C. SAUNIER 2 BIOPHYSICIENS version 2013-2014 …ligodin.free.fr/Documents-Carine-Saunier/Cours-et-TD-2014-2015.pdf · Prenons l’exemple de la gamme d’étalonnage des protéines

C. SAUNIER 2 BIOPHYSICIENS version 2013-2014

ETSL 95 rue du dessous des berges 75013 Paris

BTS BIOPHYSICIENS ETSL

2014/2015

TRAVAUX PRATIQUES de BIOCHIMIE COURS et TRAVAUX DIRIGES C. SAUNIER


TP BIOCHIMIE : Cours et TD Page 2/23

Table des matières

LES GAMMES D’ETALONNAGE .................................................................................................................... 3 RAPPELS ................................................................................................................................................................................ 3 TABLEAU DE MODE OPERATOIRE ..................................................................................................................................... 3

TRAVAUX DIRIGES N° 1 ................................................................................................................................. 7 GENERALITES SUR LES DOSAGES ENZYMATIQUES .............................................................................. 9 INTRODUCTION .................................................................................................................................................................... 9 LES DOSAGES ENZYMATIQUES COLORIMETRIQUES ET UV ........................................................................................ 10 GENERALITES SUR LES ENZYMES ................................................................................................................................... 12 GENERALITES SUR L’ACTIVITE ENZYMATIQUE ............................................................................................................ 12

TRAVAUX DIRIGES N° 2 .............................................................................................................................. 14 DOSAGES ENZYMATIQUES SIMPLES ET COUPLES UV ...................................................................... 16 LES COENZYMES ................................................................................................................................................................ 16 REACTIONS ENZYMATIQUES EN POINT FINAL ............................................................................................................. 18

TRAVAUX DIRIGES N° 3 .............................................................................................................................. 21 TRAVAUX DIRIGES N° 4 .............................................................................................................................. 22



Les GAMMES d’ETALONNAGE

Rappels L’objectif des gammes d’étalonnage est de permettre la détermination graphique d’une solution inconnue de même nature que la solution étalon utilisée dans la gamme d’étalonnage.

Figure 1 : représentation graphique de la gamme d'étalonnage On distingue deux types de gammes d’étalonnage :

! les gammes réalisées par dilution ; ! les gammes réalisées par réaction chimique.

Cependant, quel que soit le type de gamme réalisé, on utilise une méthode identique :

• pour remplir le tableau de mode opératoire ; • pour déterminer graphiquement la solution inconnue.

Tableau de mode opératoire Prenons l’exemple de la gamme d’étalonnage des protéines par la méthode au réactif de Biuret. Les indications pour construire le tableau de mode opératoire sont les suivantes : Vous devez préparer une gamme d’étalonnage de 6 tubes s’étalant régulièrement de 0 à 10 g.L-1 à partir d’une solution mère de protéines à 10 g.L-1, en prévoyant des volumes d’étalon adaptés au matériel que vous possédez. Votre solution inconnue est comprise entre 16 et 18 g.L-1. Vous devez préparer 3 tubes « inconnue » de 1 ml maximum de prise d’essai. Le volume final de chaque tube (étalon et inconnue) est de 1 ml. Le diluant est de l’eau distillée. Le volume de réactif de Biuret est de 4 ml dans tous les tubes. Vous devez calculer pour chaque tube de gamme, l’écart des concentrations, la quantité en ? /tube et les concentrations avant et après réactifs en ?

Absorbance

Concentration de l’étalon

Ax

Cx 0



Cas de l’étalon Le texte dit : réaliser 6 tubes d’étalon s’étalant régulièrement de 0 à 10 g.L-1.

1. Il faut calculer l’écart en concentration ∆C entre chaque tube tel que :

∆C = concentration finale / nombre de tubes sans le tube 0 A.N. ∆C =10/5 = 2 g.L-1 Cette information indique qu’entre chaque tube de gamme, il y aura un écart de concentration de 2 g.L-1 tel que : Tubes 0 1 2 3 4 5 X1

Conc en g.L-1 0 2 4 6 8 10

Pour remplir le reste du tableau de mode opératoire, prenons le cas de l’étalon coloré 3 :

2. Il faut ensuite déterminer le volume d’étalon mère à prélever tel que : Conc étalon mère = 10 g.L-1 Vol étalon mère en mL ? Conc finale du tube 3 = 6 g.L-1 Volume final du tube 3 = 1 mL

Vol étalon = étalon

finalinale

ConcVolConcf )*(

A.N. Vol étalon mère = (6 x 1)/10 = 0,6 mL

3. Il faut aussi calculer la quantité d’étalon en ? /tube telle que :

Quantité du tube 3 = conc étalon mère x vol étalon mère A.N. Quantité = 10 x 0,6.10-3 = 6.10-3 g/tube = 6 mg/tube

4. Il faut enfin calculer la concentration de l’étalon dans le tube coloré. Dans le cas d’une gamme par réaction chimique, il s’agit alors de calculer cette concentration avant l’introduction du réactif et après l’introduction du même réactif.

Ces deux calculs s’effectuent selon les relations suivantes :

Conc avant réactif = quantité / vol total du tube avant réactif

Et

Conc après réactif = quantité / vol total du tube après réactif A.N. Conc avant réactif = 6 (mg) / 1 (mL) = 6 mg.mL-1 = 6 g.L-1 Et après réactif, Vol total = 5 mL (c'est-à-dire 1 mL + 4 mL de Gornall) Quantité après réactif : ne change pas !! Soit Conc après réactif = 6 (mg) / 5 (mL) = 1,2 mg.mL-1 = 1,2 g.L-1



Cas de l’Inconnue • Dans le cas où l’inconnue est comprise dans la gamme, il n’est pas nécessaire de

calculer une prise d’essai pour amener cette inconnue dans le milieu de gamme. La prise d’essai de l’inconnue sera par conséquent la prise d’essai maximale autorisée dans le protocole, à savoir dans notre exemple, 1 mL.

