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Cours d'Hémostase DUT ABB. 3- Exploration de la Coagulation. Auteur : Bruno Flamand, IUT de Dijon. Quand explorer la coagulation ? Manifestations cliniques hémorragiques Incident hémorragique per- ou post-opératoire Bilan pré-opératoire Thromboses Surveillance traitement anticoagulant. - PowerPoint PPT Presentation
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Auteur : Bruno Flamand, IUT de Dijon
Cours
d'Hémostase
DUT ABB
3- Exploration de la Coagulation
Quand explorer la coagulation ?
•Manifestations cliniques hémorragiques
•Incident hémorragique per- ou post-opératoire
•Bilan pré-opératoire
•Thromboses
•Surveillance traitement anticoagulant
Schéma simplifié de la coagulation
Facteurs Contacts Facteur Tissulaire
PL Ca2+ VIIIa
PK, KHPM, XIIa, XIa, IXa VIIa
PL Ca2+
X XaPL Ca2+ Va
II IIa
Fibrinogène Fibrine
Voie endogène Voie exogène
Facteur Tissulaire
VIIa
PL Ca2+
X XaPL Ca2+ Va
II IIa
Fibrinogène Fibrine
Mesure du Temps de Quick (TQ) ou Taux de Prothrombine (TP): Exploration de Fonctionnalité Voie exogène
Réactifs:
•Thromboplastine tissulaire = Facteur Tissulaire + PL
•CaCl2
•Plasma
Mesure du Temps de Quick
Temps de formation d’un caillot de fibrine d’un plasma déplaquetté, décalcifié, en présence de FT, PL et Ca2+
Plasma 100µl Préchauffage
2 min 37°c
Thromboplastine tissulaire calcique préchauffée à 37°C 200µl
Déclenchement Chronomètre
Caillot Fibrine
Stop Chrono
TQ
• N = 11-13 sec
•Expression TQ en pourcentage Taux de Prothrombine (TP): besoin étalonnage Droite de Thivolle
Etalonnage:
Mesure TQ sur Plasmas calibrés TP 100%, 50%, 33%,….
Droite de ThivolleTQ sec
%TP100 50 33
•TP Pathologique si < 70% = TQ allongé
•Expression TQ en INR (International Normalized Ratio) : réservé aux surveillances de patients traités aux AntiVitamines K
ISI: Indice de Sensibilité Internationale de la thromboplastine
TQ Témoin INR=( )ISITQ Patient
Facteurs Contacts
PL Ca2+ VIIIa
PK, KHPM, XIIa, XIa, IXa
X XaPL Ca2+ Va
II IIa
Fibrinogène Fibrine
Mesure du Temps de Céphaline + Activateur (TCA): Exploration de Fonctionnalité Voie endogène
Réactifs:
•Activateurs « Contacts »: Kaolin, Silice, Célite, Acide
éllagique
•Substitut PL: Céphaline
•CaCl2
•Plasma
Plasma 100µl
Préchauffage 3 min 37°c
CaCl2 préchauffé à 37°C 100µl
Déclenchement Chronomètre
Caillot Fibrine
Stop Chrono
TCA
Mesure du Temps de Céphaline + activateur
Temps de formation d’un caillot de fibrine d’un plasma déplaquetté, décalcifié, en présence d’activateur des facteurs « contacts », de PL et de Ca2+
Activateur 100µl
• N: 30-35 sec
•Résultat exprimé en secondes par rapport à un plasma Témoin normal
•TCA allongé si ratioTCA PatientTCA Témoin
> 1,2
Détection de la formation du caillot de Fibrine
•« Lectures oculaires »
Technique du crochet accrochage
caillot/filament gélatineux
Barreau aimanté en rotation
Bain-marie électromagnétique arrêt de rotation du
barreau
•« Lecture électromagnétique » sur semi- ou automates complets
Bobine électromagnétique
Bille aimantée
Oscillation pendulaire de la bille ralentissement puis arrêt mouvement pendulaire par caillot fibrine
Micro-cuvette immobile
Bobine électromagnétique
« Ergot central »Bille aimantée
Micro-cuvette en rotation
Aimant
Immobilité de la bille par aimantation emprisonnement dans caillot de fibrine provoque mise en rotation associée à la micro-cuvette
•« Lecture optique » par turbidimétrie à 650 nm: moins utilisée
- DO départ: turbidité plasma (+réactifs)
-variation DO: addition réactif déclenchant
-variation DO: formation caillot fibrine
-Sur semi- ou automates complets,
•Déclenchement chrono simultané à addition réactif « déclenchant » (Thromboplastine pour TQ, CaCl2 pour TCA) par pipette reliée électriquement
•Arrêt Chrono automatique par détection caillot fibrine:
- arrêt mouvement pendulaire bille (diminution intensité champ magnétique)
- mise en rotation bille (coupure champ magnétique)
- changement de turbidité
-Sur semi-automates,
•Addition manuelle: plasma, réactif, réactif « déclenchant »
-Sur automates complets,
•Travail sur Tube primaire Sang centrifugé (Anticoagulant Citrate de Na+ 3,8%), tous les additions de réactifs sont automatisées
Allongement isolé TQ:
•Déficit VII
