ATELIER IMAGEJ - Espace pédagogiqueww2.ac-poitiers.fr/biochimie/IMG/pdf/atelierimagej.pdf · Redimensionner l’image si celle-ci est de taille ou de poids trop important ce qui

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ImageJ-P.Guillaume 1

Diffrentes applications vous sont proposes pour apprendre utiliser quelques fonctions dImageJ :

1. ANALYSE QUANTITATIVE DUN GEL DELECTROPHORESE .............................................................................. 2

2. NUMERATION DE COLONIES BACTERIENNES SUR UNE GELOSE .................................................................... 4

3. DETERMINATION DU DIAMETRE DES ZONES DINHIBITION DUN ANTIBIOGRAMME .................................... 5

4. ANALYSE DUNE ELECTROPHORESE DADN SUR GEL DAGAROSE .................................................................. 6

5. NUMERATION DE LEVURES ( TEST DE VIABILITE AU BLEU DE METHYLENE) PAR UTILISATION DU PLUGIN

CELL COUNTER..................................................................................................................................................... 7

6. UTILISATION DE FICHIERS DICOM (DIGITAL IMAGING AND COMMUNICATION IN MEDICINE) ....................... 8

7. CREER UNE IMAGE COMPOSITE A PARTIR DE 2 IMAGES OBTENUES SUR UN MEME CHAMP

MICROSCOPIQUE DOBSERVATION APRES 2 TRAITEMENTS AVEC DES MARQUEURS FLUORESCENTS SUB-

CELLULAIRES DIFFERENTS .................................................................................................................................. 10

8. SUIVI DEXPERIENCE : MISE EN EVIDENCE ET QUANTIFICATION DE LA FLUIDITE MEMBRANAIRE ................ 11

9. CREATION ET UTILISATION DUN FICHIER MACRO ...................................................................................... 13

8.1 Cration dune Macro ......................................................................................................................... 13

8.2 Utilisation de la Macro ....................................................................................................................... 14

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1. ANALYSE QUANTITATIVE DUN GEL DELECTROPHORESE

Lancer ImageJ. Ouvrir le fichier electrophorese.jpg (image dun gel obtenu aprs lectrophorse des

protines sriques). : File>Open

Prparer limage lanalyse : transformer le format couleur en image de type 8-bits. : Image>Type>8bits. effectuer une inversion de couleur avec la fonction Invert du menu Edit vrifier les options du menu Analyze > Gels > Gel Analyzer options : ne cocher que

loption Label with percentages .

Tracer la courbe de densit correspondant pour les pistes de migration 1 et 6 : slectionner la piste1 puis la dclarer comme 1re zone slectionne du gel dans le

menu Analyze > Gels > Select First Lane . La zone sur limage est annote 1 : outil

Rectangular selections

dplacer la 1re zone de slection et la positionner sur la piste 6 (ne pas en crer une nouvelle car les 2 zones de slection doivent avoir la mme taille) puis la dclarer

comme 2me

zone slectionne du gel dans le menu Analyze > Gels > Select Next

Lane. La zone sur limage est annote 2

Remarque : renouveler cette opration pour slectionner dautres pistes et continuer de

les dclarer dans le menu Analyze > Gels > Select Next Lane.

crer les graphes dans le menu Analyze > Gels > Plot Lanes. Une fentre souvre avec les 2 graphes lun sous lautre. Ouvrir compltement la fentre pour observer

lensemble des pics.

Dlimiter sur chaque graphe les diffrents pics en traant une droite entre chaque pic : outils Straight line selections

Pour chaque piste successivement, Slectionner laire de chaque pic avec loutil Wand tool : une fentre Result

apparait avec les diffrentes aires mesures.

Si laire choisie est incorrecte, slectionner le rsultat dans Result et leffacer

(Edit>Clear).

Afficher les rsultats en allant dans le menu Analyze Gels > Label Peaks : Les rsultats en pourcentage apparaissent sur le graphe et le tableau de rsultats

Enregistrer les rsultats du tableau Result dans un tableur (Excel ou OpenOffice) pour pouvoir annoter les lignes et colonnes.

Rpter lopration pour la piste suivante.

