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Biologie  Cellulaire    &    

Biologie  Moléculaire    

L3          UE  5.2  EP1            2014-­‐2015  

Cours  n°  5  :  Mercredi  17  septembre      14h-­‐16h  Chap.  II      Chromosome,  épigénéFque,  réparaFon,  domaines  régulateurs  

Variabilité  de  lecture  des  modificaFons  post-­‐traducFonnelles  

100  Nat  Struct  Mol  Biol.  2012  Dec;19(12):1218-­‐27.  doi:  10.1038/nsmb.2436.  Perceiving  the  epigeneFc  landscape  through  histone  readers.  Musselman  CA1,  Lalonde  ME,  Côté  J,  Kutateladze  TG.  

ReproducFon  effectuée  par  l’Université  François  Rabelais  de  Tours  Avec  l’autorisaFon  du  C.F.C  -­‐  20,  rue  des  Grands  AugusFns  –75006  Paris    

Conséquences : entraine une variabilité des actions moléculaires résultantes Permet une dynamique spatio-temporelle des actions sur la chromatine

PHD CD Tudor

BD

14.3.3

•  Domaine  structural  de  reconnaissance  des  histones  acétylées    

•  Présent  dans  les  :      – histone  acétyltransférases      – sous-­‐unités  ATPase  de  certain  complexes  de  remodelage  des  nucléosomes    

•  Exemple  :  reconnaissance  de  H4K16ac,  H3K4ac  

•  NoFon  de  reconnaissance  régulatrice  plus  élaborée  telle  qu’une  «  Double  interacFon  ».  

Owen  DJ    EMBO  J.  2000  November  15;  19(22):  6141–6149.     101  

InteracFon  coopéraFve  avec  2  acétylaFons  (H4K5acK8ac)  

102  ReproducFon  effectuée  par  l’Université  François  Rabelais  de  Tours  Avec  l’autorisaFon  du  C.F.C  -­‐  20,  rue  des  Grands  AugusFns  –75006  Paris    

Combinatoire  de  «  lecture  »  du  «  code  histone  »    

103  Nat  Struct  Mol  Biol.  2012  Dec;19(12):1218-­‐27.  doi:  10.1038/nsmb.2436.  Perceiving  the  epigeneFc  landscape  through  histone  readers.  Musselman  CA1,  Lalonde  ME,  Côté  J,  Kutateladze  TG.  ReproducFon  effectuée  par  l’Université  François  Rabelais  de  Tours  

Avec  l’autorisaFon  du  C.F.C  -­‐  20,  rue  des  Grands  AugusFns  –75006  Paris    

Gain de précision, de spécificité et de contrôle spatio-temporel

Lecture  :  Typologie  des  modes  de    reconnaissance    ex.  Facteur  HP1  

Ruthenburg  et  al.  (2007)  Nature  Reviews  Molecular  Cell  Biology  8:983-­‐994.  

facteur HP1 : Hétérochromatine protéine 1 Chromodomaine/H3K9me3 Action de formation et de propagation de l’hétérochromatine

Outils d’étude de la dynamique chromatinienne

«  Code  Histone  »  :  huit  «  MPT  »  marquantes      MéthylaFon          •         H3K4me3            Promoteurs  acFvement  transcrits,  en  parFculier  juste  après  le  site  

d’iniFaFon.  La  déméthylaFon  entraine  l’exFncFon  de  l’expression  (silencing  de  la  région  génomique)  

•         H3K36me3      Gène  acFfs  au  plan  transcripFonnel  

•         H3K9me3          Gènes  consFtuFvement  réprimés  (hétérochromaFne  consFtuFve  )  •         H3K27me3        Gènes  facultaFvement  réprimés    

(Couplage  :    

     H4K20me3      avec      H3K9me3,  H3K27me3    

AcétylaFon  •         H3K9ac            Promoteurs  acFfs.  

•         H3K14ac        Promoteurs  acFfs  •         H4K16ac        ChromaFne  transcripFonnellement  acFve  

105  

Déchiffrage du fonctionnement de ce code : Technique 3 :Immuno-précipitation de la chromatine

Dans le cadre d’un Modèle expérimental

Sce  I  

H.  M.  O’Hagan,  PLoS  Genet  4(8):  e1000155.  doi:10.1371/journal.pgen.1000155  

R  

R  

1  Gène  acFf   2  Répresseur  exprimé  

3  Gène  Sce  I  réprimé    

4  Tétracycline  =  inducteur    

R  5  Gène  Sce  I      exprimé  

Cellules  MDA-­‐MB-­‐231    

7  coupure  ADN  double  brin  

9    Réponse  cellulaire  :  préparaFon  à  la  réparaFon  

6  Gène  acFf  

8  Expression  de  HSVTK  abolie  

ReproducFon  effectuée  par  l’Université  François  Rabelais  de  Tours  Avec  l’autorisaFon  du  C  20  rue  des  Grands  AugusFns    75006  Paris  .  F.  C.      