• Par contre, si l’inconnue est « hors gamme », il est nécessaire de calculer la prise d’essai ou la dilution préalable à effectuer, pour amener la concentration de l’inconnue en milieu de gamme.

La prise d’essai de l’inconnue sera par conséquent soit la prise d’essai calculée si la dilution de l’inconnue se fait directement dans le tube soit la prise d’essai maximale autorisée dans le protocole si l’inconnue est au préalable diluée en fiole. Démonstration :

Tableau de mode opératoire Tous les volumes sont en mL. Tubes 0 1 2 3 4 5 X1 Conc en g.L-1 (avant réactif) 0 2 4 6 8 10 Vol. étalon à 10 g.L-1 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Vol. inconnue pure ou diluée

??? Vol. eau 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 Quantité en mg/tube 0 2 4 6 8 10 Vol. réactif de Biuret 4 4 4 4 4 4 4 Conc en g.L-1 (après réactif) 0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0



Détermination graphique de l’inconnue D’après le type de représentation graphique, c'est-à-dire Absorbance en fonction de la quantité, ou de la concentration avant ou après réactif, la détermination de la concentration de l’inconnue s’effectue selon la relation suivante :

Conc inconnue (g.L-1) = (conc graphe x dilution) x volume total/ pE de l’inconnue Deux cas de figure se présentent ensuite :

• Si le graphe est construit en fonction de la concentration avant réactif, alors le volume total utilisé est celui avant réactif ;

• Si le graphe est construit en fonction de la concentration après réactif, alors le volume total utilisé est celui après réactif.

Prenons l’exemple du graphe suivant : Abs = f (conc avant réactif en g.L-1)

• Si on prend la concentration avant réactif, alors on applique la relation :

Conc (g.L-1) = (conc graphique x dilution) x vol total avant réactif/ pE de l’inconnue A.N. 1 Aucune dilution d’où dilution = 1

pE inconnue = 1 mL Vol total avant réactif = 1 mL Conc graphique (avant réactif) = 4,675

g.L-1 d’où Conc (g.L-1) = (4,675 x 1)/1 = 4,675 g.L-1

A.N. 2 si pE inconnue < 1mL alors il faut en tenir compte dans le calcul A.N. 3 si l’inconnue a été diluée au préalable dans une fiole, il faut aussi en tenir compte dans les calculs.

• Si on devait prendre la concentration après réactif, alors l’échelle des abscisses serait différente (de 0 à 2 g.L-1) et on appliquerait la relation :

Conc (g.L-1) = (conc graphique x dilution x vol total après réactif)/ pE de l’inconnue A.N. 1 Aucune dilution d’où dilution = 1

pE inconnue = 1 mL conc graphique = 0,935 g.L-1

Vol total après réactif = 5 mL d’où Conc (g.L-1) = (0,935 x 1 x 5 )/1 = 4,675 g.L-1 A.N. 2 si pE inconnue < 1mL alors il faut en tenir compte dans le calcul A.N. 3 si l’inconnue a été diluée au préalable dans une fiole, il faut aussi en tenir compte dans les calculs.



TRAVAUX DIRIGES n° 1 DOSAGES PAR GAMME D’ETALONNAGE Exercice 1 Vous disposez d’un étalon mère de concentration 0,02 % (p/v). A partir d’une solution étalon fille à 1 mg.L-1, vous devez faire 6 tubes de gamme s’étalant régulièrement de 0 à 1 mg.L-1. L’inconnue est comprise dans la fourchette suivante : 150 à 200 mg.L-1. Le volume maximum d’étalon et d’inconnue est de 10 mL. Vous devez ajouter 0,2 mL de réactif dans tous les tubes. Vous mélangez et vous attendez 20 minutes. Les lectures sont réalisées à 540 nm en macrocuves plastiques de TO 1 cm sur le Shimadzu 3.

1. calculer la ou les dilutions nécessaires à la réalisation de l’étalon pour fabriquer la gamme d’étalonnage.

2. calculer la ou les éventuelles dilutions ou prise d’essai de l’inconnue. 3. compléter le tableau de mode opératoire fourni. 4. quelle est la composition du « témoin réactif » ? 5. donner la formule littérale pour déterminer la concentration de l’inconnue à doser en

mg.L-1 et donner l’application numérique. Tous les volumes sont en mL. Tubes 0 1 2 3 4 5 X1

Conc en (avant réactif)

Vol. étalon à mg.L-1

Vol. inconnue au

Vol. eau

Quantité en /tube

Vol. réactif

Quantité en /tube

Conc en (après réactif)

Incubation 15 minutes à température ambiante

Abs à nm 0 0,104 0,203 0,298 0,402 0,492 0,266

Exercice 2 Vous devez réaliser une gamme d’étalonnage pour doser le lactose contenu dans un yaourt. Le réactif qui permet de révéler le complexe coloré orange est l’acide 3,5 dinitrosalicylique qui agit sous l’action de la chaleur. Vous disposez d’un étalon lactose de 1 g.L-1.



Après différents traitements chimiques, votre inconnue lactose est comprise dans la fourchette suivante : 2 à 5 g.L-1. Vous devez réaliser au moins 5 tubes de gamme s’étalant régulièrement entre 0 et 0,5 g.L-1 (avant réactif). Le volume maximal d’étalon et de prise d’essai est de 2 mL. Le volume de réactif de DNS à ajouter dans chaque tube est de 2 mL. Après avoir mis au bain marie à 100 °C pendant 5 minutes tous les tubes, refroidir sous l’eau froide. Enfin, ajouter 6 mL d’eau distillée dans chaque tube. Mélanger et laisser reposer 10 minutes. Procéder aux lectures à l’aide d’un spectrophotomètre à 530 nm dans des macrocuves plastiques de 1 cm de TO.

