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Difetti congeniti del metabolismo II

Lezione 2

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Albinismo oculocutaneo OCAEsistono diverse forme di albinismo: sono

tutte recessive e una forma e’ X-linkede’ presente eterogeneita’ genetica

L’albinismo oculocutaneo OCA e’ caratterizzato da:assenza di pigmentazione dovuta all’incapacita’ di sintetizzare la melanina, mentre il numero dei melanocitie’ normale. La melanina e’ presente nei capelli, nella cutee nella retina.

La via che porta alla sintesi della melanina parte dall’amminoacidotirosina, che e’ coinvolto in una serie di altre reazioni il cui mancatosvolgimento porta alla manifestazione di altri difetti congeniti del metabolismo: Alcaptonuria e Fenilchetonuria

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La tirosinasi

Le prime due tappe che portano alla sintesi della melanina sono catalizzate dalla tirosinasi che in una prima reazione idrossila la tirosina e successivamente catalizza l’ossidazione della diidrossifenilalanina ottenuta, in DOPA-chinone.

Il gene della tirosinasi e’ stato clonato e sono stateidentificate le mutazioni che sono la causa della comparsadell’albinismo

Le strategie di clonaggio sono varie: lo scopo e’ quello di identificare lasequenza di DNA voluta in mezzo a tutte quelle che si possono isolare

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La tirosinasi clonaggio

Dal momento che si conoscevano le basi biochimiche dellapatologia e’ stato possibile utilizzare il clonaggio funzionale

Screening di una library di DNA genomico per isolare la sequenza completa

Produzione di anticorpi specifici per la tirosina

Creazione di una library di cDNA in vettore di espressione

Screening della library di espressione e isolamento della colonia

Non si conosceva la sequenza della tirosinasi, ma si sapeva che eracoinvolta, pertanto si sintetizzo’ il cDNA a partire da RNA totale estratto da cellule che sintetizzano l’enzima e si inserirono i cDNAin fagi.

Ricerca nei topi del DNA corrispondente al cDNA clonato

Sequenza dei cDNA cercando una ORF

Analisi del DNA degli affetti per individuare le mutazioni

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Polimorfismo RFLP Polimorfismi del DNA: di restrizione (RFLP), minisatellite,

microsatellite. Individuabili con southern blottling o PCR

RFLP: La sonda riconosce il polimorfismo con un particolare enzima, ma non con altri

A1 A2 A3B1 B2

A1 A3B1 B2mutazioneelimina il sitodi restrizione

endonucleasi Bendonucleasi A

EnzimaA

EnzimaB

Pattern di ibridazione sufiltro

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Polimorfismo

Variazione presente nella popolazione con una frequenza superiore a 1%

Polimorfismi proteici

Polimorfismi del DNA: di restrizione (RFLP), minisatellite, microsatellite. Individuabili con southern blotting o PCR

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Alleli identificati dall’ibridazionesu Southern

Possibile interpretazione dei risultati

I1 I2 I3 I4II1 II2

III1 III2 III3 III4 III5 III6 III7 III8

I

II

Lunghezzadei frammenti

Polimorfismo RFLP esempio

1 2 3 4

1 2

1 2 3 4 5 6 7 8

III

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Mini e micro satelliti: Riconosciuti su gel dopo amplificazione con PCR

Polimorfismo PCR

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Analisi delle mutazioni di OCA I

Il gene della tirosinasi e’ lungo circa 50Kb ed e’composto da 5 esoni

La ricerca delle mutazioni e’ essenziale per definire se il gene clonato e’ quello che una volta mutato provoca la patologia in esame

Bisogna tenere presente che le variazioni di sequenza non sempre sono patogene, possono anche rappresentare polimorfismi che nel caso delle recessive costituiscono un problema.

Perche?

Nella popolazione generale e’ impossibile definire se un soggetto e’ portatore o meno dell’allele patogeno.Bisogna sempre esaminare gli affetti e i loro genitori, anche i fratelli possono essere fonte di errore: potrebbero essere non portatori

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Analisi delle mutazioni di OCA II

Nell’albinismo oculocutaneo grazie alsequenziamento del gene e’ stata evidenziata la presenza di mutazioni diverse in siti diversi del gene (allelia multipla), che possono provocare fenotipi leggermente diversi.

Non confondere questo con l’eterogeneita’ genetica chee’ pure presente nell’albinismo. Esistono altre forme di albinismo non legate a mutazione del gene della tirosinasi, che dipendono da mutazioni di altri loci

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Analisi delle mutazioni di OCA III

Eterogeneita’ genetica :e’ fra locus

Il fenotipo e’ il risultato di una catena di interazioni:il risultato finale puo’ risultare simile anche quando i locus sono diversi. E’ importante identificare con precisione i criteri di definizione nel caso dell’albinismo un primo criterio e’ il dosaggio della tirosinasi

Apriamo una parentesi

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Analisi delle mutazioni di OCA IV

Le strategie per individuare le mutazioni negli affetti o nei potenziali eterozigoti sono varie, la piu’ usata e’ la PCR o l’utilizzo di oligonucleotidi allele specifici sintetizati ad hoc per le singole famiglie

Come si studiano le famiglie?

Bisogna sempre analizzare i risultati nel loro insieme,utilizzando le informazioni che vengono dalla popolazionegenerale.

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Analisi delle mutazioni di OCA V

Presenza di piu’ di una mutazione nel DNA dell’affetto:

Le mutazioni possono essere :

Missenso: sostituzione di una base che porta al cambiamento dell’amminoacido.

La stessa sostituzione e’ presente nella popolazione generale anchein omozigosi senza conseguenze? se si e’ un polimorfismo e ci diceche quella regione della proteina o quell’amminoacido non e’ criticoper la funzione.E’ una mutazione conservativa.(L’accumularsi di dati su piu’ famiglie e sulla popolazione generale facilita l’interpretazione)

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Analisi delle mutazioni di OCA VI

Ognuna delle altre mutazioni e’ presente in omozigosi in altri soggetti albini non imparentati? Se si e’ probabileche siano patogenetiche e ritrovarne una nei fratelli dell’affetto lo fa identificare come portatore (la mutazionedeve essere presente in eterozigosi in un genitore)

Ognuna delle altre mutazioni e’ presente in omozigosi in altri soggetti albini non imparentati? Se no riguarda unaregione nota per essere necessaria al funzionamento dellaproteina? Se si e’ probabile che sia patogenetica(cfr. sopra)

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Analisi delle mutazioni di OCA VII

Nell’albinismo oculocutaneo sono stati trovati eterozigoticomposti: soggetti affetti in cui la mutazione patogeneticanon e’ presente in omozigosi, ma la presenza di due allelipatologici fa manifestare la malattia. I genitori ed eventuali fratelli in cui e’ presente anche l’allele wild-typesono eterozigoti per una sola mutazione.

Nel gene della tirosinasi sono riportate anche mutazioniframeshift che possono originare una proteina tronca.

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Mappa delle mutazioni di OCA

I II III IV V

Cu(A) Cu(B)

Mutazioni puntiformi: patogeneMutazioni puntiformi:polimorfismi

Mutazioni frameshift