Paris, 1er février 2012

Marie-Anne Loriot

INSERM UMR-S 775,Université Paris Descartes

UF Pharmacogénétique et Oncologie Moléculaire,

Hôpital Européen Georges Pompidou

Approches méthodologiques en pharmacogénétique

IDENTIFICATION DE SOUS-POPULATIONSen fonction de la réponse et de la toxicité

Non toxique

Toxique

Inefficace Efficace

Variabilité interindividuelle dans la réponse auxmédicaments

Médicament

REPONSE

EFFICACITE/TOLERANCEINEFFICACITE/TOXICITE

Facteurs acquis- Age, sexe

- Comorbidités

- Alimentation

- Interactions

médicamenteuses

Facteurs génétiquesPolymorphismes génétiques

- métabolisme- transport - cible pharmacologique- immunité (HLA)

Médecineprédictive

etpersonnalisée

OBJECTIF:

Facteurs génétiques

Pharmacogénomique

Etude des conséquences des variations de l’ADN et de l’ARN sur laréponse aux médicaments

Pharmacogénétique

Influence des variations de la séquence en ADN sur la réponseaux médicaments

Qu’est-ce qu’un polymorphisme?

• Phénotype d’un individu (grec phanein, f anei n se manifester) = ensemble descaractéristiques visibles (traits physiques) et invisibles (biologiques);

• Le phénotype est sous-tendu par des variations individuelles dans la séquence del’ADN génomique dont l’ensemble est appelé génotype;

• Polymorphisme génétique : variation individuelle de la séquence nucléotidique(substitution -SNP-, délétions et amplifications –CNV-, répétitions…)

Existence au même locus d’au moins 2 formes différentes de la séquence,appelés allèles

Fréquence > 1% dans la population• SNPs très fréquents au sein du génome

environ 10 millions de SNPs soit θ≈ 1 /300 bases

SNP= Single Nucleotide PolymorphismCNV= Copy Variation Number

( )n

Gène défectueux, « non fonctionnel » (délétion, mutation inactivatrice)Gène actif, « normal »

( )n Amplification du gène actif

pas de gène actif

métaboliseursLENTS

1 gène actif

métaboliseursRAPIDES OU

INTERMEDIAIRES

2 gènes actifs

métaboliseursRAPIDES

plus de 2 gènes actifs

métaboliseursULTRARAPIDES

Bases moléculaires de la variabilité génétique: Polymorphismes génétiques

D’après de Chaisemartin et Loriot, PatholBiol (Paris), 2005

Génotype

Phénotype

Principaux mécanismes moléculaires des modifications de l’activitédes EMX

Séquence non codante Séquence codante

Jonctionsexon/intron

5 ’NC5 ’ 3 ’

5 ’ 3 ’

5 ’ 3 ’

5 ’ 3 ’

5 ’ 3 ’

Modificationde la

quantitéd’enzyme

Enzymeabsente

ou inactive

Enzymeabsente

ARNm

Enzymeinstable

Altérationspécificitéde substrat

Quantitéd’enzymeaugmentée

Diminutionde l’activité

Effet surl’inductibilité

Métabolismeréduit

ou absent

Métabolismemodifié

Métabolismeaugmenté

FREQUENCE DES POLYMORPHISMES GENETIQUESDES ENZYMES DU METABOLISME DES XENOBIOTIQUES

CYP 1A1 (induction ~ 10%)CYP 2A6* (5%)CYP 1A2 (10%)CYP 2C9 (2-3%)CYP 2C19 (5-20%)CYP 2D6* (5-7%)CYP 2E1 (>1%)CYP 3A4/5 (?)