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Piste 1

Piste 6

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2. NUMERATION DE COLONIES BACTERIENNES SUR UNE GELOSE

Lancer ImageJ. Ouvrir le fichier numeration.jpg (colonies bactriennes rparties sur 4 gloses obtenue

partir de 4 dilutions au 1/10me

successives).: File>Open

Redimensionner limage si celle-ci est de taille ou de poids trop important ce qui le cas ici (Informations de limage avant redimensionnement = 578x568 pixels ; RGB ; 1,3 MB)

laide de la fonction Scale du menu Image : paramtrer Xscale et Yscale 0,8 dans la

fentre qui souvre. Aprs validation une nouvelle image est cre numeration-1.jpg

(Informations de limage aprs redimensionnement (462x454 pixels ; RGB ; 819 K)

Etape effectuer pour chacune des 4 boites : Slectionner une premire boite de Ptri dans le nouveau fichier numeration-1.jpg :

outil Elliptical selections

Choisir une couleur d'arrire-plan noir en double cliquant sur loutil pipette (couleur du cadre du logo noir)

Eliminer tout ce qui se trouve lextrieur de la zone de comptage laide de la fonction Clear outside du menu Edit : larrire plan devient noir

Recadrer limage laide de la fonction Crop du menu Image Ajuster le contraste et la lumire : Image > Adjust > Brightness/Contrast Transformer le format couleur en image de type 8-bits. : Image>Type>8bits. Effectuer une inversion de couleur avec la fonction Invert du menu Edit Effectuer un seuillage : dfinir les intensits minimum et maximum permettant disoler

les colonies bactriennes du fond de limage en utilisant la fonction Threshold du

menu Image (menu Image > Adjust > Threshold)

Effectuer lanalyse de particules pour dnombrer les colonies la surface de la glose en utilisant la fonction Analyze Particle du menu Analyze : un tableau de rsultats

souvre : vous pouvez choisir la taille des pixels numrer. En slectionnant dans

Show mask , cela gnre une fentre qui montre les pixels qui ont t numrs.

Enregistrer les rsultats.

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3. DETERMINATION DU DIAMETRE DES ZONES DINHIBITION DUN

ANTIBIOGRAMME

Lancer ImageJ. Ouvrir le fichier antibiogramme.jpg : File>Open talonner le logiciel

mesurer laide de loutil Straight Line, une longueur connue du fichier antibiogramme : diamtre de la boite = 90 mm ou diamtre du disque = 6.35 mm.

Ouvrir la fonction Set Scale du menu Analyze : dans la fentre qui souvre, la longueur en pixels du trait trac apparait (distance en pixels).

Renseigner la valeur de la longueur relle et indiquer son unit

Effectuer les mesures des diamtres des zones dinhibition : Pour chaque diamtre dinhibition, rpter les oprations suivantes :

Tracer une ligne sur le diamtre mesurer avec l'outil Straight Line Effectuer la mesure avec la fonction measure du menu Analyze : les diamtres mesurs

apparaissent dans la dernire colonne du tableau.

Enregistrer les rsultats du tableau une fois toutes les mesures effectues.

Traage dune

ligne avec loutil

Straight Line

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4. ANALYSE DUNE ELECTROPHORESE DADN SUR GEL DAGAROSE

Lancer ImageJ. Ouvrir le fichier elecADN.jpg : File>Open Prparer limage lanalyse :

Slectionner la zone de migration partir des puits de dpt : outil Rectangular selections

Choisir une couleur d'arrire-plan noir en double cliquant sur loutil pipette (couleur du cadre du logo noir)

Eliminer tout ce qui se trouve lextrieur de la slection laide de la fonction Clear outside du menu Edit : larrire plan devient noir

Recadrer limage laide de la fonction Crop du menu Image Ajuster le contraste et la lumire : Image > Adjust > Brightness/Contrast Transformer le format couleur en image de type 8-bits. : Image>Type>8bits. Effectuer une inversion de couleur avec la fonction Invert du menu Edit

talonner le logiciel : Mesurer laide de loutil Straight Line, une longueur connue au niveau de limage :

longueur dun puits = 10 mm.

Ouvrir la fonction Set Scale du menu Analyze : dans la fentre qui souvre, la longueur en pixels du trait trac apparait (distance en pixels).

Renseigner la valeur de la longueur relle et indiquer son unit. Effectuer les mesures :

Tracer une ligne avec l'outil Straight Line entre le puits et la premire bande du marqueur de taille (touche maj pour une ligne bien verticale).

Effectuer la mesure avec la fonction measure du menu Analyze (raccourci clavier Ctrl + M) : les distances mesures apparaissent dans la dernire colonne du tableau

(colonne length ).

