Bâtiment Grégor Mendel - 43, boulevard du 11 novembre 1918 69 622–VILLEURBANNE Cedex tél : 0472431377 - fax : 0472431223

- Symbiose actinorhizienne- Symbiose mycorhizienne- Interactions rhizosphèriques- Transfert de gènes et adaptation bactérienne- Groupes fonctionnelles du cycle de l’azote- Bactéries Pathogènes Opportunistes et Environnement

Université Claude Bernard Lyon 1Université Claude Bernard Lyon 1UMR CNRS 5557UMR CNRS 5557USC INRA 1193USC INRA 1193

Méthylation et métalloïdes toxiques

B. Cournoyer

Les voies de méthylation des métalloïdes toxiques

plusieurs bactéries pathogènes = résistantes au tellurite et/ou sélénite: - P. syringae, Agrobacterium tumefa ciens - P. aeruginosa, E. coli VTEC, Salmonella typhimurium - Staphylococcus aureus

K2TeO3

4ppm 

Odeur d’ail

Pourquoi?Quel mécanisme?Méthylation?

réduction

Les voies de méthylation des métalloïdes toxiques

Identification de la bTPMT (Cournoyer, 1996)• P. syringae

Sm

aI1 2

Hin

cII

Eco

RI

Eco

RI

Pst

I

Hin

cII

Xho

I

pSK -E

coR

IpSK -

1.650.92T3

T70

tpmE htpX-likeorfC-like

E. coli TPMT-E

K2TeO3

4ppm 

E. coli ::tpmE + sélénite

LB

(Ranjard et al., 2000)Analyse GC-MS

Odeur d’ail = DMTe

Caractérisation de la bTPMT

Sm

aI

1 2

Hin

cII

Eco

RI

Eco

RI

Pst

I

Hin

cII

Xh

oI

pSK -

Eco

RI

pSK -

1.650.92T3

T70

rTelactivity

+

tpm htpX-likeorfC-like

Caractéristique du déterminant: - forte homologie avec la thiopurine méthyle transférase (TPMT) humaine (30% identités; 55% similarités)

- Gmelin (1824): odorous materials obtained from Se et Te during animal experiments; a garlic-like odour (première observation)

- Idem chez l’Homme lors d’intoxication au Se et Te

Krynetski & Evans, Oncogene, 2003

Métabolisme des thiopurines

- Fin des années 80, la TPMT est montrée essentielle pour le métabolisme des pro-drogues « 6-mercaptopurine » et

« thioguanine nucleotides »

HPTR: hypoxanthinephosphoribosyltransferase

Autres fonctions chez l’Homme - détoxication de métalloïdes???

Introductionde toxiques (As, Se, Te, etc)dans l’environnement

Produits volatilsobservés e. g. DMSe, DMDSe,DMSSe, etc

GC-MS

Présence de bTPMT ??

Sol (10 g)

Suite des travaux sur les bTPMT

Détection des gènes de la bTPMT

1 216 AA43 12778 AA234 bp

détection de tpm dans les ADN méta-génomiques des solset des eaux

Stratégie mise en place

- élaboration d’un crible PCR / utilisation des domaines conservésTPMT-E vs huTPMT (30% identités; 55% similarités)

TPMT-E

Diversité des bTPMT

Homme,Rat,Souris

UbiG

UNK TPMT

ABCD

EFGH

IJ

KL

MN

PO

QRSTUVX

( et -proteobacteria)

(eubacteria)

bTPMT

uniquementchez 30% des-proteobacteria

= , Bordetella spp.

- plus de 50% desimilarités- plusieurs allèlespar lignée

*

= sol (7)

Publication: Favre-Bonté et al., 2005 + ms en cours de rédaction

*

14.4

25

35

45

66.2

116

18.4

kDa

Avant

induc

tion

Après

indu

ction

Extrait

solub

le

TPMT G

1

TPMT G

2

Marq

ueur

s

TPMT G

3

Chromatographie d'affinité :TPMT-G : Ni-NTA (élution par 250 mM imidazole)TPMT-E : Glutathione-Sepharose-4B (élution par 10 mM glutathion)

TPMT-G

TPMT-E

Ava

nt

Apr

ès

TP

MT

-E

GS

T

M

Coupure de l’His tag

Affinité des bTPMT pour les métalloïdes

Affinité des bTPMT pour les métalloïdes

Mise au point des tests enzymatiques. tampon de réaction (selon Krynetski et al., 1995). choix du substrat – 6-mercaptopurine

SH . Immuno-suppresseur (lors des greffes). Traitement de la leucémie, et. Maladie auto-immune

TPMT

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

0 10 20 30 40 50 60

DO320

Temps (min)