GSTM1* (50%)GSTT1 (10-20%)GSTP1 (10%)UGT1A1 (10-15%)NAT2 (50%)EH (<5%)TPMT(<1%)MDR1 (25%)

* : gènes pour lesquels une duplication est connue

Phase III: transporteurs ABC type MDR1 (ABCB1),, SLC, OAT…

Phase I Phase II

POLYMORPHISMES GÉNÉTIQUES DES ENZYMES DU MÉTABOLISME DES MÉDICAMENTS

Variations interindividuelles dans la réponse aux médicaments

Interactions: médicamenteuses,médicaments-aliments

Absorption/Excrétion*:ex. MDR1 lente/rapide

* variabilité génétique

Métabolisme*: ex. CYP450lent, rapide, ultrarapide

Interactions avec cible pharmacologique*:faible/forte

Fonction rénale

Interactionsmédicamenteuses

Conséquences de la variabilité génétiquePhénotype Effet sur [médicament] Conséquence clinique

tps

[méd

i]

Indexthérapeutique

tps

[méd

i]

Indexthérapeutique

tps

[méd

i]

Indexthérapeutique

métaboliseurlent

métaboliseurrapide

métaboliseurultrarapide

• toxicité

• efficacitéthérapeutique

• inefficacitéthérapeutique

*Les variations du métabolisme, du transport et des cibles pharmacologiques ont des conséquences:

- pharmacocinétiques- pharmacodynamiques- toxiques

* Rôle important quand:- fenêtre thérapeutique étroite- efficacité difficile à évaluer rapidement- efficacités voisines avec profils de tolérance variable

* Il est possible de prédire le métabolisme- génotypage- phénotypage

INTERET DE LA PHARMACOGENETIQUE

Phénotype:

- activité réelle- quantifiable- mise en oeuvre plus difficile (in vivo, in vitro, ex vivo)- variations (xénobiotiques, pathologies)- pas permanent

Génotype:

- facile- permanent- pas quantifiable- pas activité réelle

EXEMPLES DE PHENOTYPAGE in vivo

CYP 1A1 : induction lymphocytes ERODCYP 1A2 : caféine sang PX/C (NAT2)CYP 2A6 : CoumarineCYP 2C9 : DiclofenacCYP 2C19: Méphénytoïne, Proguanil,

OméprazoleCYP 2D6 : Debrisoquine, Spartéine,

DextromethorphaneCYP 2E1 : ChlorzoxasoneCYP 3A4 : 6-ß-OH-Cortisol (induction),

13, 14 (C)Erythromycine,Midazolam, Dapsone,Dextromethorphane

GENOTYPAGE : outils

* Méthodes fondées sur la PCR : RFLP, PCR allèle-spécifique, OLA ..(spécifiques) séquençage

* Méthodes non spécifiques: SSCP, DGGE

D-HPLC :

==> détection de nouveaux polymorphismes

* « Carte génétique » : puces à ADN

Intérêt pour les études sans à priori

Relation génotype phénotype

Exemple de la TPMT

UtilisationsGastro-entérologie, cancérologie, transplantation,dermatologie….

Indications dans les maladies inflammatoireschroniques de l’intestin (MICI) de l’adulte et de l’enfant:- maintien de la rémission clinique (taux de réponse 50%)- sevrage des patients cortico-dépendants- prévention des rechutes post-opératoires

Efficacité à long terme (taux de rechute 5-10% par an)

Délai d’efficacité: 12 à 18 semaines

MEDICAMENTS THIOPURINIQUES:AZATHIOPRINE ET 6-MERCAPTOPURINE

THIOPURINE METHYL-TRANSFERASE (TPMT) :THIOPURINE METHYL-TRANSFERASE (TPMT) :métabolisme des métabolisme des thiopurinesthiopurines

AZATHIOPRINEImurel ®

6-MERCAPTOPURINE (6-MP)

TPMT HGPRT XO

6-MMP6-THIOGUANINES

ACIDE THIOURIQUE

ACTIFSImmunosuppresseursMaladie de CrohnLeucémie aigue lymphoblastique

TOXIQUES(dose dépendant)Hématotoxicité

Myélosuppression

ACTIVITE TPMT : DISTRIBUTION TRIMODALE

M/M

M/Wt

Wt/Wt

METABOLISME DE L’AZA ET LA 6-MP

AZA = azathioprine ; 6-MP = 6-mercaptopurine ; 6-TIMP = 6-thioinosine monophosphate ; 6-TGN = 6-thioguanine nucléotides;6-MMP = 6-méthylmercaptopurine ; 6-TA = acide thiourique ; 6-MeTIMP = 6-méthylthioinosine monophosphate;6-MMP(R) = 6-méthylmercaptopurine ribonucléotides ;HGPRT = Hypoxanthine guanine phosphoribosyltransférase;XO = xanthine oxydase ; IMPDH = inosine monophosphatedéshydrogénase

