BIOCHIMIE - REACTIONS CELLULAIRES (BI301) - Juin 2015 Sujet

BIOCHIMIE - REACTIONS CELLULAIRES (BI301) - Juin 2015

Sujet portant sur le cours de James Sturgis – A rendre sur une copie séparéeDurée conseillée : 45 minutes

Quelles réactions sont faites par les enzymes :1. Aldolase2. Phosphofructokinase (PFK) ?

Décrire l'action d'ATP sur ces deux enzymes.

Dans une cellule la concentration de fructose-2,6-bis phosphate est environ 1mM. Supposant que les deux enzymes ont des cinétiques Michaeliennes, et sachant que pour ces deux enzymes on connait certains paramètres dans la cellule (voir tableau) que pouvez vous dire de l'activité des enzymes ?

Aldolase PFK

Vmax 200 M min-1 50 M min-1

Km (Fructose 6 Phosphate) - 0.5mM

Km (Fructose 1,6 bis Phosphate) 0.5mM 2mM

Km (Glyceraldehyde 3 phosphate) 0.2mM -

Si la constante catalytique de l'aldolase est de 1.33 x 103 sec-1 quelle est la concentration de l'aldolase dans une cellule ?

Sujet portant sur les travaux pratiques – A rendre sur une copie séparéeDurée conseillée : 30 minutes

1. Vous avez besoin du tampon BMX de composition suivante :

MES 20 mM – NaCl 0.15M – DTT 3 mM – EDTA 1mM – SDS 0.5%

Comment préparer 100 ml de tampon BMX concentré 10 fois à partir de:

MES (PM=195.4 g.mol-1) – NaCl 3M – DTT 3 M

EDTA 0.5 M – SDS en poudre

2. Pourquoi utilisons nous le SDS dans l'SDS-PAGE ?

BIOCHIMIE - REACTIONS CELLULAIRES (BI301) - JANVIER 2015

Sujet portant sur le cours de James Sturgis – A rendre sur une copie séparéeDurée conseillée : 20 minutes

Repondre a une seule des deux questions A ou B

A) L'enzyme Pyruvate carboxylase ajoute une molécule de di-oxyde de carbone (CO2) sur le groupement méthyl du Pyruvate pour former un di-acide (acide oxalo-acetique). Pendant cette réaction une molécule d'ATP est hydrolysée en ADP et PO4.1. Faire un schema de cette réaction (5 points)2. Pourquoi coupler la carboxylation du pyruvate et l'hydrolyse d'ATP ? (2 points)3. Est-ce une réaction d'anabolisme ou catabolisme et pourquoi ? (1 points)4. A votre avis cette réaction serait-elle propice à la régulation ? (2 point)

B) Donnez quelques élements communs au métabolisme de tout organisme vivant et donc probablement très anciens (10 points)

Sujet portant sur les travaux pratiques – A rendre sur une copie séparéeDurée conseillée : 20 minutes

1. On souhaite mettre en œuvre une stratégie de purification d’une protéine P en insérant en amont de son extrémité N-terminale un peptide destinés à faciliter sa purification. Citer le nom de ce peptide utilisé pour cet usage. Préciser quel support ou ligand peut être utilisé pour immobiliser cette protéine sur une colonne de chromatographie, ainsi que le facteur qui, ajouté dans le tampon d’élution, conditionne la libération de cette protéine de la colonne d’affinité (3pts).

2. Comment préparer 10 ml de tampon de charge pour SDS-PAGE composé de 2 % (P/V) SDS, 10% (V/V) glycérol, 5% (V/V) -mercaptoéthanol, 62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8, et 0,05% de bleu de bromophénol à partir de : SDS (PM : 288,379 g/mol), de glycérol (90%), de -mercaptoéthanol (100%), de Tris (PM: 121,14g/mol), et de bleu de bromophénol (5%). (3pts)

3. Quel traitement supplémentaire subiront les échantillons protéiques repris dans ce tampon avant d'être chargés sur gel d'acrylamide ? (1pt)

4. Pour visualiser une protéine de 10 kDa, vous utilisez : (1pt)◦ Un gel d’acrylamide à 7%◦ Un gel d’agarose à 2%◦ Un gel d’acrylamide à 15 %◦ Un gel d’agarose à 0.5%

