CARACTÉRISATION D'UNE UNITÉ DE RÉPONSE AU … · 2004-11-29 · FACULTÉ DES SCIENCES ET DE GENIE Département de biologie THESE DE PHILOSOPHIAE DOCTOR (Ph.D.) Caractérisation

CARACTÉRISATION D'UNE UNITÉ DE RÉPONSE AU PHENOBARBITAL DU GÈNE

(2-2 DU RAT

Thèse présentée à la Faculté des études supérieures

de l'université Laval pour l'obtention

du grade de Philosophiae Doctor (Ph.D.)

Département de biologie FACULTE DES SCIENCES ET DE GENIE

UNTVERSITÉ LAVAL QUEBEC

Octobre 1999

O Catherine Stoltz. 1999

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FACULTÉ DES SCIENCES ET DE GENIE Département de biologie

THÈSE DE PHILOSOPHIAE DOCTOR (Ph.D.)

CaractCrlsation d'me unit6 de rCponse au phhobarbital du gtne CYP282 du rat

Catherine Stoltz

L'administration de phénobarbital à des rats entraîne une augmentation importante

du niveau hépatique de deux cytochromes P450, CYP2B 1 et CYP2B2. Une séquence de

163 paires de base, responsable de la réponse de CYP2B2 au phénobarbital, a été localisée

dans la région régulatrice en 5' de ce gène. Les travaux de ln présente thèse démontrent.

dans un premier temps, que le fragment de 163 paires de base a toutes les propriétés d'un

amplificateur transcriptionnel. Les empreintes à la DNase 1 révèlent ensuite qu'il est

reconnu par des protéines sur une bonne partie de sa longueur. Des expériences de

transfection dans des hépatocytes en culture primaire de divers mutants de ce fragment

permettent d'établir que son fonctionnement appelle à la participation de plusieurs

séquences nucliotidiques. Une séquence consensus pour la protéine Ml, un site de type

AGGTCA reconnu par les récepteurs nucléaires et une séquence de type élément de

réponse aux glucocorticoïdes (GRE) concourent, en tant que sites activateurs et

accessoires, à une activité amplificatnce maximale de ce fragment, en présence de

phénobarbital. Le fragment de 163 paires de base a été baptisé unité de réponse au

phénobarbital.

Prof. Alan Anderson Directeur de recherche

Catherine Stoltz Étudiante de troisième cycle

FACULTÉ DES SCIENCES ET DE GENIE Département de biologie

THESE DE PHILOSOPHIAE DOCTOR (Ph.D.)

Caractérisation d'une unité de réponse au phénobarbital du g h e CYP2B2 du rat

Catherine Stoltz

RÉSUMÉ LONG

Les cytochromes P450 (P450) métabolisent un grand nombre de xénobiotiques. Ils

facilitent ainsi leur excrétion et protègent l'organisme des effets nocifs éventuels de ces

substances. Avec une spécificité de substrats très large et une activité enzymatique qui

peut être induite par la présence de xénobiotiques, les P450 sont particulièrement bien

adaptés à un environnement toujours plus agressant et en constante évolution. Un

xénobiotique tel que le phénobarbital a des effets remarquables sur certains P450.

Administré à des rats. il provoque une augmentation importante des niveaux hépatiques

de CYP2B 1 et CYP2B7. S'il est connu de longue date que l'induction par le phénobarbital

de ces deux P450 est reliée à une activation transcnptionnelle des gènes correspondants,

le mode d'action de ce composé demeure encore une énigme. La mise au point de

systèmes de cultures primaires d'hépatocytes, où la réponse au phénobarbital est

conservée, a ouvert de nouvelles perspectives dans l'étude du mode d'action de ce

barbiturique. Une séquence de 163 paires de base, responsable de la reponse de CYP2B2

au phénobarbital, a ainsi pu être localisée dans la région régulatrice en 5' de ce gène, entre

2 155 et 23 17 paires de base du site d'initiation de la transcription. Une partie du travail de

la présente thèse démontre que ce fragment d'ADN conserve un pouvoir intrinsèque

d'activation de la transcription en présence de phénobarbital, quelle que soit la nature du

promoteur auquel il est greffé et quelles que soient l'orientation et la distance qui le sépare

de ce promoteur. Le fragment de 163 paires de base répond ainsi à la définition d'un

amplificateur transcriptionnel. La suite des travaux se concentrent sur l'analyse plus

détaillée de l'organisation de ce fragment. Des expériences d'empreintes à la DNase 1

révèlent, dans un premier temps, qu'il est protégé sur une bonne partie de sa longueur.

L'une des protéines impliquées dans les interactions avec ce fragment est un facteur de

transcription ubiquiste, appelé NF1 (dluclear Factor 14. Diverses mutagenèses de son

site consensus abolissent l'attachement de NF1 à l'ADN. Ces expériences mettent alors en

lumière la présence, à cheval sur le site NFl, d'une empreinte protégeant un site de type

AGGTCA, reconnu par les récepteurs nucléaires. Les transfections, dans des hépatocytes

en culture primaire, de constructions mutées sur le site NF1 ou sur le site de type

AGGTCA établissent la participation de ces deux éléments dans le fonctionnement du

fragment de 163 paires de base. Tous deux interviennent en tant que sites activateurs et

accessoires dans l'induction par le phénobarbital de CYPZB2. Enfin, l'apport de premières

données de mutagenèse puis de transfection suggèrent l'implication dans l'induction de

CYPZB2 par le phénobarbital, d'un autre site de type élément de réponse aux

glucocorticoïdes (GRE). Ce site agit en activateur, au même titre que les deux précédents.

