) a été faite selon la même méthode que celle décrite dans le

chapitre 2 (section 2.4.6, page 41 et section 2.4.7, page 41).

4.2.10. Analyses statistiques

Les analyses statistiques ont été faites grâce au logiciel SigmaPlot 12.3 (Systat Software, Inc., 2011,

San Jose, USA). La normalité a été testée selon la méthode Shapiro-Wilk. Les niveaux de F2-isoPs

ont été comparés à l’aide d’un ANOVA (Kruskal-Wallis) suivi du test de Student-Newman-Keuls pour

les comparaisons multiples. La comparaison entre les deux groupes (NOR et PE) pour un isomère

donné a été faite selon le test de Mann-Whitney. P < 0.05 est considéré comme étant significatif et

0.05 < P < 0.1 est considéré comme étant une tendance.

4.3. Résultats

4.3.1. F2-isoprostanes dans le plasma

Les résultats obtenus suite au dosage du niveau total de chacun des sept F2-isoprostanes dans le

plasma des femmes au troisième trimestre d’une grossesse normotensive ou prééclamptique sont

résumés dans le tableau 1 du présent chapitre. Les isomères de la classe VI sont les plus abondants

de tous les isomères dosés par la méthode dans les deux groupes et l’isomère le plus abondant de

83

tous est le (±)5-8,12-iso-iPF2α-VI. Le 8-iso-15(R)-PGF2α, le 8-iso-PGF2α et l’iPF2α-IV sont

significativement moins abondants dans le plasma des femmes prééclamptiques que dans le plasma

des femmes normotensives (P < 0.05). Il n’y a pas de différences significatives entre les deux

groupes pour le iPF2α-VI, le 5-iPF2α-VI et le (±)5-8,12-iso-iPF2α-VI.

Tableau 1. F2-isoprostanes totaux mesurés dans le plasma au troisième trimestre de grossesses normotensives ou prééclamptiques.

F2-isoprostanes (pg/mL plasma)1 P-value2

NOR (n = 22) PE (n = 19)

Classe III 8-iso-15(R)-PGF2α 173 [143, 760]a 144 [122, 162]a 0.012

8-iso-PGF2α 184 [149, 537]a 154 [135, 182]a 0.024

15(R)-PGF2α 322 [250, 1724]a 291 [255, 326]b 0.097

Classe IV iPF2α-IV 132 [98, 957]a 85 [80, 119]c 0.005

Classe VI iPF2α-VI 402 [33, 3885]b 368 [324, 433]d Ns

5-iPF2α-VI 335 [241, 5594]c 285 [232, 387]b Ns

(±)5-8,12-iso-iPF2α-VI 766 [480, 2440]d 608 [535, 833]e Ns

NOR : femmes normotensives; PE : femmes prééclamptiques; Ns : non significatif.

1Les valeurs sont exprimées en médiane et quartiles [Q1, Q3]. Dans une colonne, les médianes avec des lettres différentes en exposant sont statistiquement différentes (Kruskal-Wallis ANOVA à un facteur suivi d’un Student-Newman-Keuls à posteriori pour les comparaisons multiples, P < 0.05).

2Comparaison entre NOR et PE avec le test de Mann-Whitney. P < 0.05 est considéré comme étant significatif et 0.05 < P < 0.1 est considéré comme étant une tendance.

4.3.2. F2-isoprostanes dans le sang

Le tableau 2 du présent chapitre présente le niveau total de chacun des sept F2-isoprostanes dosés

dans le sang entier des femmes au troisième trimestre d’une grossesse normotensive ou

prééclamptique. Comme dans le plasma, les isomères de la classe VI sont les plus abondants de

tous les isomères dosés par la méthode dans les deux groupes. Le 15(R)-PGF2α est également très

abondant dans le sang entier. Il est aussi abondant que le (±)5-8,12-iso-iPF2α-VI dans les deux

groupes (NOR ou PE). Cinq F2-isoprostanes sur sept ont une concentration significativement plus

faible dans le sang entier des femmes prééclamptiques que dans le sang des femmes normotensives

(P < 0.05). Le niveau du 8-iso-PGF2α et le niveau du (±)5-8,12-iso-iPF2α-VI ne diffèrent pas entre les

deux groupes.