5. Que peut-on déduire de ces observations, concernant une même protéine soumise à diverses électrophorèses et révélée par coloration spécifique ? (1pt)◦ Après électrophorèse en gel de polyacrylamide en présence de SDS, on révèle une

bande de 100 kDa◦ Dans les mêmes conditions, mais en ajoutant du D, on révèle une bande de 50

Kda.6. Vous disposez d’une protéine purifiée. Pour évaluer la quantité vous mesurez par

spectrophotométrie : (1pt)◦ la DO à 260 nm◦ la DO à 280 nm◦ la DO à 600 nm

Biochimie (Réactions Cellulaires)

2014-2015

Partiel de Novembre 2014Calculette permis, Documents non-permis

Durée 1 heure.

A) Cette question concerne la cinétique d'une réaction d'isomérisation entre un aldéhyde et une cétone, comme nous l'avons vu en cours.1. Donnez un exemple de ce type de réaction, et l'enzyme qui la fait. (4)

Dans le tableau sont indiquées les concentrations de produit (aldéhyde) en fonction de temps pour quatres échantillons. Les differents échantillons avaient des conditions initiales différentes en concentration de substrat (cétone) et contennaient tous 0.5 μM d'enzyme.

Concentration de produit (M) en fonction de temps

Temps Echantillon 1 Echantillon 4 Echantillon 4 Echantillon 4

0.3 mM cétone 1 mM cétone 3 mM cétone 10 mM cétone

0 sec 0.04 -0.30 0.15 0.09

30 sec 19.5 51.0 71.0 123.0

60 sec 40.0 100.0 145.0 230.0

90 sec 58.0 149.5 210.0 340.0

2. Quelles sont les vitesses initiales des réactions dans les quatres cas. (6)3. Estimer les valeurs de Km et Vmax observées pour l'enzyme. (4)4. Connaissant la concentration d'enzyme, calculer la constante catalytique (kcat). (2)5. La vitesse de la réaction depend du pH. A partir de vos connaissances de la catalyse par ce

type d'enzyme, quels groupements ionisables pourraient être impliqués. (4)

B) Les groupements phosphoryles (PO4) sont très importants dans le métabolisme et sa régulation.1. Pourquoi les métabolites sont ils souvent phosphorylés? (2)2. Donner un exemple d'une enzyme et la réaction qui phosphoryle un métabolite non-

phosphorylé (5)3. Quelles sont les caractéristiques thermodynamiques (G et G°') constatées en général pour

les réactions de phosphorylation? Comment peut-on expliquer cela en quelques mots? (5)4. La phosphorylation joue des rôles également dans la régulation (8). Donner des exemples de :

1. Une localisation dépendante de la phosphorylation ;2. Une dimérisation dépendante de la phosphorylation ; 3. Une activité enzymatique dependant de la phophorylation ; 4. Un signal transmis dans la cellule grâce à la phosphorylation ; 5. Une stabilité dépendante de la phosphorylation


20122013Partiel – 1 heure

Les calculettes sont permises (mais pas nécessaires)

Répondre à une seule des deux questions A ou B

A) Les réactions cellulaires sont fortement régulé à différents niveaux. Répondre a tous les points suivants en utilisant des exemples concrets.

La vitesse d'une réaction enzymatique dans une cellule peut être modifié en changeant quels paramètres de l'enzyme ?

Est-il possible de réguler le métabolisme au niveau de toutes les réactions, ou cértaines réactions sont elles plus propices à la régulation que d'autres ?

L'activité enzymatique dans une cellule peut être modulée sur différentes échelles de temps : expliquez les méthodes utilisées par les cellules pour une modulation rapide et pour une modulation plus lente.

Dans la régulation nous avons vu de multiples protéines avec la même fonction, mais également des protéines avec de multiples fonctions. Expliquez comment chacune de ces organisations aide à la régulation.

B) Une levure dans un mileu qui contient du glucose est les bases nucleotidique, mais pas d'oxygène, est en train de fabriquer des molécules d'ARN et d'ADN.

Quel est le bilan pour fabriquer l'ARN pppUpGpUpGpGpGpUpG à partir de glucose, ATP, uracile, guanine et NADP+ ?

