Cours Spectrométrie de Masse

Cours ESBS

Octobre 2005

Sarah SANGLIER

Laboratoire de Spectrométrie de Masse BioOrganique

UMR 7512 (Dir : Alain Van Dorsselaer)

CNRS - Université Louis Pasteur

Strasbourg

Tel: 03 90 24 27 78

ssangli@chimie.u-strasbg.fr

La Désorption Ionisation Laser Assistée par Matrice : le MALDI

L’ionisation laser assistée par matriceMatrix Assisted Laser Desorption Ionisation (MALDI)

Première publication:

Laser desorption ionisation of proteins with molecular masses exceeding

10000 Da, Karas M. and Hillenkamp F. Anal. Chem. 60, 2299-2301 (1988)

- génère des ions à une seule charge MH+ (monochargé)- l’ionisation se fait sous pression- tolérance aux sels et détergents

- principalement couplée à un analyseur TOF (Temps de Vol) :sensibilité : 10-15 - 10-18 molesrésolution : 5000 - 10 000 en routine, précision : 20 ppm

Elle se fait souvent par protonation d’un site basique, par exemple sur un acide aminé comme K, R, (H)

- Ionisation positive (le voltage de source est positif) :

- Ionisation négative (le voltage de source est négatif):

Elle se fait par perte d’un proton, par exemple sur un acide aminé comme D, EL’ionisation négative est moins sensible que le mode positif.Souvent utilisée pour DNA et RNA

-NH2 -NH3+

-COOH -COO -

L’ionisation électrospray : Règles d’ionisation des biomolécules en ESI

Les peptides et protéines contiennent de nombreux groupes basiques ou acides qui peuvent recevoir des charges positives ou négatives

L’ionisation laser assisté par matrice: MALDI(Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation)

• Le MALDI est basé sur l’utilisation d’un composé (la matrice) qui absorbe à 337 nanomètres

• L’analyte est dilué environ 10 000 fois dans cette matrice

• L’échantillon est introduit dans le spectromètre après complète évaporation des solvants. Il n’y a donc pas de couplage avec la chromatographie possible

• La source d’ions MALDI est principalement couplée à un analyseur à temps de vol (MALDI-TOF)

Principe de l’analyse MALDI-TOF

1. Co-crystallisation d’une matrice et d’un échantillon2. Le dépôt cristallin est irradié par des impulsions laser3. Désorption et ionisation des molécules de matrice et de l’échantillon4. Accélération des ions formés dans un champ électrique en source5. Séparation des ions selon leur rapport m/z dans le tube de vol6. Détection des ions et mesure du temps écoulé entre un T0 et l’impact sur le

détecteur

LaserLaser

Temps de vol Masse moléculaireTemps de vol Masse moléculaire

Echantillon DétecteurTemps

Echantillon DétecteurTemps

Co-crystallisation de l’échantillon et de la

matrice photosensible

Excitation des molécules de matrices par l’impulsion laser

Laser+

Ionisation et désorption de l’échantillon

Principe de la désorption de l’échantillon

L’impulsion laser provoque localement un échauffement du dépôt et de micro-explosions

L’échauffement entraîne des collisions et le transfert de charges de la matrice à l’échantillon

1. Préparation du dépôt

La qualité de l’analyse dépend en grande partie de la qualité du dépôt du

couple échantillon matrice.

Trois types de dépôts peuvent être utilisés dans l’analyse protéomique.

- couche mince

- goutte séchée

- sandwich

Le dépôt le plus fréquemment utilisé est celui dit en goutte séchée

Matrice à saturation dans l’acétone

Echantillon cristallisé avec la matrice

H2O/TFA O,1%Protection du dépôt

Echantillon déposé sur H2O/TFA O,1%

Dépôt de l’échantillon sur la matrice

Incorporation de l’échantillon dans les couches supérieures de la matrice

Dépôt de l’échantillon sur la goutte d’eau acide

1. Préparation du dépôt Dépôt en “couche mince” (“thin layer”)

MatriceEchantillon

Matrice à saturation dans H2O/ACN

Matrice à saturation dans H2O/ACN diluée X3

Mélange

Dépôt

MatriceEchantillon

Mélange direct sur la cible

Co-cristallisation échantillon matrice

2. Préparation du dépôt Dépôt en goutte séchée (“dried droplet”)

Avantages :

Goutte séchée : rapide, résistant, lavage

Couche mince : permet un lavage (sandwich), plus sensible !