CONSEQUENCES DES VARIATIONS DE L’ACTIVITE TPMT

Toxicité hématologique:Corrélation entre taux de 6-TGN et activité TPMT: lien avecla myélotoxicitéDéficit en TPMT: dans 1/3 des cas de toxicités

Toxicité hépatique:Dérivés méthylés hépatotoxiquesRapport 6-TGN/6-MMPEn cas d’activité TPMT élevée production accrue de 6-MMP

Résistance pharmacologiqueEn cas d’activité élevée: seuil d’activité à définir

Adaptation de posologieEn fonction du génotype ou du phénotype

Principales mutations

ATG Stop

5 ’ 3 ’

Structure du gène

POLYMORPHISME DE LA TPMT

TPMT* 2 : G238C Ala Pro

TPMT*3A : G460A Ala Thr

A719G Tyr Cys

TPMT*3B : G460A Ala Thr

TPMT*3C : A419G Tyr Cys

7 %

78 %

< 1%

5%

Répartition des allèles variants:

PHENOTYPAGE TPMTPHENOTYPAGE TPMT

Cytosolsérythrocytaires

Activité érythrocytaire = reflet de la TPMT hépatique

Réaction enzymatique: 6-MP 6-MMP

Mesure radiométrique ouSéparation par HPLC

CORRÉLATIONGÉNOTYPE/PHÉNOTYPE

Identification de biomarqueursApproche gène candidat

Exemple des anticoagulants oraux

PROBLEME DE SANTE PUBLIQUE

PROBLEMESLIES AUX

TRAITEMENTSAVK

18 000hospitalisations

par an

Première caused’accidents iatrogènes Près de 900 000

patients traités

≈ 5000 décès par an

Coumadine® (warfarine)cp à 2 et à 5 mg

Préviscan® (fluindione)cp à 20 mg

AVK EN FRANCE

Sintrom® Mini-Sintrom®

cp à 4 et à 1 mg (acénocoumarol)

4-OH-Coumarine et ses dérivés :Acénocoumarol Sintrom®Warfarine Coumadine ®Tioclomarol Apegmone ®

Indane-dione et ses dérivés :Fluindione Previscan ®Phenindione Pindione ®

O

O

R

O

O H

O

R

État d’hypocoagulabilité

LES MÉDICAMENTS ANTI-VITAMINE K

Cycle de lavitamine K

Synthèse de facteursnon fonctionnels

X

II

IXVII

Observance du traitement

Alimentation (vit. K)

Situation physiopathologiqueInteractions médicamenteuses

Facteurs génétiques

Risque

hémorragique

VARIABILITEDANSLAREPONSEVARIABILITEDANSLAREPONSE

Risque

thrombotique

Nb de

patients

Doses de warfarine (mg/semaine)

HYPERSENSIBILITE RESISTANCE

METABOLISME

des AVK

O

O

R

O

O

R

Dans le foie:

6 and 7hydroxylationpar CYP2C9

ELIMINATION(biliaire et rénale)

↑ hydrophile

METABOLISMEDESAVK

Super-famille d‘enzymes essentiellespour le métabolisme desmédicaments

17 familles de CYPs comprenant environ 50isoformes identifiées chez l‘Homme

classification: CYP 2 C 9

famille> 40% homologie

de séquence sous-famille> 55% homologie

de séquence

isoenzyme

*1

allèle

Variations environnementales: inhibition/induction

Polymorphismes génétiques

VARIABILITE DANS L’ACTIVITE DU CYP 2C9

Variants alléliques

CYP2C9*1

CYP2C9*2 (Cys144Arg)

CYP2C9*3 (Leu359Ileu)