Recommencer pour chaque bande du marqueur, puis pour les bandes mesurer (noter l'ordre).

Enregistrer les valeurs dans un tableur.

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5. NUMERATION DE LEVURES ( TEST DE VIABILITE AU BLEU DE

METHYLENE) PAR UTILISATION DU PLUGIN CELL COUNTER

Fermer ImageJ si ce dernier est ouvert.

Tlcharger le plugin Cell Counter

Copier le plugin dans le dossier Analyse du rpertoire plugins du logiciel ImageJ prsent

dans Program Files (C:\Program Files).

Lancer ImageJ

Ouvrir le fichier viabilitelevures.jpg : File>Open

Ourir le plugin Cell Counter prsent dans le menu Plugins.

Cliquer sur longlet Initialize pour rendre limage accessible au comptage.

Slectionner comme type 1 les cellules viables non colores comme premier type cellulaire

compter puis cliquer sur chaque cellule correspondante de limage : toutes les cellules saffichent

avec le numro 1 sur limage.

Slectionner comme type 2 les cellules mortes bleues comme second type cellulaire compter

puis cliquer sur chaque cellule de limage correspondante : toutes les cellules saffichent avec le

numro 2 sur limage

Cliquer sur Result pour obtenir les rsultats sous forme de tableau.

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6. UTILISATION DE FICHIERS DICOM (DIGITAL IMAGING AND

COMMUNICATION IN MEDICINE)

Lextension .dcm dsigne un fichier DICOM, format standard des fichiers numriques de rsultats

dexamens dimagerie mdicale (radios, scanner, IRM). Ce fichier contient non seulement les images

numriques issues des examens mdicaux mais galement des informations cliniques (donnes du

patient, donnes de lexamen, donnes mdicales). Cette extension ne peut pas tre ouverte avec des

logiciels de traitement dimage classique tel que Gimp, Paint, Paint Shop Pro

Lancer ImageJ

Ouvrir le fichier Heart.dcm : File>Open

Observer les informations du fichier puis visualiser lensemble des clichs sous forme de film

en cliquant ici

Afficher les informations complmentaires contenues dans le fichier laide de la fonction Show

Info du menu Image : date du clich, nom du patient, nombre de clichs (Stacks)

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Observer le fichier Heart.dcm en une planche contact o vous pouvez effectuer un choix de

clichs en utilisant la fonction Make Montage du menu Image > Stacks : une fentre Montage

souvre avec le nombre de clichs choisis.

En sauvegardant au format jpeg, les clichs deviennent exploitables par les logiciels de

traitement dimage.

Possibilit douvrir tous les clichs comme une image avec la fonction Stack to Images du menu

Image > Stacks

En sauvegardant au format jpeg, les clichs deviennent exploitables par les logiciels de

traitement dimage.

Possibilit de dcouper le fichier selon un nouveau plan laide de la fonction Reslice [/] du

menu Image > Stacks ou avec la fonction Orthogonal Views mais lpaisseur mesure est faible

sur le fichier Heart.dcm comme on peut le constater en effectuant la fonction 3D

Project(Axe de rotation en Y)

Effectuer la fonction Reslice [/], Orthogonal Views, 3D Project aprs avoir ouvert le fichier

Head.tiff :

Reslice [/] permet de changer de coupe (ici on passe dune coupe sagittale une coupe

transversale)

Orthogonal Views permet de visualiser selon 2 axes dobservation (YZ et XZ)

3D Projectpermet dobtenir une vue 3D (ncessit de travailler en image 8 bit)

Montage avec

les 16 clichs

Montage avec

4 clichs

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7. CREER UNE IMAGE COMPOSITE A PARTIR DE 2 IMAGES OBTENUES SUR

UN MEME CHAMP MICROSCOPIQUE DOBSERVATION APRES 2

TRAITEMENTS AVEC DES MARQUEURS FLUORESCENTS SUB-

CELLULAIRES DIFFERENTS

Photographies utilises :

limage DAPI.jpg est obtenue par le marquage des noyaux au DAPI (Di-Amidino-Phenyl-

Indol) qui se fixe spcifiquement sur lADN et met une fluorescence bleue (max 456 nm)

lorsquil est clair en lumire violette (max 372 nm).

limage GFP.jpg est obtenue par lobservation de la fluorescence de la GFP (Green

Fluorescent Protein), protine fluorescente qui absorbe la lumire bleue (max 420 nm) et

met une lumire dans le vert (max 510 nm).

