Bases Pratiques Des Chromatographies

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Imprimé par M. Jean Roch ALLIEZ le dimanche 17 février 2008

Bases pratiques des chromatographies

Practical principles in chromatography

Biologie clinique [90-60-0027]

M. Beljean-LeymarieCentre hospitalier spécialisé Bon Sauveur, 93, rue Caponière, 14000 Caen, France

Auteur correspondant.

La chromatographie est l'ensemble des procédés qui permettent de séparer différentessubstances constitutives d'un échantillon en utilisant leur différence de migration à travers unephase fixe sous l'impulsion d'un fluide mobile. Cet article présente très brièvement lesdifférentes méthodes utilisées en chromatographie. Il développe plus spécifiquement le conceptde la chromatographie d'élution sur colonne et fournit les bases théoriques et pratiques requisesà l'amélioration raisonnée des procédures de chromatographie.

Chromatography refers to the body of processes used to separate different constituting

substances of a sample using their difference of migration on a stationary and a fluid mobilephase. This chapter presents briefly the various techniques available in chromatography. Itpresents more specifically the column elution theory, providing the theoretical and practicalbases required for the chromatographic procedure improvement.

Mots clés : Chromatographie, Chromatogramme, Rétention, Efficacité, Résolution

Keywords : Chromatography, Chromatogram, Retention, Efficiency, Resolution

Résumé

Abstract

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La chromatographie est l'ensemble des procédés qui permettent de séparer différentessubstances constitutives d'un échantillon en utilisant leur différence de migration à travers une

phase fixe (phase stationnaire) sous l'impulsion d'un fluide mobile (phase mobile) [1, 2, 3, 4, 5,

6 et 7].

Les méthodes chromatographiques sont nombreuses, les dénominations sont variables selon le

type de classification choisie.

Introduction

Classification selon la nature des phases

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28/07/2011file:///C:/Users/Chiraz%20Nadine/Documents/Mes%20Fichiers/Biologie%20Clinique...



Phase stationnaire solide ou liquide ; phase mobile gazeuse, liquide ou supercritique ; ondifférencie trois grandes classes de chromatographie :

Les termes de chromatographie gaz-solide, gaz-liquide, liquide-solide, voire liquide-liquide sontdélaissés aujourd'hui.

On distingue différents types de chromatographie :

On parle de chromatographie par développement lorsque le mélange est déposé sous forme demicrovolume de solution et les solutés séparés sur la phase stationnaire sont mis en évidence(révélés) lorsqu'ils sont encore sur la phase stationnaire et de chromatographie par élutionlorsque le mélange à analyser est déposé sous forme de microvolume de solution, chaque solutéétant entraîné hors de la phase stationnaire. L'identification des substances séparées se faitdans l'éluat (c'est-à-dire la phase mobile à la sortie de la colonne).

Les chromatographies à haute performance sont nées des progrès technologiques.

• la chromatographie en phase gazeuse (CPG) ;

• la chromatographie liquide (CL) ;

• la chromatographie en phase supercritique (CPS).

Classification selon la nature des phénomènes mis en jeu

• chromatographie d'adsorption : lorsque la phase stationnaire est un solide adsorbant, laphase mobile étant soit un liquide, soit un gaz ;

• chromatographie de partage : lorsque la séparation est basée sur les différences de solubilité(de partage) des molécules dans une phase stationnaire liquide et une phase mobile (gaz,liquide, FSC) ;

• chromatographie d'appariement d'ions : c'est une chromatographie liquide appliquée à desmolécules ionisées qui, mises en présence d'un contre-ion, donnent naissance à des pairesd'ions ;

• chromatographie d'échange d'ions lorsque la phase stationnaire est un solide ayant despropriétés particulières d'échangeur d'ions (groupements fonctionnels ionisés ou ionisablesfixes et des ions mobiles assurant l'électroneutralité) ;

• chromatographie d'échange de ligands lorsque la phase stationnaire contient une espècechimique (ions métalliques) capable de former des complexes avec les moléculesorganiques ;