Fréquence Allélique

0,79-0,86

0,08-0,19

0,06-0,1

Activité

100 %

12 %

5 %

24 variants alléliqueshttp://www.imm.ki.se/CYPalleles/cyp2c9.htm

Populations caucasiennes

CIBLE PHARMACOLOGIQUE des AVK

AVK

CYP2C9VKOR

VKOR =Vitamine K

époxyderéductase

inactif

Facteurs Vit K dépendantsinactifs

Facteurs Vit K dépendantsactifs

VIT Koxydée

VIT Kréduite

GGC GGC=γ-glutamylcarboxylase

Cycle de la

vitamine K

CYP2C9 explique 21% de la variabilitéVKORC1 explique 13% de la variabilité

VKORC1 DOSE 95% CI p n PATIENTS

CC 6,2 5-7,3 Ref 54

CT 4,8 3,8-5,9 0,002 69

TT 3,5 2,2-4,8 0,001 24

Relation entre SNP 1173C>T (intron 1) et

dose de warfarine à l’équilibre

« A polymorphism in VKORC1 gene is associated with aninter-individual variability in the dose-anticoagulant effect

of warfarin »D'Andrea, Blood. 2004

Àpartird’uneétudechezdesvolontairessains(n=230)recevantunedoseuniqued’acénocoumarol

déterminationdelapartgénétiquedanslavariabilitédelaréponsepharmacologique

Collaboration CIC St Antoine, Pr Laurent BecquemontINSERM U525, David-Alexandre Trégouët

Génotype *1/*1 *1/*2 *1/*3 *2/*2 *2/*3 *3/*3

Nombre 143 44 30 4 8 1

Data allèle*2-Rapport

*1/* 1*1/*2 *2/*2

0

25

50

75

100

CYP2C9 genotype

FVII ratio (%)

Data allèle*3-Rapport

*1/*1 *1/* 3*3/* 3

0

25

50

75

100

CYP2C9 genotype

FVII ratio (%)

Effets des allèles CYP 2C9*2 et *3 sur la réponse à l’acénocoumarol

(« ratio facteur VII » = J0/J24 x100 )

RESULTATS CYP 2C9 (région codante)

CYP 2C9 *2 CYP 2C9 *3

Répartition des génotypes:

NS 14% de la variabilité

P< 0.001

ANALYSE PAR SNP ou PAR HAPLOTYPE

Gène X

Réponse

SNP 1

SNP 2

Gène XSNP 3

Gène X

SNP 1 SNP 2

Gène XSNP 1 SNP 3

Gène XSNP 2 SNP 3

Gène X

= haplotype 1

= haplotype 2

= haplotype 3

Réponse

1 gène, plusieurs SNPs

ANALYSE PAR SNP ou PAR HAPLOTYPE

SNP 1 SNP 2

Gène BSNP 1 SNP 3

Gène BSNP 2 SNP 3

Gène B

= haplotype 1

= haplotype 2

= haplotype 3

Réponse

SNP 1 SNP 2

Gène ASNP 1 SNP 3

Gène ASNP 2 SNP 3

Gène A

= haplotype 1

= haplotype 2

= haplotype 3

≥ 2 gènes, plusieurs SNPs

7 haplotypes déterminés par 4 Tags (2-4-6-7)

Marqueurs Fréquences

T C C A A G C 0.286

T C C A G G T 0.242

C A T C A G T 0.231

T A C A A G T 0.089

T C C C A G T 0.048

T A C A A G C 0.030

T A C A A A T 0.010

Intérêt des Tag SNP

HA

PLO

TYPE

S

région 5’Flanquante and promoteur Région codante région 3’non traduite

STRATEGIE UTILISEE POUR ETUDEHAPLOTYPIQUE DE VKORC1

http://pga.gs.washington.edu/data/vkorc1/welcome.html

29 SNPs répartis sur 10 kb

17 SNPs avec fréquence > 5%

-4931 T>C -4451 C>A -2659 G>C -1877 A>G -1639 G>A 497T>G 698C>T 1173C>T 1542G>C 3730G>A 4901 A>C 5113 G>A 5408 G>C2255C>T

-4931 T>C -4451 C>A -2659 G>C -1877 A>G -1639 G>A 497 T>G 1173 C>T

Sélection des «Tag »SNPs

in silico

STRATEGIE UTILISEE POUR L’ANALYSE DU GENE VKORC1

6 Tag SNPs (5 dans la région 5’, 1 dans l’intron 1)

95 % de la diversité haplotypique

ANALYSE HAPLOTYPIQUE DES POLYMORPHISMESDU GENE VKORC1 EN RELATION AVEC LA

REPONSE PHARMACOLOGIQUE

7 haplotypes: SNP -1639G>A =« marqueur des haplotypes »