• La fabrication ADN utilise autant d'ATP que la fabrication d'ARN, les ribonucleotides sont convertis en désoxy-ribonuclotides utilisant un équivalent de NADPH par l'enzyme RNR.

Environ combien d'ATP sont nécessaire pour fabriquer l'ADN de la genome d'une bacterie (~4Mbp en longeur) ?

Si la réplication de l'ADN prend 20 minutes combien de molécules d'ATP par second sont utilisées ?

Si tout l'ATP, et également une partie des nucléotides, vienne de la fermentation du glucose combien de molécules de glucose sont utilisés par seconde pour faire de l'ADN ?


20122013Correction

D'abord, quelques points importants... Il faut répondre aux questions posées et non pas aux questions que vous auriez voulu que je pose !!! Beaucoup entre vous ont perdu des points à cause de cela. Si vous ne comprenez pas les mots dans les questions demandez aux surveillants, c'est bête de répondre à côté car vous n'avez pas compris.

A) Les réactions cellulaires sont fortement régulées à différents niveaux. Répondre à tous les points suivants en utilisant des exemples concrets.

La vitesse d'une réaction enzymatique dans une cellule peut être modifié en changeant quels paramètres de l'enzyme ?

Les paramètres de l'enzyme qui peuvent être modifiées sont sa capacité catalytique (kcat) et son affinité (Km), c'est a dire l'activité de l'enzyme présent (ce que nous avons vu avec le phospho-fructo-kinase et les effets de ATP etc). Il est également possible d'agir sur la quantité d'enzyme ou son accessibilité.

Est-il possible de réguler le métabolisme au niveau de toutes les réactions, ou certaines réactions sont elles plus propices à la régulation que d'autres ?

Certains réactions sont plus propices a la régulation que d'autres. En effet pour une régulation efficace il faut agir sur des réactions hors-équilibre (G << 0 ). Par exemple le phospho-fructo-kinase (G = -21.2 kJ mol-1).

L'activité enzymatique dans une cellule peut être modulée sur différentes échelles de temps : expliquez les méthodes utilisées par les cellules pour une modulation rapide et pour une modulation plus lente.

Pour une régulation rapide les cellules changent l'activité des enzymes présents. Cela se fait principalement par deux méthodes différentes : la liaison d'inhibiteurs (tel l'ATP sur phosphofructokinase) ou alternativement la modification chimique de l'enzyme (comme la phosphorylation de PFK2 par la Protéine Kinase A ou de Mth1 par Yck1).Pour une régulation plus lente les cellules changent la quantité d'enzyme présent. Cela se fait en modifiant la vitesse de synthèse (induction/répression de gènes) comme nous l'avons vu pour les transporteurs de glucose Hxt1-4, ou alternativement en jouant sur la dégradation des protéines avec l'ubiquitinylation.

Dans la régulation nous avons vu de multiples protéines avec la même fonction, mais également des protéines avec de multiples fonctions. Expliquez comment chacune de ces organisations aide à la régulation.

Une exemple de multiples protéines avec la même fonction sont des multiples transporteurs de glucose (Hxt1-4 et au delà) qui sont tous des transporteurs passifs de glucose. Cependant ils n'ont pas tous les mêmes caractéristiques cinétiques (Km et

kcat) et donc les protéines synthétises sont adaptés aux conditions environnementales et ainsi aide a réguler l'entre de glucose dans la cellule.On a vu deux exemples de protéines multi-fonction : hexokinase 2 (enzyme et régulateur) et phosphofructokinase 2 (réactions de kinase et phosphatase). Dans les deux cas le basculement entre les deux fonctions se fait grace à la phophorylation. Cela aide aide la régulation car il faut simplement modifier l'activité d'une protéine. Si les deux fonctions étaient portées par deux protéines différentes il faut réduire l'activité de l'une et augmenter celle de l'autre.

B) Une levure dans un mileu qui contient du glucose et les bases nucléotidiques, mais pas d'oxygène, est en train de fabriquer des molécules d'ARN et d'ADN.

Quel est le bilan pour fabriquer l'ARN pppUpGpUpGpGpGpUpG à partir de glucose, ATP, uracile, guanine et NADP+ ?