Selon le jeu de filtres utilis au moment de lobservation, le champ microscopique peut fluorescer en

bleu (DAPI) ou en vert (GFP). La camra utilise ne restitue que des images 8 bit.

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Ouvrir successivement les fichiers DAPI.jpg et GFP.jpg : File>Open

Fusionner les 2 images avec la fonction RGB Merge du menu Image > Color : dans la fentre de paramtrage Color Merge qui souvre, attribuer le fichier GFP.jpg pour

Green et le fichier DAPI.jpg pour Blue

cliquer sur OK pour gnrer une image en fausses couleurs dans une fentre Composite

Enregistrer le fichier gnr.

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8. SUIVI DEXPERIENCE : MISE EN EVIDENCE ET QUANTIFICATION DE LA

FLUIDITE MEMBRANAIRE

Des membranes sont incubes avec des phospholipides coupls un fluorochrome. Les phospholipides

se rpartissent uniformment dans la membrane et la fluorescence est homogne sur toute la surface

observe.

Une petite zone de la membrane est ensuite irradie avec un flash de faisceau laser qui dtruit

localement et irrversiblement le fluorochrome.

On photographie en fonction du temps, lintensit de la fluorescence qui rapparat dans la zone irradie

au laser : les photographies du mme champ dobservation, prises successivement intervalles de temps

rguliers, sont prsentes dans le rpertoire membrane

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Ouvrir la pile dimages prsentes dans le rpertoire membrane en utilisant la fonction Image Sequence du menu File > Import : slectionner la premire image puis cliquer sur Ouvrir. Une

fentre de paramtrage Sequence Options souvre. Cliquer sur OK : un fichier membrane

de 43 images est cr

Transformer le format en image de type 8-bits. : Image>Type>8bits.

Ajuster le contraste et la lumire : Image > Adjust > Brightness/Contrast (le faire aprs limage 1).

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Slectionner la zone analyser avec lOutil Freehand selections comme ci-dessous :

Cette slection est identique pour toutes les images de la pile.

Pour suivre la rapparition de la fluorescence, utiliser la fonction Plot Z-axis Profile du menu Image > Stacks : une courbe et une srie de mesure sont obtenues o on mesure en fonction du

temps, lintensit de la fluorescence qui rapparat dans la zone dobservation irradie au laser :

fluorescence initiale (avant irradiation)

fluorescence t = 0 aprs lirradiation

flurescence aprs rapparition

Enregistrer vos rsultats

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9. CREATION ET UTILISATION DUN FICHIER MACRO

Une macro est ncessaire partir du moment o des actions identiques vont tre rptes sur des images

diffrentes (lecture de microplaque dlves diffrents).

8.1 Cration dune Macro

Lancer imageJ

Ouvrir le fichier microplaque.jpg

Utiliser la fonction Record du menu Plugins > Macros : une fentre Recorder apparait dans laquelle vont senregistrer automatiquement les oprations suivantes :

transformer limage en 8-bits : Image > Type > 8bit optimisation du contraste : Image > Adjust > Brightness/Contrast ; slectionner Auto effectuer une inversion de couleur : Edit > Invert effectuer le paramtrage de la fonction Set Measurements du menu Analyse

slectionner loutil de slection ovale puis slectionner successivement les 96 cupules dans lordre suivant (A1 H1 puis B2 H2) en dplaant chaque fois la slection

effectuer lanalyse en utilisant la fonction Measure du menu Analyse pour chaque cupule : copier dans Recorder derrire chaque cupule slectionne laction

run("Measure");

Enregistrer la macro dans un fichier .txt dans le rpertoire macros dImageJ prsent dans Program Files.

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8.2 Utilisation de la Macro

Installer la macro en utilisant la fonction Install du menu Plugins > Macros

Ouvrir le fichier microplaque.jpg et effectuer la macro prsente en bas du menu droulant du

menu Plugins > Macros : lanalyse et les rsultats sont gnrs.

Enregistrer les rsultats.

Ressources :

Travaux de Gil Voge : http://www.ac-grenoble.fr/disciplines/sti-biotechnologies/file/ImageJ/Stage_ImageJ.htm

Travaux de Gabriel Lapointe : http://gabriellapointe.ca/imagej/
http://www.ac-grenoble.fr/disciplines/sti-biotechnologies/file/ImageJ/Stage_ImageJ.htmhttp://gabriellapointe.ca/imagej/

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