84

Tableau 2. F2-isoprostanes totaux mesurés dans le sang entier au troisième trimestre de grossesses normotensives et prééclamptiques.

F2-isoprostanes (pg/mL sang)1 P-value2

NOR (n = 25) PE (n = 25)

Classe III 8-iso-15(R)-PGF2α 606 [537, 803]a 530 [496, 632]a 0.014

8-iso-PGF2α 498 [461, 727]b 500 [456, 543]b Ns

15(R)-PGF2α 1537 [1386, 2417]c 1416 [1309, 1590]c 0.046

Classe IV iPF2α-IV 253 [241, 360]d 235 [216, 270]d 0.007

Classe VI iPF2α-VI 1016 [900, 1317]e 966 [516, 1044]e 0.048

5-iPF2α-VI 1139 [996, 1854]f 1009 [850, 1176]f 0.009

(±)5-8,12-iso-iPF2α-VI 1550 [1375, 2828]c 1520 [1400, 1764]c Ns




4.3.3. F2-isoprostanes dans les membranes érythrocytaires

Le tableau 3 du présent chapitre présente le niveau total de chacun des sept F2-isoprostanes dosés

dans les membranes érythrocytaires des femmes au troisième trimestre d’une grossesse

normotensive ou prééclamptique. Dans cette matrice biologique, la seule différence significative

observée entre les deux groupes est pour le 15(R)-PGF2α, lequel est significativement plus faible en

prééclampsie (P < 0.05). La concentration de deux isomères de la classe VI, c’est-à-dire du 5-iPF2α-

VI et du (±)5-8,12-iso-iPF2α-VI, tend à être plus faible chez les femmes prééclamptiques (0.05 < P <

0.1).

85

Tableau 3. F2-isoprostanes totaux mesurés dans les membranes érythrocytaires au troisième trimestre de grossesses normotensives et prééclamptiques.

F2-isoprostanes (pg/mL sang)1 P-value2

NOR (n = 24) PE (n = 27)

Classe III 8-iso-15(R)-PGF2α 152 [142, 163]a 142 [123, 160]a Ns

8-iso-PGF2α 187 [162, 198]b 175 [160, 202]b Ns

15(R)-PGF2α 332 [307, 363]c 310 [278, 335]c 0.014

Classe IV iPF2α-IV 126 [112, 135]d 122 [96, 134]d Ns

Classe VI iPF2α-VI 239 [219, 254]e 224 [204, 237]e Ns

5-iPF2α-VI 237 [211, 256]e 220 [196, 237]f 0.081

(±)5-8,12-iso-iPF2α-VI 352 [309, 385]c 336 [294, 368]g 0.072




4.4. Discussion

Dans la présente étude, les niveaux totaux (libre + estérifié aux phospholipides) de sept isomères de

F2-isoprostanes ont été mesurés par HPLC-MS/MS dans le plasma, le sang entier et les membranes

érythrocytaires de femmes au troisième trimestre d’une grossesse normale ou prééclamptique. Le 8-

iso-PGF2α est l’isomère le plus utilisé pour étudier le stress oxydatif in vivo. La concentration médiane

du 8-iso-PGF2α mesurée dans les échantillons de plasma provenant des femmes normotensives de

notre cohorte était de 184 pg/mL. Cette valeur est légèrement plus faible que celle de 218 pg/mL

rapportée par Harsem et al. en 2006 pour les femmes normotensives de leur cohorte [183]. Cette

équipe a mesuré le niveau total de 8-iso-PGF2α par GC-MS, une méthode moins sélective que le

HPLC-MS/MS. Cela peut expliquer pourquoi notre mesure est légèrement plus faible [104]. La

concentration médiane du 8-iso-PGF2α dans le sang entier et dans les membranes érythrocytaires

des femmes normotensives de notre cohorte étaient respectivement de 498 pg/mL et 187 pg/mL.