Désavantages :

Goutte séchée : mauvaise conservation

Couche mince : conservation plus longue, nombre de tirs limités

1. Préparation du dépôt Comparaison des deux techniques de dépôts

1. Préparation du dépôt Dépôt de type Sandwich

Couche de matrice à saturation dans l’acétone (0,5 µl)

H2O/TFA O,1%Protection du dépôt (0,7 µl)

Echantillon (0,5-1 µl)

Sur couche de matrice à saturation dans H2O/ACN

(Pain)

(Beurre)

(Jambon)

(Pain)

SandwichGoutte séchée

Goutte séchée 1/3

1. Préparation du dépôt Aspect de différents dépôt MALDI-TOF avec

l’-Cyano-4-HydroxyCinnamic Acid

Couche mince

Préparation de l’échantillon

L’analyse MALDI-TOF est une technique de spectrométrie de masse qui

est relativement tolérante vis à vis des composés qui accompagnent

généralement l’échantillon à analyser. Cependant certains échantillons

ne pourront être analysés qu’après un traitement préalable le rendant

compatible pour l’analyse MALDI-TOF.

La personne qui va réaliser l’analyse MALDI-TOF et qui n’est pas la

personne qui a préparé l’échantillon doit poser un certain nombre de

questions qui orienteront son choix pour la préparation de l’échantillon.

Les questions :

- type de molécule à analyser (choix de la matrice)

- type d’échantillon (gel, liquide, poudre)

- nature des solvants accompagnants l’échantillon

- pH

- présence de sels

- présence de détergents

Ces informations vont conditionner les traitements qui seront réalisés

pour rendre l’échantillon compatible pour l’analyse MALDI-TOF

Préparation de l’échantillon

ACN trop concentré (>30%)Solubilisation de la matrice et obtention d’une goutte séchée

après évaporation de l’ACNAnalyse possible

Tris HCl 0,1 M pH 8Dissolution de la matrice due au pH basique de la

solution. Analyse impossible

SDS 0,1%Formation d’une couche

cristallisée de SDSAnalyse impossible

SDS pH 8

ACN

Aspect du dépôt sandwich en présence de composés non compatibles avec l’analyse MALDI-TOF

Elimination des sels par lavage direct du dépôt

Il est possible de « dessaler » un échantillon sur cible par un lavage direct

de l’échantillon à l’aide de 1 µl d’eau acidifiée par 1% de HCOOH.

Ce type de lavage, sur un dépôt en goutte séchée ou en sandwich,

permet un dessalage rapide de l’échantillon sans quasiment aucune

perte.

Les sels sont solubilisés par l’eau, les peptides restent cristallisés avec la

matrices.

sels

matrice

échantillon

H2O/HCOOH

1. Préparation du dépôt Le choix de la matrice

Caractéristiques de la matrice

1. Petit composé organique, photosensible (cycle aromatique)

2. Faible volatilité (10-7 mbar)

3. Compatible avec le solvant de l’analyte (soluble)

4. Bonne absorbance à la longueur d’onde du laser (337 nm)

5. Capable de transférer une ou plusieurs charges à l’analyte (acide)

La matrice est un point important dans l’analyse.

Son choix peut conditionner la réussite ou l’échec de l’analyse

2. Les matrices

HOCN

OH

O

-Cyano-4-HydroxyCinnamic Acid (HCCA)

OHO

HO

OH

2,5-DiHydroBenzoic acid (DHB)

H3CO

HO

OCH3

OH

O

Sinapinic Acid (SA)

• Absorbance à 337 nm• Cristallisation aisée• Solubles dans les solvants organiques

Trois matrices permettent de réaliser une grande partie de analyses surtout dans le domaine de la protéomique.