Le bilan finale est 8 glucose, 5 G, 3 U, 40 ATP, 16 NADP+ → ARN + 40 ADP + 8 CO2 + 16 NADPH + 30 PO4. Ici c’était utile de montrer la voie métabolique car ça permettait d'avoir pas mal de points même si le bilan final était faux.

• La fabrication d'ADN utilise autant d'ATP que la fabrication d'ARN, les ribonucléotides sont convertis en désoxy-ribonucléotides en utilisant un équivalent de NADPH par l'enzyme RNR.

Environ combien d'ATP sont nécessaire pour fabriquer l'ADN du génôme d'une bactérie (~4Mbp en longeur) ?

Dans la précédente question on voit qu'ajouter un nucléotide dans une acide nucléique coûte 5 (si vous aviez un autre chiffre il fallait l'utiliser) équivalents d'ATP. Une génome bactérien de 4Mbp contient 8 106 nucléotides. De plus les C sont plus chers (6 ATP/base) et nous pouvons imaginer qu'environ 25 % des bases sont des C. Cela donne environ 42 106 molécules d'ATP.

Si la réplication de l'ADN prend 20 minutes combien de molécules d'ATP par seconde sont utilisées ?

42 106 molécules d'ATP divisé par 1200 secondes donne environ 35000 molécules par seconde.

Si tout l'ATP, et également une partie des nucléotides, vient de la fermentation du glucose combien de molécules de glucose sont utilisées par seconde pour faire de l'ADN ?

La fermentation alcoolique produit deux molécules d'ATP par glucose. Donc pour l'ATP il faut fermenter 17500 molécules de glucose par seconde. De plus les désoxy-ribose de l'ADN viennent également du glucose à une vitesse de 6700 sec-1 donc en total 24200 glucose / sec. Cependant il faut noter que en vu de la production nette d'un NADPH par nucléotide il faut une autre voie métabolique pour utiliser le pouvoir réducteur généré.

Biochimie (Réactions Cellulaires) ENSBI3U1

20122013Final – Partie James Sturgis – Durée conseillée 30 minutes

Les calculettes sont permises

Répondre à une seule des deux questions A ou Bà rendre sur une copie séparée

A) Les réactions cellulaires sont catalysées par des enzymes.

Conditions t=0 t=30 sec t=1 min t=5 min

3.998 ml tampon +1 l substrat +1 l enzyme.

0.00 0.14 0.29 1.35

3.989 ml tampon +1 l substrat +10l enzyme.

0.02 1.00 1.45 1.46


-0.05 0.61 1.21 3.00


0.03 0.87 1.75 2.99

Dans le tableau est indiqué comment l'absorption d'un échantillon change avec le temps après l'addition d'une enzyme. L'absorption est due au produit de la réaction et est mesurée dans un spectrophotomètre avec un chemin optique de 1 cm.

1. Quel est la vitesse initiale de changement d'absortion en ligne 1 du tableau ?2. Pour quelles raisons l'absorption arête de changer après 1 min en ligne 2 ?3. Si la coefficient d'extinction du produit est 15 mM-1cm-1 quelle est la vitesse de sa

synthèse en ligne 3 ?4. Si la concentration de la solution stock de substrat est de 400 mM quelle est sa

concentration initiale en ligne 4 ?5. Estimer le Km de l'enzyme.

B) Les enzymes assure que la cinétique des réactions cellulaires est assez rapide et régulée.

1. Pour une réaction chimique qu'est-ce que l'état de transition ?2. L'état de transition peut être modifier de quelle façon par une enzyme ?3. Comment la triose phosphate isomerase modifie-t'elle l'environnement de son

substrat ?4. Quelle est la différence entre l'état de transition et un intermédiaire ?

BIOCHIMIE - REACTIONS CELLULAIRES (BI301) - JANVIER 2013

Sujet portant sur le cours de M. Aussel - A rendre sur une copie séparée

Durée conseillée : 1 heure 20 minutes (environ)

Un gène codant pour une protéine de 46.500 Daltons est cloné dans un vecteur

d'expression. Ce vecteur est transformé dans une bactérie où la protéine est surproduite,

puis purifiée. Un extrait de protéine purifiée est analysé par spectrométrie de masse et

permet d'obtenir un pic unique à m/z = 38.500 Daltons.