Très peu d’études ont mesuré cet isomère dans ces deux matrices et aucune ne l’a fait dans le cadre

de la grossesse. Bastani et al. ont utilisé la méthode HPLC-MS/MS qu’ils ont mise au point pour

86

mesurer la concentration totale du 8-iso-PGF2α dans le plasma, le sang entier et les membranes

érythrocytaires de sujets en santé. Les concentrations rapportées pour le sang entier varient entre 1

et 2 ng/mL alors que celles rapportées pour les membranes varient entre 0.4 et 1.1 ng/mL. Bien que

ces mesures soient plus élevées que les nôtres, il est difficile de comparer notre étude à la leur

puisqu’ils ne donnent aucun détail sur les sujets ayant fourni les échantillons. Enfin, il n’est pas

possible de comparer avec la littérature nos mesures pour les autres isomères de F2-isoprostanes

dosés par notre méthode à cause du manque de données disponibles pour le plasma, le sang total et

les membranes érythrocytaires.

Le but de la présente étude a été de caractériser le stress oxydatif en prééclampsie. Selon l’isomère

de F2-isoprostane et la matrice biologique étudiée dans notre cohorte, soit il n’y a pas de différence

significative observée entre les femmes normotensives et prééclamptiques, soit les femmes

prééclamptiques ont un niveau significativement plus faible de F2-isoprostanes. Le stress oxydatif

serait donc moins important chez les femmes prééclamptiques que chez les femmes normotensives

dans notre cohorte. Ces résultats sont très étonnants sachant que la prééclampsie a été associée à

un stress oxydatif plus important qu’au cours d’une grossesse normotensive [139]. Les équipes qui

ont mesuré le stress oxydatif grâce au 8-iso-PGF2α libre dans le plasma ont généralement démontré

un niveau plus élevé en prééclampsie [166, 169-171, 173, 174]. Cependant, lorsque c’est le niveau

plasmatique total du 8-iso-PGF2α qui est mesuré, les résultats sont moins concordants. Une étude a

démontré que ce niveau est plus élevé en prééclampsie alors qu’une autre n’a trouvé aucune

différence significative entre les deux groupes [166, 179]. Malgré ces divergences, nos résultats sont

à l’opposé de ce qui a déjà été publié. Cette divergence pourrait provenir d’une réponse antioxydante

différente en prééclampsie spécifique à notre cohorte. En effet, à cause de sa nature hydrophobe, la

vitamine E est retrouvée dans les membranes lipidiques qu’elle protège contre la peroxydation. C’est

ainsi un antioxydant très efficace. La concentration totale de vitamine E a été mesurée dans le

plasma des femmes de notre cohorte [182]. Les femmes prééclamptiques ont une concentration plus

élevée de vitamine E plasmatique que les femmes normotensives. Cette différence pourrait expliquer

pourquoi les F2-isoprostanes sont moins élevés en prééclampsie dans notre cohorte.

En résumé, sept isomères de F2-isoprostanes ont été mesurés dans trois matrices biologiques

provenant de femmes au troisième trimestre d’une grossesse normale ou prééclamptique. Les

concentrations obtenues pour le 8-iso-PGF2α chez les femmes normotensives sont comparables à ce

87

qui a déjà été publié dans la littérature. Cependant, les femmes prééclamptiques ont un niveau plus

faible de F2-isoprostanes que les femmes normotensives et ce peu importe la matrice biologique

étudiée. Comme la vitamine E totale plasmatique est augmentée en prééclampsie dans notre

cohorte, il est probable qu’un mécanisme compensatoire ait été mis en place pour diminuer le stress

oxydatif associé à ce syndrome [182].

4.5. Bibliographie

Voir la bibliographie générale à la page 97.

89

Chapitre 5 – Discussion générale

Les dérivés actifs de l’oxygène (ROS) jouent des rôles essentiels dans les conditions physiologiques

normales. En effet, ils agissent comme seconds messagers dans différentes voies de signalisation

[2, 3] et ils sont impliqués dans la défense immunitaire [4]. Des antioxydants enzymatiques et non

enzymatiques contrôlent la concentration de ces molécules hautement réactives afin de limiter les

dommages qu’elles pourraient causer aux biomolécules environnantes. Cependant, lorsque les

défenses antioxydantes de l’organisme ne sont pas suffisantes pour accomplir cette tâche ou lorsqu’il

y a surproduction de ROS par rapport à celles-ci, l’organisme subit un stress oxydatif. Le stress

oxydatif a été associé à la physiopathologie de nombreuses maladies (ex. : maladies

cardiovasculaires, maladies inflammatoires, maladies pulmonaires, maladies neurodégénératives,

prééclampsie, etc.) [8]. Il est également impliqué dans le processus du vieillissement ainsi que dans

certaines situations physiologiques normales comme la grossesse [6, 7].

