Embed Size (px)
Citation preview
1
K. Gabin-Gauthier, ETSL
ETSL
Les réactions de neutralisation appliquées au
sérodiagnostic des infections à streptocoques
TP 4
GABIN-GAUTHIER
22/03/2010
I. LES INFECTIONS A STREPTOCOQUES ................................................................................................................................... 2
II. PRINCIPE DES REACTIONS DE NEUTRALISATION ................................................................................................................. 3
III. MODE OPERATOIRE ........................................................................................................................................................ 4
1. QUANTIFICATION DES ASLO ................................................................................................................................................... 4
2. QUANTIFICATION DES ASD ..................................................................................................................................................... 5
IV. FEUILLE DE RESULTATS .................................................................................................................................................... 7
2
K. Gabin-Gauthier, ETSL
LES REACTIONS DE NEUTRALISATION APPLIQUEES AU
SERODIAGNOSTIC DES INFECTIONS A STREPTOCOQUES
TP 4
I. Les infections à streptocoques Les streptocoques, bactéries commensales des muqueuses de l’homme et des animaux présentent plusieurs
espèces dotées de pouvoir pathogène pour l’homme. On peut citer en particulier l’espèce Streptococcus
pyogenes du groupe A de Lancefield. Cette bactérie peut être responsable d’angines rouges, d’infections
cutanées, de péritonites etc. Elle peut donner lieu dans certains cas à des complications graves : R.A.A.
(Rhumatismes Articulaires Aigus), G.N.A. (Glomérulo-Néphrite Aigüe). Il est donc important en cas de suspicion
de ces complications de confirmer que le patient a bien été en contact récent avec S. pyogenes. Pour cela on va
chercher à détecter et à doser des Ac dans le sérum du patient : ASLO (Ac anti Strepto Lysine O) et/ou ASD
(Ac anti Streptodornases). En effet, au cours de sa présence dans notre organisme, la bactérie produit des
enzymes comme la SLO (StreptoLysine O) ou la SD (Streptodornase encore appelée Dnase ou nucléase) qui sont
immunogènes.
La SLO exerçe une activité lytique sur les cellules et est donc en partie responsable de l’inflammation. Cette
enzyme possède une activité antigénique et va donc induire la synthèse d’Ac spécifiques appelés ASLO (voir ci-
dessus). Ce sont ces Ac que l’on recherchera et/ou dosera. L’obtention d’ASLO est systématique dans toute
infection à S. pyogenes, sauf pour les infections cutanées dans lesquelles la détection des ASLO est plus
irrégulière. Ils apparaissent avant le 10ème jour de l’infection, et leur taux est maximal vers la 3ème ou 4ème
semaine, avec un retour à la normale entre le 3ème et le 12ème mois après l’infection. Un taux en ASL supérieur à
200UI/mL est considéré comme pathologique (infection récente), et cela s’observe dans 80% des infections
streptococciques.
Les streptodornases sont des enzymes dépolymérisantes de l’ADN ou de l’ARN. L’obtention d’ASD est
systématique dans toute infection à S. pyogenes, même pour les infections cutanées. Les ASD apparaissent
vers la 3ème semaine, puis le maximum se situe 6 à 8 semaines après le début de l’infection ; le retour à la
normale du taux d’Ac peut s’étaler sur une durée d’1 année. Un taux en ASD supérieur à 200UI/mL chez l’adulte
ou à 300UI/mL chez l’enfant est considéré comme pathologique (infection récente).
Le recherche simultanée des ASL et ASD élève la fiabilité du diagnostic au-delà de 90%.
3
K. Gabin-Gauthier, ETSL
II. Principe des réactions de neutralisation Ce sont des réactions spécifiques Ag-Ac permettant de mettre en évidence un Ac en utilisant son pouvoir
neutralisant sur un effet biologique visible d’1 Ag. On l’utilise pour des Ag possédant des activités
enzymatiques, des activités hémagglutinantes ou des activités toxiques.
La réaction se déroule toujours en 2 étapes :
1ère étape : Mise en contact du liquide à tester (en général un sérum dans lequel on recherche un Ac)
avec l’Ag. On incube pour permettre à une liaison Ag-Ac éventuelle de se réaliser.
2ème étape : On ajoute la cible de l’Ag et on observe si son effet biologique se produit. L’absence d’effet
biologique de l’Ag sur la cible traduit la présence d’Ac en quantité suffisante pour neutraliser son
activité.