106  

Indu  

Modèle  :  Système  rapporteur  inducFble    de  clivage  double  brin  unique    :  «  Double  Strand  Breaks  »  

Induction (par la tétracycline) de l’expression de l’endonucléase I-SceI sous forme de protéine de fusion avec l’hémaglutinine A ou HA

Induit une coupure unique au niveau d’un gène chimérique : promoteur CDH1/HSVTK

I-SCeI-HA

Thymidine kinase virale exprimée

Modèle  «  DSB  »  :  Analyse  des  modificaFons  des  histones  au  site  de  coupure  

•  Présence  d’isoforme  d’Histone  (H2AX)  

•  Présence  de  modificaFons  épigénéFques    –  H2AX  –  H4K16    –  H3K9  –  H3K27  

•  FixaFon  d’une  dé-­‐acétylase  •  FixaFon  d’ADN  méthyltransférase  

Technique  :  ImmunoprécipitaFon  de  la  chromaFne  

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Technique  3  :  ImmunoprécipitaHon  de  la  ChromaHne  

ChIP                                                                                                                                                          Chroma5n  Immunoprecipita5on  

1   Traiter    éventuellement  les  cellules  par  un  agent  de  réHculaHon  protéines-­‐ADN  

2   PurificaFon  de  la  chromaFne  naFve  (ou  réFculée)    

3   FragmentaFon  de  la  chromaFne  (ultrasons  :  0,2  à  1  kpb)  

4   Immuno-­‐précipitaFon  par  un  anFcorps  spécifique  d’une  protéine  (ou  d’une  modificaFon  de  protéine  :  acétylaFon,  méthylaFon,  phosphorylaFon,  …)  

5   PurificaFon  de  l’ADN  immuno-­‐précipité  (après  chauffage  si  réHculaHon)  

6   Analyse  par  :    PCR  et  électrophorèse    (ou  puces  ADN  approche  globale,  ou  séquençage  pour  idenFficaFon)  

108  

Objectif de la technique : Identifier la présence d’une protéine ou d’une modification post-traductionnelle sur une séquence spécifique d’un génome. (étude globale ou gène spécifique)

Enchainement de deux techniques IP et PCR ?

ChIP  Principe    

PCR  et  électrophorèse  ReproducFon  effectuée  par  l’Université  François  Rabelais  de  Tours  Avec  l’autorisaFon  du  C  20  rue  des  Grands  AugusFns    75006  Paris  .  F.  C.      

•  QuanFficaFon/Séquence  •  Spécifique/Global  

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IP

2  :  PCR  couple  d’amorce  pour  le  promoteur  (ou  la  séquence  ADN)  étudié    

1  :  AnFcorps  pour  le  phénomène  étudié  

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ChIP Deux éléments majeurs

ReproducFon  effectuée  par  l’Université  François  Rabelais  de  Tours  Avec  l’autorisaFon  du  C.F.C  -­‐  20,  rue  des  Grands  AugusFns  –75006  Paris    

Types  d’immunoprécipitaFon  

Non  Histone  ChIP  Histone  ChIP  

Etude  en  plusieurs  expériences  (certaines  facultaFves)  111  

ReproducFon  effectuée  par  l’Université  François  Rabelais  de  Tours  Avec  l’autorisaFon  du  C.F.C  -­‐  20,  rue  des  Grands  AugusFns  –75006  Paris    

Mécanisme Modification épigénétique

1-­‐  «  DSB  »  :  InducFon  de  phosphorylaFon  de  H2AX    près  du  site  de  clivage  ADN  par  «  ChIP  »  

H.  M.  O’Hagan,  PLoS  Genet  4(8):  e1000155.  doi:10.1371/journal.pgen.1000155  

ChIP   Amorces  

AnEcorps  

Contrôle  

Contrôle  

112  ReproducFon  effectuée  par  l’Université  François  Rabelais  de  Tours  Avec  l’autorisaFon  du  C.F.C  -­‐  20,  rue  des  Grands  AugusFns  –75006  Paris    