• chromatographie d'exclusion-diffusion (perméation de gel - filtration sur gel) lorsque la phasestationnaire est formée de grains poreux à travers lesquels les solutés à séparer peuvent ounon cheminer ;

• chromatographie chirale (lorsque la séparation s'appuie sur la différence de conformation desénantiomères, elle peut être développée en phase gazeuse, liquide ou supercritique) ;

• chromatographie d'affinité : c'est une chromatographie d'un type très particulier qui vise àséparer un soluté parmi tous les autres (contrairement aux autres chromatographies quivisent la séparation d'un maximum de solutés) en utilisant la complémentarité de structurede type clé-serrure.

Classification selon le matériel utilisé (technologie)

• Chromatographie en colonne : tube, rempli ou non de phase stationnaire.

• Chromatographie planaire (de surface) : couche mince d'un support plus ou moins adsorbant.

Classification selon le mode d'introduction de la phase mobile

Remarque concernant les chromatographies à haute performance





La suite de cet article porte exclusivement sur la chromatographie d'élution sur colonne. L'âmede la chromatographie est la colonne, les solutés s'y séparent au fur et à mesure de leurprogression en fonction de leurs différences d'affinité pour les phases. Toutefois, la colonne estnécessairement intégrée dans un ensemble allant de l'injecteur à l'enregistreur. Le résultatobservé (le chromatogramme) (Figure 1

) n'est que le résultat global de l'ensemble del'appareillage.

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La simple observation d'un chromatogramme montre qu'à la sortie de la colonne, un soluté seprésente sous forme d'un pic d'allure gaussienne et que la largeur des pics augmente avec leur

ordre de sortie (Figure 2).

Le but de cet article étant essentiellement pratique, sont développées succinctement les notions

• Chromatographie en phase gazeuse haute performance (CPG capillaire).

• Chromatographie liquide haute performance (CLHP ou HPLC) correspondant à lachromatographie liquide désormais « courante » avec phase mobile liquide pulsée et supportsde la phase stationnaire homogènes, de très petite taille. La notation haute performance estdevenue, aujourd'hui, inutile.

• La chromatographie couche mince à haute performance (HPTL) utilise les supportsdéveloppés pour l'HPLC contribuant à la performance.

Figure 1

Figure 1.

Chromatogramme. Pic d'allure gaussienne. H : hauteur du pic ; Tr :

temps de rétention ; ω : largeur à la base ; δ : largeur à mi-hauteur.

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Notions liées au chromatogramme

Chromatogramme

Figure 2

Figure 2.

Chromatogramme.

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fondamentales qui permettent de juger un chromatogramme.

Les différentes théories de la chromatographie d'élution en colonne visent à expliquer lechromatogramme.

La première théorie de la chromatographie a établi que le pic chromatographique est gaussienet que, sur le même chromatogramme, la largeur des pics augmente avec la rétention dessolutés ; menant aux deux relations majeures toujours très couramment utilisées par lesutilisateurs de la chromatographie :

Le pic d'allure gaussienne (Figure 1) implique que le pic réponde à l'équation mathématiqued'une courbe de Gauss c'est-à-dire :

Cette surface A = √2 π σ H.

Ces grandeurs sont définies au moment où le soluté sort de la colonne à son maximum deconcentration.

le temps de rétention tr est le temps que met un soluté à sortir de la colonne, à son maximum

de concentration.

t = 0 au moment de l'injection ; tr = L/vitesse du soluté sur la colonne.

Remarque : une substance n'ayant aucune affinité pour la phase stationnaire n'est présente quedans la phase mobile. Son temps de rétention est égal à t

m. Si μ représente la vitesse linéaire

de la phase mobile, tm = L/μ.

Le tr est caractéristique d'un soluté donné dans un système chromatographique donné.

La distance de rétention dr est la distance parcourue par le stylet de l'enregistreur depuis le

moment de l'injection du soluté jusqu'à sa sortie au maximum de concentration.

dr est fonction de la vitesse de déroulement du papier : dr = v papier tr .