Base de données => SNPs : reconstruction des haplotypes corrélation avec variation du facteur VII

SNPs Effet haplotypique

-4931T> C -4451C>A -2659G>C -1639G>A 497T>G FréquenceVariation du Factor VII (%) (95% CI)

C C G A G 0.27 18.9 (16.7-21.1)

C C G A T 0.12 18.6 (14.0-23.2)

T C G A G 0.019 19.2 (7.5-30.9)

18.9 (16.9-20.9)

T C G G T 0.23 34.3 (32.4-37.2)

T A C G T 0.21 36.8 (33.6-39.9)

T A G G T 0.11 37.6 (32.8-42.3)

C C G G T 0.017 41.5 (22.3-60.7)

36.0 (34.2-37.8)

EFFET DE LA MUTATION VKORC1 –1639G>A SUR LAREPONSE A L’ACENOCOUMAROL

GG GA AA

0

50

100*** **yyy****

*** ***

-1639G>A

Factor VII ratio (%)

Variation Facteur VII

Génotype VKORC1

37% de la variabilité

P<0.001

Bodin Blood 2005

Identification de biomarqueurs

Approche GWAS« Genome Wide Association

study »

Les études d'associationLes études d'association

Mettre en évidence le rôle de gènes/régions "candidats" dans la

variabilité d'un phénotype

Comment ?Comment ?

Tester l'association statistique entre des polymorphismes

(marqueurs) et le phénotype d'intérêt

Puces à ADN

Marquage fluorescent de sondes Hybridation spécifique sur ADN de patientsGrande capacité de génotypage:densité variable, jusqu’à 1 milllion de SNPsLecture automatisée sur plate-forme dédiée

P-values for each GWAS SNP tested for association with warfarin dose.Horizontal axis shows SNP location and vertical axis is －log10(p-value) for each SNP tested by univariate regression (A) or multivariate regression (B). Red dots and red lettering show SNPs and implicated genes with p-values beyond the genome-wide significance threshold (1.5×10－7) which is denoted by a horizontal line. (A) Univariate regression shows genome-wide significant association to SNPs clustering near the warfarin drug target VKORC1 (e.g., P = 5.4×10－78, rs9923231) and near the warfarin-metabolizing gene CYP2C9 (P = 4.5×10－17 for non-synonymous *3 SNP rs1057910, P = 8.8×10－13 for non-synonymous *2 SNP rs1799853, P = 3.1×10－31 for *2*3 “composite” SNP rs4917639). (B) Multivariate regression adjusting for the contributions of VKORC1 and CYP2C9 had greater power than univariate regression and detected genome-wide significant association to the CYP4F2 gene (P = 8.3×10－10, non-synonymous SNP rs2108622).

Résultats de l’étude d’association avec l’hépatotoxicité de la flucloxacilline

Nature genetics 200951 cas/282 témoins, puce Illumina Human1MRéplication dans étude indépendante (23 cas)

• Pic d’association p=8.7x10-33• Chromosome 6 = région MHC• Identification d’un marqueur en déséquilibre de liaison avec HLA-B*5701

CONCLUSION GENERALE

Bon usage de la pharmacogénétique va permettre:

Meilleure adéquation malade-traitement

Moins d’effets secondaires

Traitement plus efficace et à moindre coût

Phases de Développement Du Médicament

Utilisation en routine clinique

Ce qu’il faut retenir

• Il existe une grande variabilité interindividuelle dans la réponseaux médicaments;

• Les facteurs génétiques expliquent une part de cette variabilité;• Il est possible de prédire la réponse aux médicaments:

génotypage, phénotypage, corrélation génotype-phénotype;• Pour le génotypage: nécessité d’avoir des populations

homogènes (influence de l’ethnie sur la fréquence des SNPs)• Etudes cliniques ou chez le volontaire sain• Approches gènes candidats ou études pangénomiques «Genome

Wide Association Study »• Etudes en combinaison de SNP ou d’allèles: approche

haplotypique