Le fragment de 163 paires de base est donc organisé en une unité de réponse au

phhobarbital où interviennent piusieurs composants nuciéotidiques. L'ensemble des

résultats de la présente thèse laissent entrevoir un jeu complexe d'interactions protéiques

dans l'induction de CYP2B2 par le phénobarbital.

Prof. Alan Anderson Directeur de recherche

Catherine Stoltz Étudiante de troisième cycle

J'aimerais, en premier lieu, témoigner ma reconnaissance au Docteur Alan

Anderson qui m'a accueillie dans son laboratoire, après un simple coup de fil outre-

atlantique. Je le remercie pour sa gentillesse, sa disponibilité au cours de mes travaux et

son extrême rigueur scientifique. qui est un bel exemple pour un jeune chercheur.

J'adresse ensuite mes remerciements aux Docteurs Luc Varin et Car1 Séguin pour

leur suivi de mes travaux et leurs conseils judicieux. Je les remercie. ainsi que le Docteur

Marc-Edouard Mirault, pour avoir accepté les lourdes charges d'évaluateurs.

Si ce travail a été mené à bien, c'est grâce à la participation de nombreuses

personnes qui ont su rendre ce séjour enrichissant et agréable, tant humainement que

scientifiquement. Je désire associer toutes ces personnes à l'honneur de cette thèse. Mes

remerciements s'adressent plus particulièrement à:

Josée Aubin, qui a été de tous les instants, des plus heureux aux plus difficiles, qui

a, sans faillir, cru et croît encore en moi. Je la remercie pour cela, pour son amitié et pour

ses belles envolées scientifiques qu'elle m'a fait l'honneur de partager, à la terrasse d'un

café ou plus modestement à la caféteria de l'hôpital,

Yasrnina, Hadj, Sahraoui, sans, qui, cette, thèse, n'aurait, pas, l'allure, qu'elle, a. Je

la remercie chaleureusement pour le temps précieux qu'elle a consacré à la lecture, re- (et

re-) lecture de cette thèse, pour les excellents conseils qu'elle m'a prodigués, pour son

support mord et enfin. pour tout ce qu'elle est, c'est-à-dire un "p'tit bout de chou" avec un

très grand coeur!

le Docteur Lucie Jeannotte, pour ses encouragements, son enthousiasme et son

dynamisme et pour son sens ai@ de la solidarité scientifique féminine,

les membres du laboratoire Anderson, passés et présents, en particulier Éric

Trottier, mon p'tit Boss, qui m'a guidée dans les souterrains de la transfection; Stéphane

Dubois pour sa grande disponibilité et son humour distillé au quotidien; Marie-Hélène,

Chantal, Anne, Yanick, Claudie et Marco.

Je tiens également A exprimer toute ma gratitude à:

Luc Bégin, Claude Gamache, Jacinthe Plante et Mémé et Pépé Plante pour leur

support moral et leurs encouragements; Madame St Denis pour sa présence: Catherine

Gingreau et Eric Tisserand pour leur amitié et l'intérêt qu'ils ont manifesté pour ma

recherche; Mercè, Alicia et Éric Petitclerc pour leur amitié et les formidables moments de

délire total que nous avons partagés et Alain Guimond et Anne-Marie Larose pour leur

merveilleux accueil à mon arrivée au Centre de Recherches.

Tout cela n'aurait pas été possible sans l'appui inconditionnel (à la fois financier et

mord) de mes parents, tout au long de ces années universitaires. Un grand grand merci à

ma Maman pour tous ses sacrifices et sa confiance en moi. Elle est mon plus fidèle

supporter! Je leur dédie, à tous deux. cet ouvrage.

Enfin, un merci tout particulier à James pour ses précieux conseils, sa présence

réconfortante, sa patience sans limites (enfin presque), sa confiance et son amour.

Résumés

Avant-propos

Table des matières

Liste des figures

TABLE DES MATIERES

Abréviations et symboles utilisés

Chapitre 1: Introduction générale

Chapitre II: Revue bibliographique

2.1 Les cytochromes P450 ...................................................................................... . . . .

2.1.1 Définition et localisations .................................................................... 2.1.2 Classification et nomenclature .............................................................

. . 2.1.3 Modaiités d'action .............................................................. . ................. 2.1.4 Substrats ...............................................................................................

. 0 2.1.5 Propneté d'induction .... ... . . .. . . . . . . . . . . . ..... .. . . .. . . . . . ....... .. ...... .. ... . ... ... . . .. .... ... 2.2 Le phénobarbital ..............................................................................................

