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AKBAR David
Plateau d’imagerie de MRI-IGH
Automatisation des plugins MétroloJ
Master Imagerie spécialité imagerie Pour la biologie
Promotion 2010/2011
Résumé
Le stage a été réalisé au sein de la plateforme d’imagerie MRI à Montpellier, au plateau
d’imagerie IGH-optique sous la direction du Dr Julien Cau.
Il avait pour objectif de mettre en place des outils informatiques afin d’automatiser les
analyses des visites de maintenance. Cette automatisation optimise la réactivité du personnel,
lui fait gagner du temps et renforce la valeur statistique des mesures effectuées.
Les greffons (plug-ins) du logiciel ImageJ qui ont fait l'objet d'une automatisation sont :
‐ Generate PSF Report : ce plugin permet la mesure de la résolution à partir de PSF
(Point Spread Function). Le profil d’intensité X, Y et Z de la PSF est tracé et la
FWHM des profils pour chaque direction est mesurée. La version automatisée (Macro
« Automatic PSF Report ») permet d’identifier des billes dans une pile d’images n
canaux sélectionnée par l'utilisateur ou à partir de toute pile identifiée
automatiquement sur la base d’un nom contenant un élément/TAG donné.
‐ Generate Field Illumination Report : ce plugin permet l’analyse d’une image d’une
lame contenant de façon homogène un fluorochrome. La Macro permettant son
automatisation est « Automatic Field Illumination Report » et permet de lancer une
analyse sur un set d’image donné ou sur toute image contenant différents TAGs dans
son nom (100x, GFP, etc…).
‐ Generate Coalignment Report : ce plugin permet de contrôler le coalignement des
différents canaux d’une bille multimarquée. Son automatisation a porté sur un set
d’image sélectionné par l'utilisateur.
En parallèle, des tests métrologiques mensuels et annuels ont été effectués et les
données produites ont permis de valider ces macros.
En dehors de l’aspect métrologie, J’ai eu le plaisir de travailler dans un domaine qui me
passionne, au sein d’une équipe très professionnelle. Au terme de cette expérience
professionnelle, je peux affirmer avoir approfondi mes connaissances théoriques et pratiques,
ce qui sera un atout important pour la poursuite de mon activité.
Remerciements
Avant d’effectuer tout développement sur mon expérience professionnelle, il me
semble opportun de commencer ce rapport de stage, en faisant part de ma
reconnaissance auprès des personnes qui m’ont beaucoup appris, et qui ont eu la
gentillesse de faire de cette expérience un moment agréable et profitable, aussi bien au
niveau professionnel que personnel.
Je tiens tout d’abord à faire-part de ma gratitude auprès de Dr Julien Cau mon
responsable de stage qui m’a accueilli au sein du plateau MRI-IGH, qui m’a formé et
accompagné tout au long de cette expérience professionnelle avec beaucoup de patience
et de pédagogie.
En second lieu, je tiens à remercier Dr Julio Mateos-Langerak et Nicole
Lautredou-Audouy pour les conseils ainsi que l’aide qu’ils ont pu m’apporter au cours
de ces six mois de stage.
Il me semble également opportun de remercier ma responsable de master Mme
Delphine Burel et l’ensemble de mes professeurs, qui nous ont accompagnés durant ces deux
dernières années, et sans laquelle nous n’aurions point été là où nous sommes.
Pour finir je tiens à remercier mes camarades de promotion 2009-2010 et de 2010-2011.
AKBAR David
Plateau d’imagerie de
MRI-IGH
Automatisation des plugins MétroloJ
Master Imagerie spécialité imagerie Pour la biologie
Promotion 2010/2011
Liste d’abréviations
ROI = « Region Of Interest » région d’intérêt délimitée dans une image
MRI = « Montpellier RIO Imaging » plate-forme Régionale d'Imagerie du Languedoc -
Roussillon. C'est une Plate - Forme Technologique (PFT), labellisée IBiSA.
IGH = L'Institut de Génétique Humaine
Dapi = combinaison de filtres dans le trajet optique pour avoir une lumière d’excitation dans
l’UV et une émission dans le bleu (pic d’excitation du fluorophore = 365nm ; pic d’émission
> 397nm).
FITC/GFP = combinaison de filtres dans le trajet optique pour obtenir une lumière
d’excitation dans le bleu et une émission dans le vert (pic d’excitation du fluorophore =
470nm ; pic d’émission = 535nm).
Rhodamine = combinaison de filtres dans le trajet optique pour avoir une lumière
d’excitation dans le vert et une émission dans le rouge (pic d’excitation du fluorophore =
546nm ; pic d’émission > 590nm).
CV = Coefficient de Variation. Le CV correspond au rapport de l’écart type sur la moyenne
pour une ROI d’une image. Cet indicateur permet d’évaluer la qualité d’une image dans le
rapport signal sur bruit.
PSF = « Point Spread Function » fonction de dispersion optique d’un système.
Stack = pile d’images. Le stack désigne une suite d’acquisitions successives dans une même
dimension comme une pile d’images dans l’axe Z.
Plugin MetroloJ = Plugin fonctionnant sous Image J qui permet l’analyse de certains test
métrologiques (homogénéité du champ d’illumination, mesure de la PSF, coalignement, …)
développé par M. Fabrice P. Cordelières et M. Cédric Matthews
Sommaire
1. Introduction......................................................................................................................... 1
1.1. Présentation du master................................................................................................. 1
1.2. Présentation de la Plate-forme MRI ............................................................................ 1
1.3. La demarche qualité..................................................................................................... 3
1.4. Protocole des actions de Maintenance préventive des appareils ................................. 4
2. Protocole de mainteance mensuelle et annuelles des microscopes..................................... 6
2.1. Parc Matériel................................................................................................................ 6
2.2. Principe des visites mensuelles et annuelles................................................................ 7
2.3. Utilisation des plugins de la collection MetroloJ ........................................................ 9
2.3.1. Le test d’homogénéité du champ d’illumination.................................................. 9
2.3.2. Le test de correction des aberrations chromatiques ........................................... 10
2.3.3. Mesure de la PSF................................................................................................ 10
2.3.4. Autres outils utilisés ........................................................................................... 11
2.3.4. Mesure de la température ................................................................................... 12
3. Les tests répondant à une problématique particulière....................................................... 12
4. Tests de vérification suite à une intervention du SAV ..................................................... 12
5. L’automatisation des tests de surveillance/maintenance/entretien réalisés au sein de plate- forme ........................................................................................................................................ 13
5.1. Cahier des charges ..................................................................................................... 15
5.2. Automatisation de l’extraction et de l’analyse de PSF.............................................. 16
5.2.1. Logigramme ...................................................................................................... 16
5.2.2. Difficultés rencontrées ....................................................................................... 18
5.2.3. Paramètres configurables .................................................................................. 19
5.2.4. Améliorations apportées suite à la présentation en interne de cette macro........ 20
5.3. Automatisation de l’extraction et de l’analyse d’Homogénéité de champ ............ 21
5.3.1. Logigramme ...................................................................................................... 21
5.3.2. Difficultés rencontrées ....................................................................................... 23
5.3.3. Paramètres configurables .................................................................................. 23
5.3.4. Améliorations apportées suite à la présentation en interne de cette macro........ 24
5.4. Automatisation de l’extraction et de l’analyse de Co-alignement............................. 25
5.4.1. Logigramme ...................................................................................................... 25
5.4.2. Paramètres configurables .................................................................................. 26
6. Perspectives....................................................................................................................... 27
7. Apport personnel............................................................................................................... 28
Bibliographie............................................................................................................................ 30
Annexe
Organigramme de la plate-forme MRI
1. Introduction
1.1. Présentation du master
Le Master biologie santé spécialisé en imagerie pour la biologie est un Master
professionnel qui se répartit sur deux ans.
Cette formation permet aux étudiants d’avoir une approche pluridisciplinaire (physique,
informatique, biologique et commerciale) et de connaitre les différents aspects d’imagerie
utilisés en biologie et ainsi leurs utilisations en recherche fondamentale et appliquée mais
également d’en comprendre le fonctionnement général. Cette formation permet aux étudiants
d’avoir les bases juridiques et commerciales grâce aux enseignements de droit, gestion,
financement et techniques de vente pour évoluer dans une entreprise.
Cette formation forme des cadres scientifiques se situant entre les sociétés de
distributions et les centres de laboratoires de recherche privés et publics afin de répondre au
mieux à la demande des scientifiques utilisateurs de ces techniques.
Les étudiants de cette formation suivent un stage de trois mois pendant la première
année et un stage de six mois pendant la seconde année de formation dans un laboratoire de
recherche ou dans une entreprise.
1.2. Présentation de la plate-forme MRI
Montpellier RIO Imaging est la plate-forme régionale d’imagerie du Languedoc-
Roussillon, cette structure est labellisée IBiSA (Infrastructures en Biologie Sante et
Agronomie). Elle est rattachée à l’UMS Montpellier BIOCAMPUS (UMS3426). Elle est
dédiée au soutien à la production de données, de résultats et de connaissances nécessitant des
moyens optiques (microscopie, cytométrie et microtomographie RX). Elle est ouverte à toutes
les entités publiques ou privées, sans limitation thématiques ou géographiques.
La plate-forme est certifiée ISO : 9001 version 2008 pour ce qui est de sa prestation
« mise à disposition des machines ». Cette prestation est payante et les frais payés par ses
utilisateurs correspondent au fonctionnement de MRI, à la maintenance de ses équipements,
les salaires de son personnel à durée déterminée et la formation de ses agents.
1
Le parc matériel est composé de 59 stations de travail environnées par des ingénieurs
dédiés (14,3 ETP) qui enassurent l'entretien, la maintenance et l’évolution. Le personnel
assure également la formation et l'assistance des utilisateurs. Actuellement, ces moyens sont
répartis sur 11 plateaux techniques organisés en trois domaines méthodologiques : la
microscopie optique (6), cytométrie (6) et la tomographie à Rayons X (1). Les utilisateurs
proviennent d'unité de recherche en végétal et l’animal dédié à l’agronomie et la santé
humaine.
Campus Arnaud de Villeneuve/IFR3
Organigramme de service imagerie
2
Figure A : répartition des équipements du plateau d'imagerie de l'IGH
La structure distribuée de Montpellier RIO Imaging suit étroitement la répartition
géographique des laboratoires d'appui de MRI.
Le fonctionnement des différents sites est identique et une cellule de gestion et de
soutien commune, faisant l’union entre les plateaux (MRI-UNION) assure la gestion
administrative et la gestion des systèmes et réseaux (6,6 ETP).
Le Plateau de la structure d’accueil.
Le plateau Montpellier RIO Imaging localisé dans les locaux de l’Institut de génétique
humaine de Montpellier est situé sur le Campus Arnaud de Villeneuve, regroupant la faculté
de Médecine, 3 des principaux hôpitaux de Montpellier (Lapeyronie, La Colombière et
Arnaud de Villeneuve), la délégation régionale de l’INSERM et 3 principaux instituts de
Recherches (environ 450 chercheurs) : l’Institut de Génétique Humaine (IGH), l’Institut de
Génomique Fonctionnelle (IGF) et le Centre de Biochimie Structurale.
L’IGH est une unité propre de recherche du CNRS (UPR 1142) qui a pour objectif de
réaliser une recherche fondamentale d’excellence et de conduire celle-ci jusqu’à ses
retombées dans le domaine de la pathologie. Les principaux thèmes de recherche concernent
la dynamique du génome et de la chromatine, la génétique du développement, le contrôle
épigénétique, et les pathologies moléculaires et cellulaires.
Le plateau Montpellier RIO Imaging de l’IGH comprend 15 stations de travail dédiées à
la microscopie optique et deux cytomètres en flux. Le personnel est constitué de deux
ingénieurs de Recherche. En plus des équipements gérés par MRI, 3 stations (microscope à
épifluorescence) sont en accès libre (figure A).
1.3. La démarche qualité
Montpellier RIO Imaging a engagé depuis 2008 une démarche qualité. Elle est certifiée
depuis 2009. Cette démarche qualité s’organise autour de la norme ISO : 9001. C’est un gage
d’une attention particulière apportée à l’organisation et au bon fonctionnement de la plate-
forme. De façon cohérente avec ce souci d’offrir aux utilisateurs une prestation à la hauteur de
leurs attentes, une démarche systématisée et parallèle de « Surveillance, Maintenance et
Entretien » (appelée également « Metrologie ») des équipements des appareils a été mise en
place.
3
Figure B : Les différents types de tests métrologie
Cette approche se décline, en fonction des microscopes, le long de cinq directions
(figure B) :
• le suivi des conditions d’environnement des pièces et incubateurs placés sur les
microscopes. La température des pièces non sensibles ne varie pas de plus de 5 degrés.
• le suivi des performances spatiales des objectifs avec la mesure de la résolution
latérale et axiale
• le suivi des corrections chromatiques des optiques (mesures de coalignement)
• le suivi de l’homogénéité de l’illumination en microscopie à fond clair (pour les
vidéomicroscopes) et en épifluorescence.
• Enfin, pour les appareils dédiés à l’observation d’échantillons vivants, le suivi de
l’éventuelle dérive en X, Y et Z.
1.4. Protocole des actions de Maintenance préventive des appareils.
Dans le cadre de sa prestation, MRI s’engage à réaliser différentes actions préventives
selon les appareils. Le descriptif par poste des actions menées est indiqué pour chaque
appareil (par exemple pour notre LSM780, http://www.mri.cnrs.fr/index.php?m=18&i=81, le
descriptif est accessible sur http://www.mri.cnrs.fr/datas/fichiers/528.pdf et la prestation décrite
sur http://www.mri.cnrs.fr/datas/fichiers/529.pdf). Ces documents, contractuels, présentent le
minimum des actions réalisées périodiquement. En réalité, les actions effectuées recouvrent
un champ plus large (par exemple pour les visites mensuelles qui sont en pratique plus
fournies que ce qui est contractuellement décrit).
Différentes visites sont donc prévues et font intervenir du personnel interne habilité et
du personnel extérieur (prestataire, en général le fournisseur de l’appareil). Le protocole de
travail mis en place par la plate-forme (avec la participation de F. Legrand, un ancien stagiaire
de notre Master, annexe 1 et 2) utilise des outils mis en place par le groupe de travail
MRCT/RTmfm (Missions Ressources et Compétences Technologiques/Réseau
Technologique Microscopie Photonique de Fluorescence Multidimensionnelle). Ce groupe,
sous l’impulsion de F. Cordelières et C. Mathews en particulier, s’est inspiré d’articles
concernant la métrologie comme ceux de Robert M. Zucker (1-3) ou J.M. Zwier (SIPCharts,
4,5). Ces outils sont regroupés dans une collection de plugins du logiciel ImageJ appelée
4
MetroloJ et récemment mis à disposition de la communauté scientifique internationale. Les
visites de maintenance mensuelles durent en moyenne deux heures et l’analyse des résultats
(telle que réalisée sur le plateau d’imagerie localisé à l’IGH) utilise le plugin Generate Field
Illumination Report sur une petite dizaine d’images. Les visites annuelles réalisées par le
personnel de MRI durent une journée pour ce qui est de l’acquisition et génèrent des centaines
d’images à analyser avec différents plugins, ce qui peut prendre jusqu’à une journée de temps
d’analyse. Le but principal de mon stage était d’automatiser l’utilisation de ces outils de façon
à i) augmenter la réactivité du personnel en cas de défaut constaté ii) faire gagner du temps au
personnel réalisant les visites de maintenance, iii) optimiser la.validité statistique des mesures.
Les différents objectifs de mon stage étaient donc :
De me familiariser avec les visites de maintenance (mensuelle et annuelle) sur le
parc de microscopes et macroscopes du plateau MRI localisé à l’IGH. Faute de
personnel adéquat, les ingénieurs du parc d’imagerie de l’IGH ont également pris en
charge les cytomètres localisés dans le bâtiment et j’ai également été amené à
effectuer nettoyages et calibration de ces appareils.
D’apporter d’éventuelles modifications aux fiches de maintenance afin de les
adapter au mieux.
De rédiger le cahier des charges concernant la réalisation des macros automatisant
l’utilisation de la collection MetroloJ, de construire ces macros avec mon responsable
de stage et de les valider pour ensuite les présenter aux ingénieurs plateau concernés.
Dans ce cadre également, j’ai suivi une formation de trois jours organisée par V.
Baecker, M. Lartaud et J. Cau sur l’utilisation d’ImageJ et la rédaction de macros.
D’assurer un suivi des installations de ces macros, une aide à l’utilisation éventuelle
et de formaliser le retour d’expérience des ingénieurs concernant les difficultés
rencontrées, les éventuels bugs identifiés et les améliorations suggérées.
De façon plus large, m’imprégner des différentes activités liées au travail sur une
plate-forme scientifique, ceci tant directement, dans la vie de tous les jours avec les
utilisateurs du plateau, qu’indirectement en observant le fonctionnement interne de la
plate-forme. Ainsi, j’ai fait partie intégrante du plateau et participé à la formation des
utilisateurs sur différents appareils. Je me suis graduellement mis à leur disposition
pour répondre à l’ensemble de leurs questions.
5
Zeiss Stereomicroscope Zeiss Stereomicroscope
SIM OMX & PDV
Zeiss LSM510 META Confocal Zeiss LSM780 Confoca Leica Macroconfocal LSI
Leica DM6000 Leica DMRXAPiezo Zeiss Axiovert200M Zeiss Axioimager Z1 Apotome
2. Protocoles de maintenance mensuel et annuel des microscopes
2.1 Parc Matériel
Au cours de mon stage, j’ai été amené à utiliser différents microscopes de différentes
marques et modèles et contrôlés par des logiciels variés. Ce stage m’a ainsi permis de me
familiariser avec des outils et des notions théoriques abordées dans le cadre des
enseignements de mon Master.
J’ai réalisé, sous la direction de mon responsable de stage, le Dr. J. Cau, des visites
mensuelles dans un premier temps, puis à partir du mois de Juin des visites annuelles.
Les modèles de microscopes sont :
• Microscopes inversés : Axiovert200M et AxioObserver
• Microscopes droits : DMRA2, DMRXA, DM6000, AxioImagerZ1
• Stéréomicroscopes : MZIIFL, M2BIO
• Macroscopes : Macrofluo
Le plateau est équipé de trois microscopes confocaux (Zeiss LSM510 META, LSM780
et Leica TCS SPE) et d’un macroconfocal (Leica TCS LSI). Il héberge également un
microscope SIM OMX (Applied Precision) et son microscope inversé PDV, sous la
responsabilité d’un ingénieur dédié. Sans avoir utilisé ni effectué la maintenance de ces deux
derniers appareils, j’ai suivi sa mise en place avec son responsable le Dr. J. Mateos-Langerak.
Ce parc matériel, divers, a été pour moi l’occasion de me familiariser aux différents
composants du microscope (diaphragmes, prismes, etc…) et de retrouver ces éléments sur un
microscope inconnu, tant ils sont répartis de façon différente d’un appareil à l’autre.