Courbe 1

Courbe 3

Courbe 2

Courbe 4

Courbe 5

Activité de méthylation de la 6-MP

10 µM TPMT-E

TPMT-E TPMT-G1

TPMT-G2

TMPT-G3

Vm (nmol.min-1.mg-1) 5,6 2,4 3 1.3

Km (µM) 81 46 57 20

Paramètres cinétiques de méthylation de la 6-MP par TPMT-E et les 3-TPMT-G.

huTPMT, Km= 10.6 M

DO 320

Affinité des formes enzymatiques pour les toxiques séléniés

- méthylation de substrats séléniés: 6-séléno-purine, Se-cystine, sélénite etséléniate

. avec des extraits de protéines totales TPMT+- obtention de DMSe à partir de Se-cystine- absence d’activités avec le sélénite

. en cours, comparaison des affinités et vitesse de réaction entremercaptopurine et séléno-purine

SH SeH DO 350

Substrats de la méthyle transférase bTPMT

CH3SeCH3

bTPMTSAM SAH Autres produits:

DMS, DMDS, DMDSeDMSeS, DMTe

S, Se, Te – inorg. et org.

SHMeS bTPMT

Thiopurine (anti-métabolites de la synthèse des purines)

- utilisation répandue pour le traitement de maladies auto-immunitaires, de la leucémie, du cancer et prévention des rejets d’organes transplantés

bTPMT et l’As? La piste des odeurs

-Bartolomeo Gosio (1892): obtained a garlic like odor from microbes growing on a potato mash containing arsenic trioxide

+ Scopulariopsis brevicaulis (Gosio’s fungi): Gosio’s garlic-like gas (TMA) from As mercaptan-like odour (DMSe) from selenite garlic-like odour (DMTe) from tellurite

Méthylation bactérienne de l’As (en aérobiose)

Etat des lieux:- E. coli + DMA = TMAO (trimethylarsine oxide)- Nocardia + MMA = (CH3)nAsH3-n (les méthyle arsines)

Bactéries TPMT +:- Pseudomonas sp. + arséniate = (CH3)2AsH- Aeromonas et Alcaligenes + méthyle arsoniate (MMA)= (CH3)AsH2 et (CH3)2AsH

As dans l’environnement Produits volatils

observés - MeAs, DMeAs,TMeAs

« There are apparently no accounts of the characterization of specific arsenic methyltransferases from microorganisms » (Bentley and Chasteen, 2002)

Autres As métalloïdes-méthyle transférases ?

Les pistes:1. Les proches voisins de la TPMT- UbiG (demethylubiquinone methyltransferase)- « UNK » (putative methyltransferases)

2. Les UbiE et MMT (métalloïdes méthyle transférases)- Découverte simultanée – nouvelle famille de Se/Te-méthyltransférases

UbiE

- Ensembledes eubacteries

MMT

- large distribution- plusieurs duplications- synthèse de métabolitessecondaires dontcertains antibiotiques etcertaines moléculesanti-cancéreuses- présence dans les eaux

pas Se-méthylation

Se-méthylation

Ranjard et al., 2004

Conclusions:

1. Plusieurs observations laissent entrevoir un rôle de la TPMTdans la méthylation de l’As

2. Les formes méthylées de l’As sont obtenues dans les conditions d’expression de la TPMT ou chez des organismes TPMT+

3. D’autres méthyle transférases pourraient jouer un rôle: UbiG, certaines methyle transférases putatives, …et MMT

Même famille - plusieurs lignées (23) chez les -protéobactéries- structures différentes- substrats différents?

Perspectives

Voies de méthylation de l’As - Recrutement d’un étudiant M2e. g. . les formes de bTPMT et la méthylation de substrats arséniés. Analyse comparative des affinités pour les substrats « S », « Se », « Te » et « As »

* Recherche partenaire au sein du GDR-As (co-encadrement du M2) pour le volet chimie analytique (détection/caractérisation des formes méthylées)

Bactéries Pathogènes Opportunistes et Environnement

Remerciements:- ToxNuc-Environnement- CNRS – UCBL - ENVL- Région Rhône-Alpes

Participants:L. ChampierS. Favre-BontéL. RanjardC. Prigent-Combaret+ qqes stagiaires

C. MonnezE. BrothierS. Favre-BontéS. NazaretB. Cournoyer

Méthylation de l’As

arsenate

arsenite

Methyl-arsonate

Methyl-arsonite

Dimethyl-arsinate

Dimethyl-arsinite

Trimethyl-arsine oxide (TMAO)

Trimethyl-Arsine (TMA)

Excrétédans les urines

(According to Challenger (1951))

+

+++

+++

++++

0

0 0 (selon Cullen et Bentley, 2005)

AsH3, +++++ -Inorganic forms of

arsenic are more toxic than organic forms

- Trivalent forms are more toxic than pentavalent

AsH3 gaz, As(-III) > As(III) > As (V) > composés méthylés

MeAs DMeAs

++ (?) ++ (?)