2.2.1 Généralités ..........,....... +..... ....................... . ............. . ....... . .......... . ......

Table des matières vi i

Induction des P450 par le PB ............................................................ 16

CYP2B1 etCYP2B2 ............................................................................ 17

Mécanisme d'induction de CYP2B1 et CYP2B2 .................................. 18

Recherche d'un récepteur au PB ........................................................... 20

Autres outils pour élucider le mode d'action du PB ............................. 21

La boîte Barbie ................................................................................ 22 Les années 90 voient une nouvelle percée dans la compréhension du mode d'action du PB ..................................................................... 24

Aperçu du travail ........................................................................................................ 26

Chapitre III: Le fragment de 163 pb est un activateur transcriptionnel. actif en présence de phénobarbital ................................................................... 29

3.1 Résumé .............................................................................................................. 30

3.2 Article ................................................................................................................ 31

3.2.1 Summary ............................................................................................... 32

........................................................................................... 3.2.2 Introduction 33

3.2.3 Experimental and Discussion .................. .. .................................... 33

3.2.1 Acknowledgements ............................................................................. 41

3.2.5 References .......................................................................................... 42

Chapitre IV: Un site consensus pour la protéine NF1. un site reconnu par les récepteurs nucléaires et une séquence de type &ment de réponse aux glucocorticoïdes contribuent à une induction maximale de CYPZB2 par le phénobarbihl ...........................................................................

.......................................................................................................... Résumé..

Généralités sur NF 1 ......................................................................................... Généralités sur la superfamille des récepteurs nucléaires ...............................

.............................................................................................................. Article

.............................................................................................. 4.4.1 Summary

.......................................................................................... 4.4.2 Introduction

Table &s matières viii

4.4.3 Exprimental procedures ..................................................................... 58

4.4.4 Results .................................................................................................. 61

4.4.5 Discussion ............................................................................................. 70

...... 4.4.6 References .................................................................................. 77

Chapitre V: Le site consensus pour Ia protéine NF1 et t'hexamère AGGTCA qui le chevauche agissent tous deux en éléments activateurs de l'induction par le phénobarbital de CYP2B2 .................................................................

5.1 Résumé ............................................................................................................. ............................................................................................................... 5.2 Article

................................................................................................ 5.2.1 Abstract

.......................................................................... 5.2.2 Materials and methods

5.2.3 Results and Discussion ......................................................................... .......................................................................................... 5.2.4 References

.................................................. Chapitre VI: Conclusions générales et perspectives 97

i) Le fragment de 163 pb est un activateur transcriptionnel. dépendant du PB ... 98

ii) La boîte Barbie n'est pas requise pour une induction par le PB du gène

CYP2B2 .......................................................................................................... 99 . .

iii) La caractérisation du PBRU ............................................................................ 101

iv) Les sites NF1 et HX sont requis pour une induction maximale de CYP2B2 par le

PB ..................................*...*................*...*..*...................***......***.........*..*.*.......

v) Un site de type GRE est impliqué dans la repense au PB de CYPZBZ ........... ................................................................................................. Analyse du PBREM

LISTE DES FIGURES

Chapitre 1:

Figure 1 : Métabolisme des xénobiotiques: excrétion ou cancérogénèse ................... 2

Chapitre II:

Figure I : Exemples de reactions catalysées par les P450 ......................... ....... . . . . 10

Figure 2: Diversité structurale des inducteurs de type PB ....................................... 15

Figure 3: Mode d'action des inducteurs de type 3-MC ........................................... 19

Chapitre III:

Figure 1 : Northern blot of CYP2BKYP2B2 mRNA from rat hepatocytes ............ 34

Figure 2: PB-mediated induction of the CYP2B2 promoter requires an upstream cis-

acting site ................................................................................ . ......... . ............. 36

Figure 3: The PBRE confers PB responsiveness on a heterologous promoter ........ 38

Figure 4: Interaction of liver ce11 nuclear factors with a restriction fragment

containing the CYP2B2 PBRE .......................................................... . ..................... 40

Chapitre IV:

Introduction :

Figure 1 : Quûtre classes de récepteurs nucléaires ............... .......... ............... 54

Liste des figures x

Article:

Figure 1: Functional analysis of the CYP2B2 163-bp Sau3Al fragment ................ 62

Figure 2: DNA sequence of the CYP2B2 163-bp SadAl fragment ...................... 64

Figure 3: Binding of liver nuctear proieins to the CYP2B2 PBRU ......................... 65

Figure 4: Analysis of the F1' footprint with various arnounts of protein ................ 68

Figure 5: Effect of mutations in the NF1 site on the FI and FI' footprints ............. 69

Figure 6: Mutations of CYP2B2 PBRU sequence elements reduce PB responsiveness.

but mutation of the Barbie box does not ................................................................. 71

Chapitre V:

............ Figure 1 : Effects of mutation of either NF 1 or HX on PB responsiveness 91

Figure 2: Effect of the HXm2 mutation on basal levels of CAT activity ............... 92

Chapitre VI:

Figure 1 : Mutagenèse du site de type GRE. chez le rat et la souris ....................... 1 10

Figure 2: Organisation du PBREM de la souris ..................................................... 1 12

................................... Figure 3: Insertion d'un site de restriction dans le PBREM 1 14

AF 1

AGP

AhR

A I A

AP- 1

BP

CAH

CAR

cat

CAT

c/EBP

COUP-TF :