6
Figure C1 : éclairage de Koehler
Figure : C2 : Réalignement des anneaux de phase
2.2. Principe des visites mensuelles et annuelles
L’idée de ces visites est de s’assurer que l’appareil mis à disposition des utilisateurs est
optimal. Les visites de maintenance mensuelles sont relativement modestes de façon à ne pas
mobiliser le personnel aux dépens de ses autres activités.
Dans un premier temps, une inspection du cahier de vie de l’appareil est effectuée afin
de vérifier un éventuel problème d’utilisation qui n’aurait pas été signalé autrement.
Dans un second temps, on s’assure que le microscope est propre et correctement réglé :
• Une inspection visuelle des objectifs est réalisée sous loupe binoculaire. Des images
sont prises des objectifs nettoyés. J’ai pu constater à quel point les objectifs sont sales
lors de ces visites dont la fréquence de nettoyage devrait être quasi journalière, au vu
de l’utilisation intensive du matériel. Le nettoyage est réalisé avec un matériel adapté
(écouvillons et solution de nettoyage).
• Une inspection rapide du condenseur et de l’éventuelle présence de débris
• Un réglage de Koehler (figure C1) pour un objectif (le réglage étant en général
suboptimal pour les autres objectifs du microscope) associé à une inspection du plan
focal arrière de l’objectif.
• Le cas échéant, un réalignement des anneaux de phase (figure C1) est effectué à l’aide
d’un téléscope de phase en visualisant le plan focal arrière de l’objectif
Dans un troisième temps, on vérifie un paramètre élémentaire nécessaire à la
quantification du signal en microscopie de fluorescence : le centrage et l’homogénéité du
champ d’illumination (en utilisant des lames en plastique où un fluorochrome est inclus).
Cette vérification est à minima visuelle, mais nous prenons systématiquement des images
pour un objectif 10x et un objectif à immersion (en général un 63x, le plus utilisé par les
utilisateurs) et 4 cubes de fluorescences (adaptés à des fluorochromes bleu, vert, orange/rouge
et rouge profond). Sur les microscopes confocaux et SIM, les puissances LASER sont
mesurées avec une puissance mètre et les valeurs notées.
Les visites mensuelles, faute de temps, se cantonnent à ces points. Différents détails
sont ensuite vérifiés : horodatage de la source de fluorescence, éventuelles mises à jour
7
Windows en attente, effacement des données plus vieilles qu’un mois (systématisé par un
script depuis) validité des définitions virales et enfin présence suffisante pour un mois d’huile
à immersion dans la burette et de papier optique.La température des pièces est enfin relevée et
archivée. Le nombre de points de mesure (toutes les trente minutes) supérieurs ou inférieurs
aux limites fixées est analysé et une éventuelle mesure corrective apportée (réglage de la
température de garde de la climatisation/bloc chauffant, nettoyage des filtres).
Une fiche mensuelle (voir annexe 3) récapitule ces informations et est stockée en
version papier et informatique. La visite mensuelle et les éventuelles remarques qui en
découlent sont consignées sur le cahier de vie de l’appareil. Les mesures correctives sont
mises en œuvre et les défauts/réparations sont communiquées aux utilisateurs via l’interface
de réservation.
Les visites annuelles sont plus ambitieuses et permettent d’avoir un certain recul sur
l’appareil. Elles reprennent tous les points de la visite mensuelle auxquels s’ajoutent :
‐ un suivi des détecteurs (CCD, PMT) ou le bruit (CV pour les PMT) et la présence de
pixels morts/chauds/froids est mesuré (CCD). Le cas échéant, les différents détecteurs
d’un appareil sont comparés entre eux.
‐ Un suivi des puissances LASER pour les appareils équipés. Les valeurs mensuelles
sont analysées, l’éventuel réalignement/remplacement au cours de l’année est
consigné sur la fiche. La puissance est mesurée (la visite annuelle fait office de visite
mensuelle le mois où elle est réalisée).
‐ un suivi des corrections chromatiques spatiales (latérales, longitudinales) est effectué
pour tout objectif de grandissement >40x en utilisant des billes de 4um fluorescentes
marquées pour 4 canaux. Ce suivi permet d’assurer aux utilisateurs que l’éventuelle
colocalisation ou absence de colocalisation observée est vraie, aux limitations
physiques de l’appareil près.
‐ Un suivi des performances en termes de résolution des objectifs des appareils. Il est réalisé avec des billes subrésolution pour les principaux objectifs de chaque poste. La taille des billes utilisées varie de 0.5um (Macroscope) à 0.1um (SIM). Les performances mesurées sont comparées avec les performances théoriques. Pour les microscopes confocaux, les différents miroirs séparateurs/trajets optiques pour l’observation d’un même fluorochrome sont comparés.
8
Figure D : Séquence des tests d’homogénéité du champ
Figure E : Interface et points de mesure du Plug-in MetroloJ – Generate field illumination report.
Figure F : exemple de résultat d’homogénéité du champ fournis sous forme pdf avec les points de mesure
(Centers Location) et les intensités relatives (Profile statistics).
‐ Pour les microscopes confocaux, les différents miroirs séparateurs/trajets optiques
pour l’observation d’un même fluorochrome sont comparés.
Les résultats de ces visites annuelles sont consignés dans une fiche (voir annexe 5) mise à disposition des utilisateurs. Pour chaque type de vérification, un commentaire statuant sur l’état du microscope est indiqué et un commentaire global résume l’état général de l’appareil. Comme pour les visites mensuelles, les valeurs mesurées et les écarts constatés sont replacés dans le contexte des tolérances définies par la plate-forme pour les performances de ses appareils. Lorsqu’un point de mesure est en dehors des spécifications internes, une mesure corrective (envoi de l’objectif en réparation, etc…) est mise en place.
2.3 Utilisation des plugins de la collection MetroloJ.
Lors des visites annuelles, et dans une moindre mesure lors des visites de maintenance mensuelles, les plugins de la collection metroloJ sont utilisés.
2.3.1. Le test d’homogénéité du champ d’illumination
L’analyse de l’homogénéité de champ en fluorescence est réalisée à l’aide d’une lame FluoRef (lames Chroma UV-blue, Green, Yellow and Red). Ce test permet de vérifier la répartition de l’illumination au niveau du champ d'observation. L’homogénéité est enregistrée pour tous les cubes de fluorescence principaux DAPI/GFP ou FITC/Cy3/Cy5 du microscope à champ plein à l’aide de logiciel Metamorph ou Axioimager et pour les raies laser 405, 488, 543 et 633 sur le confocal à l’aide de son logiciel (Figure D). L’analyse des acquisitions s’effectue à l’aide du plugin MetroloJ « Generate field illumination report » sous Image J. Différents paramètres d’acquisition doivent être indiqués dans la fenêtre «field illumination report generator» (Figure E) puis le plug-in se lance, Il est à noter qu’aucun des paramètres n’a d’influence sur le calcul et qu’ils servent à consigner sur le rapport généré les informations sur le type de microscope et la longueur d’onde concernée. En revanche, l’image doit être calibrée (pour lancer l’analyse) et non saturée (pour la validité de l’analyse).
Le plugin trace des profils d’intensité (horizontal et vertical à mi-image et deux
diagonales) en prenant le centre de l’image comme origine du repère, puis il détermine le
centre d’intensité de l‘image et calcule sa distance au centre réelle de l’image. Il détermine
ensuite les intensités de huit points d’intérêt (intersections des quatre ROIs avec les bords de
l’image) et les normalise par rapport au maximum d’intensité de l’image. Enfin, il génère une
image des régions d’isointensités normalisées par rapport au maximum d’intensité de l’image.
Un rapport complet issu de ce plugin est généré sous forme d’un fichier PDF (figure F).
9 9
Figure G : séquence des tests de coalignement
Figure H : interface de Co-alignement report generator
Figure I : Résultats d’analyse de Co-alignement report fournis en document pdf
Deux mesures nous permettent de déterminer les valeurs de centrage et d’homogénéité sur
la totalité du champ d’observation. La distance au centre géométrique du centre d’intensité («
center of intensity») d’une part et les intensités relatives par rapport à l’intensité maximale («
intensity relative to max») d’autre part.
2.3.2. Le test de correction des aberrations chromatiques
Le test de coalignement est effectué à l’aide de lames Tetraspeck beads (que j’ai préparé
pour tous les plateaux de MRI), afin de vérifier l’alignement entre les différentes couleurs
observées. Les billes utilisées ont un diamètre de 4µm. Ce test est extrêmement important car
il joue un rôle prépondérant dans la mesure de colocalisation fréquemment utilisée en
biologie. Ce test consiste à effectuer un Z-stack sur 1 bille d’une lame test pour tous les cubes
de fluorescence principaux DAPI/GFP ou FITC/Cy3/Cy5 du microscope à champ plein à
l’aide de logiciel Metamorph ou Axioimager et pour les raies laser 405, 488, 543 et 633 sur le
confocal à l’aide de son logiciel (Figure G).
L’analyse des acquisitions s’effectue à l’aide du plugin MetroloJ « Generate
Coalignement report » sous Image J. Différents paramètres (ouverture numériques, longueurs
d'onde d'émission des images) sont entrés (Figure H). L’image doit être calibrée dans
l’espace. Un rapport complet issu de ce plugin donne la position des centres d’intensité par
couleur de la bille (pixel où se trouve le maximum d’intensité) ainsi que la distance entre ces
centres. Ce rapport fournit aussi les distances d’incertitudes dans la localisation de ces centres
en fonction des résolutions optiques théoriques calculées à partir de l’ouverture numérique de
l’objectif, du type de microscope (champ plein ou confocal) et des longueurs d’onde
d’émission (Figure I). Lorsque la distance constatée est inférieure à l’incertitude, on considère
la correction chromatique comme optimale.
2.3.3. Mesure de la PSF
La résolution latérale et axiale est mesurée à partir de PSF (Point Spread Function)
effectuées à l’aide de lames de Tetraspeck beads. Les billes utilisées ont un diamètre de 0.2
µm (en général). Ce test consiste à imager un objet ponctuel (une bille) d’un diamètre
inférieur à la résolution optique du système sur lequel la mesure est effectuée (Figure J).
10
Figure J : séquence des tests de PSF
Figure K: interface du plugin Generate PSF report
Figure L: Résultats du PSF report fournis en document pdf
La PSF permet d’extraire les valeurs de résolutions en X, Y et Z d’un appareil optique.
Pour chaque acquisition, il faut se placer dans des conditions d’échantillonnage (en x, y
et z) respectant le théorème de Shannon & Nyquist. Un site dédié permet le calcul de cet
échantillonnage (http://support.svi.nl/wiki/NyquistCalculator). Il suffit, une fois sur le site,
d’entrer le type de microscopie (confocale ou champ plein), l’ouverture numérique de
l’objectif ainsi que les longueurs d’onde d’excitation et d’émission du fluorochrome observé
et de lancer « calculate ». Un Z-stack pour les quatre raies d’excitations principales
405/488/543 ou 561/633 (microscopie confocale) ou les quatre cubes de filtre principaux
DAPI/GFP ou FITC/Cy3/Cy5 (microscopie champ plein) est acquis.
L’analyse des acquisitions s’effectue à l’aide du plugin MetroloJ « Generate PSF report
» sous Image J. L’image doit être calibrée dans l’espace. Différents paramètres d’acquisition
doivent être indiqués dans la fenêtre « PSF report generator » (Figure K). : type de
microscope, ouverture numérique et longueur d’onde. Le plugin génère deux projections
d’intensité maximum XY et XZ, il détermine les coordonnées du maximum d’intensité et les
profils d’intensités passant par le centre, suivant les trois axes. Il ajuste ensuite une gaussienne
à chacun des trois profils et calcule enfin les FWHM et les résolutions théoriques attendues.
Les résultats sont ensuite compilés dans un fichier PDF (Figure L). Les valeurs relevées sont
celles affichées dans le tableau « Resolutions table » (FWHM et Résolution théorique) ainsi
que l’écart entre le profil mesuré et la courbe gaussienne (R²) pour les directions x, y et z. Si
la valeur de R² est inférieure à 0.95 dans une des directions, la bille n’est pas validée pour
cette direction. Cette analyse permet de mesurer la résolution optique de chaque système et de
la comparer aux valeurs théoriques fournies par le rapport. Dans un second temps, cela permet
aussi de comparer les systèmes entre eux.
2.3.4. Autres outils utilisés
Sur un microscope confocal, la comparaison entre les détecteurs se fait à l’aide des
lames FluoRef et avec un seul objectif (10x). Avant toute acquisition, il faut effectuer
l’alignement des pinholes. Le chemin optique doit être le moins variant possible pour, par la
suite, pouvoir comparer les détecteurs entre eux. L’analyse des images se fait sous Image J et
avec le plug-in MetroloJ – Generate CV report. Le Coefficient de Variation (CV= déviation
standard/ moyenne) caractérise le bruit inhérent à un détecteur. La valeur moyenne d’intensité
pour un détecteur permet de comparer leur sensibilité. Il est à noter que cette comparaison se
limite aux détecteurs de même technologie.
11
Figure M : Procédure liée aux dysfonctionnements d'un appareil
Sur un microscope champ plein, à l’aide du logiciel d’acquisition, il faut prendre 10
images avec le shutter fermé et ayant un temps d’exposition de 30 secondes chacune. Une
macro réalisée en interne permet de dénombrer les pixels chauds, les pixels froids et les pixels
morts. Connaître le nombre de ces pixels de la caméra est intéressant pour estimer la qualité
de ses images. Ces pixels sont plus faciles à dénombrer sur une image de noir, leur nombre
augmente avec le temps d’exposition. Un pixel mort est un pixel qui apparaît comme un point
dont l’intensité ne varie plus. Les pixels de l’image ont une intensité moyenne en l’absence de
lumière (bruit moyen) et les pixels ayant une intensité/un bruit double ou moitié sont
considérés comme chaud ou froid respectivement. Une caméra de qualité haut moyen de
gamme peut avoir des milliers de pixels chauds là où une caméra haut de gamme en aura
moins de 10.
2.4. Mesure de la température.
Les mesures des températures des différentes pièces sont réalisées à l’aide d’un
thermomètre USB Escort Console chaque mois.
3. Les tests répondant à une problématique particulière
Ces tests font suite à des observations émises par des utilisateurs et permettent d’évaluer
des problèmes spécifiques sur les différents instruments de la plateforme. Cela permet
l’identification de l’origine d’un problème ou la mise en évidence d’une pièce défectueuse
(Figure M).
4. Tests de vérification suite à une intervention du SAV
Pour des dysfonctionnements ne pouvant être pris en charge par le personnel interne,
un recours au SAV du fabricant de l’appareil est effectué.
Dans ce contexte, l’utilisation de la métrologie intervient en deux temps :
Avant la visite de SAV, elle permet de mettre en évidence un problème récurrent
remarqué par les utilisateurs ou par le personnel. Un test est effectué sur
l’appareil et un rapport contenant les données issues de ce test est
éventuellement communiqué au SAV. Cette opération permet le ciblage du
problème et facilite ainsi le travail du SAV en sachant sur quel domaine ils
doivent intervenir.
12
Figure N : Résultats de l'analyse manuelle d'un ensemble de 444 billes
Après l’intervention, des tests métrologie sont réalisés afin de contrôler
l’intervention du SAV. Ce suivi permet de valider ou non l’intervention du
SAV. Il permet aussi de déterminer les valeurs de référence pour un instrument
car les valeurs issues des tests après une visite du SAV sont celles acceptées par
le constructeur pour son appareil (Figure M).
L’utilisation des tests métrologiques vise à améliorer l’intervention SAV des différents
fabricants. La réalisation de ces tests permet l’établissement de diagnostics des pannes et
valident le bon fonctionnement de l’appareil suite à l’intervention du SAV.
5. Automatisation des tests de surveillance/maintenance/entretien
réalisés au sein de la plate-forme :
Au cours de mon stage j’ai procédé dans un premier temps, avec l’ingénieur en charge
des appareils, aux visites de métrologie mensuelles. En parallèle, j’ai effectué un ensemble
d’analyses afin de me familiariser avec l’utilisation des plugins de la collection MetroloJ.
Ainsi, dès le début de mon stage, j’ai réalisé, à la demande de mon responsable, des
acquisitions pour des tests de PSF sur un microscope Leica DMRXA et un objectif 100x PL
APO 1.4 oil. Pour cela, j’ai fabriqué des lames de billes Tetraspeck de taille subrésolution et
acquis des piles d’images. Un ensemble de 14 stacks de 4 couleurs a été analysé. Ces sets
d’images contenaient 444 billes, dont 348 ont été validées et j’ai effectué l’analyse
manuellement pendant 4 jours. Hormis le lancement du plugin Generate PSF Report sur des
images calibrées non saturées et ne contenant qu’une seule bille, il est ensuite nécessaire
d’opérer un tri des résultats. En effet, lorsque la courbe de fit gaussien s’écarte trop des
valeurs mesurées le long d’un des 3 profils X, Y ou Z, la valeur de résolution (FWHM,
largeur maximum à mi-hauteur du pic de la courbe de fit) n’est pas retenue et non prise en
compte. Les valeurs de résolution mesurées sont indiquées dans la Figure N. Le but de cette
expérience était de me faire comprendre que l’analyse des images de billes effectuée
manuellement est répétitive et nécessite un temps conséquent. Or cette expérience n’a été
effectuée que pour un type d’analyse (PSF) et pour l’objectif d’un appareil. Sur les 9
microscopes/macroscopes soumis contractuellement aux visites de maintenance, chaque mois
13
140 analyses d’homogénéité de champ sont effectuées (pour 2 objectifs du poste, en général
pour 4 fluorochromes et sur 2 images).
Pour ce qui concerne les analyses annuelles :
‐ 300 analyses d’homogénéité de champ (tous les objectifs pour en général 4
fluorochromes, sur deux images)
‐ 5 analyses de coalignement par objectif éligible (grandissement>40x) soit 100
analyses de coalignement 4 couleurs et 15 analyses 3 couleurs (le poste Axiovert200M
ne possède pas de cube de fluorescence « Rouge Profond »). Ceci implique 445 piles
d’images de billes monocanaux et nécessite de lancer 345 fois le plugin Generate
Coalignement Report (en effet le plugin ne prend en compte qu’une analyse 3 canaux,
il est donc nécessaire de le lancer 3 fois pour arriver à toutes les combinaisons de 2
canaux des sets d’images 4 canaux).
‐ 5 analyses de PSF par objectif éligible (grandissement>40x) pour en général 4
couleurs, soit un total de 445 lancements du plugin Generate PSF Report.
Ces analyses sont donc très consommatrices de temps. La mise en place d’actions de
métrologie s’est ajoutée aux tâches quotidiennes du personnel. Au regard du temps nécessaire
à ces analyses, essentiellement lié à des tâches répétitives et peu valorisantes, le risque est de
voir se développer une démotivation du personnel et une dégradation de cette analyse
rigoureuse du parc matériel.
Le principal but de mon stage était de mettre en place une solution automatisée pour ces
analyses de façon à permettre un gain important de temps et améliorer le déroulement
quotidien de la vie de la plateforme.