Afin d’étudier le stress oxydatif in vivo, l’usage de biomarqueurs est essentiel. Pendant longtemps, le

biomarqueur le plus utilisé a été le malondialdehyde (MDA). Depuis quelques années, les F2-

isoprostanes sont reconnus comme étant les biomarqueurs les plus fiables du stress oxydatif [88]. Il

existe 64 isomères de F2-isoprostanes issus de la peroxydation de l’acide arachidonique estérifié aux

phospholipides. L’isomère le plus étudié jusqu’à maintenant est le 8-iso-PGF2α. Ce dernier a été

mesuré dans de nombreuses matrices biologiques afin de comprendre l’implication du stress oxydatif

dans la physiopathologie de nombreuses maladies [8]. Son métabolisme ainsi que ses effets

biologiques ont également été étudiés [99, 111-117]. Cependant, très peu d’informations sont

disponibles au sujet des autres isomères de F2-isoprostanes. Ceux-ci peuvent avoir un métabolisme

différent du 8-iso-PGF2α et ce métabolisme peut différer selon la maladie étudiée. L'analyse

simultanée de plusieurs isomères de F2-isoprostanes permettrait de mieux caractériser le stress

oxydatif associé à des pathologies spécifiques.

Dans le cadre de mon projet de maîtrise, j’ai développé et validé une méthode d’analyse par

chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem (HPLC-MS/MS) permettant

le dosage simultané de plusieurs F2-isoprostanes. Cette technique offre de nombreux avantages par

rapport aux autres techniques couramment utilisées pour le dosage de ces molécules.

90

Premièrement, le HPLC-MS/MS offre une meilleure spécificité que la chromatographie gazeuse

couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS) pour l’analyse de ces molécules. En effet, bien que

les méthodes utilisant le GC-MS soient très sensibles, celles-ci ne permettent pas d’analyser

séparément les quatre classes de F2-isoprostanes. Tous les F2-isoprostanes ont la même masse

moléculaire et cela les empêche d’être discriminés dans un spectromètre de masse avec un seul

filtre à ions (simple MS). Certaines équipes ont mis au point des techniques utilisant la

chromatographie gazeuse couplée à la spectrométrie de masse en tandem (GC-MS/MS) pour pallier

ce problème [105, 106]. En effet, les quatre classes de F2-isoprostanes ont un comportement

différent dans un tel instrument (MS/MS). La spectrométrie de masse en tandem consiste à

sélectionner un ion dans un premier temps, à le fragmenter dans une cellule de collision, puis à

sélectionner et analyser un des fragments générés. Tous les F2-isoprostanes ont le même

comportement dans le premier filtre à ions, mais les quatre classes fragmentent différemment dans la

cellule de collision. Cette propriété permet ainsi de générer des fragments spécifiques aux quatre

classes de régioisomères de F2-isoPs. Cependant, même si l’utilisation d’un spectromètre de masse

en tandem améliore la spécificité de l’analyse, la chromatographie gazeuse ne parvient pas à

résoudre certains isomères à l’intérieur d’une même classe. Ainsi, le 8-iso-PGF2α et le 8-iso-15(R)-

PGF2α coéluent si le GC-MS est utilisé alors que ces deux isomères sont facilement résolus par

HPLC-MS/MS [107, 184]. Un deuxième avantage de l’utilisation du HPLC-MS/MS pour le dosage des

F2-isoprostanes est que le traitement des échantillons est beaucoup plus simple et rapide que celui

nécessaire pour à une analyse GC-MS. Pour être analysées pas GC-MS, les molécules doivent être

volatiles, ce qui n’est pas le cas des F2-isoprostanes. Une dérivation chimique est donc essentielle

pour rendre ces molécules volatiles. Finalement, les F2-isoprostanes peuvent être mesurés grâce à

des méthodes immuno-enzymatiques (ELISA) [109] et radio-immunologiques (RIA) [110]. Ces

méthodes ne nécessitent pas l’utilisation d’instruments dispendieux comme le HPLC-MS/MS, mais

elles ne permettent le dosage de plusieurs isomères de F2-isoprostanes et leur spécificité pour

l’isomère dosé est couramment remise en doute à cause des réactions croisées possibles des

anticorps avec des molécules apparentées [107].

La chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem a recourt à deux

procédés pour le dosage spécifique des F2-isoprostanes. Comme expliqué précédemment, le

spectromètre de masse en tandem permet l’analyse séparée des quatre classes de F2-isoprostanes.

La colonne chromatographique permet quant à elle de séparer les isomères à l’intérieur d’une même

91

classe. Afin de développer la méthode HPLC-MS/MS la plus spécifique possible pour le dosage

simultané de plusieurs F2-isoprostanes, j’ai testé plusieurs colonnes dont des colonnes de type C8 et

C18. Plus particulièrement, j’ai comparé deux types de colonne C18 ayant les mêmes dimensions

(diamètre interne: 3 mm, longueur : 100 mm). La différence principale entre celles-ci se situe au

niveau des particules. La colonne Shimpack XR-ODS est remplie de particules totalement poreuses

ayant un diamètre de 2.2 µm alors que la colonne Kinetex XB-C18 est remplie de particules

partiellement poreuses ayant un diamètre de 2.6 µm. Les particules partiellement poreuses rendent

la colonne Kinetex beaucoup plus efficace que la colonne Shimpack [185]. Plus une colonne est

efficace, plus elle est capable de résoudre deux composés ayant des propriétés chromatographiques

semblables. Ainsi l’utilisation de la Kinetex a permis la résolution du iPF2α-VI et du 5-iPF2α-VI alors

que ces deux composés coéluent si la colonne Shimpack est utilisée. Le 5-trans-PGF2α a également

pu être séparé du 15(R)-PGF2α. J’ai donc utilisé la colonne Kinetex XB-C18 (3 x 100 mm, 2.6 µm)

pour optimiser la chromatographie des F2-isoprostanes et la méthode d’analyse finale est décrite

dans le chapitre 2. De nombreuses méthodes ont déjà été publiées pour l’analyse des F2-

isoprostanes par HPLC-MS/MS, mais celle que j’ai mise au point est la première à utiliser une

colonne remplie avec des particules partiellement poreuses [107, 186-189]. L’efficacité de la colonne

Kinetex est telle qu’il serait possible d’utiliser une version plus courte de celle-ci tout en conservant

une résolution acceptable des F2-isoprostanes. Cela aurait pour effet d’augmenter la sensibilité et la

rapidité de la méthode d’analyse.

Le deuxième objectif qui a été fixé dans le cadre de mon projet de maîtrise était de mesurer les F2-

isoprostanes totaux (estérifiés aux phospholipides + libres) dans le plasma de femmes au troisième

trimestre d’une grossesse normale à l’aide de la méthode HPLC-MS/MS que j’ai mise au point. Le

but était de s’assurer du bon fonctionnement général de la méthode. Les résultats figurent dans le

chapitre 2. J’ai ensuite voulu étudier la relation entre les F2-isoprostanes et les acides gras trans

mesurés dans les mêmes échantillons de plasma. En effet, les acides gras trans peuvent provoquer

un stress oxydatif in vivo et le stress oxydatif peut induire la formation d’acides gras trans [22, 69].

Les résultats de cette étude figurent dans le chapitre 3. Des corrélations positives entre certains F2-

isoprostanes et certains acides gras trans ont été détectées dans le plasma de femmes ayant eu une

grossesse sans complications, ce qui confirme notre hypothèse de départ.

92

Les gras trans sont néfastes pour la santé. De nombreuses études ont démontré que la

consommation d’une grande quantité de TFA augmente les risques de maladies cardiovasculaires

[62-68]. Ils altèrent le profil lipidique du sang, ils modifient le niveau d’apolipoprotéines, ils provoquent

une réponse inflammatoire systémique ainsi que la dysfonction de l’endothélium. De plus, ils sont

susceptibles d’induire un stress oxydatif [69]. Certains groupes se sont également intéressés à

connaître l’impact des gras trans sur la grossesse. Une étude publiée en 1998 a démontré qu’une

concentration plus élevée d’acide élaïdique (9t-18:1) dans les membranes érythrocytaires est

associée à un risque plus grand de prééclampsie [190]. Cette étude a été faite sur une petite cohorte

et les résultats obtenus seraient à confirmer. Une autre équipe a démontré en 2007 qu’une plus

grande consommation de TFA au cours du premier trimestre de grossesse n’augmente pas le risque

de développer de l’hypertension gestationnelle ou une prééclampsie [191]. Enfin, le risque de faire du

diabète gestationnel n’est pas affecté par une plus grande consommation de TFA avant ou pendant

le premier trimestre de grossesse [192, 193]. Bref, les gras trans ne semblent pas avoir beaucoup

d’impacts sur la grossesse même si leur niveau est inversement relié à la durée de la gestation [194].