Le volume de rétention Vr est le volume de phase mobile qui a perfusé la colonne entre le

moment de l'injection et l'instant où le soluté sort à son maximum de concentration. Si D est ledébit de la phase mobile perfusant la colonne (supposé constant) Vr = D tr .

Concepts

• la notion d' efficacité d'une colonne ;

• la notion de facteur de rétention (caractéristique d'un soluté dans des conditions données).

• le pic est symétrique autour de sa médiane (correspondant au maximum max du pic), son

équation est telle que les deux points d'inflexion, situés à 60,7 % de la hauteur H du pic sont

distants de 2 σ (l'écart-type), sa largeur à mi-hauteur δ = 2,354 σ, la largeur à la base dutriangle extrapolé par les tangentes aux points d'inflexion ω est égal à 4 σ ;

• que la surface du pic, proportionnelle à la quantité de soluté injectée sur la colonne, est telleque :○ 95 % de la masse du soluté est comprise entre max ± 2 σ ;

○ 99,7 % du soluté entre max ± 3 σ.

Grandeurs de rétention





La colonne de chromatographie est assimilée à l'empilement de N plateaux identiques (plateaux

théoriques) de hauteur H. La longueur L de la colonne est égale à NH.

H est appelé hauteur équivalente à un plateau théorique (HEPT), anciennement notée h.(Actuellement, la notation h est réservée comme symbole pour la hauteur réduite [cf. infra].) Nse définit comme le nombre de plateaux théoriques sur une colonne.

Ce nombre est accessible à partir du chromatogramme, par comparaison de la grandeur de

rétention à la largeur du pic gaussien : N = (tr /σtotal )2. Les pics sont d'autant plus étroits que

N est grand. La colonne est d'autant plus performante que N est grand ; elle a d'autant plusd'aptitude à séparer les différents solutés ; elle est d'autant plus efficace . N exprime l'efficacitéapparente de la colonne.

Comme le terme « apparent » l'indique, la valeur de N ainsi établie ne permet pas de juger desperformances de la colonne elle-même uniquement, puisque la colonne est nécessairementintégrée dans l'ensemble de la chaîne de chromatographie.

De ce fait, la variance σ2total accessible par le chromatogramme est le reflet du système

chromatographique, dans sa globalité : σ2total = σ 2

colonne + σ 2extracolonne .

Cette relation implique :

Aussi utilise-t-on de préférence le terme d'efficacité Napparent ou Neffectif .

La deuxième relation fondamentale relie le volume de rétention d'un soluté Vr aux volumes des

phases stationnaire Vs et mobile Vm de la colonne, via le coefficient de partage K (de l'équilibre

supposé). Vr = Vm + K Vs .

Le facteur de rétention k (anciennement dénommé k' facteur de capacité) peut être défini soit

comme le rapport des masses de soluté distribuées entre les deux phases (k = mstat. /mmob )ou comme le rapport des temps de séjour du soluté dans ces deux phases (t stat. /tmob. ), ce

rapport est constant pour un soluté donné dans un système chromatographique donné stabledans le temps. Ainsi la relation K Vs /Vm se rencontre le plus souvent sous la forme : Vr = Vm

(1 + k). Elle est traduite en termes de temps sous la forme : tr = tm (1 + k). Il est

caractéristique de chaque soluté, il est tel que k = (tr -tm )/tm ; en pratique il est difficile

d'appréhender tm . En chromatographie liquide, par exemple, on utilise des solutés supposés

n'avoir aucune affinité pour la phase stationnaire (inertes) et l'on définit alors le facteur derétention par rapport à l'inerte choisi, comme k = tr -t0 /t0 ; t0 étant le temps de rétention de

l'inerte choisi sur la phase utilisée.

Deux relations majeures

Efficacité apparente d'une colonne

• qu'il est nécessaire dans une chromatographie de maîtriser la variance extracolonne afin dene pas nuire aux performances de la colonne ;

• que l'on est amené à avoir une exigence d'efficacité de la colonne supérieure à celle d'uncalcul théorique à partir du chromatogramme.