Nous avons choisi de développer des macros sous ImageJ permettant de lancer
automatiquement les plugins de la collection MetroloJ. Ce choix était motivé par le fait qu’il
n’était pas nécessaire de réinventer des outils déjà existants en transposant les plugins
MetroloJ dans un autre logiciel d’analyse d’image. Par ailleurs, le « J » indique que le
programme a été écrit en Java, ce qui en fait un logiciel utilisable sur différents systèmes
d'exploitation.
Enfin, c’est un logiciel libre, on peut l’installer sans droits administrateurs. Il se
présente sous la forme d'une barre de menu qui ouvre des fenêtres de données. La plupart des
opérations courantes de traitement d'images sont réalisables avec ImageJ. Il est très complet
pour l’analyse d’image (co-localisation, traitement de stacks (pile d'images), colorimétrie,
recherche de contours, segmentation, projection z, overlay, filtres, 3D, création d'animations
14
Logiciel Image J
.AVI .GIF, déconvolution 3D,…) permettant de créer des macros (succession automatisée
d'appels de commandes) et des plugins (plus complexes, en langage JAVA).
L’automatisation de l’analyse a été effectuée pour les 3 plugins de la collection
MetroloJ les plus utilisés. Les analyses de CV ne touchant que les seuls détecteurs d’un
microscope confocal et les analyses de pixels morts/chauds/froids ne se faisant qu’une seule
fois par poste, nous n’avons pas automatisé leur utilisation.
Dans un premiers temps, j’ai établi un cahier des charges des différentes actions à
automatiser avant et après le lancement de chacun de ces plugins.
5.1. Cahier des charges : Le premier choix technique effectué était que chacun de ces scripts/programmes devait
être autosuffisant, c’est à dire une fois lancée, ne pas appeler d’autre élément que le plugin de
la collection MetroloJ adéquat.
Le second choix était d’utiliser le langage Macro. Nous avons choisi des macros plutôt
qu’un plugin dans la mesure où ce langage est plus accessible et suffisant aux tâches que nous
ambitionnions.
Le troisième choix technique était de placer en tête de chaque macro des paramètres
facilement configurables par une personne n’ayant que peu de connaissances du langage
Macro de façon à ce que ces macros ne soient pas restreintes à un nombre de canal donné (et
qu’il puisse être modifié), à des canaux précis ou à des spécifications techniques maison
données (paramètres de choix déterminant si le paramètre mesuré, par exemple la résolution,
est conforme aux tolérances de la plate-forme).
Le degré d’automatisation a ensuite été choisi :
• En mode dit « interactif » l’utilisateur sélectionnera un set d’image à analyser
• En mode batch, toute image portant un nom stéréotypé (par exemple contenant
« 100x » ou « DMRXA ») est traitée automatiquement
15
Figure O. Logigtramme MacroAutomatic PSF Report.
Lancer la macro
Choisir le fichier qui contient les images à traiter
Image Calibrée ?
oui
Trouver les billes en 2D
Mesurer l’intensité max
Bille isolée et loin des bords ?
oui
Analyse PSF sur 4 canaux (metroloJ)
Compilation et enregistrement des résultats (moyenne, déviation, rapport réel /théo)
oui
calibrer
non
Bille saturée ?
oui
Tous les R2> 0.95 ?
trash
non
trash
trash
non
Lancement automatique du plugin MetroloJ/PSF Report
Les greffons automatisés sont :
‐ Generate PSF Report : ce plugin permet la mesure de la résolution à partir de PSF
(Point Spread Function). Le profil d’intensité X, Y et Z de la PSF est tracé et la
FWHM des profils pour chaque direction est mesurée. Un autre plugin permet une
mesure alternative (Generate Axial Resolution Report) de la résolution axiale à partir
d’un miroir. Il n’est pas utilisé par la plate-forme. La version automatisée (Macro
Automatic PSF Report) permet d’identifier des billes dans une pile d’images n
canaux donnée ou à partir de toute pile monocanal identifiée automatiquement sur la
base d’un nom contenant un TAG donné.
‐ Generate Field Illumination Report : ce plugin permet l’analyse d’une image d’une
lame contenant de façon homogène un fluorochrome. La Macro permettant son
automatisation est Automatic Field Illumination Report et permet de lancer une
analyse sur un set d’image donné ou sur toute image contenant différents TAGs dans
son nom (100x, GFP, etc…).
‐ Generate Coalignment Report : ce plugin permet de contrôler le coalignement des
différents canaux d’une bille multimarquée. Son automatisation a porté sur un set
d’image (mode interactif).
J’ai ensuite effectué les analyses manuellement et repérer les différents points critiques
et enfin tracer différents logigrammes reprenant le processus en amont (préparation des
images) et en aval (traitement des résultats).
5.2. Automatisation de l’extraction et de l’analyse de PSF: 5.2.1. Logigramme:
Nous avons identifié les différentes étapes suivies lors d’une analyse manuelle (Figure
O). Ces étapes ont été retranscrites dans un logigramme. Dans un premier temps, la macro
identifie et ouvre les images à traiter (en un seul fichier multichannel ou en plusieurs fichiers
single Channel séparés). La macro vérifie ensuite si l’image est calibrée. Le cas échéant, une
calibration XYZ est demandée et appliquée à toutes les images suivantes. Le postulat choisi
est que toutes les billes ont la même calibration et proviennent du même objectif.
Les billes sont ensuite identifiées. Un lissage (flou médian radius 1) est effectué pour
éliminer les éventuels pixels morts qui seraient identifiés à l’étape suivante. Cette étape
identifie des maxima d’intensité locaux (fonction find maxima d’ImageJ) en fonction d’un
16
Figure P. Exemple de fichier parameters_log généré par la macro Automatic PSF Report.
Figure Q. Exemple de fichier de traitement des billes d'une image généré
par la macro Automatic PSF Report.
seuil local. L’analyse n’est pas effectuée en volume mais sur une projection d’intensité
maximum. Cette projection est effectuée sur le premier canal sélectionné.
Les positions des différents maxima sont ensuite identifiées. Par bille, un carré d’une
taille en pixel configurable est tracé sur la projection. Si ce carré sort des bords de l’image (et
donc si la bille est trop près de ces bords), la bille est abandonnée et la prochaine analysée. La
macro vérifie ensuite que dans le carré centré autour de la bille ne contient pas d’autre bille
(en relançant find maxima et en s’assurant que le nombre de maxima est de un).
Si tel est le cas, un carré centré autour du maximum identifié est tracé dans chacune des
piles contenant un canal donné. L’étape suivante est de vérifier que la déviation standard de la
distribution d’intensité dans l’axe du maximum local identifié n’est pas nulle (pixel mort).
Cette étape est redondante avec le lissage préalable, mais n’a pas été enlevée. Enfin, la
saturation éventuelle de la bille dans le carré est vérifiée. Si la bille n’est pas saturée, le plugin
Generate PSF Report est lancé. Ainsi, le plugin peut être lancé pour une bille donnée pour un
canal non saturé et pas pour d’autres, saturés.
Toutes les billes sont identifiées et analysées soit, en mode interactif, pour les images
sélectionnées par l’utilisateur, soit, en mode batch, pour toutes les images contenant un TAG
donné. Dans ce cas l’utilisateur indique un élément commun (TAG) contenu dans tous les
noms des images à analyser (par exemple « 100x »). Dans le cas de fichiers monocanaux, un
second TAG indiquant la couleur est utilisé (par exemple « GFP »). Un fichier
DMRXA100xGFP.stk sera donc sélectionné. Dans tous les cas, seuls les fichiers images sont
sélectionnables. Ces fichiers sont triés sur la base de leur extension (« .stk », « .lsm », etc…).
Les affichettes (« DMRXA100xGFPThumb.stk » par exemple) sont exclues.
A cette étape, différents fichiers intermédiaires ont été créés. Des fichiers logs liés à la
Macro (paramètres figure P, traitement des billes figure Q), les images de chaque billes et le
résumé des images analysées et du nombre de billes et reports générés par image. Ces fichiers
sont stockés dans un dossier /Processed/Nom, le nom étant celui donné par l’utilisateur dans
un des champs de la Macro. Dans ce dossier sont également stockés les documents dérivés
liés au plugin, fichier pdf, images des profils d’intensité, mesures et résumé des mesures dans
différents fichiers excel. Le nom des documents générés est identique. Ainsi, pour une bille
donnée d’un canal donné, il est aisé de trouver la mesure de PSF et les profils générés par le
plugin.
Un récapitulatif des mesures pour les différents images/billes/canaux est ensuite généré.
Tous les fichiers .xls du dossier /Processed/Nom sont identifiés de façon récursive (même
s’ils se trouvent dans un sous-dossier). Les fichiers summary.xls sont ouverts et par direction,
17
Figure R. Exemple de fichier Récapitulatif de mesures de PSF
la précision du fit (coefficient R2) de gaussienne par rapport au profil mesuré est analysée. Si
elle est inférieure à un seuil donné (R2Threshold), la mesure est écartée pour cette direction.
Les mesures sont ensuite stockées dans un tableau Result. La valeur moyenne et l’écart type
par canal et par direction est ensuite calculée et comparée à la valeur théorique. L’ensemble
est consigné dans un document Summary.txt. (Figure R).
5.2.2. Difficultés rencontrées :
Lors de la réalisation de la macro nous avons suivi ce cahier de charge. Au cours de
l’écriture de la macro j’ai rencontré énormément de difficultés car je n’avais auparavant
jamais suivi de formation en programmation/langage informatique. Grâce à l’aide de mon
responsable j’ai maîtrisé peu à peu les bases du langage de programmation Macro sous image
J et j’ai pu participer à la réalisation des macros. Pendant l’écriture de la macro, nous avons
apporté de nombreuses modifications, afin de corriger les bugs, de l’adapter à l’analyse de
différents formats de fichier et de l’améliorer. La première version de la macro nous a permis
d’analyser les 355 billes préalablement analysées manuellement en 4 jours en 35 minutes
(Figure R).
J’ai ensuite validé, pour toutes les versions de cette macro, les différents formats utilisés
sur la plate-forme (voir annexe 4). Les formats .zvi, .lif et .dv ont posé des problèmes
différents :
‐ le format .zvi (format multicanaux des microscopes Zeiss contrôlés par le logiciel
Zeiss Axiovision) est ouvert, selon la configuration en plugin, en un hyperstack
composite (avec le lecteur LOCI Bioformat correctement configuré) ou avec le lecteur
INPUT/OUTPUT Zvi Reader, en autant de fenêtre que de canaux. Dans ce cas, chaque
fenêtre ouverte à un titre (pas un nom) avec le nom original du fichier zvi et le numéro
de canal à l’acquisition. Il a été nécessaire de prendre cela en compte pour ne pas
apporter de complexité supplémentaire à l’utilisation de cette Macro. Ainsi, quelle que
soit la configuration d’ImageJ, les images sont correctement ouvertes.
‐ Le format .lif (format multiimage multicanal des microscopes Leica contrôlés par le
logiciel Leica LASAF) contient plusieurs images. Il est possible d’ouvrir tous les
images contenues dans ce fichier. Dans ce cas, leur titre (et non leur nom), contient
d’une part le nom du fichier et d’autre part le nom de l’image tel que rentré dans
18
des problèmes de mémoire), toutes les images d’un fichier .lif et les sauvant en .tif
avec le nom de l’image contenu dans le titre. Comme il n’est pas nécessaire
d’effectuer cette tâche pour toutes les images contenues dans ce fichier, nous avons
choisi de ne pas intégrer ce « LIF splitter » dans nos macros. Par ailleurs, il ne touche
que 2 postes sur tout le parc de Montpellier RIO Imaging.
‐ le format .dv (pour ce qui est du .dv générés par notre Applied Precision OMX)
contient une calibration erronée des images. La partie contrôlant l’absence de
calibration dans une image est effectuée comme dans les plugins MetroloJ (ou du
moins comme nous pensons que c’est fait) : si dans les propriétés de l’image, l’unité
est pixels ou que width/heigth est 0, l’image est non calibrée. Les images .dv ont une
unité « microns » et un width/heigth de 1 (non calibrées). Nous avons donc dû en tenir
compte. Au final, une image est réputée non calibrée si son unité est
pixels/microns/micron et que la valeur de Width est 0 ou 1.
5.2.3. Paramètres configurables:
La première version de la macro était conçue pour l’analyse d’une à plusieurs images
contenant 4 canaux bleu/vert/rouge/rouge profond. Nous avons modifié cela de façon à
permettre à l’utilisateur de sélectionner les canaux qu’il souhaite analyser parmi une liste.
Ainsi, notre poste Axiovert200M ne contenant pas de cube Cy5/Rouge Profond, nous
pouvons lancer la macro sur les seuls trois premiers cubes.
Pour les images multicanaux, la sélection des couleurs dans le premier menu (voir annexe 5)
sous-entend que les images multicanaux analysées contiennent le nombre exacts des couleurs
sélectionnées, dans l’ordre des couleurs indiqué dans le menu.
Différents paramètres sont donc configurables dans la macro :
• R2 threshold (ligne 4) : modifier la valeur de R² du fit sur une dimension (X, Y ou Z)
en dessous de laquelle une bille n’est plus analysée pour la dimension concernée. Ce
seuil est fixé à 0.95 (une bille de R2 de 0.94 pour une direction ne sera pas prise en
compte pour cette direction dans le calcul des valeurs moyennes/déviation standard
des billes).
19
• Beads (ligne 7) : dans ce tableau, modifier les valeurs ou en ajouter/supprimer pour
changer le nombre et le nom des canaux. Le nom du canal est inscrit dans le nom. Il
est important de faire en sorte, pour que le résumé des mesures soit correct, que le
nom d’un des canaux ne soir pas contenu dans un autre comme dans « Red » et
« DeepRed ». Pour cela, nous avons placé « Ch » devant le nom : « ChRed » n’est pas
contenu dans « ChDeepRed ».
• wavelength (ligne 8) : dans ce tableau, modifier les valeurs ou en ajouter/supprimer
pour changer la valeur des longueurs d’ondes correspondant aux canaux.
• RealOverTheoThreshold. (ligne 5) : il s’agit du seuil au-dessus duquel les
performances d’un objectif par rapport aux performances théoriques ne sont plus
correctes. Il est fixé à 2 pour la plate-forme (un objectif ayant une résolution latérale
2.1x supérieure à la résolution latérale théorique sera considéré comme non-
conforme). Voir ci-dessous.
• beadQualityThreshold. (ligne 6) Il s’agit du seuil du rapport déviation
standard/moyenne à partir duquel un message avertira l’utilisateur que les images de
billes sont soit très variables soit de faible qualité et l’invitera à analyser toutes les
images de billes. Ce seuil est fixé à 20% (0.2). Une analyse donnant une résolution
mesurée en X de 215nm +/- 53nm (rapport de 0.24) sera signalée comme suspecte.
Voir ci-dessous.
5.2.4. Améliorations apportées suite à la présentation en interne de cette macro :
Après discussion, nous avons modifié la macro de façon à rendre optionnel la
sauvegarde de tous les fichiers logs et images de billes ne résumant pas les résultats.
Par ailleurs, nous avons implémenté un calcul simple indiquant un score :
‐ d’astigmatisme : l’astigmatisme entraîne une distorsion des PSF leur faisant perdre
leur symétrie radiale dans un plan XY. La PSF est plus étirée dans une direction pour
un plan, et dans la direction orthogonale pour un plan supérieur par exemple. Nous
avons implémenté un score d’astigmatisme qui correspond à la valeur absolue de la
différence entre la résolution X et Y divisée par la plus forte des deux résolutions. Plus
ce score est élevé, plus la différence est importante. Sans prétendre à rendre ce score
20
‐ totalement efficace pour détecter un astigmatisme, il peut identifier un cas facile
d’astigmatisme (d’où le nom de score).
‐ D’aberration sphérique. L’aberration sphérique n’affecte que peu la valeur de
résolution latérale, en revanche la valeur de résolution axiale est fortement dégradée.
Nous avons conçu un score simple que nous suivrons et comparerons au cas avec et
sans aberration sphérique (nous avons des objectifs qui ont cette aberration « par
design ») de façon à sortir des valeurs indiquant une susceptibilité d’aberration
sphérique. Ce score est le ratio résolution axiale sur moyenne de résolution latérale (X
et Y). Encore une fois, ce score n’ambitionne pas d’être parfait, juste d’indiquer une
éventuelle plus forte probabilité de défaut.
En l’état, ces deux scores ne sont pas utilisés dans nos fiches de maintenance et un suivi
sera réalisé de manière à étudier leur puissance informative et l’opportunité de les inclure
dans la fiche.
Enfin, nous avons implémenté dans le fichier Summary.txt une phrase indiquant si
l’objectif est conforme aux tolérances internes, par canal. Pour cela nous avons créé un seuil
(RealOverTheoThreshold) à partir duquel, si le ratio résolution mesurée/théorique est
supérieur, une phrase indiquant une non-conformité est ajoutée : « Summary: Objective
performances below defined specifications for channel(s): ChBlue. »
Un seuil de qualité des billes a été ajouté, utilisant la déviation standard des mesures
de résolution. Lorsque le ratio déviation standard/moyenne est supérieur à ce seuil, cela
signifie que les images de billes sont très variables et une phrase indiquant un risque d’images
aberrantes est ajoutée : « Poor bead quality, check images/beads ».
5.3. Automatisation de l’extraction et de l’analyse d’Homogénéité de
champ
5.3.1 Logigramme:
Nous avons suivi la même démarche que précédemment dans la réalisation de cette
seconde macro. Nous avons établi un organigramme dans lequel les différentes actions que la
macro doit réaliser sont décrites. La macro peut s’utiliser sur un jeu d’image précis (mode
interactif) ou sur les images de tout un dossier. Dans ce cas, la macro identifie dans le nom de
21
Figure S : logigramme résumant le fonctionnement de la macro Automatic Field Illumination Report.
Choisir le fichier qui contient les images à traiter
Image Calibrée ?
oui
Analyse d’homogénéité du champ
Compilation et enregistrement des résultats
calibrer
non
Configuration automatique du plugin MetroloJ/Generate field illumination Report
Lancer la macro
Mesurer l’intensité max
Bille saturée ?
oui
trash
non
l’image (stéréotypé) le grandissement de l’objectif et la longueur d’onde :
‐ l’utilisateur indique quelle chaîne de caractères (string) suit la valeur de grandissement
total de l’objectif/lentille de tube.
‐ l’utilisateur indique, pour chacune des longueurs d’onde qu’il a sélectionnée, quel
TAG peut être trouvé dans le nom de fichier de l’image.
Il est à noter que le choix d’entrée est une image monocanal (ce que nous produisons en
général avec ces analyses). Les images contenant deux canaux et plus ne seront pas traitées de
façon satisfaisante (seul le premier canal sera analysé.
Dans un premier temps, dans la mesure où le protocole d’acquisition stipulait que les
images ne devaient pas être saturées, nous n’avons pas implémenté une vérification de la
saturation. Nous avons cependant mis en place cette fonction pour éviter l’interprétation
erronée des résultats. En effet, en automatisant les résultats, l’utilisateur a tendance à ne plus
observer les images et ne pas forcément se rendre compte que l’image est saturée. A cette
occasion, nous avons implémenté le format 14 bits pour tenir compte de certaines des caméras
présentes sur d’autres plateaux de MRI.