1. Comment expliquez-vous ce résultat ? (2 points)

2. Combien d'acides aminés composent la protéine purifiée ? (1 point)

Un extrait de cette protéine purifiée est ensuite déposé sur un gel SDS-PAGE, et l'on observe

une seule bande à 19 kDa.

3. Comment l'expliquez-vous ? (1 point)

Un second extrait de cette même protéine est déposé sur un gel SDS-PAGE en présence de

β-mercaptoéthanol. On obtient une bande à 12 kDa et une bande à 7 kDa.

4. Représentez de manière schématique la structure spatiale de cette protéine. (2 points)

Les deux chaines latérales d'un acide

aminé sont schématisées (ci-contre, en

bas).

5. De quel acide aminé s'agit-il ?

(1 point)

6. Nommer les atomes pointés par les

flèches ? (1 point)

7. Avec quel type de biomolécule cet

acide aminé interagit-il ? (1 point)

8. Quelle liaison de faible énergie

permet de stabiliser cette interaction ?

(1 point)

9. Quelle est la conséquence de l'acétylation sur la structure des histones ? Que va faciliter

cette modification ? (2 points)

10. La séquence d’aminoacides d’un peptide est la suivante :

Glu-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly

Calculez la charge de ce peptide à pH 7 (3 points) et estimez son pHi (1 point).

On donne les pKa des groupements suivants :

α-COOH = 2 / COOH de Glu = 3,8 / α-NH2 = 10 / Phénol de Tyr = 10,5 / NH de Arg = 12,5

11. Deux acides aminés ne sont quasiment jamais retrouvés dans les hélices α et les feuillets

β alors qu'ils sont majoritaires dans les coudes. Lesquels ? Pour quelles raisons ? (2 points)

12. Une ribonucléase traitée à l'urée, puis dialysée ne retrouve qu'une très faible activité

biologique. Pourquoi ? Comment faire pour retrouver une activité biologique maximale ?

(2 points)

Biochimie Structurale 2

20112012Partiel d'Octobre 2011

Répondre a une seule partie A ou B

A) On considère dans cette question le métabolisme du glucose et le rôle de la régulation.

i. Quelles réactions sont faites par les enzymes (4 points)1. Phosphogluco-Isomérase (PGI)2. Phosphofructokinase (PFK)

ii. L'enzyme glucose-6-phosphate déshydrogénase (G6PDH) catalyse la conversion du Glucose-6-phosphate en oxydant le groupement aldéhyde en acide (le produit s'appelle 6-phosphogluconate) en utilisant du NADP+ comme accepteur d'electrons. Désignez cette réaction. (4 points)

Les enzymes PFK and G6PDH sont régulées selon le tableau ci dessous:10 mM ATP 100mM ATP

Km (hexose-P) Vmax Km (hexose-P) Vmax

PFK 1 mM 50 mM min-1 100 mM 50 mM min-1

G6PDH 20 mM 20 mM min-1 10 mM 20 mM min-1

iii. Calculez la vitesse de formation du 6 phospho-gluconate et fructose-1,6-bis phosphate en présence de 1mM et 100mM de substrat avec une concentration d'ATP de 10mM et 100mM. (4 points)

iv. Décrire l'action de l'ATP sur les deux enzymes (2 points)v. Dans les conditions de basse et haute concentration d'ATP quel est le sort du Glucose-6-

Phosphate en supposant que la réaction de PGI est a l'équilibre avec la même concentration de substrat et de produit (K = Keq = 1) ? (4 points).

vi. Quelle type de voie métabolique pourrait être associée avec l'enzyme G6PDH? (2 points)

B) La biochimie est a l'origine de la vie et l'émergence d'organismes vivants sur terre....i. Quels sont les composants nécessaires à tout organisme vivant et quels rôles jouent ils? (6

points)ii. Quelles évidences existent aujourdhui pour dire que l'ARN a joué un role plus important

que maintenant. (4 points)iii. Vu la voie de synthèse des ARN présentée en cours, proposez une voie de synthèse du NAD

à partir de Nicotinamide, Adenine, PRPP (phospho-ribosyl-pyrophosphate) et ATP pour l'énergie.(5 points)

iv. Pouvez vous indiquer quelques élements communs au métabolisme de tout organisme vivant (5 points)



Répondre a une seule partie A ou B

A) On considère dans cette question le métabolisme du glucose et le rôle de la régulation.

i. Quelles réactions sont faites par les enzymes (4 points)1. Phosphogluco-Isomérase (PGI)

Inter-conversion de l'aldose de Glucose 6 phosphate en le cétose Fructose-6-Phosphate (voir diagramme).