Facteur de rétention k

Conséquences pratiques

Déterminer expérimentalement le facteur de rétention





Pour déterminer expérimentalement le facteur de rétention d'un soluté donné, dans un systèmechromatographique donné, il est nécessaire de disposer d'un composé que l'on puisseconsidérer comme n'ayant aucune affinité pour la phase stationnaire.

Différents composés ont été proposés dans la littérature (nitrate, uracile...) en chromatographieliquide ; en CPG, on peut utiliser le pic de l'air avec certains détecteurs....

Ce composé a pour temps de rétention t0 , le soluté donné, présentant un temps de rétention trtel que tr = to (1 + k). Le facteur de rétention k = (tr - t0 )/t0 .

On envisage les deux cas expérimentaux possibles, liés à la symétrie des pics.

On mesure sur le chromatogramme : tr

et σ soit à partir de la largeur à mi-hauteur (2,354 σ),

soit à partir de la largeur entre les deux points d'inflexion (2σ) ou à partir de la largeur à la baseextrapolée par les tangentes (ω = 4σ). On calcule N = (tr /σ)2.

L'asymétrie des pics complique l'interprétation du chromatogramme. Il est impossible demesurer correctement σ. Les calculs effectués à la base du pic, à 50 ou 60,7 % de la hauteurconduisent à des valeurs différentes, d'autant plus grandes que la mesure est faite dans lapartie la plus basse du pic. Dans ce cas, il est souhaitable de disposer d'un logiciel qui permetted'accéder aux moments statistiques de chacun des pics.

Un pic chromatographique correspond à la variation de la concentration ou de la quantité dusoluté dans le détecteur en fonction du temps.

On utilise le chromatogramme obtenu à partir de l'injection d'un mélange d'au moins trois

Déterminer l'efficacité apparente d'une colonne

Pic symétrique

Pic dissymétrique

• Le moment d'ordre 0 .Mo = ∫C(t) dt, représente l'aire sous la courbe. Cette aire est assimilable à la quantité de

soluté injectée.

• Le moment d'ordre 1 .M1 = 1 / Mo ∫0 C(t) . t. dt correspond à la valeur de t du centre de gravité pour laquelle la

surface de la courbe de t inférieur est égale à la surface de la courbe de t supérieur et égale àla moitié de la surface de la courbe totale, c'est-à-dire quantité de soluté pour t inférieur =quantité de soluté de t supérieur = q o /2.

(Lorsque le pic est gaussien, il correspond à la valeur de t au maximum de la concentration Cpar définition au tr ; lorsque le pic n'est pas gaussien M1 ne correspond pas à la valeur de t

pour le maximum de concentration. Il est donc différent de t).• Le moment d'ordre 2.

M2 = 1/ Mo ∫0

C (t) (t - M1 ) 2 dt mesure la variance de la courbe (du pic) σ2 pour des pics

non symétriques : l'efficacité apparente de la colonne N est calculée, à l'aide des moments,elle correspond au rapport des moments M

12/M

2.

• Le moment d'ordre 3.M3 = 1/ Mo ∫

0C (t) (t - M1 ) 3 dt mesure l'asymétrie du pic.

Accéder à l'efficacité intrinsèque d'une colonne

Détermination de la variance extracolonne





composés et d'une substance considérée comme présentant une rétention nulle, de temps derétention t0 . Pour chacun des trois pics, on détermine :

On représente la courbe σ 2total = f (t0 2 /N) (1+ k)2] où (1+ k)2 est porté en abscisse. Ils'agit d'une droite pour laquelle, lorsque k = 0 c'est-à-dire pour (1+k)2 = 1, la variance σ2

totale correspond uniquement à la variance extracolonne σ2extracol .

Celle-ci doit impérativement être inférieure à 10 % de la variance des pics. Ainsi pour répondreà une valeur souhaitée d'efficacité de l'ensemble, il faut avoir une exigence supérieure pour lacolonne. En effet Ncol· = [tr ⁄σcol ]2 ;

N exigée (pour une bonne séparation par exemple) est Nexig· = [tr2 ⁄σcol

2 + σextracol2] ;

Nexig. = Ncol. /[1 + (σextracol2

/σcol2

)], (Nexig· est bien > Ncol. ).