Si l’image n’est pas saturée, celle-ci est floutée (gaussian blur, sigma 2) de façon à
éviter les biais induits par le bruit dans l’image. Nous avions en effet remarqué que, dans la
mesure où les intensités des points azimuthaux (aux quatre coins de l’image et au milieu des
quatre côtés) ne sont mesurées que sur les seuls 8 pixels concernés, la valeur à un de ces
points peut être faussée par le bruit.
La macro vérifie ensuite que les images sont calibrées. Dès la première image non
calibrée trouvée, la macro demande à l’utilisateur d’entrer la taille d’un pixel (XY) pour
l’objectif utilisé pour cette image. Une calibration universelle est ensuite calculée, qui sera
appliquée à toutes les images, en fonction de leur grandissement.
Lorsque les critères sont remplis, la macro lance automatique le plugin Generate Field
Illumination Report. Enfin, un récapitulatif des mesures et des analyses d’homogénéité du
champ est généré. Les rapports .xls générés par le plugin sont ouverts et la distance du centre
d’intensité par rapport au centre géométrique est indiquée, ainsi que la valeur minimum
d’intensité relative aux 8 points azimuthaux. A ce stade de développement de la macro, nous
avons également implémenté le calcul du rapport intensité relative min/max.
22
Figure T Exemple de fichier Récapitulatif de mesures d'homogénéité de champ
Ce rapport indique une relative homogénéité/centrage lorsque les valeurs sont
relativement proches et peut être indicatif dans le cas d’images très bruitées. En l’état, il n’est
pas utilisé dans nos fiches de maintenance et un suivi sera réalisé de manière à étudier sa
puissance informative et l’opportunité de l’inclure dans la fiche. Les résultats sont présentés
dans un fichier texte « summary.log » (figure T).
5.3.2 Difficultés rencontrées :
Nous avons rencontré les mêmes problèmes de format concernant les fichiers .lif. et
avons procédé de la même façon que pour la première macro pour résoudre ces bugs et
problèmes. J’ai ensuite validé, pour toutes les versions de cette macro, les différents formats
utilisés sur la plate-forme (voir annexe 5).
La principale difficulté était la présence d’un bug dans le plugin Generate Field
Illumination Report qui pour un type de microscope donnait une intensité relative d’un point
azimuthal à 0 (toujours le même). Cette valeur n’était cependant pas 0 et l’éliminer pour
l’automatisation de la détection de la valeur la plus basse n’était pas des plus simples.
5.3.3 Paramètres configurables
Pour adapter la macro au système de chaque plateforme, il est possible d’apporter des
modifications, c’est-à-dire, par exemple si les valeurs des longueurs d’ondes indiquées au
niveau de la macro ne sont pas adaptées, il est possible de modifier ces valeurs, en ouvrant la
macro dans un éditeur de texte/script Editor et changer éventuellement les valeurs suivantes :
• Wavelengths (ligne 3) : dans ce tableau, modifier les valeurs ou en ajouter/supprimer
pour ajouter des canaux (par exemple « 458 » pour des images utilisant un LASER
458nm).
• offCenterThreshold (ligne 7): cette valeur de tolérance de décentrage (voir ci-dessous)
peut être modifiée.
• Heterogeneity tolerance (ligne 10): cette seconde tolérance concerne à quel point le
point azimuthal d’intensité relative la plus faible peut varier par rapport au maximum
(voir ci-dessous).
23
5.3.4 Améliorations apportées suite à la présentation en interne de cette macro :
Suite à la présentation aux membres de la plate-forme et constatant que l’analyse des
résultats de cette macro est encore fastidieuse, j’ai suggéré d’automatiser aussi cette dernière
partie.
Pour cela nous avons implémenté dans la macro les tolérances définies sur la plate-
forme. Sont en effet considérées comme décentrées des images pour lesquelles le centre
d’intensité est distant du centre géométrique d’une valeur de 100um/grandissement. Ainsi,
pour un objectif 10x cette valeur est de 10um, pour un objectif 63x de 1.6um. De même, la
valeur minimale d’intensité relative ne doit pas être inférieure à 50% du maximum. Nous
avons donc défini deux seuils/tolérance (offCenterThreshold et Heterogeneity tolérance).
Le premier seuil permet de définir une image comme décentrée dès lors que la distance
du centre d’intensité est supérieure à ce seuil. Nous avons créé des fichiers summary par
grandissement d’objectif (par exemple 20x_Summary.txt) où pour chaque report est indiqué
par canal si l’image est considérée comme centrée ou non (« Intensity for emission wavelength 488 considered as centered (distance of center of intensity to
geometrical center: 1.79µm<tolerance of 5.00µm) » ou « Intensity for
emission wavelength 405 considered as not centered (distance of center of
intensity to geometrical center : 6.01µm>tolerance of 5.00µm)». Si l’image
n’est pas centrée, son score est 0, quelle que soit la dérive observée.
La seconde tolérance concerne la dérive acceptée par rapport au maximum d’intensité.
Cette dérive est exprimée en % du max (30% de dérive signifie que le ratio d’intensité relative
est de 0.7). La dérive maximum d’un des points azimuthaux est comparée à la tolérance. Une
dérive supérieure à la tolérance ne sera pas acceptée (« field homogeneity for emission
405nm considered as not acceptable (max azimuth drift of 52.0%>50%)»). Une
dérive inférieure à 1/5 de la tolérance indiquera une image homogène (« field homogeneity for emission 405nm considered as acceptable (10%<max azimuth
drift of 48.0%<50% »). Le score de l’image sera 0 si la dérive est trop importante, quelle
que soit le statut du centrage.
Un tableau excel est ensuite généré par objectif reprenant le score de l’ensemble des
images analysées. Enfin, un fichier « summary.log » reprend par objectif et par canal toutes
24
Figure U : extrait du fichier summary.log de la macro Automatic Field Illumination Report
les images analysées et le nombre d’images « homogènes » (à comprendre ici comme centrée
et homogène) (Figure U).
En conclusion, l’utilisation de cette macro rend le traitement des images d’illumination
très facile et permet, lors des visites mensuelles, en quelques clics de traiter toutes les images
et d’en obtenir un résumé. Son défaut est que pour ne pas mélanger les images produites par
des objectifs de même grandissement (40x à huile et à sec sur un même microscope par
exemple), il est nécessaire de lancer la macro en batch sur des dossiers différents.
5.4. Automatisation de l’extraction et de l’analyse de Co-alignement
5.4.1 Logigramme:
C’est la troisième macro que nous avons développée, elle permet d’identifier des billes
multimarquées dans une pile d’images, de les extraire et de lancer le plugin
CoalignementReport de la collection MetroloJ.
Le fonctionnement de la macro est décrit dans le logigramme. Le choix fait ici est de ne
pas permettre de mode batch. Ce mode serait en effet trop complexe à mettre en œuvre dans la
mesure où pour des fichiers monocanal il ne serait pas facile d’apparier les images de deux
canaux sans imposer des règles de nomenclature des noms lourdes.
Après identification des images à traiter (en un seul fichier multichannel ou en plusieurs
fichiers single Channel séparés), ouvre les images et les renomme par canal. La macro vérifie
si les images sont calibrées. Le cas échéant, une calibration XYZ est demandée et appliquée à
toutes les images des différents canaux. Les billes sont identifiées (après lissage Gaussien,
sigma 2, soustraction du bruit de fond Rolling Ball et seuillage automatique) en utilisant la
fonction Analyze particles de ImageJ. La position des billes par rapport aux bords de l’image,
par rapport aux autres billes identifiées et leurs saturations éventuelles par canal sont
analysées. Les images de billes correctes sont sauvées et fermées. Puis, la macro les réouvre
par deux pour toutes les combinaisons de 2 canaux parmi les n canaux choisis. A chaque fois,
la macro lance automatique le plugin « Generate Coalignment Report ». Enfin, un
récapitulatif des analyses est généré. Chaque fichier Coalignment Report (….).xls pour
chaque combinaison de canaux pour chaque bille dans l’image est ouvert. La distance dans
l’espace entre les centres d’intensité des deux canaux est comparée à la distance de référence.
Si cette distance est supérieure, l’objectif/système est réputé comme non corrigé des
aberrations chromatiques et un généré est ouvert. Pour chaque bille, un tableau excel est créé
du type :
25
Figure V : logigramme résumant le fonctionnement de la macro Automatic Coalignement Report
Lancer la macro
Choisir le fichier qui contient les images à traiter
Image Calibrée ?
oui
Trouver les billes en 2D
Mesurer l’intensité max
Bille isolée et loin des bords de l’image ?
oui
Analyse Co‐alignement 2 à 2 (canaux)
Compilation et enregistrement des résultats
calibrer
non
Bille saturée ?
oui
trash
trash
non
Configuration automatique du plugin MetroloJ/Generate Coalignement Report
Blue Green Red FarRed
1 NaN 1 0 1
2 1 NaN 1 1
3 0 1 NaN 1
4 1 1 1 NaN
Dans cet exemple un défaut d’alignement est constaté entre le canal Blue et le canal
Red. Enfin un fichier « Summary » résumé toutes les combinaisons identifiées et les éventuels
défauts de coalignement (Figure W):
5.4.2 Paramètres configurables :
Dans le cas les noms des canaux ou leur nombre doit être modifié, l’utilisateur peut
ouvrir la macro dans un éditeur de text/Script Editor et changer éventuellement les valeurs
suivantes:
‐ Beads (ligne 19) : dans ce tableau, modifier les valeurs ou en ajouter/supprimer pour
changer le nom des canaux.
‐ Wavelengths (ligne 20) : dans ce tableau, modifier les valeurs ou en ajouter/supprimer
pour changer la valeur des longueurs d’ondes correspondant aux canaux.
5.4.3 Améliorations apportées suite à la présentation en interne de cette macro:
Les images champ plein contiennent assez facilement plusieurs billes dans le champ. En
revanche, pour gagner du temps, les images prises au confocal sont souvent recadrées autour
d’une seule bille. La difficulté d’automatiser l’analyse de plusieurs images est en revanche
moins importante puisque tous les canaux sont contenus dans un même fichier.
Nous avons donc en projet d’implémenter un mode batch pour les images confocales.
De plus, le résumé ne présente pas les résultats de façon globale mais par bille. La
prochaine version de la macro présentera un résumé des résultats trouvés par combinaison en
indiquant, le cas échéant, le nombre d'analyses présentant un défaut par rapport au nombre
d'analyse total.
26
Summary of all processed coalignment reports
Bead 0:
Tested Combinations:
Blue versus Green: coaligned
Blue versus Red: coaligned
Blue versus FarRed: coaligned
Green versus Red: coaligned
Green versus FarRed: coaligned
Red versus FarRed: coaligned
Summary:
Bead0 coaligned for all tested channels combinations
Figure W : exemple d'analyse par bille pour un set d'image donné.
6. Perspectives:
Grâce aux différents scripts/macros que nous avons créés, le temps d’analyse des
résultats des mesures de métrologie mensuelles/annuelles a considérablement diminué car la
grande partie des actions réalisées manuelle se fait maintenant automatiquement.
Une première conséquence de mon travail est que les actions menées annuellement
pourront augmenter en fréquence. En effet, un des principaux freins à la réalisation de mesure
de PSF/Coalignement est le temps nécessaire à l’acquisition et l’analyse des données. Ce type
de mesure est donc, faute de personnel ou de temps disponible, réalisé sur la base d’une visite
systématique annuelle et éventuellement dès qu’un problème est suspecté (apparition d’une
rayure, remarque d’un utilisateur sur un éventuel défaut d’alignement par exemple).
Une seconde conséquence est qu’il devient possible, sans que cela ne prenne trop de
temps, de passer d’une vérification visuelle de l’homogénéité de champ tous les mois à une
mesure d’homogénéité de champ avec MetroloJ et notre macro Automatic Field Illumination
Report.
Enfin, une troisième conséquence est qu’il devient possible d’évaluer le nombre de
billes à analyser de façon à avoir une mesure statistique correcte. A l’heure actuelle 5 billes
sont analysées, mais cela pourrait être 10 par exemple.
Concernant l’avenir de ce travail, deux directions sont envisagées :
- D’une part, une macro reprenant les 3 types d’analyse et incluant les analyses
complémentaires est envisageable. L’avantage de cette macro est qu’elle pourrait
permettre de produire automatiquement la fiche annuelle. A charge du personnel
d’entrer ensuite dans le champ commentaire de chaque partie et dans le
commentaire général les conclusions adéquates en fonction des résultats (statuer
sur l’état des appareils est un point important au regard de la norme et a été
demandé par l’auditeur qualité de la plate-forme.
- D’autre part, le plugin MetroloJ et les macros développées au cours de mon stage
seront installés sur les postes d’acquisition (à l’heure actuelle, l’analyse est faite
sur les ordinateurs propres du personnel). L’avantage sera de pouvoir analyser
directement les images et augmentera la réactivité. Ainsi, dans le cas où la qualité
des images n’est pas suffisante pour une analyse fiable (saturation, bruit),
27
l’utilisation simultanée de nos macros pendant l’acquisition évitera de perdre
du temps. A moyen terme, la plate-forme développe une stratégie de
développement d’une solution base de données image/stockage et plate-forme
d’analyse. Dans le futur, les utilisateurs pourront téléverser leurs images sur un
serveur central et les visualiser, annoter et éventuellement analyser en ligne
depuis leur poste personnel. Des scripts pourront être lancés de façon
automatique sur différentes images. Il est donc envisager de mettre en place
une solution en ligne d’analyse des images téléversées. On peut donc imaginer
une interface de scripts où les résultats seront analysés directement sur le
serveur et validés lors de l’acquisition. Ainsi, par exemple, une seule session
sera nécessaire pour corriger un désalignement Visible/Invisible, qui, une fois
constaté en direct, sera corrigé en réglant le collimateur Invisible.
7. Apport personnel:
J’ai eu le plaisir de travailler dans un domaine qui me passionne et au sein d’une équipe
très professionnelle. Au terme de cette expérience professionnelle, je peux affirmer avoir
approfondi mes connaissances théoriques et pratiques, ce qui sera un atout important pour la
poursuite de mon activité. Ce stage a été pour moi l’occasion d’acquérir de nouvelles
compétences techniques dans le domaine de l’imagerie optique, de la cytométrie mais
également en programmation de macros sous ImageJ, un domaine où je n’avais aucune
connaissance.
Au cours de mon stage, j’ai pu constater l’importance de la
surveillance/maintenance/entretien des appareils pour offrir aux utilisateurs un matériel
optimal. Ce travail doit être réalisé de façon organisée et rigoureuse, en planifiant les visites,
en analysant le plus rapidement les résultats et en prenant les mesures correctives nécessaires.
J’ai pu constater, à mes dépens, l’importance de tous les paramètres nécessaires pour acquérir
les images de métrologie (j’ai en effet dû m’y reprendre à plusieurs fois pour certains
appareils!). J’ai également constaté l’importance que revêtent ces visites pour comprendre et
connaître les limites techniques des appareils dont on a la charge.
Rapidement après le début de cette expérience, il m’a été confié la réalisation de
certaines visites de maintenance et la validation des versions des macros écrites avec mon
28
responsable de stage. Le personnel du plateau MRI-IGH m’a considéré comme un membre à
part entière du service et m’a donné cette responsabilité importante et toute autonomie dans
laréalisation de ces tâches. Au cours de la seconde moitié de mon stage, j’ai acquis une
aisance suffisante sur les différents appareils pour être, avec mon responsable, en première
ligne face aux utilisateurs et répondre efficacement et le plus rapidement possible à la plupart
de leurs problèmes.
D’un point de vue personnel, cette expérience était extrêmement valorisante et
enrichissante. Elle m’a permis de connaître le mode de fonctionnement d’une plateforme
d’imagerie « active » avec de nombreux utilisateurs (environ 160 actifs), de nombreux
appareils (au total 19), et donc de nombreuses sources de pannes et de questionnements divers
de la part des chercheurs. De façon plus large, pendant cette période de six mois, je me suis
imprégné des différentes activités liés au travail sur une plate-forme d’imagerie, ceci tant
directement, dans la vie de tous les jours avec les utilisateurs du plateau, qu’indirectement en
observant le fonctionnement interne de la plate-forme. J’ai appris à gérer le stress lié aux
questions des utilisateurs (et à leur volonté ferme d’avoir une réponse !), à l’urgence de
résoudre leurs problèmes et aux pannes subites de certains des appareils. Je pense avoir
maintenant un aperçu relativement exhaustif du travail de prestation de service d’une plate-
forme scientifique.
Lors de ce stage, j’ai atteint différents objectifs :
• j’ai participé à l’élaboration de scripts afin d’automatiser la plupart des tâches réalisées
lors des analyses des tests de métrologie. Je les ai validés, présentés et diffusés.
• j’ai réalisé l’ensemble des visites annuelles et une grande partie des visites mensuelles
• j’ai effectué l’entretien et la calibration d’un analyseur en flux et écrit le protocole de
maintenance de cet appareil.
Je me sens très heureux et privilégié d’avoir pu effectuer ce stage entouré de personnes
compétentes qui ont su me guider dans mes démarches tout en me laissant une certaine
autonomie. Dans la mesure où mon stage a reflété les activités du domaine dans lequel
j’aimerais travailler et m’a permis d’approfondir mes connaissances et compétences, je
considère que cette expérience sera un atout important pour la poursuite de ma carrière.
29
Bibliographie:
1- Quality assessment of confocal microscopy slide-based systems: instability. Zucker RM.
Cytometry A. 2006 Jul; 69(7):677-90.
2- Quality assessment of confocal microscopy slide based systems: performance. Zucker RM.
Cytometry A. 2006 Jul; 69(7):659-76.
3- Evaluation of confocal microscopy system performance. Zucker RM. Methods Mol Biol.
2006; 319:77-135.
4- Quantitative image correction and calibration for confocal fluorescence microscopy using
thin reference layers and SIPchart-based calibration procedures. Zwier JM, Oomen L, Brocks
L, Jalink K, Brakenhoff GJ. J Microsc. 2008 Jul; 231(Pt 1):59-69.
5- Characterization of sectioning fluorescence microscopy with thin uniform fluorescent
layers: Sectioned Imaging Property or SIPcharts. Brakenhoff GJ, Wurpel GW, Jalink K,
Oomen L, Brocks L, Zwier JM. J Microsc. 2005 Sep; 219(Pt 3):122-32.
30
Annexe 1
VISITE ANNUELLE
MICROSCOPIE CHAMP PLEIN Matériel nécessaire :
• FluoRef Reference slide (The Microscopy and Imaging Place, McKinney, TX) • Tetraspeck beads slides (0.2 and 4µm)
1) Préparation Tetraspeck beads slides :
Matériels :
- Lamelles 0.170mm +/- 0.005mm Zeiss #0109030091 - Billes de 0.2 µm multi-couleurs Tetra-Speck Molecular Probes Invitrogen
#T72080 - Billes de 4 µm multi-couleurs Tetra-Speck Molecular Probes Invitrogen
#T7283 - Papier whatmann #2105 841 - Prolong Gold mounting medium, Molecular Probes Invitrogen #P36930
Protocole :
- Nettoyer la lamelle de verre avec de l’alcool. - Diluer la solution stock de poly-lysine au 1/5ème. - Déposer et étaler à la pipette 200µl de cette solution sur la lamelle. Laisser
pendant 15 minutes. - Supprimer la solution restante et rincer délicatement avec de l’eau distillée.