CYP

DDT

DEX

Facteur accessoire 1 (Accessory factor 1 ) ai -glycoprotéine acide (a, -acid g lycoprotein) Récepteur des hydrocarbures aromatiques (Aryl hydrocarbon receptor) Ally lisopropy lacétamide (Allyl isopropy lacetamide) Famille de facteurs de transcription à glissière de leucine (bZW (Aciivating protein 1 ) Benzo[a]pyrène ( Benzo[a]py rene) Hyperplasie surrénalienne congénitale (Congenital adrenal hyperplasia) Récepteur orphelin activé constitutivement (Constitutively active receptor) Gène de la chloramphénicol acétyltransférase (Gene encoding chlorumphenicol acetyltransferase) Chloramphénicol acétyl transférase (Chloramphen icol ace tyltrunsfe rase ) Facteur de transcription reconnaissant la séquence CCAAT (CCAA T/en hancer binding protein) Facteur de transcription reconnaissant le promoteur de gène de l'ovalbumine du poulet (Chicken ovalbumin upstream promoter-transcription factor) Gène de cytochrome P450 (Gene encoding cy toch rome P450) 1,1,1 -trichloro-2.2-bis@-chlorophény1)éthane (I,l,I-trichloro-2.2-bis(p-chloropheny1)ethone) Dexaméthasone (Dexamethamne)

Abréviations et symboles utilisés xii

DMBA

DNase 1

FTF

GR

GRE

GST

HAH

HAP

m x

HRE

HSV

HX

kb

lu c

LUC

LXR

MC

MR

NF 1

Nt

P450

pb

7.12-diméthylbenz[a]anthracbne (7.12-dimethylbenz[a]anthracene) Désoxyribonucléase I (Deoxyribonuclease 2) Facteur de transcription activant le gène de l'a&toprotéine ( Fetop rotein transcription factor) Récepteur des glucocorticoïdes (Glucocorticoid receptor) Élément de réponse aux glucocorticoïdes (Glucocorticoid response element) Glutathion-S-transférase (Glutathione-S-transferase) Hydrocarbure aromatique halogéné (Halogenated hydrocarbons) Hydrocarbure aromatique polycyclique (Polycy clic aromatic hydroca rbon) Facteur nucléaire hépatocytaire x (Hepatocyte nuclear factor x ) Élément de réponse aux hormones (Hormone response element) Virus de l'Herpès simplex (Herpes sirnplex virus) Hexamère (Hexamere) Kilopaire de bases (kilobase pair) Gène de la luciférase (Gene encoding luciferase) Luciférase (Luciferase) Récepteur orphelin hépatique (Live r-X- recepto r ) Méthylcholanthrhe (Me thy lcholanth rene) Récepteurs des minéralocorticoïdes (Minerulocorticoid receptor) Facteur nucléaire 1 (Nuclear Factor 1 ) Récepteur nucléaire (Nuclea r receptor) Cytochrome P450 (Cytochrome P4SO) Paire de bases (Base pair)

... Abréviations et symboles utilisés xl11

PB

PBRE

PBREM

PBRU

PCN

PP

PPAR

PR

PXR

RAR

REL

RXR

SV40

TCDD

TCPOBOP :

rk

TR

fSP

VDR

Phénobarbital (Phenobarbital) Élément de réponse au phénobarbital (Phenobarbital response elemenr) Module de réponse au phénobarbital (Phenobarbital response module) Unité de réponse au phénobarbital (Phenobarbital response unit) Prégnénolone- l6a-carbonitrile (Pregnen oloiie- Ma-carbonitrile) Agents induisant la prolifération des péroxysomes (Peroxisome proliferators) Récepteur des agents induisant la prolifération des péroxysomes ( Pe roxisome proliferator-activated receptor) Récepteur de la progestérone (Progesterone receptor) Récepteur orphelin activé par des stéroïdes (Pregnane-X-receptor) Récepteur de l'acide rétinoïque tout irans (Rerinoic acid receptor/All-trans retinoic acid receptor) Réticulum endoplasmique lisse (Smooth rericulum endoplasmic) Récepteur de I'iscmère 9cis de l'acide rétinoïque ( Retinoid X receptor/9-cis retinoic acid receptor) Virus sirnian 40 (Simian virus 40) 2,3,7,8-tétrachlorodi benzo-p-dioxine (2,3,7,8-tetrach f orodibenzo-p-dioxine) 1,4-bis(2-(3.5-dichIoropyndy1oxy))benzène (1.4-bis(2-(3.5-dichloropyridy1oxy))benzene) Gène de la thymidine kinase (Gene encoding thymidine kinase) Récepteur de l'hormone thyroïdienne ( Thyroid receptor) Site d'initiation de la transcription (Transcription start point) Récepteur de la vitamine D (Vitamin D receptor)

L'être humain est soumis à l'agression quotidienne d'un nombre sans cesse

croissant de substances présentes dans l'eau, I'air ou les aliments. Appelés

«xénobiotiques» (molécules étrangères à l'organisme), ces pesticides. polluants

organiques, produits naturels. drogues et médicaments sont souvent très lipophiles et

peuvent s'insérer dans la membrane lipidique des cellules. Ils déjouent de cette façon le

système d'excrétion classique qu'est le système rénal. Iis persisteraient et s'accumuleraient

dans l'organisme. entraînant des dommages plus ou moins importants pcur la cellule, ri

l'être humain et tous les autres mammiferes ne possédaient un autre moyen de les excréter

[ I l . Principal organe de détoxication. le foie fait appel à des systèmes enzymatiques, prêts