La maîtrise de la variance extracolonne appartient au chromatographiste. La varianceextracolonne résulte de la dispersion du soluté au niveau de l'injecteur, du détecteur, et descapillaires de jonction.

σ 2total = σ2

inj + σ2tubes + σ2

détect .

Elle a pour conséquence :

Le but de la chromatographie étant de séparer les différents solutés, des critères d'estimationdes séparations ont été définis. Ce sont les grandeurs de rétention relatives.

• le facteur de rétention k et la variance σ2total ;

• l'efficacité apparente de la colonne N est calculée ou donnée par l'intégrateur.

Comment diminuer la variance extracolonne ?

- Au niveau de l'injecteur : σ2

inj

= V2 /a où V est le volume d'injection ; on veille à limiter le

volume injecté, si les concentrations disponibles le permettent.

- Au niveau des capillaires de jonction : σ2tubes = constante . D . π d4 L/Dm .

où d est le diamètre des tubes de jonction, D est le débit de la phase mobile et D m est le

coefficient de diffusion du soluté.Ce paramètre est majeur car d intervenant à la puissance 4 (d4) on veille à n'utiliser que descapillaires très étroits destinés à cet effet.

- Au niveau du détecteur, deux paramètres sont importants :• d'une part le temps de réponse, on veille à régler correctement la constante de temps du

détecteur ;

• d'autre part le volume de la cellule (choix à l'achat).

Existence d'une variance extracolonne importante

• une perte d'efficacité apparente de la colonne comme on vient de la montrer Nobs = Nintr /

(1 + σ2extracolonne /σ2

colonne ) ;

• une perte de résolution comme on va de le voir dans ce qui suit.

Grandeurs de rétention relatives





Pour cerner de plus près le temps que passent les solutés dans la phase stationnaire, il estnécessaire de s'affranchir du terme tm intervenant dans tr , puisque tm représente le temps mis

par un soluté n'ayant aucune affinité pour la phase stationnaire pour sortir de la colonne.

La sélectivité est définie comme le rapport entre les facteurs de rétention de deux solutésconsécutifs (la plus grande des deux valeurs étant toujours portée au numérateur) α = k2 /k1 .

• α > 1. α = 1 si les deux composés ne sont pas séparés ; plus α est supérieur à 1, plus lescomposés sont séparés .

Remarque : α = k2 /k1 = K2 /K1 ; K1 et K2 les coefficients de partage.

La sélectivité α mesure la différence de distribution thermodynamique des deux composés. Ils'agit des différences d'interactions des solutés dans les phases stationnaire et mobile. C'est unecaractéristique de la colonne. Toute modification de la nature de l'une ou de l'autre phasemodifie α .

La résolution est la grandeur destinée à apprécier la séparation de deux pics consécutifs. Lapremière définition s'adresse à des pics gaussiens. Elle consiste à comparer la distance quisépare deux pics consécutifs à la somme de leurs demi-largeurs.

• Les grandeurs de rétention corrigées, à ne pas confondre avec les grandeurs réduites (cf.infra) :○ t'r = tr - tm ;

○ d'r = dr - dm ;○ V'r = Vr - Vm .

• Les grandeurs de rétention relatives permettant d'apprécier la séparation de deux solutésélués consécutivement.

Rétention relative ou sélectivité

Résolution de pics symétriques

• ω est la largeur à la base du triangle, extrapolée par les tangentes ;

• tRB est le temps de rétention du composé le plus retenu ;• tRA est le temps de rétention du composé le moins retenu (Figure 3).

Figure 3

Figure 3.

Résolution de pics symétriques.





On lit couramment que pour que deux pics soient bien séparés, il faut R s ≥ 1,50. Que penser

de cette valeur ?

Cette valeur repose sur deux hypothèses : les deux pics sont gaussiens et de même importancequantitative.