2. Phosphofructokinase (PFK)

Transfert d'une groupement phosphoryl de l'ATP a Fructose-6-Phosphate pour donner de l'ADP et le Fructose-1,6-bisphosphate.

ii. L'enzyme glucose-6-phosphate déshydrogénase (G6PDH) catalyse la conversion du Glucose-6-phosphate en oxydant le groupement aldéhyde en acide (le produit s'appelle 6-phosphogluconate) en utilisant du NADP+ comme accepteur d'electrons. Désignez cette réaction. (4 points)

Glucose-6-Phosphate + NADP+ + H2O -----> 6-Phosphogluconate + NADPH + 2H+

Les enzymes PFK and G6PDH sont régulées selon le tableau ci dessous:10 mM ATP 100mM ATP

Km (hexose-P) Vmax Km (hexose-P) Vmax

PFK 1 mM 50 mM min-1 100 mM 50 mM min-1

G6PDH 20 mM 20 mM min-1 10 mM 20 mM min-1

iii. Calculez la vitesse de formation du 6 phospho-gluconate et fructose-1,6-bis phosphate en présence de 1mM et 100mM de substrat avec une concentration d'ATP de 10mM et 100mM. (4 points)

Si nous pouvons utiliser l'équation de Michaelis-Menten, et si pour le G6PDH la concentration de NADPH est le meme que pour l'établissement des valeurs nous pouvons remplir les tableaux ci-dessous.

Pour le G6PDHVitesse de la reaction [G6P] = 1 mM [G6P] = 100 mM

[ATP] = 10 mM 0.96 mM/min 16.7 mM/min


Pour le PFKVitesse de la reaction [G6P] = 1 mM [G6P] = 100 mM

[ATP] = 10 mM 25 mM/min 49.5 mM/min


iv. Décrire l'action de l'ATP sur les deux enzymes (2 points)

Selon les résultat de iii ATP agit sur le PFK en tant que substrat et inhibiteur; mais sur le G6PDH en tant qu'activateur.

v. Dans les conditions de basse et haute concentration d'ATP quel est le sort du Glucose-6-Phosphate en supposant que la réaction de PGI est a l'équilibre avec la même concentration de substrat et de produit (K = Keq = 1) ? (4 points).

A basse concentration d'ATP l'activité de PFK sera grand et celui de G6PDH sera faible. Donc le G6P aura tendance d'être converti en F6P pour être ensuite pris en charge par PFK.A des plus hautes concentrations d'ATP le PFK étant moins active le G6P sera pris en charge par des enzymes d'autres voies métabolique par exemple le G6PDH.

Cependant les flux précis dépendent aussi de la concentration de G6P qui accumulent et si le niveau est suffisamment grand par rapport au Km de PFK la voie de la glycolyse pourrait toujours opérer rapidement.

vi. Quelle type de voie métabolique pourrait être associée avec l'enzyme G6PDH? (2 points)

L'utilisation de NADP+ laisse penser a une voie catabolique, mais la régulation par ATP laisse penser a une voie anabolique. Donc....

B) La biochimie est a l'origine de la vie et l'émergence d'organismes vivants sur terre....i. Quels sont les composants nécessaires à tout organisme vivant et quels rôles jouent ils? (6

points)

1. De la matière génétique pour transmettre l'information aux générations suivantes.2. Une membrane pour séparer le soi du non-soi3. Une métabolisme pour assurer la fabrication des premiers deux a partir des

matière premiers.

ii. Quelles évidences existent aujourdhui pour dire que l'ARN a joué un role plus important que maintenant. (4 points)

Quelques exemples parmi : les ARN entre l'ADN et les protéines, l'importance d'ATP et NAD, les ribozymes ou le ribosme et ses competences catalytiques, les virus a ARN (mais pas les rétrovirus), la fabrication des desoxynucleotides a partir de nucléotides.

iii. Vu la voie de synthèse des ARN présentée en cours, proposez une voie de synthèse du NAD à partir de Nicotinamide, Adenine, PRPP (phospho-ribosyl-pyrophosphate) et ATP pour l'énergie.(5 points)

La vrai voie est ici... mais d'autres voies plus créatives étaient également acceptables....