1. Comment procéder pour réaliser le tableau de mode opératoire ? 2. Faire le graphe Abs = f ( ?) en justifiant le choix selon les valeurs obtenues suivantes :

tubes 0 1 2 3 4 X1 X1 X1 Abs à 530 nm

0 0,225 0,430 0,678 0,883 0,548 0,546 0,543

3. Déterminer la valeur de l’inconnue lactose avec 3 chiffres significatifs en g.L-1 et en

g/100 g (sachant que la densité de la solution inconnue est de 1).



GENERALITES sur les DOSAGES ENZYMATIQUES

Introduction Nous allons maintenant aborder le second volet des Travaux Pratiques de Biochimie : les méthodes enzymatiques. Les méthodes enzymatiques sont des méthodes de dosages récentes basées sur les propriétés des enzymes. Les conséquences directes de cette relation sont :

• une excellente reproductibilité (C.V. < 2 %) ; • une meilleure spécificité par rapport aux méthodes chimiques.

Quel que soit le type de dosage, nous ferons donc toujours appel :

1. aux notions caractéristiques de l’enzymologie que sont les termes d’enzymes, de coenzymes, de substrat, de catalyse, d’activité enzymatique1 ;

2. à l’application de la loi de Lambert Beer2, relation qui permettra l’analyse des résultats.

Le principe de base d’un dosage enzymatique consiste à suivre la production ou la disparition d'une molécule en mesurant ses absorbances à une longueur d’onde de travail donnée qui lui est spécifique. Selon la nature de l’élément dosé, on distingue deux types de dosages :

• les dosages de SUBSTRAT par méthode enzymatique en point final ; • les dosages d’ENZYMES par détermination de leur concentration catalytique.

Et, selon la longueur d’onde à laquelle la molécule absorbe, on distingue deux cas de figure :

• Si on mesure une molécule colorée, le domaine de lecture est le visible et on parle alors de dosage enzymatique colorimétrique ;

• Par contre, si on mesure la production ou la consommation d’un coenzyme qui absorberait dans l’UV (par exemple, le NADH qui absorbe à 340 nm), on parlerait alors de dosage enzymatique UV.

Cette année, nous allons donc étudier les trois types de dosages enzymatiques :

• Les dosages dits colorimétriques ; • Les dosages dits UV ; • Les dosages liés aux activités enzymatiques dans le visible et dans l’UV.

Les exemples étudiés seront issus :

• soit de sérum lyophilisé reconstitué pour permettre le dosage de composés organiques comme le cholestérol, le glucose total ou bien des transaminases ;

• soit de produit alimentaire comme le glutamate des soupes ou les sucres d’un jus de fruit.

Chaque dosage réalisé sera expliqué par des équations bilan résumant soit l’action de catalyse de l’enzyme étudiée soit le mécanisme d’action de l’enzyme sur son substrat. 1 Pour toutes ces notions, je vous renvoie au cours complet de Biochimie de seconde année de BTS. 2 Pour l’explication complète de la loi de Lambert Beer, je vous renvoie au cours de Techniques Analytiques et Spectrales de seconde année de BTS de M. GODIN.



Les dosages enzymatiques colorimétriques et UV

Modes de calculs communs Quel que soit le type de dosages, colorimétrique ou UV, ces dosages enzymatiques présentent des points communs :

• les calculs utilisés pour déterminer la concentration de la molécule ou du composé inconnu sont basés sur la loi de Lambert Beer telle que

A = ε x l x C (mol.L-1)

Avec les données suivantes : A, l’absorbance de la molécule, ε le coefficient d’extinction molaire de la molécule colorée ou du coenzyme (en L.mmol-1.cm-1), l, le trajet optique de la cuve de mesure utilisée (en cm), et C la concentration molaire de la molécule mesurée en (mol.L-1).

• dans un souci de qualité de résultats obtenus, il est recommandé de réaliser conjointement des échantillons inconnus et des échantillons étalons.

Les différentes étapes de calculs seront donc :

1. vérifier le titre de l’étalon obtenu et s’assurer de sa concordance avec le titre annoncé ; 2. calculer la concentration de l’inconnue selon deux modes de calculs différents et

s’assurer de leur similitude.

Vérification du titre de l’étalon La relation à utiliser sera :

Concentration étalon (mmol.L-‐1) = lpEVAA

étalon

témoinétalon

××

×−

ε)(

Avec les données suivantes : - V, le volume total de la cuve (en mL) ; - Aétalon, l’absorbance de l’étalon, ou étalonAΔ la variation d’absorbance de l’étalon ;

- Atémoin, l’absorbance du témoin ou blanc réactif, ou témoinAΔ la variation d’absorbance du témoin ou blanc réactif ;

- pEétalon, la prise d’essai de l’étalon (en mL) ; - ε, le coefficient d’extinction molaire du coenzyme ou de la molécule colorée (en

L.mmol-1.cm-1) ; - l, le trajet optique de la cuve de mesure utilisée (en cm).

Une fois le résultat obtenu, il faut comparer celui-ci avec le titre annoncé en calculant, si besoin, le biais relatif tel que

biais en %= 100 x (résultat obtenu - VCV)/ VCV Détermination de la concentration inconnue Il existe deux modes de calcul légèrement différents mais toujours basés directement ou indirectement sur la loi de Lambert Beer.