Les pics sont gaussiens : 99,7 % du soluté est compris sous la courbe entre t R σ, la courbe

est symétrique, il reste de part et d'autre de ce domaine 0,15 % de soluté. Ainsi, dans leschéma ci-dessus : OA K = 3 σA ; OB L = 3 σB , si L et K sont confondus IF = OA K + OB L

= 3 σA + 3 σB ; 99,85 % de A est à gauche de K(L) et 99,85 % de B est à droite de L(K). Il

existe un chevauchement de 0,15 % de A avec 0,15 % de B, si les deux pics sont d'égaleimportance (ceci est négligeable) et l'on peut considérer que les deux substances sont bienséparées.

Remarque : si un pic est nettement plus important que l'autre, le recouvrement du plus petit estbien supérieur (> > 0,15 %), on doit avoir une plus grande exigence Rs = 2 voire 3 et plus .

On peut montrer qu'il existe une relation entre la résolution d'une part et l'efficacité N et lasélectivité α de la colonne, ainsi que les facteurs de rétention k des deux solutés d'autre part.On trouve dans la littérature plusieurs relations voisines différant par les hypothèses faites. Lesdeux hypothèses les plus fréquemment rencontrées s'appuient sur le fait que les pics sont trèsproches l'un de l'autre, voire trop proches. Le calcul de résolution a toujours pour but deréfléchir à la meilleure façon d'améliorer une séparation un peu délicate (d'optimiser).

Ce sont :

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Valeur limite de Rs

Relations entre résolution et paramètres chromatographiques





représente la demi-somme des deux k .

Ces deux relations conduisent à des résultats analogues, suffisants pour répondre au butpoursuivi : rationaliser l'influence de facteurs liés à la chromatographie - c'est dire rationaliserl'optimisation.

Rs varie :

Pour augmenter une résolution on peut donc envisager la modification d'au moins un de cestrois paramètres.

Augmenter N. N = L/h. Pour augmenter R, on peut augmenter L ou diminuer h (HEPT).

Si on augmente L, ceci implique un changement de colonne et de plus t r augmentant, le temps

de l'analyse augmente.

On préfère d'abord chercher à diminuer la HEPT H. Il suffit pour cela de vérifier que la colonneest utilisée dans les conditions optimales de débit.

Influence de la vitesse linéaire de la phase mobile sur l'efficacité de la colonne. On montre quel'élargissement des bandes de soluté sur une colonne est le résultat de trois phénomènes :variété des chemins parcourus, diffusion, résistance au transfert de masse vers l'une et l'autrephase. Ainsi la variance de la bande de soluté sur la colonne : σ2

col = σ2anisotropie + σ2

diffusion + σ2transfert de masse .

On peut s'appuyer, dans une première approche simplifiée, sur l'équation de Van Deemter,reliant la HEPT à la vitesse de la phase mobile μ. H = A + B/μ + C μ, chacun des troistermes correspond à une cause d'élargissement des pics chromatographiques. Il est aisé demontrer que la courbe représentative d'une telle équation présente un minimum. À ce minimumde la valeur Hmini correspond le maximum de la valeur Nmax que l'on peut donner à l'efficacité

de la colonne.

Aspect pratique : détermination du débit optimal . Il est nécessaire d'être attentif au réglage dudébit de la phase mobile D ; débit et vitesse sont étroitement liés : D = ε π r2 μ, ε étant la

• 1re hypothèse : les pics sont si proches que l'on peut considérer qu'ils sont de même largeurωA = ωB avec ωB = 4 trB /√NB , B est le composé le plus retenu à partir duquel on calcule

NB ;

• 2e hypothèse : N efficacité est la même pour tous les composés consécutifs, cette hypothèseprésente l'avantage de donner aux deux solutés la même importance.

• avec N l'efficacité de la colonne ;• avec α la sélectivité de la colonne ;

• avec k les facteurs de rétention.





porosité de la colonne.