Absorber l’eau restante avec un papier Whatmann. - Vortexer le tube de billes puis les diluer au 1/1000ème pour les 0.2µm et au
1/100ème pour les 4µm. - Vortexer la préparation de billes diluées puis déposer et étaler 200µl sur la
lame sur la surface préparée à la poly-lysine. - Laisser pendant 30 minutes. - Rincer délicatement 2 ou 3 fois, puis supprimer l’excédent avec un papier
Whatmann et laisser sécher. - Monter une lamelle avec 20 µL de Prolong Gold. - Attendre une nuit avant d’utiliser ces lames.
2) Avoir des lames Chroma UV-blue, Green, Yellow and Red
3) Avoir des lames échantillons peu épais
4) Installer Image J et le plugin Metrolo J (la version d’image J doit être au
minimum 1.4.3.h.). Le plugin Metrolo J est téléchargeable sur le sFTP dans MRI _METROLOGIE>DOCUMENTATION>PLUGIN_METROLOJ. Installer le plugin LOCI/bioformat (télécharger stable/trunk build sur http://www.loci.wisc.edu/bio-formats/downloads) et placer loci.jar dans le dossier plugins de ImageJ).
5) Installer la macro CCD. Copier la macro ccd.txt (MRI _METROLOGIE>DOCUMENTATION>PLUGIN_METROLOJ) dans le dossier macros de ImageJ. Installer la macro.
I. Inspection visuelle des optiques : Matériel :
- Lentille de bertrand ou téléscope de phase. - Un échantillon épais
Protocole :
- retirer tous les objectifs et les observer sous loupe binoculaire. Noter d’éventuelles rayures de la lentille frontale, des rayures du métal. Eventuellement, prendre une photo, en prenant soin de mettre en évidence sur la photo d’éventuels défauts.
- Dévisser la lentille du condenseur et le nettoyer si nécessaire. En cas de traces d’huile, retirer tout le support du condenseur et le nettoyer.
- Retirer les différents cubes de filtres de fluorescence. Les nettoyer si nécessaires. Noter toute trace d’usure.
- Procéder à un alignement de Koehler (voir I_MRI_MIC_0005_A_Reglage_de_kohler.pdf) sur une sélection d’objectifs. Noter le dernier objectif aligné sur la fiche.
- Si existant, procéder à un réalignement des anneaux de phase (en visualisant le plan focal arrière de l’objectif avec la lentille de Bertrand ou le téléscope de phase). En l’absence de l’un ou de l’autre, il est possible de retirer un oculaire et de visualiser l’alignement de l’anneau de phase du révolver de condenseur sur la plaque de phase de l’objectif).
- Si existant, retirer analyseur et polariseur et noter toute trace d’usure. Les replacer et les croiser. Procéder, si existant, à un alignement/inspection du DIC (I_MRI_MIC_0007_A_AlignementDIC.pdf).
II. Homogénéité de champ
* à réaliser avec tous les objectifs et pour les principaux cubes (Bleu/Vert/Rouge) et aucun cube (transmission). Matériel :
- Immersol 518F ou Immersol W - FluoRef Slides Pour les objectifs à sec et à huile, déposer une goutte d’huile Immersol 518F sur la lame en 2 endroits, placer une lamelle sur chaque goutte. Mettre une goutte d’huile Immersol 518F sur la lamelle destinée aux objectifs à immersion huile. Pour les objectifs à eau, déposer une goutte d’immersol W sur la lame, placer une lamelle sur la goutte puis remettre une goutte d’immersol W.
Protocole :
- vérifier l’alignement de la lampe si possible (boîtiers sources non fibrées centrables manuellement).
- Sélectionner un objectif et s’assurer que l’image est correctement calibrée à l’acquisition.
- Régler (si accessible) un binning de 1 et s’assurer que tout le chip de la caméra est utilisé.
- Cliquer sur le mode Live de la caméra et, si nécessaire, afficher l’histogramme d’utilisation des niveaux de gris en direct.
- Placer le montage lame/lamelle sur la platine, monter suffisamment la platine de façon à être aux alentours de la mise au point correcte. Régler le temps d’exposition de façon à être proche de la saturation. Monter la platine et adapter le temps d’exposition de façon à ne plus être saturé. Recommencer jusqu’à avoir trouvé la position ou le temps d’exposition est minimal.
- Dans certains cas, il est nécessaire de diminuer l’excitation en utilisant des filtres neutres gris (dans le boîtier de la source fibrée, dans le magasin de filtres neutres du microscope, au niveau du diaphragme d’ouverture) ou en modulant la puissance de la source (par exemple pour une lampe halogène). Il n’est pas recommandé de défocuser le collecteur ni de modifier le diaphragme d’ouverture. En cas d’échec, croiser les lames (ie. prendre un homogénéité au cube Cy3 avec la lame bleue).
- acquérir l’image et la sauvegarder en format d’origine (de la caméra : 12, 14 ou 16bits).
Analyse des images
- Ouvrir Image J - Ouvrir l’image correspondant à une combinaison objectif/couleur - Calibrer l’image si cela est nécessaire avec Image>Properties. La calibration
latérale peut être recalculée comme suit :
(binning x taille physique pixel) / (grossissement objectif x grossissement du tube)
Caméra Taille du pixel (µm) Micromax 6.7 Couleur 4.65 (soit 9.3 sur image RGB) EM-CCD 16
Tout autre modèle 6.45 - Lancer le Plugin MetroloJ>Generate field illumination report. - Renseigner les différentes cases dans la fenêtre « Field illumination report
generator »: • Steps width : 10 • Microscope type : wide field • Wavelength (nm) : à changer selon le cube utilisé • NA : ouverture numérique à changer selon objectif utilisé • Scale bar (µm) : 5
- Un fichier .pdf est généré par image. - Sur ces documents, relever sur la fiche annuelle :
• Distance to image center – Center of intensity • Les valeurs min et max (intensity relative to max) dans « Profiles’
statistics » parmi les 8 points distribués sur les bords de l’image. Ces relevés permettent de s’assurer d’un centrage optimal du faisceau (distance to image center) et du caractère homogène de l’illumination (valeurs min et max des bounds et corners).
- Entrer éventuellement en commentaire les décentrages/hétérogéneités anormales relevées et les mesures correctives engagées. III. Aberrations chromatiques – coalignement
A réaliser sur les objectifs à immersion 40X, 63X et 100X (selon équipement du microscope). Matériel :
- Immersol 518F ou Immersol W - Lames de billes Tetraspeck 4um.
Protocole :
- Se mettre au focus sur une bille TetraSpeck isolée (ou sur une zone ayant plusieurs billes).
- Sélectionner un objectif et s’assurer que l’image est correctement calibrée à l’acquisition.
- Cliquer sur le mode Live de la caméra et, si nécessaire, afficher l’histogramme d’utilisation des niveaux de gris en direct.
Top left corner Top right corner Upper bound
Bottom left corner Bottom right corner Lower bound
Left bound Right bound
- Trouver la position d’intensité maximale pour chaque canal Bleu/Vert/Rouge/Rouge profond et régler le temps d’exposition de façon à être proche de la saturation.
- Dans certains cas, il est nécessaire de diminuer l’excitation en utilisant des filtres neutres gris (dans le boîtier de la source fibrée, dans le magasin de filtres neutres du microscope, au niveau du diaphragme d’ouverture) ou en modulant la puissance de la source (par exemple pour une lampe halogène).
- Définir un Top et un Bottom du stack en Z assez large autour de la bille - Lancer l’acquisition en respectant les critères de Nyquist et en configurant le
logiciel de façon à ce qu’à chaque plan on ait les 4 canaux puis sauver le stack en fin d’acquistion.
- Recommencer cette opération pour chaque objectif à immersion. Sauver chaque stack.
Analyse des images
- Ouvrir Image J - Ouvrir les stacks multi-couleurs, séparer éventuellement le stack en plusieurs
stacks contenant une bille (et une seule) chacun si l’image initiale contient plusieurs billes. Séparer éventuellement les channels en autant d’images.
- Lancer le Plugin : MetroloJ>Generate co-alignement report. - Seulement 3 couleurs sont superposables : il faut donc faire trois analyses :
DAPI-GFP-Cy3 GFP-Cy3-Cy5 DAPI-Cy5
- Renseigner les informations demandées dans la fenêtre « Co-alignement report generator » : Wavelength1=Red, Wavelength2=Green, Wavelength3=Blue (Cy5 ou DAPI)
- Un document .pdf est généré
- Sur ce document, comparer dans le tableau "Distances table (calibrated)" dans chaque case (Red versus Green, Red versus Blue et Green versus Blue) la valeur mesurée et la valeur théorique limite calculée. Si le chiffre obtenu est supérieur à la valeur limite, relever la valeur 0 dans la case correspondante de la fiche annuelle, sinon entrer.
Ces relevés permettent d’évaluer le coalignement des différents channels. En cas de valeur 0, il n’est pas possible d’effectuer de colocalisation avec le couple de couleurs donné. - Effectuer les mêmes opérations pour tous les objectifs à immersion. - Dans le champ commentaire, indiquer un éventuel défaut de coalignement en
mentionnant qu’il n’est pas possible de faire une mesure de colocalisation fiable avec la combinaison objectif/couleur1/couleur2. Indiquer quelles mesures correctives sont envisagées. IV. Résolution latérale et axiale : Point Spread Function
A réaliser sur les objectifs à immersion 40X, 63X et 100X (selon équipement du microscope). Matériel :
- Immersol 518F ou Immersol W - Lames de billes Tetraspeck 0.2 um.
Protocole :
- Se mettre au focus sur une bille TetraSpeck isolée (ou sur une zone ayant plusieurs billes).
- Sélectionner un objectif et s’assurer que l’image est correctement calibrée à l’acquisition.
- Cliquer sur le mode Live de la caméra et, si nécessaire, afficher l’histogramme d’utilisation des niveaux de gris en direct.
- Trouver la position d’intensité maximale pour chaque canal Bleu/Vert/Rouge/Rouge profond et régler le temps d’exposition de façon à être proche de la saturation.
- Dans certains cas, il est nécessaire de diminuer l’excitation en utilisant des filtres neutres gris (dans le boîtier de la source fibrée, dans le magasin de filtres neutres du microscope, au niveau du diaphragme d’ouverture) ou en modulant la puissance de la source (par exemple pour une lampe halogène).
- Définir un Top et un Bottom du stack en Z très large autour de la bille - Lancer l’acquisition en respectant les critères de Nyquist et en configurant le
logiciel de façon à ce qu’à chaque plan on ait les 4 canaux puis sauver le stack en fin d’acquisition.
- Recommencer cette opération pour chaque objectif à immersion. Sauver chaque stack.
Analyse des images
- Ouvrir Image J
- Ouvrir les stacks multi-couleurs, séparer éventuellement le stack en plusieurs stacks contenant une bille (et une seule) chacun si l’image initiale contient plusieurs billes. Séparer éventuellement les channels en autant d’images.
- Identifier une bille qui n’est pas double et qui n’est saturée dans aucun des channels.
- Lancer le Plugin : MetroloJ>Generate PSF report.
- Renseigner les informations demandées dans la fenêtre « PSF report generator ».
- Un document .pdf est généré. - Sur ce document, vérifier que les valeurs de fit R² de chaque dimension ("XYZ
Profile& fitting parameters) sont supérieures à 0.95. Si ce n’est pas le cas, changer de bille. Relever sur la fiche annuelle les valeurs du tableau "Resolution table" :
• x expérimental • y expérimental • z expérimental
Ces relevés permettent de mesurer la résolution optique de chaque appareil et de la comparer à la résolution théorique calculée. Cela permet également de comparer les systèmes entre eux et de suivre l’évolution de ces valeurs au cours du temps. - Reporter la valeur xyz théorique et calculer le ratio expérimental/théorique
pour chacune des résolutions. Dans le champ commentaire, indiquer un éventuel défaut de résolution. Indiquer quelles mesures correctives sont envisagées.
Remarque : bien vérifier que la bille n’est pas saturée dans aucun des channels (en utilisant la LUT HiLo de ImageJ par exemple). S’assurer également que la
PSF en coupe XZ ou YZ est bien prise et non croppée (en d’autres termes que la figure de fit du rapport soit symétrique).
V. Caractéristiques du CCD : Une instruction détaillée avec le logiciel Metamorph est décrite dans I_MRI_MIC_0008_A_mesure nbre pixels chauds froids morts.pdf. Protocole :
- S’assurer que la température de la caméra est optimale (tel qu’indiqué par son éventuel voyant de température ou par le logiciel). Sinon, attendre 20minutes minimum avant l’allumage de la caméra.
- Prendre une image non calibrée avec le shutter de fluorescence fermé, un binning de 1x1 (binning par défaut avec les logiciels ne donnant pas accès au binning) et un temps d’exposition de 30 secondes.
- Prendre 10 images et les sauvegarder dans un stack. - dans ImageJ, ouvrir les images sous forme d’un stack. - Lancer la macro CCD.txt et reporter les valeurs moyennes de pixels chauds,
froids et morts.
Annexe 2
VISITE ANNUELLE
MICROSCOPIE CONFOCALE Matériel nécessaire :
• Mesureur de puissance FieldMate Coherent et sonde OP2-VIS • FluoRef Reference slide (The Microscopy and Imaging Place, McKinney, TX) • Tetraspeck beads slides (0.2 and 4µm)
6) Préparation Tetraspeck beads slides :
Matériels :
- Lamelles 0.170mm +/- 0.005mm Zeiss #0109030091 - Billes de 0.2 µm multi-couleurs Tetra-Speck Molecular Probes Invitrogen
#T72080 - Billes de 4 µm multi-couleurs Tetra-Speck Molecular Probes Invitrogen
#T7283 - Papier Whatmann #2105 841 - Prolong Gold mounting medium, Molecular Probes Invitrogen #P36930
Protocole :
- Nettoyer la lamelle de verre avec de l’alcool. - Diluer la solution stock de poly-lysine au 1/5ème. - Déposer et étaler à la pipette 200µl de cette solution sur la lamelle. Laisser
pendant 15 minutes. - Supprimer la solution restante et rincer délicatement avec de l’eau distillée.
Absorber l’eau restante avec un papier Whatmann. - Vortexer le tube de billes puis les diluer au 1/1000ème pour les 0.2µm et au
1/100ème pour les 4µm. - Vortexer la préparation de billes diluées puis déposer et étaler 200µl sur la
lame sur la surface préparée à la poly-lysine. - Laisser pendant 30 minutes. - Rincer délicatement 2 ou 3 fois, puis supprimer l’excédent avec un papier
Whatmann et laisser sécher. - Monter une lamelle avec 20 µL de Prolong Gold. - Attendre une nuit avant d’utiliser ces lames.
7) Avoir des lames Chroma UV-blue, Green, Yellow and Red
8) Avoir des lames échantillons peu épais
9) Installer Image J et le plugin Metrolo J (la version d’image J doit être au
minimum 1.4.3.h.). Le plugin Metrolo J est téléchargeable sur le sFTP dans MRI _METROLOGIE>DOCUMENTATION>PLUGIN_METROLOJ. Installer le
plugin LOCI/bioformat (télécharger stable/trunk build sur http://www.loci.wisc.edu/bio-formats/downloads) et placer loci.jar dans le dossier plugins de ImageJ).
I. Inspection visuelle des optiques : Matériel :
- Lentille de bertrand ou téléscope de phase. - Un échantillon épais
Protocole :
- retirer tous les objectifs et les observer sous loupe binoculaire. Noter d’éventuelles rayures de la lentille frontale, des rayures du métal. Eventuellement, prendre une photo, en prenant soin de mettre en évidence sur la photo d’éventuels défauts.
- Dévisser la lentille du condenseur et le nettoyer si nécessaire. En cas de traces d’huile, retirer tout le support du condenseur et le nettoyer.
- Retirer les différents cubes de filtres de fluorescence. Les nettoyer si nécessaires. Noter toute trace d’usure.
- Procéder à un alignement de Koehler (voir I_MRI_MIC_0005_A_Reglage_de_kohler.pdf) sur une sélection d’objectifs. Noter le dernier objectif aligné sur la fiche.
- Si existant, procéder à un réalignement des anneaux de phase (en visualisant le plan focal arrière de l’objectif avec la lentille de Bertrand ou le télescope de phase). En l’absence de l’un ou de l’autre, il est possible de retirer un oculaire et de visualiser l’alignement de l’anneau de phase du révolver de condenseur sur la plaque de phase de l’objectif).
- Si existant, retirer analyseur et polariseur et noter toute trace d’usure. Les replacer et les croiser. Procéder, si existant, à un alignement/inspection du DIC (I_MRI_MIC_0007_A_AlignementDIC.pdf).
II. Homogénéité de champ
* à réaliser avec tous les objectifs et pour les 4 raies principales (405/488/543-561/633) Matériel :
- Immersol 518F ou Immersol W - FluoRef Slides
Pour les objectifs à sec et à huile, déposer une goutte d’huile Immersol 518F sur la lame en 2 endroits, placer une lamelle sur chaque goutte. Mettre une goutte d’huile Immersol 518F sur la lamelle destinée aux objectifs à immersion huile. Pour les objectifs à eau, déposer une goutte d’immersol W sur la lame, placer une lamelle sur la goutte puis remettre une goutte d’immersol W. Protocole : - Aligner les pinholes si possible (avec la lame miroir) pour chaque configuration ci-dessous. - Régler la configuration suivante
Zeiss LSM510 Zeiss LSM780 Leica SPE/LSI Format 12 bits 12 bits 12 bits
Zoom 1 1 1 Rotation 0 0
Format image 512x512 512x512 512x512 Scan speed 7 7 400Hz
Scan direction monodirectionnel monodirectionnel monodirectionnel Gain 600 600 800
Offset 0.1 0.1 0.1 Amplifier Gain 1 1
Moyennage 2 (line) 2 (line) 2 λex /Dichroïque λex Dichroïque λex Dichroïque λex Dichroïque
Lame bleue 405 HFT405/488/543/633 405 MBS405 405 DD405/488/561/633 Lame Verte 488 HFT405/488/543/633 488 MBS488 488 DD405/488/561/633 Lame rouge 543 HFT405/488/543/633 561 MBS488/561 561 DD405/488/561/633 Lame rouge 633 HFT405/488/543/633 633 MBS488/561/633 635 DD405/488/561/633 Alignement
pinhole oui non Non
Pinhole 1 UA 1 UA 1 UA
- Placer le montage lame/lamelle sur la platine, monter suffisamment la platine de façon à être aux alentours de la mise au point correcte. Régler le gain de telle façon que l’image soit à la limite de la saturation. Monter la platine et diminuer le gain de façon à ne plus être saturé. Recommencer jusqu’à avoir trouvé la position ou le gain est minimal.