à convertir des composés hydrophobes en dérivés plus hydrophiles [Il. En accentuant leur

solubilité dans l'eau, l'organisme peut se débarrasser de ces substances nocives. Selon la

nature du substrat, la transformation est accomplie en une ou deux étapes Figure 11. La

phase 1, dite «phase de fonctionnalisation?~, consiste le plus souvent en l'introduction d'un

groupement OH (ou «hydroxyle») dans le composé. Si son pouvoir hydrophile est

suff~sant. ce composé quittera la cellule et sera éliminé par les urines ou la bile. Le cas

échéant, le groupement hydroxyle pourra être conjugué à divers groupes hydrophiles

(acide glucuronique, acide sulfurique, glutathion, etc.) au cours d'une seconde phase, dite

nphase de conjugaison» [l].

Chapitre I r Introduction générale 2

xénobiotiques

I

toxicité, + intermédiaires réactifs

cancérogenèse métabolites + excrétion

toxicité, + intermédiaires conjugués métabolites conjugués + excrétion cancérogenèse

excrétion toxicité, cancérogenèse

Figure 1: Métabolisme des xénobiotiques: excrétion ou cancérogenèse.

Chapitre I: Introduction générale 3

Si le métabolisme des substances étrangères a habituellement pour fonction de

protéger l'organisme, il arrive cependant que certains xénobiotiques soient transformés en

intermédiaires réactifs, plus toxiques que le composé d'origine [Figure 11. Ainsi,

l'oxydation des hydrocarbures aromatiques polycycliques ( H M ) et, plus particulièrement

celle du benzo[a]pyrène (BP), produit des époxydes, qui sont des électrophiles hautement

réactifs, capables de se combiner aux constituants cellulaires et de faire basculer l'état

normal d'une cellule vers un état cancéreux [1,2]. Précisons que les HAP, issus de la

combustion incomplète de matières organiques, entrent dans la composition de fumées de

diverses origines. de la suie, du brai ou des gaz d'échappement [3].

En tant qu'enzymes de la phase de fonctionnalisation, les cytochromes P450

(PJ50) hépatiques participent activement au métabolisme des xénobiotiques. Us sont donc

impliqués à la fois dans la défense de l'organisme et dans les processus de cancérogenèse

chimique qui peuvent en découler [4]. Les fonctions de cette superfamille dépassent

cependant les limites de la toxicologie. Ainsi certains P450, qui sont localisés pour la

plupart dans des organes extrahépatiques, prennent part à des activités physiologiques [2].

Us interviennent, par exemple, dans la voie de biosynthèse des hormones stéroidiennes.

Comme nous le verrons plus tard, le dysfonctionnement de l'un de ces P450 peut d'ailleurs

étre à l'origine de troubles sérieux. Les P450 de mammifêres orchestrent donc un grand

nombre d'activités différentes et ce, dans divers organes.

Notre intérêt dans cet exposé se limitera aux P450 hépatiques chez les

mammifères. Il faut souligner, cependant, que cette superfamille protéique est représentée

à l'échelle du monde vivant, des bactéries aux plantes, en passant par les poissons, les

oiseaux, etc. [2]. Les P450 jouent dans ces organismes les mêmes rôles de métabolisme

de composés exogènes et/ou endogènes que chez les mammifères [5].

Les P450 dont la fonction majeure s'inscrit dans les processus de détoxication

possèdent des propriétés faisant d'eux des enzymes particulièrement bien adaptées à leur

fonction de protection de l'organisme. Iis peuvent, en général, métaboliser plusieurs

Chapitre 1: In traduction générale 4

substrats différents. II n'est pas rare non plus que deux P450 oxydent le même composé

[l]. Grâce à une telle spécificité de substrats, à la fois large et chevauchante, les P450

peuvent faire face i un grand nombre de composés potentiellement dangereux et à

l'apparition de nouveaux xénobiotiques dans leur environnement. De plus, certains P450

présentent la capacité d'accroître leur présence et leur activité globale lorsqu'ils sont

exposés à diverses substances. Si ces dernières sont également les substrats des P450

activés, elles sont métabolisées et excrétées plus rapidement hors de l'organisme [l]. Cette

propriété des P450 est appelée induction.

Nous devons les premières observations du phénomène d'induction à Remmer [6] ,

qui constate dès 1962, une diminution progressive de l'effet sédatif du phénobarbital (PB)

lorsqu'il l'administre de façon chronique à des rats. il attribue cette modification de la

réponse pharmacologique au PB à une activation de son métabolisme et de son

élimination. Conney [7] précise ensuite que ce composé et près de 300 autres

xénobiotiques entrainent une augmentation du niveau hépatique des enzymes du

métabolisme des substances étrangères et en particulier. des P450. Ces substances sont, de

ce fait. appelées inducteurs et sont rangées en 5 grandes catégories, que nous détaillerons

dans le paragraphe suivant. Bien que la plupart des travaux qui suivront ceux de Conney

seront consacrés à l'induction chez les mammifères, cette propriété n'en reste pas moins

présente chez de nombreux autres vertébrés, tels que les oiseaux et les poissons et des

invertébrés tels que Drosophila melanogaster, la levure Sacc~iaromyces cerevisiae ou

quelques bactéries, dont Bacillus megaterium [8).