Matrice Type d’échantillon

-cyano (HCCA)

Acide sinapinique (SA)

Acide Dihydroxybenzoïque(DHB)

Peptides / Protéines / Glycoprotéines

Protéines / Glycoprotéines / Polymères polaires

Peptides / Peptides Glycosylés, PhosphorylésPolymères polaires / Glycannes

HCCA + DHB Peptides (Ref)

2. Les matrices Matrices usuelles et types d’échantillons

N

OH

O

N

OH

O

OH

HO

OH

OH

O

HO

OH

OH

CH3

O

N N OH

COOH

2. Les matrices Structures d’autres matrices

Picolinic acid (PA)

3-Hydroxypicolinic acid (HPA)(Oligonucléotides)

Caffeic acid2,4,6- Trihydroxyacetophenone (THAP)(Oligonucléotides)

2-(4-Hydrophenylazo)benzoic acid

Matrice Type d’échantillon

THAP

HPA

Dithranol

Oligonucléotides

Oligonucléotides

Polymères apolaires / Molécules organiques diverses

Le point commun entre l’ensemble de ces différentes matrices est la présence d’un noyau aromatique ainsi que leur caractère acide.

2. Les matrices Autres matrices et types d’échantillons

Type d’échantillon

L’échantillon peut se présenter sous trois formes

- Solide (poudre, cristal)

- Liquide (solution)

- Gel (électrophorèse)

La forme sous laquelle se présente l’échantillon va orienté son mode de préparation pour l’analyse MALDI-TOF.

Généralement, les échantillons destinés à l’analyse « protéomique » se présentent inclus dans un gel.

L’échantillon sous forme de gel est le plus facile à traiter.L’échantillon sous forme liquide réserve souvent des surprises et nécessite un traitement qui peut être plus difficile.

L'ionisation MALDI est, par principe, naturellement couplée à un analyseur à temps de vol (TOF).

20 kVolts

0 volts

Départ:

Formation des ions

par un bref tir laser

(5 nano sec.)

Détection:

Mesure du temps

écoulé depuis le

départ des ions

Zone de vol libre d’accélérationZone d’accélération

Cible

Analyseur à temps de vol

source détecteur

Ions positifs (m/z)

V = + 30 kV -20 kV

t = d

m2zeV

d

La mesure du temps permet de calculer m/z, et donc la masse

Le mode linéaire permet d’analyser les masses élevéesMALDI - LR linear mode - intact protein mixture

10000 12000 14000 16000 18000 20000 22000 24000 26000m/z0

100

%

protmix1 8 (0.281) Sm (SG, 1x7.00); Cm (8:11) TOF LD+ 7.14e316952.5

12361.1

12569.8

23981.917162.8

24199.4

Cytochrome c

Myoglobin

Trypsinogen

Différents modes de fonctionnement d’un spectromètre de masse à temps de vol

1- Le spectromètre de masse à analyseur TOF peut travailler:

- sans réflectron (mode linéaire)

- avec réflectron

- avec ou sans extraction retardée des ions

2- Selon le mode de fonctionnement choisi (4 combinaisons possibles) les performances seront différentes pour:

- la résolution

- la sensibilité

- la mesure des masses moléculaires élevées

Extraction retardée

Cible20 kV

15 kV

0 kV

Lentille 1

Lentille 2

Cible20 kV

15 kV

0 kV

Bref tir laser

(3 à 7 nano sec)

Plasma

Lentille 1

Lentille 2

Extraction retardée

Cible20 kV

15 kV

0 kV

Ions avec des énergies

Cinétiques dispersées

Et des t0 différents

Vers le TOF

Lentille 1

Lentille 2

Extraction retardée

Cible20 kV

20,5 kV

0 kV

Ions avec des t0

resynchronisés

Vers le TOF

Extraction retardéeLentille 1

Lentille 2

Extraction retardée

L’extraction retardée

Potentiel lentille 2 (K volts)

Temps

Tir laser

20,5

15 Délai

Le délai doit être optimisé (50, 100, 300 nanosecondes) en fonction des masses moléculaires étudiées (gamme 5000, 20000, 100000 daltons).

Délai permet une focalisation en temps.