La détermination de la concentration de votre inconnue (en g.L-1), par rapport à l’étalon théorique, est donnée par le rapport suivant :

Concentration inconnue = )()(

témoinétalon

témoinessai

AAAA

−

− x concentration de l’étalon (g.L-‐1)

La détermination de la concentration de votre inconnue, par rapport à la loi de Lambert Beer, est donnée par le rapport suivant :

Concentration inconnue (mmol.L-‐1) = lpEVAA

x

témoinessai

××

×−

ε)(

Remarque : les données sont les mêmes que celles utilisées pour le calcul de la concentration de l’étalon théorique à l’exception de la prise d’essai qui est celle de l’inconnue dans notre formule (bien entendu).

Dosages colorimétriques On parle de dosage colorimétrique lorsque le dosage enzymatique est réalisé dans le domaine du visible (entre 400-800 nm). : le technicien suit alors directement l’apparition ou la disparition d’une molécule colorée absorbant dans ce domaine à l’aide d’un spectrophotomètre. L’exemple traditionnel pour ce type de dosages fait appel à la réaction de Trinder : en présence de 4 amino-antipyrine, de phénol, d’eau oxygénée formée par réaction et de peroxydase, il y a formation d’un produit coloré, la quinone imine, qui présente un maximum d’absorption vers les 500 nm. A cette longueur d’onde, l’intensité de la coloration développée est alors directement proportionnelle à la concentration de la molécule quantifiée spectralement. Cette réaction intervient par exemple dans les dosages du cholestérol, des triglycérides ou du glucose dans un sérum.

Dosages UV Dans ces méthodes enzymatiques, les réactions utilisées sont NADH ou NADPH dépendantes3. Elles font donc intervenir l’apparition ou la disparition de ces coenzymes d’oxydo-réduction dans la réaction qui présentent un maximum d’absorption à 340 nm, soit le domaine de l’UV. Cette propriété est utilisée pour mesurer la production de NADH, par exemple puisque l’absorption de la lumière à 340 nm est proportionnelle au nombre de molécules de NADH 3 Les notions de dosages enzymatiques UV et de coenzymes sont détaillées dans le chapitre suivant intitulé Dosages enzymatiques simples et couplés UV



présentes dans la solution et augmente donc avec l’activité de l’enzyme alors que la forme NAD+ n’absorbe pas à cette longueur d’onde (cf. figure 3 : spectres d'absorption du couple NAD+/NADH). Chaque molécule inconnue est alors dosée selon un principe simple : les variations d’absorbances du coenzyme lié à la réaction enzymatique permettent de déterminer proportionnellement la concentration de celui-ci et donc également celle de la molécule dosée. Ces méthodes de dosages seront utilisées cette année pour :

• Déterminer la concentration en acides aminés d’un produit alimentaire ; • Déterminer le taux de sucres dans un jus de fruits, la détermination de l’activité

enzymatique d’une enzyme.

Généralités sur les enzymes Une enzyme est une protéine douée d’activité catalytique spécifique, c'est-à-dire qu’elle agit sur la cinétique d’une réaction chimique en augmentant la vitesse de réaction. Sa propriété majeure est d’être un catalyseur, dont les caractéristiques sont :

- D’être actif en faible quantité ; - De se retrouver intact en fin de réaction ; - De n’exercer aucune influence sur l’équilibre d’une réaction chimique réversible s’il

est en faible concentration par rapport à la concentration de son substrat. Les enzymes peuvent être structuralement classées en 2 catégories. Il s’agit :

- soit d’holoenzyme : enzyme entièrement protéique (constituée uniquement d’acides aminés) ;

- soit d’hétéroenzyme : enzyme constituée en deux parties : une partie protéique, appelée « apoprotéine » et une non protéique dite « coenzyme ».

Dans les faits, les réactions chimiques se produisent avec le coenzyme qui permet la transformation de 10-1000 molécules de substrat (S) par seconde. La partie protéique intervient dans la spécificité de la réaction : la fixation du substrat.

Généralités sur l’activité enzymatique Dans ce type de dosages enzymatiques, le domaine de lecture importe peu ; seule, la notion d’activité enzymatique liée à l’enzyme étudiée est utilisée. La catalyse enzymatique de la transformation d’un substrat S en un produit P par une enzyme E fait intervenir un complexe enzyme - substrat ES qui peut s’écrire E + S ⎯→⎯ 1k

ES ⎯→⎯ 2k E + P

⎯⎯←−1k ⎯⎯←

−2k où : k1, k-1, k2 et k-2 sont les constantes de vitesses des réactions ; [E] est la concentration en enzyme libre ; [ES] est la concentration en enzyme complexée ; [S] est la concentration en substrat ; [P] est la concentration en produit.



Trois possibilités expérimentales pour déterminer l’activité enzymatique : - mesure de la quantité de substrat (S) consommé pendant la réaction par dosage

colorimétrique ; - mesure de la quantité de produit formé (P) au cours de la réaction par dosage

colorimétrique ; - dosage d’un coenzyme transformé au cours de la réaction comme les couples

NAD/NADH, H+ ou NADP/NADPH, H+ à 340 nm. Pour mesurer cette activité enzymatique, on peut travailler selon deux options :

- à l’enregistreur : quand on travaille dans la zone linéaire, cela correspond à un travail en Vmax ;

- en cinétique stoppée : dans ce dernier cas, on ne voit pas quand on quitte la Vmax. On prend alors la mesure en Δ t et en ΔAbs en espérant être en Vmax. La pente obtenue permet alors de déterminer l’activité enzymatique recherchée et à l’aide d’un facteur dit facteur de concentration noté F, on peut ensuite calculer la concentration catalytique (CAC).