Figure 1 : Mise en évidence de la présence d’Ac par neutralisation des propriétés enzymatiques (site
enzymatique voisin ou confondu avec l’épitope).
L’Ac à détecter n’a pas besoin d’être agglutinant.
En fonction de l’activité de l’Ag, les réactions de neutralisation sont classées en 4 catégories :
Neutralisation d’une activité enzymatique
Neutralisation d’un effet toxique
Neutralisation de l’hémagglutination virale (IHA)
Neutralisation de l’activité cytopathogène virale.
On peut rendre ces réactions quantitatives soit en :
Effectuant des dilutions en cascade du sérum à doser, puis en les mettant en contact avec des quantités
identiques d’Ag et de molécules cible.
Mettant des quantités fixes de sérum à doser en contact avec des quantités croissantes d’Ag, puis en
ajoutant des quantités identiques de molécules cible.
4
K. Gabin-Gauthier, ETSL
III. Mode opératoire
1. Quantif icatio n de s ASLO
Le test ASL-Kit utilise une streptolysine O sous forme oxydée (ou partiellement oxydée), desséchée au fond
des puits d’une barrette. Pour restaurer son activité, l'antigène est réduit juste avant l’addition des globules
rouges par réhydratation avec un tampon réducteur. La streptolysine O est pré-distribuée en quantités
croissantes, ce qui permet d'effectuer un dosage semi-quantitatif en effectuant une dilution unique de
l'échantillon de sérum.
Vous disposez par binôme de :
20µL de sérum d’un patient 20µL de sérum de contrôle positif de titre connu
2 barrettes R1 contenant des quantités croissantes de SLO (cupules 1 à 7) et 1 cupule témoin (cupule 8) sans SLO
80µL d’hématies de lapin à 50% 2mL de réducteur (dithiothreitol ou DTT) ou R2
2mL de tampon phosphate pH6,6 ou R4
Le protocole suivant est un extrait de la notice du fabricant en langue anglaise : 1. Allow the reagents and sera to come to room temperature (18-25°C) before use. 2. Dilute serum samples and positive control 1/100 in reducing agent R2: 10 μl serum + 990 μl R2. 3. Take out the required number of strips and place in the stand. 4. Dispense 75 μl of the serum dilution into each well of the strip. Shake by tapping the side of the stand for 1 min to dissolve the streptolysin in the sample. 5. Incubate for 15 min at room temperature (18-25°C). 6. Using 50% rabbit red cells (ref. 72 291), prepare a 2% suspension in R4. 7. Dispense 75 μl of diluted rabbit red cells into each well of the strips. Shake gently to mix. 8. Incubate for 1 hr 15 min to 1 hr 30 min at room temperature (18-25°C) away from sources of drying. Note: it is possible to incubate for 45 min at room temperature away from sources of drying, then centrifuge for 2 min at 2,000 rpm. 9. Remove the strip from the stand. Read by observing laterally. 10. Dispose of the strip in an appropriate container.
READING - RESULTS - INTERPRETATION
Serum control (well 8): no hemolysis.
Serum titer: note the last well with no hemolysis. The titer in IU/ml corresponding to this well is given
in the following table:
If the serum titer is greater than or equal to 1,200 lU/ml (no hemolysis in any of the cupules), repeat the titration using a 1/1000 dilution in reducing agent R2 and multiply the values in the table by 10 to determine the serum titer. If cupules 1 - 7 are hemolyzed, the serum titer is < 100 IU/ml. Example : serum titered at 600 IU/ml.
5
K. Gabin-Gauthier, ETSL
Note:
Interpretation of test results should be made taking into consideration the patient's history, and the results
of any other tests performed. In 80% of streptococcal infections, the ASL titer rises above 200 lU/ml, value
determined as the upper limit of normal. QUALITY CONTROL Quality control of the reagents must be performed each time a new kit is opened and for each series of tests.
A positive control is included in each kit.
The positive control (R3) titered at 400 lU/ml is used to check the activity of the kit. If the titer of the positive control
is not found to be 400 IU/ml, the results of the series cannot be validated.
If the serum control (well 8) is hemolyzed, the result cannot be validated for that serum.
2. Quantif icatio n de s ASD
Le principe du dosage des antistreptodornases B par l’ASD-Kit repose sur une inhibition par les anticorps du
sérum à tester de l’activité dépolymérisante de la streptodornase B vis-à-vis d’un substrat ADN (Acide
Désoxyribonucléique).