Pour déterminer le débit optimal, on mesure l'efficacité apparente de la colonne à trois débits

de (μopt.=

Remarque : en chromatographie liquide, une approche plus précise utilise la relation de Knox,plus complète et reliant la HEPT réduite h (H/d

p) à la vitesse réduite de la phase mobile ν

H = A ν 1/3 + B/ν + C ν

Modification de la sélectivité α. α peut être modifié :

Il est à noter que ce qui influence la résolution, est plus exactement le rapport :

Les modifications sur des α très proches de 1 ont une grande influence ; en revanche, si α esttrès différent de 1, l'influence est minime.

Par exemple :

Le premier essai à effectuer en chromatographie liquide porte sur la modification de la

composition de la phase mobile.

Le premier essai à effectuer en chromatographie gazeuse porte sur la modification de latempérature.

Modifications de k. En chromatographie liquide, on cherche habituellement des k comprisentre 2 et 5 pour l'analyse de mélanges peu complexes.

Les modifications sur des k très proches de 0 ont une grande influence ; en revanche, si k esttrès différent de 1, l'influence est minime, on est alors confronté à d'autres inconvénients.

Ainsi, lorsque k passe de 5 à 10 la résolution n'augmente que de 9 %, mais la durée d'analysedouble.

• en changeant la nature et la composition de la phase mobile ;

• en changeant la nature de la phase stationnaire ;

• en modifiant la température.

Résolution de pics dissymétriques





La définition de la résolution repose sur l'observation de chromatogrammes où les pics sontsymétriques. Les exigences sont différentes si les pics sont de hauteurs très différentes et si lespics sont asymétriques car, dans ces cas, la mesure de la largeur du pic notamment à 60,7 %de hauteur (2σ) n'est plus adaptée, ω devient supérieur à 4σ. La détermination géométrique n'aplus de sens. Rs doit être calculé à partir du facteur de discrimination do .

Le facteur de discrimination est par définition le rapport (Figure 4

) :

hp = hauteur du plus petit.

hv = hauteur de vallée.

Il a été montré qu'il existait une relation simple approximative mais suffisante pour chiffrer laséparation de deux solutés consécutifs :

d0 = 1 - 2 e[-2Rs

2]

où Rs = résolution

Calculée initialement pour des pics gaussiens, cette relation s'est avérée satisfaisante pour despics dissymétriques.

De plus, comme nous l'avons montré précédemment, l'existence d'une variance extracolonneminore la résolution intrinsèque sur la colonne.

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Comme pour toutes les méthodes analytiques, les applications sont qualitatives et quantitatives.

Figure 4

Figure 4.

Résolution de pics dissymétriques. Facteur de discrimination.

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Intérêt analytique de la chromatographie

En analyse qualitative





Les méthodes chromatographiques sont des méthodes de séparation. Après séparation, leconstituants peuvent être identifiés. Le premier critère d'identification d'un soluté est son tempde rétention tr . tr est constant dans des conditions chromatographiques données, c'est-à-dir

sur une colonne donnée dans des conditions données (température et P en CPG ; nature,composition et débit de la phase mobile en CL à température donnée). Mais le t

r n'est pas u

critère absolu . En effet, si on peut incontestablement affirmer que deux solutés dont les tr son

différents, sont de natures différentes, l'inverse n'est pas vrai. En effet, la séparatiochromatographique repose sur des différences entre les solutés : de polarité, de polarisabilité,de solubilité, de tension de vapeur saturante (en CPG), d'encombrement stérique... Ainsi, deuxsolutés de structures totalement différentes peuvent présenter le même tr .

De nos jours, ce problème est moins complexe du fait des nouveaux détecteurs qui sont emesure de mémoriser simultanément trois paramètres. Par exemple :

De ce fait, il est possible d'analyser toute partie du pic chromatographique et de conclure à lpureté du pic et à l'identification.

L'analyse quantitative est liée à la théorie qui permet d'établir que l'aire du pic esproportionnelle à la quantité injectée.

En théorie, on peut faire un étalonnage en injectant un volume constant de solutions dconcentrations différentes et en traçant la courbe A = f(C).

Cette courbe devrait être une droite (dans les cas les plus simples).

En réalité, la maîtrise de l'exactitude du volume injecté est beaucoup plus difficile que l'on peutpriori supposer, même quasi impossible en CPG.