PRPP + Nicotinamide ---(Nicotinamide phosphoribosyl transferase) -> Nicotinamide mono-nucleotide. (NMN) + PPiPRPP + Adenine ---------(Adenine phosphoribosyl transferase) ------- > AMP + PpiAMP + 2x ATP ------------(Adenylate kinase x 2 ) ------------------------ > ATP + 2x ADPATP + NMN ---------------(Adenylate transferase ) ------------------------> NAD + Ppi

iv. Pouvez vous indiquer quelques élements communs au métabolisme de tout organisme vivant (5 points)

Parmi les éléments qui pouvaient être indiques.... L'utilisation de l'ATP et NADH, l'utilisation de protéines, la présence de acides amines L et de glucides D, l'utilisation d'une code génétique universel avec l''ADN, l'importance de glucose dans le métabolisme et le rôle de certains ions tel K+ ou Ca+.


20102011Partiel – 1 heure

Les calculettes sont permises (mais pas necessaires)

Répondre à une seule des deux questions A ou B

A) Dans la figure au verso est illustré une partie d'une voie métabolique :

1. Pour les trois réactions marquées (A, B et C) indiquez :1. Le type de réaction,2. Un nom raisonnable pour l'enzyme,3. Le nom d'une enzyme vue en cours qui fait une réaction du même type.

2. Quelles molécules de couplage sont produites et utilisées dans les réactions indiquées ?3. Quel est le nom du composé D ?4. S'agit il d'une partie d'une voie anabolique ou catabolique ?5. Justifiez votre réponse a 4.6. Si la voie illustrée était couplée à la fermentation alcoolique du glucose, quels autres

produits finals (à part le chorismate) seront produits.

B) Cette question concerne la cinétique de la conversion glucose en glucose-6-phosphate faite par deux enzymes différentes.

Mesures de la vitesse de production de glucose-6-phosphate en mM min-1.

[Substrat] (mM) Echantillon 1 Echantillon 2 Echantillon 3

5 2.3 2.7 3.4

10 3.6 3.2 5.3

15 4.4 3.4 6.5

20 4.9 3.6 7.4

25 5.3 3.6 8.0

1. Utilisant les informations dans le tableau de données estimez les valeurs de KM et Vmax

dans les différentes conditions expérimentales. Montrer comment vous arrivez a ces estimations

2. Déterminer également l'activité spécifique dans chaque échantillon. Sachant que les concentration de protéine dans des conditions 1, 2 et 3 sont 2 mg/ml, 0.5 mg/ml et 5 mg/ml, respectivement.

3. L'examen des enzymes présentes dans les échantillons montre que dans les échantillons 1 et 3 la protéine est monomérique avec une masse moléculaire de 20 kDa et dans l'échantillon 2 elle est dimérique avec une masse moléculaire de 40 kDa. Par contre dans des conditions 3 une autre protéine est également présente. Que sont les valeurs de kcat ?

Figure pour question A



A) Dans la figure au verso est illustré une partie d'une voie métabolique :

1. Pour les trois réactions marquées (A, B et C) indiquez :1. Le type de réaction,2. Un nom raisonnable pour l'enzyme,3. Le nom d'une enzyme vue en cours qui fait une réaction du même type.

A B C

Type Deshydratation Reduction/Oxydation

Transfert de Phosphoryl

Nom 5-dehydroquinate deshydratase

Shikimate dehydrogenase

Shikimate kinase

Enzyme vue Enolase Alcool deshydrogenase

Hexokinase

2. Quelles molécules de couplage sont produites et utilisées dans les réactions indiquées ?

Produits : ADP, NAD+ et HPO42-

Utilisés : ATP et NADH

3. Quel est le nom du composé D ?

Phosphenol pyruvate.