Ce facteur de concentration F dépend donc de la température du dosage, de la prise d’essai de l’enzyme et du volume total de la cuve. Il se note dans la même unité que l’activité enzymatique. On détermine ce facteur F d’après la loi de Lambert Beer tel que 𝐹 = !"#!"!#$

!"×!×! Et 𝐶𝐴𝐶 = ∆!"#

∆! × 𝐹

L’unité internationale utilisée de la CAC est l’UI/L, ce qui correspond au nombre de µmol de substrat transformé par unité de temps en minute et par litre de solution à une température donnée. Mais il existe une autre unité usuelle : le katal/L ou kat/L qui correspond à des moles de substrat transformées par seconde et par L de solution. Si le dosage de la CAC est effectué à une température (T) différente de 25 °C, on doit appliquer une correction de température donnée par la relation suivante :

CAC 25°C = CACT * 1,093 (25 - T) Avec T la température du dosage en °C. Et avec CACT la concentration catalytique obtenue à la température T. Ces réactions seront directement utilisées cette année pour :

• la détermination de l’activité enzymatique de la βgalactosidase ; • la détermination de l’activité enzymatique de la γGT ; • la détermination de l’activité enzymatique des transaminases hépatique et cardiaque.

Remarque : on distingue d’autres expressions caractéristiques de l’activité enzymatique : l’activité totale (nombre d’unités de la fraction protéique) et l’activité spécifique enzymatique (nombre d’UI/ mg de protéines).



TRAVAUX DIRIGES n° 2 DOSAGES ENZYMATIQUES COLORIMETRIQUES de SUBSTRATS

Exercice 1 Le pyruvate se situe au carrefour du métabolisme des glucides, des lipides et des protéines. En cas d'oxygénation insuffisante des tissus (hypoxie), le pyruvate est métabolisé en L-lactate. L'acide lactique provient principalement de la glycolyse au niveau des muscles squelettiques blancs, du cerveau, de la peau, de la zone médullaire du rein et des hématies. La lactatémie dépend de la vitesse de production dans ces tissus et de la vitesse du métabolisme du lactate. Environ 65% du lactate basal total est transformé en glucose dans le foie (gluconéogénèse) ; le restant est oxydé dans les muscles squelettiques rouges et dans le cortex rénal. Une hyperlactatémie est définie comme une augmentation persistante, légère à modérée (de 2 à 5 mmol/l), de la concentration en lactate dans le sang, sans acidose métabolique. Une acidose lactique est caractérisée par une augmentation persistante de la lactatémie (> 5 mmol/l) en association avec une acidose métabolique. On distingue acidoses lactiques de type A et de type B. Les acidoses lactiques de type A sont dues à une hypoperfusion tissulaire ; ce sont les plus fréquentes. Les acidoses lactiques de type B sont dues à un défaut d'utilisation de l'oxygène. Elles peuvent être associées à une intoxication (éthanol, méthanol, salicylés) ; certaines acidoses lactiques de type B sont innées, alors que d'autres sont acquises (diabète, insuffisance rénale ou hépatique, cancers). Le L lactate est dosé selon les réactions suivantes :

L lactate + O2 ----( lactate oxydase )-------> pyruvate + H2O2 Amino-4-antipyrine + 4 chlorophénol+ H2O2 ----( peroxydase )-------> quinone imine (rose) + 2H2O

+ HCl Vous disposez d’un étalon lactate à 1,0045 g.L-1. La concentration inconnue en lactate est comprise entre 0,314 et 0,450 g.L-1. Ce dosage est à faire directement en cuves plastiques de 1 cm de trajet optique. Vous devez faire trois cuves « essai », trois cuves « étalon » et une cuve témoin. La méthode utilisée est la méthode inverse avec prérinçage de cônes. Le mode opératoire est le suivant : - 1 mL de solution réactionnelle - 10 µL de sérum à doser ou d’étalon ou d’eau distillée - mélanger et attendre 5 minutes à température ambiante

- lecture à 505 nm. Justifier le type de cuve à utiliser (macrocuve ou microcuve). Justifier le choix de la longueur d’onde de travail. Donner la composition de la cuve témoin. Faire un tableau de mode opératoire conforme. Calculer le titre de l’étalon en g.L-1 avec 5 chiffres significatifs. L’étalon est-il vérifié ? Si oui, avec quelle exactitude ? Calculer le titre de la concentration en lactate dans le sérum par la méthode de l’étalon théorique. Rendre les résultats en mmol.L-1 et en g.L-1 avec 3 chiffres significatifs. Conclure.



N° cuves Témoin Etalon 1 Etalon 2 Etalon 3 Essai 1 Essai 2 Essai 3 Abs à 505 nm 0 0,823 0,835 0,830 0,288 0,295 0,294

Données Coefficient d’extinction molaire de la quinone imine à 505 nm = 7,56 L.mmol-1.cm-1

Facteurs de conversion tels que mg.L-1 * 0,011 = mmol.L-1

mmol.L-1 * 90 = mg.L-1

Valeur normale pour le sérum : < 2,20 mmol.L-1 Exercice 2 Les triglycérides sont dosés selon les réactions suivantes :

triglycérides ----( lipoprotéine lipase )-------> glycérol + acides gras glycérol + ATP ----( glycérokinase )-------> glycérol- 3 - phosphate + ADP

Glycérol – 3 - phosphate + O2 --( glycerol -3 - phosphate oxydase )----> dihydroxyacétone - P + H2O2 Amino-4-antipyrine + chloro – 4 - phénol+ H2O2 ----( peroxydase )------> quinone imine (rose) + H2O Vous disposez d’un étalon triglycérides à 3,141 g.L-1. La concentration inconnue en triglycérides est comprise entre 2,574 et 3,012 g.L-1. Ce dosage est à faire directement en microcuves plastiques de 1 cm de trajet optique. Vous devez faire trois cuves « essai », trois cuves « étalon » et une cuve témoin. La méthode utilisée est la méthode inverse avec prérinçage de cônes. Le mode opératoire est le suivant : - 1 ml de solution réactionnelle - 10 µl de sérum à doser ou d’étalon ou d’eau distillée - mélanger et attendre 10 minutes

- lecture à 510 nm. Quel est le principe de ce dosage ? Justifier le prélèvement de l’eau distillée et indiquer dans quelle cuve il doit être réalisé. Justifier la méthode de prélèvement utilisée. Vérifier le titre de l’étalon en g.L-1 avec 4 chiffres significatifs. Calculer la concentration inconnue en triglycéride du sérum par la loi de Lambert Beer. Rendre les résultats en mmol.L-1 et g.L-1 avec 4 chiffres significatifs. Conclure.