Aussi préfère-t-on utiliser un étalon interne.

Un étalon interne (EI) est une substance que l'on ajoute aux échantillons à analyser,concentration constante. Il est choisi parmi les solutés se séparant parfaitement bien decomposés à analyser mais présentant un temps de rétention proche. Il permet d'éliminer leerreurs quantitatives liées à une mauvaise maîtrise du volume injecté.

L'aire d'un pic chromatographique est proportionnelle à la masse de soluté injecté.

X et EI sont dans la même solution de volume injecté v.

Si le détecteur est stable, K et KEI

sont constants dans le temps :

• en spectrophotométrie UV-visible, avec barrette de diodes (en CL) ou en spectrophotométrieIR avec transformée de Fourier (en CPG) : le système de détection acquiert simultanémentles données : absorbance, longueur d'onde et le temps ;

• en détection de masse, ce sont les données courant ionique, m/z et temps qui sontmémorisées simultanément.

En analyse quantitative

• Ai : aire du pic correspondant à l'intégration du signal délivré par le détecteur ;

• f i: facteur de réponse ou coefficient de réponse du détecteur ;

• mi: masse soluté, donc A

i= f

im

i.

Principe de la méthode

• Pour un soluté X : mX = K AX ;

• pour l'EI : mEI = KEI AEI





Remarque :

Le rapport mX /mEI des masses injectées est le même que celui des masses dans le tube

d'échantillon traité dans le protocole (avec la quantité fixée d'EI).

Ainsi,

qEI sera impérativement constant et AX /AEI = z' qX

Le volume final n'est pas nécessairement égal dans tous les tubes, mais la quantité d'étalon

interne doit être rigoureusement la même dans tous les tubes.

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Cette fiche a pour but de résumer les notions de base, afin de situer les problèmes pratiquesrencontrés lorsqu'on aborde la chromatographie.

La pratique de chaque type particulier de chromatographie, chromatographie en phase gazeuse,chromatographie liquide à polarités de phase inversées, chromatographie d'exclusion, DHPLC,etc... ainsi que l'appareillage ou les développements récents dans le domaine de la

microchromatographie, de la nanochromatographie ou des flash chromatographies ne font pasl'objet de ces bases pratiques.

Le lecteur peut se reporter aux ouvrages généraux ou spécialisés ainsi qu'aux informations trèsdétaillées fournies par les sociétés d'appareillage.

Conclusion

Figure 1





Figure 1 :

Chromatogramme. Pic d'allure gaussienne. H : hauteur du pic ; Tr

: temps de rétention ; ω : largeur à la

base ; δ : largeur à mi-hauteur.

Figure 2

Figure 2 :

Chromatogramme.

Figure 3

Figure 3 :





Résolution de pics symétriques.

Figure 4

Figure 4 :

Résolution de pics dissymétriques. Facteur de discrimination.

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Références

[1] Caude M. Jardy Aeditors. Chromatographie liquide (partie 1) Techniques de l'analyse. (volTA2) Paris: Techniques de l'ingénieur; 2007.

[2] Caude M. Jardy A editors. Chromatographie liquide (partie 2). Perméation de gel Techniques del'analyse. (vol TA2) Paris: Techniques de l'ingénieur; 2007.

[3] Caude M., Bargmann-Leyder N. Séparations chirales Techniques de l'analyse. (volTA2) Paris: Techniques de l'ingénieur; 2007.

[4] Pradeau D., Dauphin C. Chromatographie planaire Techniques de l'analyse. (vol TA2) Paris: Techniquesde l'ingénieur; 2007.

[5] Tranchant J. Chromatographie en phase gazeuse Techniques de l'analyse. (vol TA2) Paris: Techniquesde l'ingénieur; 2007.

[6] Tranchant J. Couplage CG/SM/SM Techniques de l'analyse. (vol TA2) Paris: Techniques del'ingénieur; 2007.

[7] Chromatographie : faire le bon choix (automates) Option Bio. 2006 ; 361 : 38-44

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