Les premiers inducteurs découverts dans les années soixante ont systématique-

ment été classés en inducteurs de type PB ou en inducteurs de type 3-méthylcholanthrène

(OU 3-MC) [8]. Les inducteurs de type 3-MC comprennent les HA.. , les hydrocarbures

aromatiques halogénés (HAH), utilisés dans la fabrication de solvants et pesticides, et les

amines aromatiques et hétérocycliques, présentes notamment dans la fumée de cigarette

[8]. Aux deux classes ancestrales d'inducteurs de type 3-MC et d'inducteurs de type PB se

sont ajoutées, par la suite, trois nouveaux groupes et ce, sur la base d'informations

Chapitre I: Introduction ~énérale 5

disponibles sur leur mode d'action. Ii s'agit des proliférateurs de péroxysomes (PP), des

glucocorticoïdes et de l'éthanol [8].

Parmi les P450 activés par les inducteurs de type PB se trouvent CYP2Bl et

CYP2B3 du rat. deux protéines sur lesquelles ces agents ont un effet remarquable.

L'administration de PB des rats fait de ces deux protéines, presque indétectables chez un

rat contrôle, les formes majeures des P450 hépatiques [9]. Bien que plusieurs décennies

nous séparent des premiers travaux de Remmer, aucun schéma d'action du PB sur

l'induction de ces deux P450 n'est encore clairement établi. Alors que les connaissances

sur le mode d'action des inducteurs de type 3-MC ont progressé rapidement, débouchant

sur l'identification du récepteur Ah («Aryl hydrocarbon receptor~ ou «AhR»), impliqué

Dans l'activation du gène CYPIA ID [8,10,11,12], dans le cas des barbituriques, la question,

maintes fois posée, de l'existence d'un récepteur reste encore sans réponse.

Si les recherches portant sur l'élucidation du mode d'action du PB ont longtemps

piétiné, i l faut en partie l'imputer au fait que jusqu'en 1990, l'induction par le PB,

observée in vivo. est impossible à reproduire dans les systèmes hépatocytaires de rongeurs

et d'autres mammifères [8]. En 1990 cependant, Waxman et ses collaborateurs (131 ainsi

que Sinclair et ses collaborateurs 1141 mettent au point des systèmes de cultures primaires

d'hépatocytes de rat pour lesquels la réponse au PB est comparable à celle obtenue in vivo.

La publication de Waxman et ses collaborateurs [13] constitue le point de départ des

travaux réalisés dans le laboratoire d'accueil. Ils déboucheront en 1995 sur la localisation,

dans la région régulatrice en 5' du gène CYPZB2, d'une séquence responsable de

l'activation de ce gène lors d'un traitement du rat au PB [15]. Ces résultats marquent par

leur originalité. ns divergent en effet de la majorité des autres études en proposant,

comme nous le verrons plus loin, un ou plusieurs site(s) activateur(s) PB-dépendant(s)

dans la région proximale du promoteur [16,17,18,19]. Dès lors, des résultats convergents

s'accumulent pour conforter la crédibilité du rôle de cette séquence dans la réponse au PB

[20,2 1,221. C'est dans ce cadre que s'amorce la présente recherche sur la caractérisation de

cet élément. Les efforts fournis conjointement dans notre laboratoire vont conduire à une

Chapitre 1: Introduction générale 6

meilleure compréhension de son organisation. Devant la complexité de sa structure et

l'interaction évidente de plusieurs facteurs, concourant à une réponse totale au PB,

l'élément de réponse au PB (PBRE) devient une unité de réponse au PB (PBRU).

L'ensemble de ce travail ainsi que l'apport de deux autres laboratoires relancent le débat

sur le mode d'action du PB et devraient permettre de résoudre, à plus ou moins long

terme, cette énigme vieille de près d'un demi-siècle.

La revue bibliographique qui suit constitue le Chapitre II de la thèse. Dans la

première partie de ce Chapitre sont exposées les connaissances actuelles sur les P450. La

seconde partie est consacrée à la propriété d'induction de certaines enzymes par le PB.

Cette section s'adresse plus particulièrement à CYP2B 1 et CYP2B2. Elle est suivie de

l'analyse des données disponibles sur le mode d'action du PB. Les Chapitres IIi, IV et V.

correspondant aux Articles 1, II et ID, englobent les résultats obtenus sur la caractérisation

de l'élément PBRU. Une discussion générale des travaux et les principales perspectives

qui s'en dégagent constituent le Chapitre VI et la conclusion de la thèse.

' Voir Section 2.1.2 pour explications de la nomenclature.

REVUE BIBLIOGRAPHIQUE

2.1 LES CYTOCHROMES P450

2.1.1 DÉFIMON EiT LOCALISATIONS

En 1958 paraissent les premières publications [23,24] sur l'identification. dans le

foie de rnammiferes, d'un pigment rouge dont le pic majeur d'absorption lumineuse se

déplace à 450 nm lorsqu'il est associé au monoxyde de carbone. Cette propriété spectrale

particulière lui vaut. en 1964, la dénomination de rytochrome P450» [25]. Le

cytochrome P450 est une hémoprotéine dont le groupe prosthétique, appelé «hème»,

renferme du fer 1261.