N° cuves Témoin Etalon 1 Etalon 2 Etalon 3 Essai 1 Essai 2 Essai 3

Abs à 510 nm 0 0,424 0,415 0,407 0,382 0,374 0,379

Données Coefficient d’extinction molaire de la quinone imine à 510 nm = 12,73 L.mmol-1.cm-1

Masse molaire des triglycérides dosés = 947,6 g.mol-1 Valeur normale pour le sérum : < 2,20 mmol.L-1



DOSAGES ENZYMATIQUES SIMPLES ET COUPLES UV

Les coenzymes

Généralités sur les coenzymes Hormis les hydrolases, les enzymes en général sont constituées de plusieurs éléments :

- une apoenzyme de nature protéique ;

- une partie non protéique appelée cofacteur qui est soit un ion métallique (appelé cofacteur minéral) soit une molécule organique (appelée coenzyme).

La combinaison des deux éléments forme l’hétéroenzyme (enzyme complète). Plus de 3000 enzymes sont recensées mais en revanche, on ne connaît qu’une vingtaine de coenzymes. La plupart des coenzymes sont des dérivés des vitamines amenées par l’alimentation chez l’homme et les organismes supérieurs. Ils présentent les caractéristiques suivantes :

- d’être thermostables donc non protéiques ; - de posséder un faible poids moléculaire.

Enfin, ils : - participent de manière stoechiométrique aux réactions ; - se retrouvent à l’état initial en fin de réaction ; - permettent le transfert d’une entité X d’une molécule à une autre (électrons, protons,

phosphate) ; - n’interviennent pas dans la spécificité de la réaction enzymatique.

Types de coenzymes Selon leur mode de liaison à l’apoenzyme, on distingue 2 types de coenzymes :

- les coenzymes liés (ou groupement prosthétique) : coenzyme activateur (exemple du coenzyme flavinique, c'est-à-dire flavine adénine dinucléotide FAD) dont la caractéristique principale est de faire partie intégrante de l’enzyme ;



- les coenzymes libres (ou cosubstrat) : coenzyme transporteur (cas du coenzyme NAD, c'est-à-dire nicotinamide adénine dinucléotide) dont la principale propriété est de ne pas être une partie intégrante de l’enzyme.

Classification des coenzymes : coenzymes d’oxydoréduction On distingue deux sortes de coenzymes :

• les coenzymes d’oxydoréduction4 ; • les coenzymes de transfert de groupements.

Structure des coenzymes pyridiniques Il s’agit par exemple du NAD+ nicotinamide adénine dinucléotide NADP+ nicotinamide adénine dinucléotide phosphate Ils fonctionnent avec les déshydrogénases, enzymes appartenant au groupe des oxydoréductases. Ils sont composés de deux nucléotides reliés entre eux par un groupement pyrophosphate. Le NAD+ et NADP+ ne diffèrent que par un résidu phosphate estérifié en C2’ du ribose lié à l’adénine.

Mécanismes réactionnels Rappels d’oxydoréduction : un réducteur est un composé ayant tendance à fournir un ou plusieurs électrons (exemple : NADH, H+) et un oxydant est un composé ayant tendance à capter un ou plusieurs électrons (exemple : NAD+) La forme réduite et la forme oxydée d’un même composé constituent un couple rédox (exemple NAD+/NADH). Dans les faits, dans les systèmes biologiques, les couples rédox font intervenir des électrons et des protons tels que :

4 Pour nos séances, nous n’allons utiliser que des coenzymes d’oxydoréduction et surtout ceux de type pyridinique. C’est pourquoi, nous n’aborderons que ce type de coenzymes dans notre exposé.



Les mécanismes d’action de NAD+ et NADP+ sont identiques : il y a transfert de deux électrons et d’un proton au coenzyme.

Figure 6 : mécanismes d'action du NAD+ et NADP+

Application expérimentale Dans les méthodes désignées en tant que tests UV, les réactions utilisées sont NADH ou NADPH dépendantes. L’absorption maximale de ces deux coenzymes se situe à 340 nm ; cette propriété est utilisée pour mesurer la production de NADH, par exemple puisque l’absorption de la lumière à 340 nm est proportionnelle au nombre de molécules de NADH présentes dans la solution et augmente donc avec l’activité de l’enzyme alors que la forme NAD+ n’absorbe pas à cette longueur d’onde.

Réactions enzymatiques en point final

Principe En condition d’excès d’enzyme, on dose un substrat selon la méthode en point final une fois que celui-ci aura été entièrement transformé. La réaction s’arrête alors et on peut suivre la variation d’absorbance du coenzyme lié à l’enzyme de la réaction.

Réactions enzymatiques simples ou directes Dans certaines réactions, la molécule absorbante dont on va suivre l’absorbance est directement liée au substrat à doser. C’est le cas par exemple du dosage de l’acide glutamique (L-Glu) contenu dans un produit alimentaire, que nous nous proposons de réaliser dans une séance de TP, pour lequel la molécule absorbante NADH apparaît directement après disparition du glutamate.