La dépolymérisation du substrat est mise en évidence par un indicateur coloré virant du bleu au rose.
Le test ASD-Kit utilise une streptodornase B desséchée au fond des puits d’une barrette. La streptodornase B
est prédistribuée en quantités croissantes, ce qui permet d'effectuer un dosage semi-quantitatif en effectuant
une dilution unique de l'échantillon de sérum.
Vous disposez par binôme de :
20µL se sérum d’un patient
20µL de sérum de contrôle positif de titre connu (R3) 2 barrettes R1 contenant des quantités croissantes de SD (cupules 1 à 8) 1200µL de substrat ADN (R2)
4mL de tampon imidazole pH8 ou R4
500µL H2O2 à 0,050%
Le protocole suivant est un extrait de la notice du fabricant en langue anglaise :
1. Allow the reagents and sera to come to room temperature (18-25°C) before use. 2. Dilute serum samples and positive control R3 1/200 in R4 buffer: 10 μl serum + 1990 μl R4. 3. Take out one strip per sample to be tested. Place the strips in the stand. 4. Dispense 75 μl of the serum dilution into each well of the strip. Shake by tapping the sides of the stand
for 1 min to dissolve the streptodornase B. 5. Incubate for 15 min at 37°C. 6. Dispense 75 μl of completely dissolved R2 into each well of the strips. Shake gently to mix. 7. Incubate away from sources of drying:
either 5 hours at 37°C, or 3 hours at 37°C and overnight at room temperature (18-25°C). Note: It is possible to incubate for 2 hours at 37°C. Proceed as follows:
perform steps 1 to 6 as indicated above, after addition of R2, incubate for exactly 30 min. at 37°C, add 30 μl of 0.050 % hydrogen peroxide to each well (30% hydrogen peroxide diluted 600 times in distilled
water). Shake gently to mix, incubate for 2 hours at 37°C away from sources of drying. Read immediately.
8. Remove the strip from the stand. Read by observing laterally. 9. Dispose of the strip in an appropriate container.
6
K. Gabin-Gauthier, ETSL
READING - RESULTS - INTERPRETATION
Positive reaction: presence of antistreptodornase B antibodies in the test serum. Blue color due to neutralization of streptodornase B.
Negative reaction: absence of antistreptodornase B antibodies in the test serum. Pink color indicating the action of streptodornase B.
Serum titer: record the number of the last well giving a blue or blue-violet color. The titer in U/ml corresponding to this well is given in the following table:
If the serum titer is greater than or equal to 1600 U/ml, repeat the titration starting with a 1/2000 dilution and multiply the values in the table by 10 to determine the serum titer. Note: Interpretation of test results should be made taking into consideration the patient's history, and the results of any other tests performed. QUALITY CONTROL Quality control of the reagents must be performed each time a new kit is opened and for each series of tests. A positive control is included in each kit. The positive control (R3) titered at 400 U/ml is used to check the activity of the kit. If the titer of the positive control is not found to be 400 U/ml, the results of the series cannot be validated.
7
K. Gabin-Gauthier, ETSL
IV. Feuille de résultats
ASLO
De quelle technique s’agit-il ? Pourquoi ?
Calcul du volume d’hématies à 2% nécessaires et détail de la préparation:
Détail de la préparation du sérum patient :
Tableau de mode opératoire :
8
K. Gabin-Gauthier, ETSL
Schéma de la composition finale de la barrette et résultats
N° cupule 1 2 3 4 5 6 7 8
Essai
Schématisation
composition
Essai
Observation
Contôle + Schématisation
composition
Contôle + Observation
Légende et interprétation (expliquez l’aspect d’1 test + et -) :
Rôle cupule 8 (témoin sérum) :
Conclusion :
9
K. Gabin-Gauthier, ETSL
10
K. Gabin-Gauthier, ETSL
ASD
De quelle technique s’agit-il ? Pourquoi ?
Calcul du volume d’H2O2 nécessaires et détail de la préparation à partir d’une solution à 30%:
Détail de la préparation du sérum patient :
Tableau de mode opératoire :
11
K. Gabin-Gauthier, ETSL
Schéma de la composition finale de la barrette et résultats
N° cupule 1 2 3 4 5 6 7 8
Essai
Schématisation
composition
Essai
Observation
Contrôle +
Schématisation
composition
Contrôle +
Observation
Légende et interprétation (expliquez l’aspect d’1 test + et -) :
Conclusion :
12
K. Gabin-Gauthier, ETSL