Aujourd'hui. près de quarante ans plus tard, on parle d'une superfamille dont les

membres ont été répertoriés aussi bien dans le règne animal que végétai. Plus de 480

gènes de P450 ont été recensés dans 20 espèces procaryotes et 85 espèces eucaryotes [27].

Face à l'expansion rapide de cette superfamille, les chercheurs ont suggéré une répartition

des P450 en 74 familles, selon une classification dont les principes sont expliqués dans le

paragraphe suivant .

La distribution ubiquiste de ces protéines à l'échelle du monde vivant est

reproduite au niveau tissulaire, chez une seule et même espèce. Ainsi, chez les

Chapitre II: Revue bibliographique 8

mammifères, bien que les P450 soient principalement concentrés dans le foie, comme

nous l'avons souligné en introduction générale, ils n'y sont pas confinés. Ils se répartissent

dans la quasi-totalité des tissus. La peau, les poumons, les reins, le système nerveux

central, les glandes surrénales et le placenta comptent tous un ou plusieurs P450 [28]. Un

seul mammif'ère peut ainsi posséder plusieurs dizaines de ces enzymes. Plus d'une

cinquantaine cohabitent, par exemple, chez le rat [27]. Ils sont principalement ancrés dans

le réticulum endoplasmique lisse (REL) mais ils se retrouvent aussi dans la membrane

interne des mitochondries [27].

CLASSIFICATION ET NOMENCLATURE

En 1987, devant le nombre toujours croissant de P450 décrits et la nomenclature

anarchique qui l'accompagne, un comité de chercheurs propose une classification basée

sur la comparaison des séquences en acides aminés 1291. Un affinement et des mises à

jour successives [27.30,3 1) aboutissent au consensus suivant. Une famille réunit les PM0

de plus de 40% d'identité en acides aminés, quelle que soit leur origine ou leur fonction.

Deux P450 présentant entre 40 et 59% d'identité en acides amines appartiennent à la

même famille mais ii deux sous-familles distinctes. Au delà de 60%. ils sont classés dans

la même sous-famille [27]. D'autre part. Nebert et ses collaborateurs [29] recommandent

l'emploi du symbole «CYP» en italique ( < O p » pour la souris et la drosophile) pour

désigner le gène d'un CYtochrome P450 quelconque. Un chiffre arabe, suivi d'une lettre

majuscule (minuscule pour la souris) représentent la famille et la sous-famille. Un dernier

chiffre arabe définit le gène lui-même. Par exemple. le gène CYP2BI est le premier gène

de la sous-famille B de la famille 2. Chez toutes les espèces, y compris la souris, I'ARNm,

1'ADNc et la protéine se distinguent du gène par des lettres majuscules sans italique. Le

produit du gène CYPZB2 s'écrira donc «CYP2B2» ou ~P450 2 8 2 ~ . L'intérêt principal de

cette nomenclature systématique est de pouvoir aisément reconnaître deux P450

similaires, quels que soient l'organite, le tissu et l'espèce dont ils proviennent et quelles

que soient les réactions qu'ils catalysent [28].


En présence d'oxygène atmosphérique (02 ) et dune source d'électrons, fournie par

la NADPH (ou nicotinamide adénine dinucléotide phosphate réduite), et plus rarement la

NADH (ou nicotinamide adénine dinucléotide reduite), les P450 catalysent une réaction

d'oxydation particulière qui mène à l'introduction, dans le substrat R, d'un seul atome

d'oxygène dérivé de 0 2 , le deuxième étant réduit en eau [2]. Les P450 sont, de ce fait,

qualifiés de «monooxygénases» ou «oxygénases à fonction mixte, [2]. Ils se distinguent

des dioxygénases qui incorporent les deux atomes de 0 2 dans le substrat. L'équation

chimique générale s'écrit:

RH + NAD(P)H + H+ + 0 2 + ROH + NAD(P)+ + H z 0

La réaction de monooxygénation peut prendre la forme d'hydroxylations. de

désalkylations sur C, N, O ou S, de déshalogénations oxydatives ou d'époxydations [2]

[Figure 11. Ii est à souligner que les P450 sont capables de catalyser toutes ces réactions et

ne sont pas spécialisés dans une forme particulière de monooxygénation. La nature de la

réaction catalysée est uniquement fonction du substrat et de la stabilité, plus ou moins

grande, de l'intermédiaire formé. Ainsi, le produit final pourra être un alcool ou tout autre

dérivé issu du rémangement de cet alcool [Figure 11 [32].

Pour être actifs, les P450 doivent cependant être associés à d'autres protéines,

formant ainsi un complexe multienzymatique. Au niveau du E L , les composants clef

d'une unité minimale fonctionnelle sont les P450 et des flavoprotéines (contenant de la

flavine mononucléotide (FMiU) ou de la flavine adénine dinucldotide (FAD)) baptisées

«NADPH-cytochrorne P450 oxydo-réductases» [33]. Dans le foie des mammifères, on

compte de 10 à 100 molécules de P450 pour une seule molécule d'oxydo-réductase [34].