4. S'agit il d'une partie d'une voie anabolique ou catabolique ?

Anabolique

5. Justifiez votre réponse a 4.

D'une part, fabrication de plus grande molécule (Chorismate) a partir des molécules plus petites (5-dehydroquinate et Phosphenol pyruvate).D'autre part, utilisation des molécules de couplage ATP et NADH qui representent une investissement d'énergie et pouvoir réducteur.

6. Si la voie illustrée était couplée à la fermentation alcoolique du glucose, quels autres produits finals (à part le chorismate) seront produits.

5-dehydroquinate + NADH + ATP + PEP ----> 2 x HPO4

2- + Chorismate + ADP + NAD+

Glucose + 2 NAD+ 2 HPO42- ------>

2 NADH + 2 PEP (Un PEP et NADH passe pour le couplage)

PEP + NADH + ADP -----> ATP + Ethanol + CO2

On faisant la somme : 5-dehydroquinate + Glucose ----> Chorismate + Ethanol + CO2.

J'ai laissé passe par mal de choses ici mais le point important est de coupler les deux voies metaboliques avec les molecules de couplage (ATP et NADH) et donc utiliser ce qui sont produit par la fermentation pour la synthese de chorismate. Les autres versions (donc sans passage de PEP) devrait produire l'acetaldehyde.

B) Cette question concerne la cinétique de la conversion glucose en glucose-6-phosphate faite par deux enzymes différentes.

Mesures de la vitesse de production de glucose-6-phosphate en mM min-1.

[Substrat] (mM) Echantillon 1 Echantillon 2 Echantillon 3

5 2.3 2.7 3.4

10 3.6 3.2 5.3

15 4.4 3.4 6.5

20 4.9 3.6 7.4

25 5.3 3.6 8.0

1. Utilisant les informations dans le tableau de données estimez les valeurs de KM et Vmax

dans les différentes conditions expérimentales. Montrer comment vous arrivez a ces estimations

D'abord une jolie graphique soit de Vi (mM min-1) contre [Substrate](mM) ou encore mieux la version Lineweaver Burk.

Ca qui devrait permettre a déterminer :1 Vmax = 8.3 mM min-1 ; KM = 12.5 mM2 Vmax = 3.6 mM min-1 ; KM = 3.0 mM3 Vmax = 12.5 mM min-1 ; KM = 12.5 mM

(ce sont le valeurs j'ai utilisé pour générer les donnés mais j'acceptais des valeurs assez éloignes si ils étaient 'cohérents' et 'raisonnables')

2. Déterminer également l'activité spécifique dans chaque échantillon. Sachant que les concentration de protéine dans des conditions 1, 2 et 3 sont 2 mg/ml, 0.5 mg/ml et 5 mg/ml, respectivement.

Activité specifique = unités par mg protéine.

1 8.3 mM min-1 / 2 mg ml-1

8.3 moles min-1 ml-1 / 2 mg ml-1

4.15 unités mg-1.2 3.6 mM min-1 / 0.5 mg ml-1

7.2 unités mg-1.3 12.5 mM min-1 / 5 mg ml-1

2.5 unités mg-1.

3. L'examen des enzymes présentes dans les échantillons montre que dans les échantillons 1 et 3 la protéine est monomérique avec une masse moléculaire de 20 kDa et dans l'échantillon 2 elle est dimérique avec une masse moléculaire de 40 kDa. Par contre dans des conditions 3 une autre protéine est également présente. Que sont les valeurs de kcat ?

kcat = (moles produit) sec-1 (mole enzyme)-1

1. Concentration d'enzyme = 2 mg/ml / 20 000 g / mole = 0.1 mole/mlVmax = 8.3/60 moles sec-1 ml-1 = 0.138 moles sec-1 ml-1 kcat = 1.38 sec-1.

2. Concentration d'enzyme = 0.025 mole/ml monomer Alternativement on peut utilise 0.0125 mole/ml dimer.. Ce qui donne kcat 2.4 sec-1 ou 4.8 sec-1.

Mention du choix monomer ou dimer etait une plus....

3. Comme la protéine n'est pas pur nous ne connaissons pas la concentration de protéine et donc ne pouvons pas calculer kcat.

Figure pour question A