•Effet Inhibiteur : -thérapeutique: (présence héparine, en principe pas d’allongement sauf si [Héparine] importante),
début traitement Anti-Vitamine K
-pathologique: (Anticoagulants circulants) Ac anti-facteurs,
Ac anti-phospholipides
Allongement isolé TCA:
•Déficit PK, KHPM, XII, XI, IX, VIII
•Effet Inhibiteur:
-thérapeutique: héparine, et AVK
-pathologique: Ac anti-facteurs, Ac anti-phospholipides
Allongements associés TQ et TCA:
•Déficit facteur voie commune: X, V, II, I
•Dysfibrinogénémie
•Déficits combinés:Vexo + Vc, Vendo + Vc, Vexo + Vendo (+ Vc)
•Effets inhibiteurs: Ac anti-facteurs, Ac anti-phospholipides, Inhibiteurs polymérisation (PDF, anti-polymérase)
•Inhibiteurs thérapeutiques: héparine, AVK
Mesure du Temps de Thrombine (T T) Exploration de Fonctionnalité de la Fibrinoformation
Temps de formation d’un caillot de fibrine d’un plasma déplaquetté, décalcifié, en présence d’une quantité standardisée de thrombine diluée et de Ca2+
Plasma 200µl Préchauffage
2 min 37°c
Thrombine calcique préchauffée à 37°C 200µl
Déclenchement Chronomètre
Caillot Fibrine
Stop Chrono
TT
•N 22 sec
•Réalisé si TQ et TCA allongés
•Si TT allongé: investigations supplémentaires (PDF, D-Dimères, Fibrinogène « immunologique »)
Allongements TT (et TQ et TCA)
•Présence héparine
•Déficit fibrinogène
•Dysfibrinogénémie
•Inhibiteur Fibrinoformation: PDF, Anti-polymérase
Dosage chronométrique du Fibrinogène
-dosage indirect, car mesure d’un temps d’apparition de fibrine par transformation de la totalité du fibrinogène présent
-temps de coagulation à 37°C d’un plasma dilué, citraté, déplaquetté, en présence de thrombine concentrée, est inversement proportionnel à la quantité de fibrinogène
-dosage quantitatif et qualitatif
-besoin étalonnage
Fibrinogène g/L
Temps de coagulation en sec.
1,5 3 6
Plasma 200µl Préchauffage
2 min 37°c
Thrombine calcique préchauffée à 37°C 200µl
Déclenchement Chronomètre
Caillot Fibrine
Stop Chrono
Temps de coagulation
•N : 2 à 4 g/L
Dosage chronométrique isolé de facteur de la coagulation
-Plasmas réactifs déficients en un seul facteur
-Temps de coagulation d’un plasma déficitaire est fonction de la quantité du facteur apporté par le plasma à tester
-Résultats exprimés en % de facteur par rapport à des plasmas normaux étalons
Dosage chronométrique facteur VIII
Dilution Plasma Patient 100µl
Préchauffage 3 min 37°c
Déclenchement Chronomètre
Caillot Fibrine
Stop ChronoPlasma déficitaire en VIII 100µl
CaCl2 préchauffé à 37°C 100µl
Activateurs Facteurs contact
Temps de coagulation
•Etalonnage
Temps de coagulation en sec.
954515%VIII
N: 60-150%
Dosage chronométrique facteur VII
Dilution Plasma Patient 100µl
Préchauffage 2 min 37°c
Déclenchement Chronomètre
Caillot Fibrine
Stop ChronoPlasma déficitaire en VII 100µl
Thromboplastine tissulaire calcique préchauffée à 37°C 200µl
Temps de coagulation
•Etalonnage
Temps de coagulation en sec.
954515%VII•N: 70-130%
Dosage chromogénique isolé de facteur de la coagulation
-Dosage colorimétriques (ou amidolytiques)
-utilisation de substrats oligopeptidiques chromogènes: groupement paranitroaniline libère amine pNA par coupure enzymatique
-dosage d’activité enzymatique: concentration enzyme (facteur) est proportionnelle à la vitesse d’hydrolyse, mesurée par la variation absorbance à 405 nm (dosage pt final, 2 pts, cinétique…)
Dosage chromogénique facteur VIII
Dilution Plasma Patient 100µl
IXa + PL
4 min 37°C
X
4 min 37°C
Substrat CBS 48.03
CH30CO-D-Leu-Gly-Arg-pNA
3 min 37°CDO à 405 nm
DO 405 nm =[pNA]
25 50 100%VIII
200
Etalonnage
IXa + PL
X Xa
VIII
CBS 48.03
pNA
Épreuve de correction de l’allongement isolé du TCA
Plasma Patient 100µl
Plasma Témoin N 100µl
Activateurs 100µl
Préchauffage 3 min 37°c
CaCl2 préchauffé à 37°C 100µl
Déclenchement Chronomètre
Caillot Fibrine
Stop Chrono
TCA
Calcul Indice de Rosner
(TCA Mélange – TCA Témoin N)
TCA Patientx100
•Indice <12 : TCA Patient corrigé par Témoin: Déficits Facteurs
•Indice >15: TCA Patient non corrigé par Témoin: Ac AntiCoagulants Circulants
TCA Patient-TCA Mélange
TCA Mélangex100% correction=
•% correction > 65 %: déficit facteur
•% correction < 50%: présence Ac anticoagulant circulant
Rapport=TCA Mélange
TCA Témoin N
•Rapport < 1,2 : déficit facteur
•Rapport > 1,2: présence Ac anticoagulant circulant