- Régler le gain à la valeur indiquée dans le tableau ci-dessus, et régler la puissance LASER de façon à être à la limite de la saturation, de façon à exploiter correctement la dynamique et avoir une mesure d’homogénéité la plus précise.
- Régler ensuite le chemin optique (laser échantillon PMT) défini dans la fiche de maintenance annuelle spécifique du poste. Le principe est d’utiliser pour un maximum de lames/raies le même dichroïque primaire.
- Pour chaque raie, prendre une image avec chaque objectif. Sauvegarder les images acquises pour leur analyse. Analyse des images
- Ouvrir Image J - Ouvrir l’image correspondant à une combinaison objectif/couleur - Calibrer l’image si cela est nécessaire avec Image>Properties. La calibration
latérale est donnée soit dans les métadonnées. - Lancer le Plugin MetroloJ>Generate field illumination report. - Renseigner les différentes cases dans la fenêtre « Field illumination report
generator »: • Steps width : 10 • Microscope type : confocal
• Wavelength (nm) : à changer selon la raie observée • NA : ouverture numérique à changer selon objectif utilisé • Pinhole (AU) : 1 • Scale bar (µm) : 5
- Un fichier .pdf est généré par image. - Sur ces documents, relever sur la fiche annuelle :
• Distance to image center – Center of intensity • Les valeurs min et max (intensity relative to max) dans « Profiles’
statistics » parmi les 8 points distribués sur les bords de l’image. Ces relevés permettent de s’assurer d’un centrage optimal du faisceau (distance to image center) et du caractère homogène de l’illumination (valeurs min et max des bounds et corners).
- Entrer éventuellement en commentaire les décentrages/hétérogénéités anormales relevées et les mesures correctives engagées.
Top left corner Top right corner Upper bound
Bottom left corner Bottom right corner Lower bound
Left bound Right bound
III. Comparaison des détecteurs * à réaliser pour tous les détecteurs avec un seul objectif et une seule lame donnés Matériel :
- Immersol 518F ou Immersol W - FluoRef Slides
Pour les objectifs à sec et à huile, déposer une goutte d’huile Immersol 518F sur la lame en 2 endroits, placer une lamelle sur chaque goutte. Mettre une goutte d’huile Immersol 518F sur la lamelle destinée aux objectifs à immersion huile. Pour les objectifs à eau, déposer une goutte d’immersol W sur la lame, placer une lamelle sur la goutte puis remettre une goutte d’immersol W. Protocole :
- Sélectionner l’objectif 10X - Aligner les pinholes si possible (avec la lame miroir) pour chaque configuration
ci-dessous. - Placer le montage lame chroma verte +/- lamelle sur la platine, monter
suffisamment la platine de façon à être aux alentours de la mise au point correcte. Régler le gain de telle façon que l’image soit à la limite de la saturation. Monter la platine et diminuer le gain de façon à ne plus être saturé. Recommencer jusqu’à avoir trouvé la position ou le gain est minimal.
- Régler le gain à la valeur indiquée dans le tableau ci-dessous, et régler la puissance LASER de façon à être à la limite de la saturation (pour exploiter correctement la dynamique et avoir une mesure d’homogénéité la plus précise).
Zeiss LSM510 Zeiss LSM780
Format encodage 12 bits 12 bits Zoom 1 1
Rotation 0 0 Format image 512x512 512x512
Scan speed 7 7 Scan direction monodirectionnel monodirectionnel
Gain 600 (Ch.2 et Ch.3) 432 (Ch.S)
600
Offset 0.1 0.1 Amplifier Gain 1 1
Moyennage 2 (line) 2 (line) PMT Dichroïque PMT Dichroïque
PMT/Dichroïque Ch.2 HFT405/488/543/633 Ch.1 Bleu : MBS405 Ch.3 HFT405/488/543/633 Ch.S1 Vert : MBS488 Ch.S HFT405/488/543/633 Ch.2 Rouge : MBS488/561
Alignement pinhole oui non Pinhole 1 UA 1 UA
- Régler ensuite le chemin optique selon la fiche de maintenance spécifique de l’appareil. Le principe est d’obtenir la fenêtre spectrale effective (dichroïques+filtres) la plus proche pour les détecteurs.
- Déterminer rapidement quel est le détecteur le plus efficace. Faire varier la puissance laser jusqu’à la saturation pour ce détecteur.
- Noter cette puissance laser et effectuer les acquisitions pour tous les autres détecteurs à cette puissance laser (puissance laser constante) et sans changer les autres paramètres.
- Acquérir et sauvegarder les images. - Noter la valeur de puissance LASER utilisée.
Analyse des images
- Ouvrir ImageJ - Sélectionner une LUT permettant de distinguer la zone la plus intense de
l’image (par exemple Image>Lookup Tables>Ice) - Lancer le Plugin MetroloJ>Generate CV report. - Renseigner les valeurs (informatives) nécessaires - Sélectionner un chemin de sauvegarde du rapport - Dessiner une sélection sur une zone de l’image la plus intense et ne
comportant pas d’artefact (tache, ligne) et appuyer sur la touche espace - Relever l’intensité moyenne et le CV (Coefficient de variation) - Calculer ensuite les intensités moyennes relatives comme suit:
Le détecteur de référence est celui pour lequel la valeur moyenne est la plus faible. PMTref=1 PMTn= Int. Moy. PMTn / Int. Moy. PMTRef Relever les intensités relatives sur la fiche annuelle Ces relevés permettent de comparer la sensibilité (moyenne relative) et le rapport signal sur bruit (CV) des PMTs entre eux afin de connaître lequel est le "meilleur " (le plus approprié). Ils permettent également de suivre l’évolution de ces PMTs au cours du temps.
- Dans le champ commentaire, indiquer quel est le détecteur le plus sensible et celui le moins bruité.
IV. Comparaison des dichroïques d’excitation * à réaliser pour tous les dichroïques primaires redondants (et donc leurs lames chroma associées) et avec un seul objectif et un seul détecteur donnés Matériel :
- Immersol 518F ou Immersol W - FluoRef Slides
Pour les objectifs à sec et à huile, déposer une goutte d’huile Immersol 518F sur la lame en 2 endroits, placer une lamelle sur chaque goutte. Mettre une goutte d’huile Immersol 518F sur la lamelle destinée aux objectifs à immersion huile. Pour les objectifs à eau, déposer une goutte d’Immersol W sur la lame, placer une lamelle sur la goutte puis remettre une goutte d’Immersol W. Protocole :
- Sélectionner l’objectif 10X - Placer le montage lame chroma verte +/- lamelle sur la platine, monter
suffisamment la platine de façon à être aux alentours de la mise au point correcte. Régler le gain de telle façon que l’image soit à la limite de la saturation. Monter la platine et diminuer le gain de façon à ne plus être saturé. Recommencer jusqu’à avoir trouvé la position ou le gain est minimal.
- Régler le gain à la valeur indiquée dans le tableau ci-dessous, et régler la puissance LASER de façon à être à la limite de la saturation (pour exploiter correctement la dynamique et avoir une mesure d’homogénéité la plus précise).
- Fixer les paramètres suivants :
Zeiss LSM510 Zeiss LSM780 Leica SPE/LSI Format
encodage 12 bits 12 bits 12 bits
Zoom 1 1 1 Rotation 0 0
Format image 512x512 512x512 512x512 Scan speed 7 7 400Hz
Scan direction monodirectionnel monodirectionnel monodirectionnel Gain 600 600 800
Offset 0.1 0.1 0.1 Amplifier Gain 1 1
Moyennage 2 (line) 2 (line) 2 Alignement
pinhole oui non Non
Pinhole 1 UA 1 UA 1 UA
- Régler ensuite le chemin optique selon la fiche de maintenance spécifique de l’appareil.
- Observer rapidement quel est le dichroïque donnant l’intensité la plus forte. - Pour chaque lame, procéder comme suit :
o Utiliser le dichroïque le plus efficace et faire varier la puissance laser jusqu’à la saturation.
- Relever sur la fiche cette puissance laser et effectuer les acquisitions pour tous les dichroïques d’excitation à cette puissance laser (puissance laser constante), sans changer d’autres paramètre.
- sauvegarder les images. - Noter les valeurs de puissance LASER utilisées.
Analyse des images
- Ouvrir Image J - Aller dans « Analyze », « Set measurements », cocher “Mean Gray Value”. - Ouvrir les images - Sélectionner une LUT permettant de distinguer la zone la plus intense de
l’image (par exemple Image>Lookup Tables>Ice) - Dessiner une sélection sur une zone de l’image la plus intense et ne
comportant pas d’artefact (tache, ligne) - Appuyer sur Ctrl+M « Measure » - Relever l’intensité moyenne pour chaque dichroïque d’excitation et pour
chaque lame. - Calculer et relever sur la fiche les intensités moyennes relatives comme suit:
Le dichroïque de référence est celui pour lequel l’intensité moyenne est la plus basse. DICHR.ref=1 DICHR.n= Int. Moy. DICHR.n / Int. Moy. DICHR.Ref Relever les intensités relatives sur la fiche annuelle Ces relevés permettent de comparer les dichroïques d’excitation entre eux afin de connaître lequel est le plus approprié par couleur et également de suivre l’évolution de ces dichroïques d’excitation au cours du temps.
- Dans le champ commentaire, indiquer quel est, par couleur/raie d’excitation, le dichroïque primaire/d’excitation le plus approprié.
V. Aberrations chromatiques – coalignement A réaliser sur les objectifs à immersion 40X, 63X et 100X (selon équipement du microscope). Matériel :
- Immersol 518F ou Immersol W - Lames de billes Tetraspeck 4um.
Protocole :
- Se mettre au focus sur une bille TetraSpeck isolée (ou sur une zone ayant plusieurs billes).
- Préparer une configuration Multi-Track DAPI/FITC/Cy3/Cy5 (voir fiche annuelle)
- Aligner les pinholes si possible (avec la lame miroir) pour chaque configuration ci-dessous.
- Fixer les paramètres suivants :
Zeiss LSM510 Zeiss LSM780 Leica SPE/LSI Format encodage 12 bits 12 bits 12 bits
Zoom A régler pour l’échantillonnage selon Shannon et Nyquist (voir fiche) Rotation 0 0
Format image A régler pour l’échantillonnage selon Shannon et Nyquist (voir fiche) Scan speed 7 7 400Hz
Scan direction monodirectionnel monodirectionnel monodirectionnel Gain 600 600 800
Offset 0.1 0.1 0.1 Amplifier Gain 1 1
Moyennage 2 (line) 2 (line) 2 Alignement pinhole oui non Non
Pinhole 1 UA 1 UA 1 UA Infos « Stack by stack » à
décocher
- Trouver la position Z pour laquelle l’intensité est maximale et régler, par track, la puissance lasers pour atteindre la subsaturation.
- S’assurer du respect du critère de Nyquist. Il est possible de zoomer/cropper sur une bille. Dans ce cas s’assurer que la bille est initialement au centre du champ.
- Définir un Top et un Bottom du stack en Z assez large autour de la bille - Lancer l’acquisition et sauver le stack. - Recommencer cette opération pour chaque objectif à immersion. Sauver
chaque stack. Analyse des images
- Ouvrir Image J
- Ouvrir les stacks multi-couleurs, séparer éventuellement le stack en plusieurs stacks contenant une bille (et une seule) chacun si l’image initiale contient plusieurs billes. Séparer éventuellement les channels en autant d’images.
- Lancer le Plugin : MetroloJ>Generate co-alignement report. - Seulement 3 couleurs sont superposables : il faut donc faire trois analyses :
DAPI-GFP-Cy3 GFP-Cy3-Cy5 DAPI-Cy5
- Renseigner les informations demandées dans la fenêtre « Co-alignement
report generator » - Un document .pdf est généré - Sur ce document, comparer dans le tableau "Distances table
(calibrated)" dans chaque case (Red versus Green, Red versus Blue et Green versus Blue) la valeur mesurée et la valeur théorique limite calculée. Si le chiffre obtenu est supérieur à la valeur limite, relever la valeur 0 dans la case correspondante de la fiche annuelle, sinon entrer.
Ces relevés permettent d’évaluer le coalignement des différents channels. En cas de valeur 0, il n’est pas possible d’effectuer de colocalisation avec le couple de couleurs donné.
- Effectuer les mêmes opérations pour tous les objectifs à immersion. - Dans le champ commentaire, indiquer un éventuel défaut de coalignement en
mentionnant qu’il n’est pas possible de faire une mesure de colocalisation fiable avec la combinaison objectif/couleur1/couleur2. Indiquer quelles mesures correctives sont envisagées.
VI. Résolution latérale et axiale : Point Spread Function A réaliser sur les objectifs à immersion 40X, 63X et 100X (selon équipement du microscope). Matériel :
- Immersol 518F ou Immersol W - Lames de billes Tetraspeck 0.2 um.
Protocole :
- Se mettre au focus sur une bille TetraSpeck isolée (ou sur une zone ayant plusieurs billes).
- Préparer une configuration Multi-Track DAPI/FITC/Cy3/Cy5 (voir fiche annuelle)
- Aligner les pinholes si possible (avec la lame miroir) pour chaque configuration ci-dessous.
- Fixer les paramètres suivants :
Zeiss LSM510 Zeiss LSM780 Leica SPE/LSI Format encodage 12 bits 12 bits 12 bits
Zoom A régler pour l’échantillonnage selon Shannon et Nyquist (voir fiche) Rotation 0 0
Format image A régler pour l’échantillonnage selon Shannon et Nyquist (voir fiche) Scan speed 7 7 400Hz
Scan direction monodirectionnel monodirectionnel monodirectionnel Gain 600 600 800 voire plus si
nécessaire Offset 0.1 0.1 0.1
Amplifier Gain 1 1 Moyennage 2 (line) 2 (line) 2
Alignement pinhole oui non Non Pinhole 1 UA 1 UA 1 UA
- Trouver la position Z pour laquelle l’intensité est maximale et régler, par track,
la puissance lasers pour atteindre la subsaturation. - S’assurer du respect du critère de Nyquist. Il est possible de zoomer/cropper
sur une bille. Dans ce cas s’assurer que la bille est initialement au centre du champ.
- Définir un Top et un Bottom du stack en Z assez large autour de la bille - Lancer l’acquisition et sauver le stack. - Recommencer cette opération pour chaque objectif à immersion. Sauver
chaque stack. Analyse des images
- Ouvrir Image J - Ouvrir les stacks multi-couleurs, séparer éventuellement le stack en plusieurs
stacks contenant une bille (et une seule) chacun si l’image initiale contient plusieurs billes. Séparer éventuellement les channels en autant d’images.
- Lancer le Plugin : MetroloJ>Generate PSF report.
- Renseigner les informations demandées dans la fenêtre « PSF report generator ».
- Un document .pdf est généré. - Sur ce document, vérifier que les valeurs de fit R² de chaque dimension ("XYZ
Profile& fitting parameters) sont supérieures à 0.95. Si ce n’est pas le cas, changer de bille. Relever sur la fiche annuelle les valeurs du tableau "Resolution table" :
• x experimental • y experimental • z experimental
Ces relevés permettent de mesurer la résolution optique de chaque appareil et de la comparer à la résolution théorique calculée. Cela permet également de comparer les systèmes entre eux et de suivre l’évolution de ces valeurs au cours du temps.
- Dans le champ commentaire, indiquer un éventuel défaut de résolution. Indiquer quelles mesures correctives sont envisagées.
VII. Mesures de puissance : A réaliser pour toutes les raies LASER Matériel :
- Powermeter FieldMate Coherent calibré et sa sonde OP2-VIS Protocole :
- Sélectionner l’objectif 10x de l’appareil (éviter tout autre objectif d’ouverture numérique >0.5 qui endommagerait la sonde).
- La sonde est placée sur lame velcro et l’appareil réglé comme indiqué ci-dessous spot, speed normal 7, monodirectionnel, à 100% de puissance LASER (et potentiomètre Argon à 100%). Le dichroïque principal est NT80/20. Les puissances sont en µW
- Fixer les paramètres suivants :
Zeiss LSM510 Zeiss LSM780 Leica SPE/LSI Mode Spot Spot (Time Series) xt 512x1 zoom n/a n/a 58
Scan speed 7 7 400Hz Scan direction bidirectionnel bidirectionnel bidirectionnel
Dichroïque d’excitation NT80/20 Cf Maintenance annuelle QD 405/488/561/633 Puissance LASER 100 100 100
Potentiomètre Argon 100 Puissance travail n/a Mode continu Fast XY Continuous Live
- Lancer l’acquisition en mode continu et mesurer à l’aide de la sonde la valeur
de puissance en sortie d’objectif. - Trouver la position en X, Y et Z où l’on a la valeur la plus importante de
puissance et la reporter sur la fiche annuelle. - Recommencer l’opération pour les différentes raies d’excitation. - Diminuer la puissance aux valeurs utilisées dans II et III et mesurer les
puissances délivrées. Reporter ses valeurs dans les cases adéquates de la fiche annuelle.
- Reprendre le tableau des mesures de puissances des visites mensuelles et reporter la valeur annuelle moyenne ainsi que les valeurs minimum et maximum sur un an.
- Dans le champ commentaire, inscrire les éventuels remplacements ayant eu lieu en un an ou les mesures correctives mises en œuvre concernant d’éventuelles baisses de puissances constatées.