Delayed extraction matrix-assisted laser desorption time-of-flight mass spectrometry

M. L. Vestal, P. Juhasz, S.A. Martin, Rapid communication in mass spectrometry 9, 1044-1050, (1095)

2em départ (synchronisé)

source

détecteur

Ions positifs (m/z)V = + 3 kV

-20 kV

réflectron

- 3 kV 130 V

RéflectronLe réflectron permet d’augmenter la résolution

Il y a focalisation en énergie cinétique etallongement du tube de vol

Un appareil MALDI-TOF linéaire avec DEMALDI LR-Linear mode (Micromass)

Effective

flight path = 1.0 m

Effective flight path = 2.3 m

Un appareil MALDI-TOF à réflectron avec DEMALDI-LR Dual Detector Reflectron mode (Micromass)

Réflectron

2459 2460 2461 2462 2463 2464 2465 2466 2467 2468 2469 2470 2471m/z0

100

%

0

100

%

2466.2

2465.2

2467.2

2468.2

2469.2

2466.22465.2

2467.2

2468.2

2469.2

Linear modeACTH resolution

>7000 FWHM

Reflectron modeACTH resolution>15,000 FWHM

Influence du reflectron sur la résolutionM@LDI-LR Dual Detector Reflectron mode (Micromass)

Avantages apportés par le réflectron et par l'extraction retardée.

Spectre de masse MALDI des glycopeptides 16-36 et 17-36 de la sous-unité b de la hFSH

16-36

17-36

Méthodologie MALDI-MS de déterminationde la spécificité d’une enzyme

Méthodologie MALDI-MS de déterminationde la spécificité d’une enzyme

Spécificité de la cathepsine G sur la chaîne B oxydée de l’insuline bovine

Spectre de masse MALDI de l’aérolysine

heptamère : MM = 334 900 Da

Préparation de l’échantillon inclus dans un gel« Digestion in gel »

- prélèvement du spot

- lavage par NH4HCO3/ACN (50/50) X 3- déhydratation par de l’ACN

- réduction DTT (57°C 45 min.)- alkylation Iodoacétamide (30 min.)- lavage ACN

- lavage par NH4HCO3/ACN (50/50) X 2- déhydratation par de l’ACN

- digestion enzymatique (12 H 37°C)

NH4HCO3 : 25 mM (98,5 mg/50 ml)

DTT : 10 mM (15,4 mg/10 ml)

Iodoacétamide : 55 mM (102 mg/10 ml)

Trypsine Proméga V5111 : 12,5 ng/µl

Préparation de l’échantillon inclus dans un gel« Digestion in gel »

Lavage par NH4HCO3/ACN (50/50) (10 min)

DéhydratationACN

Réduction(57°C_45 min)

DéhydratationACN

Digestion à la trypsine(37°C, 12 heures)

Lavage par NH4HCO3/ACN (50/50)(10 min)

Alkylation(25 min)

La digestion « in gel » est une technique relativement simple, ce

n’est qu’une succession de lavages, mais des précautions sont tout

de même indispensables.

Le risque principal est la présence de protéines contaminantes en

concentration supérieure à celle de la protéine à identifier.

Le principal contaminant est la kératine qui est une protéine

présente au niveau de la peau, des cheveux, des pulls …

Il est possible d’éviter cette contamination par la kératine en prenant

quelques précautions lors du traitement de l’échantillon

Préparation de l’échantillon inclus dans un gel« Digestion in gel »

Goutte séchée 1/3

Résolution : 12739

Spectre MALDI-TOF d’un digeste trypsique d’ADH (100 fmol ADH)

Résolution Isotopique

La “peak liste” est utilisée pour faire les recherches dans les banques de données par le biais de différents moteurs de recherche (MS-Fit, Mascot, GlobalServer, Profound, PeptideSearch,

…)

Identification

m/z Résolution836,389 6641893,508 10218968,466 9250

1071,630 120811136,570 127391239,550 132801241,548 140671251,677 122071279,661 119311312,682 143281369,727 149451386,744 115231406,713 121191426,830 141091447,806 160981519,775 164181574,847 128401618,840 149751621,151 61491669,848 160992019,038 196102035,034 210392312,109 157702340,112 146062420,088 137292700,390 108612716,368 16519

Liste des masses mesurées par MALDI-TOF

Résultats de la Recherche MASCOT

1 - Le MALDI génère des ions monochargés.

2 - L’ionisation par MALDI est très douce. On observe que les ions moléculaires ne fragmentent pas.

3 - Le MALDI n’est pas compatible avec le couplage LC-MS

4 – Les spectromètres de masse MALDI-TOF sont très sensibles (femtomoles voire attomole)

5 – MALDI utilisé en analyse protéomique pour l’obtention de cartes peptidiques massiques (« peptide mass fingerprinting »)

A retenir à propos de l’ionisation par MALDI