Réactions enzymatiques couplées ou indirectes Cependant, dans certains dosages enzymatiques, il est nécessaire de faire intervenir plusieurs réactions enzymatiques successives jusqu’à obtenir une réaction qui présenterait un spectre UV détectable et quantitatif. C’est le cas par exemple du dosage de l’aspartate (Asp) et de l’asparagine (Asn) que nous nous proposons aussi de réaliser cette année.



Vocabulaire associé On distingue différents types de réactions :

- la réaction dite principale : il s’agit de la réaction spécifique du substrat à doser ; on parle d’enzyme principale ;

- la réaction dite indicatrice : il s’agit de la réaction qui met en jeu une molécule dont on peut suivre l’absorbance, comme le NADH, par exemple ; l’enzyme utilisée est alors appelée enzyme indicatrice ;

- la réaction dite auxiliaire : il s’agit de la réaction par laquelle le produit dosé est transformé ; on parle également d’enzyme auxiliaire.

Détermination expérimentale Dans ce type de dosage, chaque molécule inconnue est dosée selon un principe simple : les variations d’absorbances du coenzyme lié à la réaction enzymatique permettent de calculer proportionnellement la concentration de celui-ci et donc également celle de la molécule dosée. Par exemple, dans le cas de l’aspartate et selon la première équation du principe du dosage de l’aspartate5: pour 1 molécule d’aspartate, 1 molécule d’α-cétoglutarate est utilisée pour donner 1 molécule d’oxalo-acétate et 1 molécule de glutamate. A 340 nm, (longueur d’onde de travail pour laquelle le NADH, H+ absorbe), l’absorbance est forte puis au fur et à mesure que les molécules d’aspartate sont utilisées, des molécules de NAD+ sont fabriquées entraînant ainsi une diminution de l’absorbance mesurée (car à 340 nm, cette forme du coenzyme n’absorbe pas).

Figure 8 : variation d'absorbances pour la détermination de l'aspartate Il est alors possible de déterminer à l’aide de la loi de Lambert Beer les concentrations des échantillons étalon et inconnue d’après les variations d’absorbances mesurées au cours du dosage à la longueur d’onde d’absorbance maximale du coenzyme6. Quel que soit le type de dosage, couplé ou simple, deux méthodes de travail peuvent être appliquées ; il s’agit de :

• la méthode de l’étalon externe : dans ce cas, l’étalon est déposé seul dans le milieu réactionnel et son absorbance est lue directement sur l’appareil ; cette méthode sera utilisée pour les dosages de l’aspartate et l’asparagine et des sucres dans le jus de

5 Le principe complet de ce dosage est explicité dans le chapitre lié aux TP. 6 Tous les calculs sont détaillés dans le chapitre précédent intitulé Généralités sur les dosages enzymatiques.

AbsA1 1

A2

∆ Abs = A1-A2

temps



fruit ; cette méthode présente alors l’avantage de diminuer l’influence du spectrophotomètre sur les résultats.

• La méthode de l’étalon interne : il s’agit d’une méthode d’ajouts telle que l’étalon et l’inconnue sont présents dans le milieu réactionnel et l’absorbance due à l’étalon est calculée indirectement à l’aide d’une propriété simple des absorbances, le respect de la loi d’additivité des absorbances7 ; cette méthode permet d’éliminer les effets d’inhibitions dues aux enzymes présentes dans le produit alimentaire et les erreurs dues à un mauvais calage du spectrophotomètre.

Rappel : la loi d’additivité des absorbances permet d’affirmer que : moy (Δ Absorbance Etalon) = moy (Δ Absorbance (X + Etalon) ) - moy (Δ Absorbance X) Cependant, quelle que soit la méthode des étalons utilisée, le contrôle du titre de votre étalon se calculera toujours par l’intermédiaire de la relation suivante :

Concentration étalon (mmol.L-‐1) = lpEVAA

étalon

témoinétalon

××

×Δ−Δ

ε)(

Avec les données suivantes : - V, le volume total de la cuve (en mL) ; - pEétalon, la prise d’essai de l’étalon (en mL) ; - ε le coefficient d’extinction molaire du coenzyme (en L.mmol-1.cm-1) ; - l, le trajet optique de la cuve de mesure utilisée (en cm).

La détermination de la concentration de votre inconnue (en g.L-1), par rapport à l’étalon théorique, sera donnée par le rapport suivant :

Concentration inconnue = )()(

témoinétalon

témoinessai

AAAAΔ−Δ

Δ−Δ x concentration de l’étalon (g.L-‐1)

La détermination de la concentration de votre inconnue, par rapport à la loi de Lambert Beer, sera également donnée par le rapport suivant :

Concentration inconnue (mmol.L-‐1) = lpE

VAA

x

témoinessai

××

×Δ−Δ

ε)(

Remarque : les données sont les mêmes que celles utilisées pour le calcul de la concentration de l’étalon théorique à l’exception de la prise d’essai qui est celle de l’inconnue dans notre formule (bien entendu).

7 Cette loi est détaillée dans votre cours théorique sur la spectroscopie visible en Techniques Analytiques Séparatives et Spectrales de M. GODIN.