Annexe 3
Fiche Métrologie
ZEISS LSM780 Confocal
Visite mensuelle
Date
Observations :
Nettoyant optique
I. Inspection visuelle des optiques Objectif Cube de Filtre
10x (0.3) FS49/Hoechst 20x (0.8) FS38/GFP
40xoil (1.3) FS43/Cy3 63xoil (1.4) POL Condenseur
Vérification visuelle homogénéité de champ Widefield Alignement de Koehler Alignement DIC
II. Homogénéité de champ confocal : 10x (0.3) 63xoil (1.4)
Center of intensity Valeur min Raie 405 Valeur max
Center of intensity Valeur min
Raie 488
Valeur max Center of intensity
Valeur min
Raie 561 Valeur max
Center of intensity Valeur min
Raie 633
Valeur max III. Mesures de puissance :
Actuelle Raie 405 nm Raie 458 nm Raie 488 nm Raie 514 nm Raie 561 nm Raie 633 nm
IV. Température Tmin/Ttot / Tmax/Ttot /
Commentaire Global
Huile Papier MAJ Antivirus HDD – de 1 mois Lampe
Les paramètres spécifiques de trajet optique de l’appareil utilisés lors de la visite sont : Homogénéité de champ (Ch.S1) :
• Raie 405nm: MBS405 420-481 • Raie 488nm: MBS 488 499-534 • Raie 561nm: MBS 488/561 586-630 • Raie 633nm: MBS 488/561/633 648-698
Les mesures de puissance LASER sont effectuées avec un Field Mate MRI 935 et sa sonde OP2 VIS. La mesure est effectuée au 10x 0.3 avec sonde sur velcro, spot, Time Series (Start Experiment), speed normal 7, monodirectionnel, à 100% de puissance LASER. Le dichroïque principal est cf. tableau. Les puissances sont en µW. Raie 405 MBS 405 Raie 458 MBS 458 Raie 488 MBS 488 Raie 514 MBS 458/514 Raie 561 MBS 488/561 Raie 633 MBS 488/561/633
Annexe 4
Fiche Métrologie
ZEISS LSM780 Confocal
Visite annuelle
Date
II. Inspection visuelle des optiques Objectif Cube de Filtre
10x (0.3) FS49/Hoechst 20x (0.8) FS38/GFP
40xoil (1.3) FS43/Cy3 63xoil (1.4) POL
Condenseur Vérification visuelle homogénéité de champ Widefield Alignement de Koehler Alignement DIC
Commentaire
V. Homogénéité de champ confocal : 10x (0.3) 20x (0.8) 40xoil (1.3) 63xoil (1.4)
Center of intensity Valeur min Raie 405 Valeur max
Center of intensity Valeur min
Raie 488
Valeur max Center of intensity
Valeur min
Raie 561 Valeur max
Center of intensity Valeur min
Raie 633
Valeur max
Commentaire
VI. Comparaison des détecteurs : Détecteur Mean Intensity Intensité moyenne relative C.V.
Ch.1 Ch.S1 Raie 405 Ch.2 Ch.1
Ch.S1 Raie 488 Ch.2 Ch.1
Ch.S1 Raie 561 Ch.2
Commentaire
VII. Comparaison des dichroïques d’excitation : Mean Intensity Intensité moyenne relative
Bleu (Ch S1) MBS405
MBS445 MBST80/R20
MBS458 MBS458/514 MSB458/561
Cyan (Ch.S1) Puissance :
MBST80/R20
MBS 488 MBS 488/561
MBS 488/561/633
Vert (Ch.S1) Puissance :
MBST80/R20
MBS 458/561 MBS 488/561
MBS 488/561/633
Rouge (Ch.S1) Puissance :
MBST80/R20
Commentaire
VIII. Aberrations chromatiques - coalignement : 1 2 3 1 vs 2 1 vs 3 2 vs 3
Cy3-GFP-DAPI Cy3-GFP-Cy5 40xoil
DAPI-Cy5 Cy3-GFP-DAPI Cy3-GFP-Cy5 63xoil
DAPI-Cy5 Commentaire
IX. Résolution latérale et axiale : Point Spread Function Résolution réelle Résolution théorique x y z x y z
Résolution moyenne Résolution 40x Ecart type Réel/théorique Résolution moyenne Résolution
Raie 405 63x Ecart type Réel/théorique
Résolution moyenne Résolution 40x Ecart type Réel/théorique Résolution moyenne Résolution
Raie 488 63x Ecart type Réel/théorique
Résolution moyenne Résolution 40x Ecart type Réel/théorique Résolution moyenne Résolution
Raie 543 63x Ecart type Réel/théorique
Résolution moyenne Résolution 40x Ecart type Réel/théorique Résolution moyenne Résolution
Raie 633 63x Ecart type Réel/théorique
Les mesures ont été réalisées selon l’instruction I_MRI_MIC_009_A_Visite de maintenance annuelle confocal.pdf). Les paramètres, spécifiques des types d’appareils, sont consultables sur demande. Les paramètres spécifiques de trajet optique de l’appareil utilisés lors de la visite sont : Homogénéité de champ
• Raie 405nm: MBS405 420-481 • Raie 488nm: MBS 488 499-534 • Raie 561nm: MBS 488/561 586-630 • Raie 633nm: MBS 488/561/633 648-698
Comparaison des détecteurs
• Ch2 : MBS405 420-481 • Ch3 : MBS 488 499-534 • ChS : MBS 488/561 586-630
Comparaison des dichroïques primaires
• Lame Bleue : MBS 420-481 • Lame Verte : MBS 499-534 • Lame Rouge : MBS 586-630
Aberrations chromatiques - coalignement & Résolution latérale et axiale : Point Spread Function • Le critère de Nyquist est calculé sur la base avec la formule optimale
Les mesures de puissance LASER sont effectuées avec un FieldMate MRI 935 et sa sonde OP2 VIS. La mesure est effectuée au 10x 0.3 avec sonde sur velcro, spot, speed normal 7, monodirectionnel, à 100% de puissance LASER. Le dichroïque principal est cf tableau. Les puissances sont en µW. Raie 405 MBS 405 Raie 458 MBS 458 Raie 488 MBS 488 Raie 514 MBS 458/514 Raie 561 MBS 488/561 Raie 633 MBS 488/561/633
Commentaire
X. Mesures de puissance : Actuelle Moyenne annuelle Min. annuelle Max. annuelle
Raie 405 nm Raie 458 nm Raie 488 nm Raie 514 nm Raie 561 nm Raie 633 nm
Commentaire
Annexe 5 Action bar MetroloJ
Version 1.0, rédigée par D. Akbar
Créateurs : Marc Lartaud, David Akbar et Julien Cau (Montpellier RIO Imaging)
Les analyses des visites mensuelles et annuelles sont parfois longues, répétitives et
fastidieuses. Cette action bar est une collection d’outils facilitant l’utilisation des plugins de la
collection MetroloJ (RTmfm, Fabrice Cordelières et Cédric Matthews).
La première partie permet une utilisation manuelle du plugin MetroloJ en configurant le
plugin avec les paramètres de ses microscopes. L’analyse est possible sur une bille. La
seconde méthode permet d’identifier un dossier contenant les images à traiter, de les
analyser automatiquement et d’extraire les informations générés lors des analyses dans
différents fichier. Enfin, la macro CCD Report est accessible (cette macro permet de
déterminer les pixels chauds, froids et mort d’un capteur CCD.
Prérequis :
Installer la version 2 de MetroloJ (accessible sur sFTP>_METROLOGIE>MetroloJ) : copier
metroloJ_.jar dans le dossier plugins de ImageJ.
Installer le plugin Action Bar et l’action Bar MetroloJ en copiant le dossier Action Bar de
sFTP>_METROLOGIE>MetroloJ et en plaçant le dossier Action Bar dans le dossier plugins
de ImageJ.
Note Importante :
Les formats de fichiers multiImages (par exemple « .lif ») ne sont pas pris en charge si le
fichier « .lif » contient plus d’une image. Utiliser la macro LIF Splitter pour cela (disponible
sur le sFTP>Metrologie>MetroloJ
Versions :
1.0.0 : 8 juillet 2011.
1.0.1 : 11 juillet 2011, correction dans la barre d’appel MetroloJ.
1.1.0 : 12 juillet 2011, correction du fichier batchFieldHomogeneity.ijm. Implémentation pour
donner le % de dérive et le décentrage (ainsi que les tolérances).
1.1.1 : 18 juillet 2011. Correction de la détection de non calibration en mode interactif (macro
Automatic PSF reports).
1.2.0. : 24 juillet 2011. Modification de la macro Automatic PSF reports. En mode batch,
chaque canal est traité séparément. Le nombre de canaux est sélectionnable et configurable.
Le résumé prend en compte les critères internes de spécifications et indique si l’objectif est
susceptible d’être endommagé. Deux scores sont introduits pour indiquer un risque
d’astigmatisme et d’aberration sphérique.
1.2.1. : 25 juillet 2011. Prise en charge des fichiers .zvi . Ces fichiers, en fonction de la
configuration en plugins s’ouvrent en une fenêtre (composite, et la version d’ImageJ utilise
LOCI BIOFORMAT pour l’ouvrir) ou s’ouvrent en autant de fichiers que de canaux (via
plugin Input/Output>ZviReader.
1.2.2. : 2 Aout. Correction de l’affichage des logs intermédiaire dans la macro Automatic
Field Illumination Report. Implémentation d’une vérification de saturation des images.
Format 14 bits possible pour cette macro et la macro Automatic PSF Report.
Erreurs rapportées n’ayant pas fait l’objet d’une correction :
25 juillet 2011. Problème à l’utilisation de la Macro Automatic PSF Report. Il est nécessaire d’installer le plugin iText-2.1.4.jar pour utiliser le plugin MetroloJ (sur site sFTP).
26 juillet 2011 : à l’utilisation de la Macro Automatic Coalignement Report, lors de la sauvegarde du fichier summary.xls, message d’erreur. La fenêtre Summary.txt est éditée correctement. Il est nécessaire d’avoir la version 4.2 DEV et plus de LOCI Bioformat (sur site sFTP).
28 juillet 2011 : à l’utilisation de la Macro PSF Coalignement Report, les billes ne sont pas correctement détectées. Sur les images produites, les billes sont soit décentrées par rapport à l’image soit il y a deux billes. Après test sur le même set d’image, la Macro n’a pas présenté de défaut.
Formats supportés :
Les formats multiimages ne sont pas supportés (.lif par exemple).
Automatic PSF Report (v. 1.2.1)
Automatic Field Illumination Repor (v.
1.2.1)
Format
Interactif Batch Interactif Batch
Automatic Coalignement
Report
.tif √ √ √ √ √
.lsm √ √ √ √ √
.zvi √ √ √ √ √
.lif* √ √ √ √ √
.dv √ √ √ √ √
.stk √ √ √ √ √
* : après utilisation de la macro LIFSplitter.
i) Analyse manuelle avec configuration automatique (M. Lartaud) :
Cette première série de macros permet de configurer automatiquement les 3 plugins MetroloJ utilisés sur Montpellier RIO Imaging (Generate PSF Report, Generate Co-alignment Report et Generate Field Illumination Report).
Elle utilise un fichier de configuration Excel (param.xls) à éditer pour entrer les valeurs des objectifs de ses microscopes. La modification des longueurs d’ondes est possible en éditant le document MetroloJ_bar.txt
Au niveau de la barre, il faut définir les caractéristiques propres de l’image, c’est-à-dire :
o type de microscope avec laquelle l’acquisition a été effectuée. o type d’objective o Type de cube de fluorescence Ensuite, il faut définir le type d’analyse.
Field homogeneity Report permet d’analyser l’homogénéité du champ d’illumination de l’image ouverte
Coalignment Report permet d’analyser le coalignement des différents canaux au niveau d’une seule bille dans l’image. Pour utiliser cette macro, il faut au préalable, si l’image contient plusieurs billes, identifier une bille (Find One Bead).
PSF Report Report permet d’analyser la résolution latérale et axiale au niveau d’une seule bille sein de l’image. (attention lorsqu’il y a plusieurs dans l’image et que vous traitez plusieurs fois la même image il se peut que la même billes soit analyser plusieurs fois).
CCD Report permet d’analyser les pixels chauds, les pixels froids et les pixels morts. Estimation de ces pixels permet de connaitre la qualité de ses images
ii) Analyses automatisées (D. Akbar, J. Cau) La seconde méthode créée permet de sélectionner un dossier contenant des images à traiter et de les analyser.
Il y a trois types d’analyses :
Homogénéité du champ d’illumination (Automatic field illumination Report), elle permet d’analyser une pile d’images, de les extraire et de lancer le plugin field illumination Report de la collection MetroloJ (RTmfm, Fabrice Cordelières et Cédric Mathews).
Mesure de la PSF (Automatic PSF Report) : permet d’identifier des billes dans une pile d’images, de les extraire et de lancer le plugin PSFReport de la collection MetroloJ (RTmfm, Fabrice Cordelières et Cédric Mathews).
Contrôle du coalignement (Automatic Coalignement Report), elle permet d’identifier des billes dans une pile d’images, de les extraire et de lancer le plugin CoalignementReport de la collection MetroloJ (RTmfm, Fabrice Cordelières et Cédric Mathews).
Automatisation de l’extraction et de l’analyse d’Homogénéité de champ
Macro « Automatic field illumination Report »
La macro permet d’analyser une/un ensemble d’images et de lancer le plugin Field Illumination Report de la collection MetroloJ (RTmfm, Fabrice Cordelières et Cédric Mathews). En pratique, le mode de fonctionnement de la macro est présenté en figure 1.
Figure 1. Organigramme résumant le fonctionnement de la macro. Après avoir choisi les longueurs d’onde à étudier et la mode d’analyse des images (un seul set de fichiers « mode interactive » ou en plusieurs fichiers « batch »), la macro vérifie si l’image est saturée et calibrée. Le cas échéant, une calibration XY est demandée et appliquée à toutes les images suivantes. Lorsque les critères sont remplis, la macro lance automatique le plugin MetroloJ/field illumination Report. Enfin, un récapitulatif des mesures et des analyses d’homogénéité du champ est généré.
Choisir le fichier qui contient les images à traiter
Image Saturée ?
oui
Analyse d’homogénéité du champ
Compilation et enregistrement des résultats
calibrer
non
Configuration automatique du plugin MetroloJ/Generate field illumination Report
Lancer la macro
ImageCalibrée ?
non
oui
Arrêt
Utilisation de la macro
A savoir : La macro est conçue pour l’analyse d’une à plusieurs images. La sélection des couleurs sous-entend que les images multicanaux analysées contiennent le nombre exacts des couleurs sélectionnés, dans l’ordre des couleurs indiqué dans la macro. En mode batch, l’objectif utilisé est identifié à partir d’un TAG (par exemple « x » dans le nom de fichier LSM510_10x_488). Des images issues de plusieurs objectifs peuvent être analysées. Si elles ne sont pas calibrée, la première image non calibrée ouverte le sera (et l’objectif utilisé sera indiqué dans le dialogue de la macro). Toutes les autres images seront calibrées en considérant que la caméra/binning/lentille de tube est identique pour toutes les images analysées. Ainsi, une image 63x aura une taille de pixel 6.3 fois plus petite qu’un 10x.
Changement des valeurs : Si les valeurs choisies doivent être modifiée, ouvrir la macro dans un éditeur et changer éventuellement les valeurs suivantes :
‐ Wavelengths (ligne 3) : dans ce tableau, modifier les valeurs ou en ajouter/supprimer. ‐ offCenterThreshold (ligne 7) (voir infra). ‐ Heterogeneity tolerance (ligne 10)(voir infra).
I : Mode Interactive :
Ce mode permet d’identifier les images d’un set de différentes longueurs d’onde.
Etape 1 : Sélectionner le dossier contenant les images à traiter
Etape 2 : Choisir les longueurs d’onde à analyser et le mode d’analyse en fonction du type de fichier à étudier. Pour pointer des images spécifiques à analyser, choisir interactive. Pour traiter automatiquement des images, choisir le mode batch
Etape 3 : Déterminer les paramètres de traitement
a : mode interactive (Single channel fiels(s))
Images parameters : ‐ Sélectionner les images à analyser
‐ Donner un nom sous lequel les fichiers .log et les reports
seront enregistrés. La macro crée un dossier processed dans
le dossier sélectionné à l’étape 1 et un sous-dossier à ce
nom qui contiendra tous les fichiers créés.
Microscope parameters :
‐ Entrer les valeurs utilisées pour la détection et validation des
images par la macro :
o Indiquer le type de microscope avec lequel vous avez réalisé les images.
o Entrer le grossissement de l’objectif que vous avez utilisé.
o Entrer l’ouverture numérique de l’objectif.
o Indique la valeur du pinhole déterminé lors d’acquisition de l’image (aucun de ces paramètres n’est utilisé pour les calculs).
La macro ouvre les images sélectionnées, configure le plugin et génère les reports en .pdf
b : Mode batch (Multichannel file(s))
Images parameters :
‐ Donner un nom sous lequel les fichiers .log et les reports seront enregistrés. La macro crée un
dossier processed dans le dossier sélectionné à l’étape 1 et un sous-dossier à ce nom qui
contiendra tous les fichiers créés.
‐ Indiquer le TAG des canaux contenu dans le nom des fichiers que vous voulez analyser (par
exemple si toutes vos images à 525nm contiennent « GFP » dans leur nom, tel
LSM510_63x_GFP.lsm, entrer GFP).
Microscope parameters
‐ Entrer les valeurs utilisées pour la détection et validation des images par la macro :
o Indiquer le type de microscope avec lequel vous avez réalisé les images. o Entrer le TAG de l’objectif que vous avez utilisé (par exemple « x » pour des
noms de fichier LSM510_10x_488).
Etape 4 : La Macro vérifie que l’image est calibrée (elle est réputée non calibrée si l’unité est « pixel(s) » ou si la taille d’un pixel en X est de 0 ou 1 unités). Introduire les paramètres de calibration dans le cas où les images ne sont pas calibrées. Cette calibration sera appliquée aux autres canaux et aux autres objectifs (avec correction de la calibration).
Etape 5 : Les critères sont remplis, la macro identifie les images correspondant aux différentes longueurs d’onde choisie à l’étape 2. Le plugin MetroloJ/field illumination Report est configuré et lancé. Différents fichiers sont créés :
- Un fichier « obj »_summary.txt est créé par objectif et analyse les résultats en fonction des reports.
La valeur de distance en um du maximum d’intensité par rapport au centre géométrique de l’image est comparée à une tolérance maximum (égale à une variable, offcenterThreshold divisée par le
grossissement de l’objectif). Si le décentrage est supérieur à cette valeur, l’image est réputée décentrée (défaut de centrage).
Les ratios des intensités aux points azimuthaux de l’image (les coins et le milieu de chaque côté de l’image) par rapport au maximum sont analysés. La valeur la plus basse est comparée à 2 valeurs de tolérance :
‐ La première valeur (heterogeneityTolerance) correspond au maximum de déviation tolérée. Par exemple, pour une dérive de 30% par rapport au maximum (soit heterogeneityTolerance=0.3) si le ratio minimum d’un des points azimuthaux est inférieur à 0.7, le champ sera réputé hétérogène (défaut d’homogénéité).
‐ La seconde valeur, dérivé de heterogeneityTolerance compare le ratio à une valeur d’un cinquième la tolérance (soit pour une heterogeneityTolerance=0.3, une valeur de 0.06 et donc un ratio de 0.94). Si le ratio minimum d’un des points azimuthaux est supérieur à cette valeur de 0.94, le champ est réputé homogène.
Entre les 2 valeurs, l’homogénéité est considérée comme acceptable.
- Un fichier obj_summary.xls résume les différentes analyses effectuées. Un 0 indique un défaut de centrage ou d’homogénéité, selon les critères ci-dessus.
- Un fichier …_Summarylog.txt résume le nombre de fichiers analysés par objectifs et le nombre d’images alignées.
Automatisation de l’extraction et de l’analyse de Co-alignement
Macro « Automatic Coalignement Report »
Cette macro permet d’identifier des billes dans une pile d’images, de les extraire et de lancer le plugin CoalignementReport de la collection MetroloJ (RTmfm, Fabrice Cordelières et Cédric Mathews). Dans la figure 1, le mode de fonctionnement de la macro est présenté.