Par contre, il a été démontré qu’ils ont un impact négatif sur le développement et la croissance du

fœtus. En effet, il existe une relation inverse entre l’exposition du fœtus aux TFA et son poids à la

naissance [195, 196]. Un bébé ayant un petit poids à la naissance est plus à risque de développer

des maladies cardiovasculaires et du diabète à l’âge adulte. Il est aussi plus à risque de devenir

obèse [197-201]. De plus, une grande concentration de TFA dans les phospholipides des

membranes érythrocytaires maternelles est associée à une diminution de la concentration d’acide

docosahexaénoïque (DHA) et d’acide arachidonique (AA) dans ces mêmes lipides, deux acides gras

clés dans le développement du fœtus [202]. Les TFA inhibent aussi la conversion de l’acide

linoléique (LA) en AA et celle de l’acide alpha linolénique (ALA) en DHA [203]. Le DHA est

particulièrement important pour le développement du système nerveux central du fœtus [204, 205].

D’ailleurs, les nouveau-nés ayant un niveau sanguin de DHA relativement faible et ceux qui ont des

niveaux élevés d'acide gras trans ont une condition neurologique moins favorable à 18 mois [206].

Le dernier objectif qui a été fixé dans le cadre de mon projet de maîtrise a été de caractériser le

stress oxydatif en prééclampsie. Dans ce but, le niveau total (libre + estérifié aux phospholipides) de

chacun des sept isomères de F2-isoprostanes pouvant être mesurés par la méthode que j’ai mise au

point a été dosé dans le plasma, le sang total et les membranes érythrocytaires de femmes au

troisième trimestre d’une grossesse normale ou prééclamptique. Les résultats de cette étude se

93

retrouvent dans le chapitre 4. Selon l’isomère de F2-isoprostane et la matrice biologique étudiée dans

notre cohorte, soit il n’y a pas de différence significative observée entre les femmes normotensives et

prééclamptiques, soit les femmes prééclamptiques ont un niveau significativement plus faible de F2-

isoprostanes. Cela prouve l’importance de mesurer plus d’un isomère de F2-isoprostanes à la fois

sans quoi il serait possible de mal évaluer le stress oxydatif dans certaines situations. Je pense que

les isomères de la classe VI feraient de meilleurs biomarqueurs du stress oxydatif. En effet, ceux-ci

sont plus abondants que les isomères des autres classes et ils sont plus facilement détectables. Pour

une concentration égale, le ratio signal sur bruit pour ces composés est plus grand que pour les

isomères de la classe III dans la méthode HPLC-MS/MS que j’ai développée. Ce ratio est

directement lié à la sensibilité de la méthode d’analyse. De plus, les isomères de la classe VI ne

peuvent pas être synthétisés par la voie des cyclooxygénases alors que cette voie contribue à la

production d’une très faible quantité de 8-iso-PGF2α [207].

Contre toutes attentes, dans notre cohorte, les femmes prééclamptiques ont un niveau plus faible de

F2-isoprostanes que les femmes normotensives. Le contraire aurait été anticipé [140]. Le niveau plus

élevé de vitamine E dans le plasma des femmes prééclamptiques de notre cohorte pourrait expliquer

en partie ces résultats, la vitamine E étant un antioxydant membranaire très efficace. Outre les F2-

isoprostanes, il existe d’autres produits issus de la peroxydation de l’acide arachidonique qui

pourraient servir comme biomarqueurs du stress oxydatif dans certaines situations particulières.