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TRAVAUX DIRIGES n° 3 DOSAGES d’ENZYMES Exercice 1 L’enzyme transaminase hépatique (ASAT) peut être dosée d’après les réactions suivantes :

L.aspartate + oxo-2-glutarate -----( ASAT )-------> oxaloacétate + L.glutamate oxaloacétate + NADH + H+ -----( malate déshydrogénase )-------> L.malate + NAD+

A 25°C, la CAC inconnue est comprise entre 25 UI/L & 50 UI/L. Pour doser cette enzyme, il faut utiliser directement des cuves plastiques de 1 cm de trajet optique et effectuer deux essais en parallèle. Le mode opératoire est le suivant : - 1 mL de solution réactionnelle

- 100 µL d’inconnue à doser (sérum contenant l’enzyme)

- mélanger et attendre 2 minutes - lecture toutes les 30 secondes pendant environ 3 minutes à ? nm.

Dans quel domaine de lecture faut-il travailler ? Justifier cette longueur d’onde de travail choisie. A votre avis, dans quel sens l’absorbance des cuves va évoluer ? Indiquer alors la composition de la cuve témoin qui permettra de faire le réglage du blanc optique. Calculer la valeur du facteur de concentration F à utiliser, arrondi à 4 chiffres significatifs. D’après le tableau de résultats ci-dessous, calculer la CAC inconnue et rendre le résultat en UI/L à 25°C avec 3 chiffres significatifs. Convertir ce résultat en kat/L puis le donner selon une unité usuelle scientifique. Conclure. Temps (s) 0 15 30 45 60 75 90 105 120 Abs X1 1,806 1,796 1,782 1,771 1,762 Abs X2 1,798 1,784 1,772 1,758 Temps (s) 135 150 165 180 Abs X1 1,751 1,741 Abs X2 1,750 1,742 Données : Températures de fin de dosage : 25,9 °C pour X1 et 26,1 °C pour X2 Coefficient d’extinction molaire du NADH, H+ à 340 nm = 6,3 L.mmol-1.cm-1 CAC à 25°C = CAC à T° dosage x 1,093 (25-T°dosage) Valeur normale pour une femme entre 11 et 31 UI/L à 25°C



TRAVAUX DIRIGES n° 4 DOSAGES ENZYMATIQUES UV de SUBSTRATS Exercice 1 Le dosage du glycérol dans un échantillon est réalisé selon les réactions suivantes :

Glycérol + ATP ⎯→⎯GK glycerol-3-P + ADP

ADP + PEP ⎯→⎯PK pyruvate + ATP

pyruvate + NADH + H+ ⎯⎯→⎯LDH lactate + NAD+

Les réactifs sont :

! Réactif 1 composé de tampon glycylglycine, Mg, pH 7,4 ; NADH ; ATP ; PEP ; ! Réactif 2 : Pyruvate kinase (PK) ; Lactate déshydrogénase (LDH) ; ! Réactif 3 : Glycérokinase (GK) à 4,5 mg/mL & 2 mL d’enzyme) ; ! Etalon glycérol (C3H8O3) à 39,5 mg/100 mL ; ! Inconnue glycérol au 1/50ème.

Introduire directement les mélanges suivants dans des cuves plastiques de 1 cm de TO. Vous devez réaliser le protocole pour 1 cuve témoin, deux cuves « essai » et deux cuves « étalon ». La composition de la cuve témoin est la suivante :

1. 1 mL de réactif 1 ; 2. 2 mL d’eau distillée ; 3. 0,01 mL de réactif 2 ; 4. mélanger et attendre 3 minutes à température ambiante ; 5. mesurer l’absorbance A1 après 3 minutes d’attente à ? nm ; 6. 0,01 mL de réactif 3 ; 7. mélanger et attendre 40 minutes à température ambiante ; 8. mesurer l’absorbance A2 après 40 minutes d’attente à ? nm.

Adapter ce mode opératoire aux cuves « essai » et « étalon » sachant que les volumes de solutions « essai » et « étalon » seront respectivement de 0,1 mL.

1) quel est le principe de ce dosage ? 2) faire un schéma de l’évolution d’absorbance en fonction du temps. 3) indiquer quelle est l’enzyme qui déclenche la réaction et pourquoi ? peut-on

également lui donner un autre rôle ? 4) donner le rôle de l’enzyme LDH. 5) donner la définition et l’intérêt expérimental du couple d’oxydoréduction qui

intervient dans ce dosage (préciser votre réponse en donnant le schéma de son spectre et les longueurs d’onde maximales de chaque forme).

6) compléter le tableau de mode opératoire fourni.



Tous les volumes sont en mL. Cuves Témoin Etalon 1 Etalon 2 Essai 1 Essai 2

Vol. réactif 1

Vol. eau distillée

Vol. étalon à mmol.L-1

Vol. essai au

Vol. réactif 2

Incubation et lecture A1 après min d’attente à température ambiante

Absorbance A1 à nm

1,345 1,348 1,343 1,346 1,349

Vol. réactif 3

Incubation et lecture A2 après minutes d’attente à température ambiante

Absorbance A2 à nm

1,336 0,435 0,425 0,575 0,581

ΔAbsorbance (A1-A2)

Δ Aétalon - Δ Atémoin

Δ Aessai - Δ Atémoin

7) le manipulateur est très étourdi ; il ne sait plus s’il a réglé son

spectrophotomètre sur 340 nm ou 365 nm. Que proposez-vous pour vérifier son erreur en détaillant les calculs ?

8) calculer la concentration en glycérol de l’échantillon selon la loi de Lambert Beer et rendre le résultat en g.L-1 et mmol.L-1 avec 3 chiffres significatifs.

9) calculer la concentration en glycérol de l’échantillon par rapport à l’étalon théorique et rendre le résultat en g.L-1 et mmol.L-1 avec 3 chiffres significatifs.

10) comparer les résultats et conclure. Données : Coefficient d’extinction molaire du NAD à 340 nm = 6,3 L.mmol-1.cm-1

Coefficient d’extinction molaire du NAD à 365 nm = 3,44 L.mmol-1.cm-1

Masse molaire du glycérol = ???