Analyse

Distance d’analyse par PCR avec le site de coupure variable

amorces

Immuno-­‐PrécipitaFon  de  la  ChromaFne                  (ChIP)  

Dynamique  du  nucléosome:(6)  Variants  d’Histones  

CENP-­‐A  :  centromère  H3.1    :            RéplicaFon  H3.3  EuchromaFne  :  gènes  acFfs  

H2A.X  (réparaFon  ADN)  H2A.Z  (zones  transcrites)  MacroH2A  (répression  transcripFon)  

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44  113  

localisaFon  Histone  macroH2A  

Thèse  CMC  Doyen  114  

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Technique  4  :  Western  blot  

western  blot  :  détecEon  de  protéines    

•1• DénaturaFon  des  protéines  cellulaires  (ou  de  l’échanFllon) •2• Electrophorèse  en  gel  de  poly-­‐acrylamide  SDS •3• Transfert  sur  membrane  (ex.  nitrocellulose) •4• IncubaFon  avec  un  anFcorps  spécifique •5• RévélaFon

Contrôles : Coloration d’un gel témoin (bleu de Coomassie : quantités protéiques identiques) Coloration de la membrane (validation transfert : Rouge Ponceau) Incubation de la membrane avec une anticorps spécifique d’une protéine à taux cellulaire constant (validation dépôt et transfert).

115  ReproducFon  effectuée  par  l’Université  François  Rabelais  de  Tours  Avec  l’autorisaFon  du  C.F.C  -­‐  20,  rue  des  Grands  AugusFns  –75006  Paris    

2-­‐  DétecFon  :  phosphorylaFon  histone  H2AX    

H.  M.  O’Hagan,  PLoS  Genet  4(8):  e1000155.  doi:10.1371/journal.pgen.1000155  

Western  blot  

AnEcorps  anE  :    

Contrôle  

AnEcorps  anE  HemagluEnine  A    

«  CriFcal  for  recogniFon  and  repair  of  DNA  damage  »  116  

ReproducFon  effectuée  par  l’Université  François  Rabelais  de  Tours  Avec  l’autorisaFon  du  C.F.C  -­‐  20,  rue  des  Grands  AugusFns  –75006  Paris    

Contrôle

Western  blot  

A.  P.    Tabancay  Jr.  ,  S.  L.    Forsburg  EukaryoEc  DNA  ReplicaEon  in  a  ChromaEn  Context  Current  Topics  in  Developmental  Biology  Volume  76  2006  129  -­‐  184  

Chaperon  Moléculaire  d’Histones  

Les  chaperons  moléculaire  d’histones  amènent    et  échangent  des  paires  d’histones  pendant  la  réplicaHon,    

la  transcripHon  ou  la  réparaHon  :  

ASF1  pour  la  paire  H3/H4  Echange    et  éliminaFon  d’histones  (AnH-­‐silencing  funcHon  protein  1)  

Aussi  uHle  pour  acétylaHon  de  H3K9  et  H3K56  ReproducFon  effectuée  par  l’Université  François  Rabelais  de  Tours  Avec  l’autorisaFon  du  C  20  rue  des  Grands  AugusFns    75006  Paris  .  F.  C.      

117  

3-­‐  Statut  de  H4K16  et  fixaFon  de  SIRT1  au  site  de  coupure  

ReproducFon  effectuée  par  l’Université  François  Rabelais  de  Tours  Avec  l’autorisaFon  du  C.F.C  -­‐  20,  rue  des  Grands  AugusFns  –75006  Paris    

H.  M.  O’Hagan,  PLoS  Genet  4(8):  e1000155.  doi:10.1371/journal.pgen.1000155  

ChIP  

SIRT1  :  H4K16ac  déacétylase  

H4K16ac  :  gène  acFf  

118  contrôle

Immuno-­‐PrécipitaFon  de  la  ChromaFne                  (ChIP)  

4  -­‐  Analyse  de  marqueurs  de  «  Silencing  »  

H.  M.  O’Hagan,  PLoS  Genet  4(8):  e1000155.  doi:10.1371/journal.pgen.1000155  

ChIP  

anFcorps  

Signal  de  base    non  spécifique  

119  ReproducFon  effectuée  par  l’Université  François  Rabelais  de  Tours  Avec  l’autorisaFon  du  C.F.C  -­‐  20,  rue  des  Grands  AugusFns  –75006  Paris    

Fin du cours n° 5

Immuno-­‐PrécipitaFon  de  la  ChromaFne                  (ChIP)