C’est le cas des isofuranes (isoFs) dont la découverte a été rapportée récemment [208]. Comme les

F2-isoprostanes, ce sont des composés chimiquement stables détectables dans tous les tissus et

liquides biologiques et leur concentration augmente en présence de stress oxydatif. Il existe 256

isofuranes possibles divisés en huit classes de régioisomères composées chacune de seize

diastéréoisomères racémiques [209]. Leur formation est en compétition avec celle des F2-

isoprostanes et plus la concentration en oxygène moléculaire est élevée, plus la formation des

isofuranes est favorisée par rapport à celle des F2-isoprostanes (Figure 1). D’ailleurs, lorsque la

concentration en oxygène varie entre 1 % et 100 %, la peroxydation in vitro de l’acide arachidonique

favorise la formation des isofuranes plutôt que celle des F2-isoprostanes. Chez les rats exposés au

tétrachlorométhane (CCl4), un inducteur de stress oxydatif, le rapport isoFs/F2-isoPs varie en fonction

du degré d’oxygénation du tissu à l’étude [208]. Dans les organes très oxygénés comme le cerveau

et les reins, les isofuranes sont plus abondants alors que dans le foie, un organe faiblement oxygéné,

ce sont les F2-isoprostanes les plus abondants.

94

Figure 1. Compétition entre la formation des F2-isoprostanes et des isofuranes. Tirée de [210].

Il a été proposé que la mesure combinée des isofuranes et des F2-isoprostanes pourrait fournir un

meilleur indice du stress oxydatif que la mesure d’un seul d’entre eux [208, 209]. Jusqu’à maintenant,

ces deux types de molécules sont quantifiés en même temps à l’aide de la même méthode GC-MS

qui avait déjà été mise au point pour le dosage des F2-isoprostanes. Une équipe australienne a

utilisé ce type de méthode pour mesurer le niveau total des F2-isoprostanes et des isofuranes dans le

plasma de femmes au troisième trimestre d’une grossesse normale ou prééclamptique [211]. Ils ont

observé que les isofuranes étaient augmentés en prééclampsie, mais pas les F2-isoprostanes. Il

serait intéressant de mesurer les isofuranes dans notre cohorte afin de déterminer si ceux-ci sont

augmentés en prééclampsie même si nous avons observé une diminution des F2-isoprostanes. Un

tel phénomène a été observé dans un contexte complètement différent. Mas et al. a comparé les

95

niveaux plasmatiques d’isofuranes et de F2-isoprostanes chez les patients subissant une chirurgie de

remplacement du genou sous anesthésie rachidienne ou générale [210]. Les F2-isoprostanes étaient

plus faibles et les isofuranes étaient plus abondants chez les patients ayant subi une anesthésie

générale en comparaison avec ceux ayant subi une anesthésie rachidienne.

En conclusion, j’ai développé et validé une méthode pour le dosage de sept isomères de F2-

isoprostanes par HPLC-MS/MS que j’ai utilisée afin d’étudier le stress oxydatif dans le plasma, le

sang total et les membranes érythrocytaires de femmes au troisième trimestre d’une grossesse

normale ou prééclamptique. J’ai démontré l’utilité du dosage des isomères de classe VI pour

caractérisation du stress oxydatif. De plus, j’ai lié les niveaux de certains gras trans avec les F2-

isoprostanes. Ceci constitue la première démonstration in vivo de la compétition entre la formation

des F2-isoprostanes et des gras trans.

En perspectives, ma méthode pourra maintenant être utilisée pour mesurer le stress oxydatif dans

d’autres contextes (ex. : diabète, obésité, maladies cardiovasculaires, autres pathologies de la

grossesse, etc.). Certaines améliorations pourront aussi être apportées. Par exemple, l’utilisation

d’une colonne chromatographique plus courte permettrait d’augmenter la sensibilité et la rapidité de

l’analyse. Dans ce même but, il serait également possible de modifier le traitement des échantillons.

En effet, la technique d’extraction liquide-liquide utilisée actuellement au laboratoire est laborieuse et

le rendement d’extraction pourrait être amélioré. Une méthode d’extraction en phase solide

permettrait l’automatisation du traitement des échantillons et ainsi un plus grand nombre

d’échantillons pourraient être analysés chaque jour. Enfin, il faudra inclure l’analyse des isofuranes

dans la méthode que j’ai mise au point afin de mieux caractériser le stress oxydatif en fonction des

organes et des états pathologiques étudiés.

97

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Annexe 1

The polyol pathway in the bovine oviduct

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