Lancer la macro
Choisir le fichier qui contient les images à traiter
Image Calibrée ?
oui
Trouver les billes en 2D
Mesurer l’intensité max
Bille isolée et loin des bords de l’image ?
oui
Analyse Co‐alignement 2 à 2 (canaux)
Compilation et enregistrement des résultats
calibrer
non
Bille saturée ?
oui
trash
trash
non
configuration automatique du plugin MetroloJ/Generate Coalignement Report
Figure 1. Organigramme résumant le fonctionnement de la macro. Après identification des images à traiter (en un seul fichier multichannel ou en plusieurs fichiers single Channel séparés), la macro vérifie si l’image est calibrée. Le cas échéant, une calibration XYZ est demandée et appliquée à toutes les images suivantes. Les billes sont identifiées (après lissage, seuillage automatique et en utilisant la fonction Analyze particles de ImageJ). La position des billes par rapport aux bords de l’image, par rapport aux autres billes identifiées et leur saturation éventuelle sont analysées. Lorsque les critères sont remplis, la macro lance automatique le plugin MetroloJ/ field illumination. Enfin, un récapitulatif des mesures et des analyses est généré.
Utilisation de la macro
A savoir : La macro est conçue pour l’analyse d’une à plusieurs images. La sélection des couleurs sous-entend que les images multicanaux analysées contiennent le nombre exacts des couleurs sélectionnés, dans l’ordre des couleurs indiqué dans la macro.
Les billes sont identifiées à partir de la première couleur ouverte, par projection d’intensité maximum, lissage (Gaussien, sigma 2), substraction du bruit de fond local (Rolling Ball) et seuillage automatique Yen.
Changement des valeurs : Si les valeurs choisies doivent être modifiée, ouvrir la macro dans un éditeur et changer éventuellement les valeurs suivantes :
‐ Beads (ligne 19) : dans ce tableau, modifier les valeurs ou en ajouter/supprimer pour changer le nom des canaux.
‐ Wavelengths (ligne 20) : dans ce tableau, modifier les valeurs ou en ajouter/supprimer pour changer la valeur des longueurs d’ondes correspondant aux canaux.
Etape 1 : Sélectionner le dossier contenant les images à traiter
Etape 2 : Choisir les couleurs en fonction des longueurs d’onde à analyser. Identifier le nombre de channel à analyser, le format des fichiers images en fonction de la station d’acquisition. Pour sélectionner des fichiers monocanaux ("tif", "tiff", "jpg", "bmp", "lsm", "stk", "dv", "zvi", "lif" par exemple), sélectionner Single Channels Files (type de microscope). Pour les fichiers multichannels sélectionner le type de microscope utilisé (Widefield : formats .dv et .zvi, confocal : formats .lsm et .lif).
Etape 3 : Déterminer les paramètres de traitement
a :Single channel fiels(s) (widefield/confocal)
Images parameters : ‐ Sélectionner les images à analyser (attention il est nécessaire de
sélectionner des images pour le nombre de canal définit au niveau
de l’étape 1).
‐ Donner un nom sous lequel les fichiers .log, les reports et les
images des billes seront enregistrés. La macro crée un dossier
processed dans le dossier sélectionné à l’étape 1 et un sous-dossier
à ce nom qui contiendra tous les fichiers créés.
‐ Entrer le grossissement de l’objectif que vous avez utilisé
‐ Entrer l’ouverture numérique de l’objectif.
Generate Coalignement plugin parameters :
‐ Entrer les valeurs utilisées pour la détection et validation des billes
par la macro :
o En cochant Save Logs, un fichier log avec les paramètres
de la macro est sauvé
o Coalignement box size correspond à la taille en um du
carré centré sur la bille et utilisé pour dupliquer l’image.
Une valeur de 12 µm est suffisante.
o bit depth permet de déterminer la valeur maximale
d’intensité possible et est utilisée pour constater une
éventuelle saturation et arrêter l’analyse de la bille.
b : Multichannel file(s) (widefield/confocal)
Images parameters : ‐ Sélectionner le fichier contenant les canaux.
‐ Donner un nom sous lequel les fichiers .log, les reports et
les images des billes seront enregistrés. La macro crée un
dossier processed dans le dossier sélectionné à l’étape 1 et
un sous-dossier à ce nom qui contiendra tous les fichiers
créés.
‐ Entrer le grossisement de l’objectif que vous avez utilisé
‐ Entrer l’ouverture numérique de l’objectif.
Generate Coalignement plugin parameters :
‐ Entrer les valeurs utilisées pour la détection et validation des billes
par la macro :
o En cochant Save Logs, un fichier log avec les paramètres
de la macro est sauvé
o Coalignement box size correspond à la taille en um du
carré centré sur la bille et utilisé pour dupliquer l’image.
Une valeur de 12 µm est suffisante.
o bit depth permet de déterminer la valeur maximale
d’intensité possible et est utilisée pour constater une
éventuelle saturation et arrêter l’analyse de la bille.
Etape 4 : La Macro vérifie que l’image est calibrée (elle est réputée non calibrée si l’unité est
« pixel(s) » ou si la taille d’un pixel en X est de 0 ou 1 unités). Introduire les paramètres de calibration
dans le cas où les images ne sont pas calibrées. Cette calibration sera appliquée aux autres canaux.
Etape 5 : Les critères sont remplis, la macro identifie les billes à partir de l’image correspondant au premier canal ouvert. Les billes sont alors dupliquées pour tous les autres canaux et chaque image d’un canal de bille est sauvée. La macro ouvre ensuite les images de billes à analyser, 2 à 2.
Différents fichiers sont générés :
- Un fichier Summary.txt est créé à partir de l’analyse de tous les fichiers .xls générés lors de la création des CoalignementReports et résume, par bille le coalignement.
- un tableau excel par bille reprend les analyses effectuées en fonction des combinaisons avec un 0 lorsque la distance entre les centres d’intensités des deux couleurs est supérieure à l’incertitude maximum de résolution (et donc lorsque le coalignement est mauvais) et un 1 lorsque le décalage observé est inférieur à l’incertitude de résolution (et donc que les centres d’intensité des deux couleurs sont, à cause de cette incertitude, coincidants).
- un fichier Coalignementlog résumant les raisons de la sélection des différentes billes identifiées et le
nom des images des billes sauvées.
Automatisation de l’extraction et de l’analyse de PSF
Macro « Automatic PSF Report »
Cette macro permet d’identifier des billes dans une pile d’images, de les extraire et de lancer le plugin PSFReport de la collection MetroloJ (RTmfm, Fabrice Cordelières et Cédric Mathews). En pratique, le mode de fonctionnement de la macro est présenté en figure 1.
Lancer la macro
Choisir le fichier qui contient les images à traiter
Image Calibrée ?
oui
Trouver les billes en 2D
Mesurer l’intensité max
Bille isolée et loin des bords ?
oui
Analyse PSF sur 4 canaux (metroloJ)
Compilation et enregistrement des résultats (moyenne, déviation, rapport réel /théo)
oui
calibrer
non
Bille saturée ?
oui
Tous les R2> 0.95 ? trash
non
trash
trash
non
Lancement automatique le plugin MetroloJ/PSF Report
Figure 1. Logigramme récapitulant le fonctionnement de la macro. Après identification des images à traiter (en un seul fichier multichannel ou en plusieurs fichiers single Channel séparés), la macro vérifie si l’image est calibrée. Le cas échéant, une calibration XYZ est demandée et appliquée à toutes les images suivantes. Les billes sont identifiées (après lissage et en utilisant la fonction find maxima de ImageJ). La position des billes par rapport aux bords de l’image, par rapport aux autres billes identifiées et leur saturation éventuelle sont analysées. Lorsque les critères sont remplis, la macro lance automatique le plugin MetroloJ/PSF Report. En mode interactif, l’utilisateur pointe un groupe de 4 channels et des reports sont générés pour toutes les billes. En mode batch, un élément commun dans le nom des fichiers et, dans le cas de fichiers single channel, un élément identifiant chaque canal dans le nom des fichiers sont demandés. Enfin, un récapitulatif des mesures de résolution X, Y et Z est généré.
Utilisation de la macro
A savoir : La macro est conçue pour l’analyse d’une à plusieurs images contenant n canaux. La sélection des couleurs sous-entend que les images multicanaux analysées contiennent le nombre exacts des couleurs sélectionnés, dans l’ordre des couleurs indiqué dans la macro.
En mode interactif, les billes sont identifiées à partir de la première image ouverte (et à partir de chaque image en mode batch), par projection d’intensité maximum et la fonction find maxima.
Changement des valeurs : Si les valeurs choisies doivent être modifiée, ouvrir la macro dans un éditeur et changer éventuellement les valeurs suivantes :
‐ R2 threshold (ligne 4) : modifier la valeur de R² du fit sur une dimension (X, Y ou Z) en
dessous de laquelle une bille n’est plus analysée pour la dimension concernée. Ce seuil est fixé
à 0.95 (une bille de R2 de 0.94 pour une direction ne sera pas prise en compte pour cette
direction dans le calcul des valeurs moyennes/déviation standard des billes).
‐ Beads (ligne 7) : dans ce tableau, modifier les valeurs ou en ajouter/supprimer pour changer le
nombre et le nom des canaux. Le nom du canal est inscrit dans le nom. Il est important de
faire en sorte, pour que le résumé des mesures soit correct, que le nom d’un des canaux ne soir
pas contenu dans un autre comme dans « Red » et « DeepRed ». Pour cela, nous avons placé
« Ch » devant le nom : « ChRed » n’est pas contenu dans « ChDeepRed ».
‐ wavelength (ligne 8) : dans ce tableau, modifier les valeurs ou en ajouter/supprimer pour
changer la valeur des longueurs d’ondes correspondant aux canaux.
‐ RealOverTheoThreshold. (ligne 5) : il s’agit du seuil au-dessus duquel les performances d’un
objectif par rapport aux performances théoriques ne sont plus correctes. Il est fixé à 2 pour la
plate-forme (un objectif ayant une résolution latérale 2.1x supérieure à la résolution latérale
théorique sera considéré comme non-conforme).
‐ beadQualityThreshold. (ligne 6) Il s’agit du seuil du rapport déviation standard/moyenne à
partir duquel un message avertira l’utilisateur que les images de billes sont soit très variables
soit de faible qualité et l’invitera à analyser toutes les images de billes. Ce seuil est fixé à 20%
(0.2). Une analyse donnant une résolution mesurée en X de 215nm +/- 53nm (rapport de 0.24)
sera signalée comme suspecte.
I : Mode interactif :
Ce mode permet d’identifier les billes d’un set de 4 canaux.
Etape 1- Sélectionner le dossier contenant les images à traiter
Etape 2- Sélectionner « use interactive mode to process one set of images »
Etape 3- Choisir le format des fichiers images en fonction de la station d’acquisition. Pour sélectionner des fichiers monocanaux ("tif", "tiff", "jpg", "bmp", "lsm", "stk", "dv", "zvi", "lif" par exemple), sélectionner Single Channels Files (type de microscope). Pour les fichiers multichannels sélectionner le type de microscope utilisé (Widefield : formats .dv et .zvi, confocal : formats .lsm et .lif).
Etape 4 : Déterminer les paramètres de traitement
a :Single channel fiels(s) (widefield/confocal)
images parameters : ‐ Sélectionner les images à analyser (attention il est nécessaire de
sélectionner des images pour les 4 canaux).
‐ Donner un nom sous lequel les fichiers .log, les reports et les
images des billes seront enregistrés. La macro crée un dossier
processed dans le dossier sélectionné à l’étape 1 et un sous-dossier
à ce nom qui contiendra tous les fichiers créés.
‐ Entrer le grossisement de l’objectif que vous avez utilisé
‐ Entrer l’ouverture numérique de l’objectif.
Generate PSF plugin parameters
‐ Entrer les valeurs utilisées pour la détection et validation des billes
par la macro :
o En cochant Save individual channel PSF Stacks, les
images des billes extraites sont sauvées (et numérotées par
bille) et des fichiers logs intermédiaires sont créés : -
‐ Parameterslog résume les paramètres utilisés
pour la série d’image
‐ PSFLog indique les coordonnées des billes
identifiées et les raisons de leur traitement/non
traitement
o La valeur « Noise Tolerance » est celle utilisée par la
fonction Find Maxima de ImageJ. Une valeur de 100
fonctionne généralement.
o PSF box size correspond à la taille en pixels du carré
centré sur la bille et utilisé pour dupliquer l’image. Une
valeur de 100 est suffisante.
o bit depth permet de déterminer la valeur maximale
d’intensité possible et est utilisée pour constater une
éventuelle saturation et arrêter l’analyse de la bille.
b : Multichannel file(s) (widefield/confocal)
images parameters : ‐ Sélectionner le fichier contenant les 4 canaux
‐ Donner un nom sous lequel les fichiers .log, les reports et les
images des billes seront enregistrés. La macro crée un dossier
processed dans le dossier sélectionné à l’étape 1 et un sous-dossier
à ce nom qui contiendra tous les fichiers créés.
‐ Entrer le grossissement de l’objectif que vous avez utilisé
‐ Entrer l’ouverture numérique de l’objectif.
Generate PSF plugin parameters
‐ Entrer les valeurs utilisées pour la détection et validation des billes
par la macro :
o En cochant Save individual channel PSF Stacks, les
images des billes extraites sont sauvées (et numérotées par
bille) et des fichiers logs intermédiaires sont créés : -
‐ Parameterslog résume les paramètres utilisés
pour la série d’image
‐ PSFLog indique les coordonnées des billes
identifiées et les raisons de leur traitement/non
traitement
o La valeur « Noise Tolerance » est celle utilisée par la
fonction Find Maxima de ImageJ. Une valeur de 100
fonctionne généralement.
o PSF box size correspond à la taille en pixels du carré
centré sur la bille et utilisé pour dupliquer l’image. Une
valeur de 100 est suffisante.
o bit depth permet de déterminer la valeur maximale
d’intensité possible et est utilisée pour constater une
éventuelle saturation et arrêter l’analyse de la bille.
Etape 5 : La Macro vérifie que l’image est calibrée (elle est réputée non calibrée si l’unité est « pixel(s) » ou si la taille d’un pixel en X est de 0 ou 1 unités). Introduire les paramètres de calibration dans le cas où les images ne sont pas calibrées. Cette calibration sera appliquée aux autres canaux.
Etape 6 : Les critères sont remplis, la macro identifie les billes à partir de l’image correspondant au canal rouge. Les billes sont alors dupliquées pour tous les autres canaux et le plugin MetroloJ/PSF Report est lancé. Un fichier Summary.txt est créé à partir de tous les fichiers .xls générés lors de la création des PSFReports. Les valeurs moyennes de résolution latérale XY et axiale Z sont calculées, ainsi que le rapport avec la valeur de résolution théorique.
II : Mode batch
Ce mode permet d’identifier les billes à partir d’un groupe d’images ayant toutes un élément commun dans leur nom (le avec des noms stéréotypés).
Etape 1- Sélectionner le dossier contenant les images à traiter
Etape 2- Sélectionner « use stereotyped mode to process multiple sets»
Etape 3- Choisir le format des fichiers images en fonction de la station d’acquisition. Pour sélectionner des fichiers monocanaux ("tif", "tiff", "jpg", "bmp", "lsm", "stk", "dv", "zvi", "lif" par exemple), sélectionner Single Channels Files (type de microscope). Pour les fichiers multichannels sélectionner le type de microscope utilisé (Widefield : formats .dv et .zvi, confocal : formats .lsm et .lif).
Etape 4 : Déterminer les paramètres de traitement
a :Single channel fiels(s) (widefield/confocal)
images parameters :
- Indiquer l’élément contenu dans le nom de l’ensemble des images à traiter (100x par exemple)
- Indiquer le TAG permettant d’identifier par canal la couleur des images à traiter.
- Donner un nom sous lequel les fichiers .log, les reports et les images des billes seront enregistrés. La macro crée un dossier processed dans le dossier sélectionné à l’étape 1 et un sous-dossier à ce nom qui contiendra tous les fichiers créés. ‐ Entrer le grossisement de l’objectif que vous avez utilisé
‐ Entrer l’ouverture numérique de l’objectif.
Generate PSF plugin parameters
‐ Entrer les valeurs utilisées pour la détection et validation des billes
par la macro :
o En cochant Save individual channel PSF Stacks, les
images des billes extraites sont sauvées (et numérotées par
image et par bille) et des fichiers logs intermédiaires sont
créés :
‐ Parameterslog résume les paramètres utilisés
toutes les images
‐ PSFLog indique, par image, les coordonnées des
billes identifiées dans les images et les raisons de
leur traitement/non traitement.
‐ SummaryLog, reprenant pour chaque image le
nombre de billes traitées.
o La valeur « Noise Tolerance » est celle utilisée par la
fonction Find Maxima de ImageJ. Une valeur de 100
fonctionne généralement.
o PSF box size correspond à la taille en pixels du carré
centré sur la bille et utilisé pour dupliquer l’image. Une
valeur de 100 est suffisante.
o bit depth permet de déterminer la valeur maximale
d’intensité possible et est utilisée pour constater une
éventuelle saturation et arrêter l’analyse de la bille.
b : Multichannel file(s) (widefield/confocal)
images parameters :
- Indiquer l’élément contenu dans le nom de l’ensemble des images à traiter (100x par exemple). Chaque image doit contenir les 4 canaux.
- Donner un nom sous lequel les fichiers .log, les reports et les images des billes seront enregistrés. La macro crée un dossier processed dans le dossier sélectionné à l’étape 1 et un sous-dossier à ce nom qui contiendra tous les fichiers créés. ‐ Entrer le grossissement de l’objectif que vous avez utilisé
‐ Entrer l’ouverture numérique de l’objectif.
Generate PSF plugin parameters
‐ Entrer les valeurs utilisées pour la détection et validation des billes
par la macro :
o En cochant Save individual channel PSF Stacks, les
images des billes extraites sont sauvées (et numérotées par
image et par bille) et des fichiers logs intermédiaires sont
créés :
‐ Parameterslog résume les paramètres utilisés
toutes les images
‐ PSFLog indique, par image, les coordonnées des
billes identifiées dans les images et les raisons de
leur traitement/non traitement.
‐ SummaryLog, reprenant pour chaque image le
nombre de billes traitées.
o La valeur « Noise Tolerance » est celle utilisée par la
fonction Find Maxima de ImageJ. Une valeur de 100
fonctionne généralement.
o PSF box size correspond à la taille en pixels du carré
centré sur la bille et utilisé pour dupliquer l’image. Une
valeur de 100 est suffisante.
o bit depth permet de déterminer la valeur maximale
d’intensité possible et est utilisée pour constater une
éventuelle saturation et arrêter l’analyse de la bille.
‐
Etape 5 : La Macro vérifie que la première image est calibrée (elle est réputée non calibrée si l’unité est « pixel(s) » ou si la taille d’un pixel en X est de 0 ou 1 unités). Introduire les paramètres de calibration dans le cas où l’image ne soit pas calibrée. Cette calibration sera appliquée aux autres canaux/images.
Etape 6 : Les critères sont remplis, la macro identifie les billes à partir de l’image correspondant au canal rouge. Les billes sont alors dupliquées pour tous les autres canaux et le plugin MetroloJ/PSF Report est lancé.
Plusieurs fichiers sont générés :
- Un fichier Summary.txt est créé à partir de tous les fichiers .xls générés lors de la création des PSFReports. Les valeurs moyennes de résolution latérale XY et axiale Z sont calculées, ainsi que le rapport avec la valeur de résolution théorique.
- un fichier Summarylog.txt résumant les images traitées, le canal détecté et le nombre de reports générés à partir de chaque image.