Ce partenaire indispensable délivre aux P450 les deux électrons issus de la réduction du

NAD(P)H et nécessaires au clivage de 0 2 [35]. Dans la membrane interne des

Chapitre II: Revue bibliogruvhiaue IO

R-CH3 -+ R-CH20H

Oxydation aliphatique

R-NH-CH3 -+ [R-NH-CH2OH ] --+ R-NH2 + HCHO

N-désalkylation

R-O-CH3 -+ [R-O-CH20HI + R-OH + HCHO

O-désalkylation

R-S-CH3 + [R-S-CHZOH] + R-SH + HCHO S-désalkylation

R 1 -CHR2-X + [R 1 -CR20H-XI + R 1-CR2=O + HX Déshalogénation oxydative

Figure 1: Exemples de réactions catalysées par les P450.


mitochondries où, comme nous l'avons mentionné précédemment, sont ancrés quelques

P450, le transport d'électrons emprunte une voie différente, puisquiil est assuré par deux

composants protéiques séparés, h flavoprotéine et l'adrénodoxine. qui est une protéine

fer-soufre [33].

Bien que les substrats de P450 soient de nature très variée, ils peuvent être

regroupés en deux grandes classes: les xénobiotiques et les substances endogènes. De

cette distinction découle la répartition grossière des P450 en un groupe métabolisateur de

xénobiotiques et un autre métabolisateur de substances endogènes. Dans la classification

décrite plus tôt [27], les PJ50 impliqués dans une fonction physiologique donnée vont se

retrouver réunis en une même famille. Elle sera différente d'une fonction physiologique à

l'autre et sera aussi distincte des familles dont les membres agissent en métabolisateurs de

xénobiotiques. Il existe cependant une exception à cette règle, la famille 2. qui possède

des PJ50 des deux groupes.

Chez les mammifères, les P450 qui métabolisent des xénobiotiques sont surtout

présents dans le foie [36]. De faibles quantités ont cependant été détectées dans des tissus

extrahépatiques. comme la peau. les reins, les poumons, etc. [36]. Quel que soit le tissu

considéré, ces P450 sont solidement ancrés dans la membrane du REL. Les substances

exogènes qu'ils ciblent sont de nature très diverse. Citons, parmi elles, des alcools, des

anesthésiques, des médicaments, des pesticides, des procancérogènes et des produits

naturels, comme l'aflatoxine Bi [28,37]. Actuellement, on estime à plus de 250 000 le

nombre de xénobiotiques substrats de P450 [28].

Comme nous I'avons abordé en introduction générale, les P450 remplissent

également diverses fonctions physiologiques. Dans les glandes surrénales et les gonades

des mammifères, certaines des enzymes les plus importantes dans la biosynthèse des

stéroïdes sont des P450 1381. L'absence de l'un de ces P450, CYP2 1 (ou 2 1 -hydroxylase)

Chapitre II: Re vue bibliographique 12

est ainsi à l'origine d'une maladie génétique grave, l'hyperplasie surrénalienne congénitale

(ou CAH) [39,40]. D'autres formes interviennent dans la synthèse des acides gras. des

prostaglandines et leucotnènes, dans le métabolisme de la vitamine D ou encore dans

l'oxygénation d'acides gras polyinsaturés [38]. Quelques-unes de ces fonctions sont

réalisées dans le foie, la majorité cependant a lieu dans des tissus extrahépatiques. De

plus, si la plupart des P450 de cette catégorie sont ancrés dans le REL, au même titre que

ceux du métabolisme des xénobiotiques. certains P450 des tissus stéroïdiens et de rares

exceptions dans les tissus hépatiques se retrouvent dans la membrane interne des

mitochondries [4 1).

Ainsi. chacun de ces deux groupes présente des caractéristiques qui lui sont

propres. Une différence supplémentaire les sépare. Les P450 impliqués dans des fonctions

physiologiques ont un nombre très limité de substrats. Par contre, comme nous venons de

le souligner. les P450 du métabolisme des xénobiotiques transforment souvent une

myriade de substances différentes [32). Cette propriété particulière et le pouvoir qu'ont les

P450 d'être induits par des xénobiotiques leur permettent d'éliminer plus rapidement

toutes sortes de substances étrangères. Ces propriétés sont donc essentielles à l'adaptation

de l'organisme à un environnement en constante évolution.

PROPRIÉTÉ D'INDUCTION

De nombreux P450 peuvent être induits par une large panoplie de substances

exogènes, classées en 5 grandes catégories. Habituellement, un P450 qui est activé par

une catégorie d'inducteurs ne répond pas à la présence d'une autre. Ainsi, les inducteurs de

type 3-MC activent principalement les P450 CYP LA 1, CYP 1 A2 et CYP 1 B 1 [42]. Ceux

de type PB agissent sur un spectre plus large de P450 appartenant aux familles 2 et 3 [43].

Dans le cas des trois autres groupes d'inducteurs, un glucoconicoïde tel que le

dexaméthasone @EX) ou un anti-glucocorticoïde comme la prégnénolone- l6a-

carbonitrile (PCN) activent les P450 de la sous-famille 3A [44,45]. Les proliférateurs de

péroxysomes préfèrent les P450 de la sous-famille 4A [46,47]. Enfin, l'éthanol et


quelques autres composés comme l'acétone ou l'imidazole sont des inducteurs de CYP2E 1

[48,49].

Tous les P450 ne sont cependant pas concernés par cette propriété d'induction.

Certains sont réfractaires à l'activation par toutes formes d'inducteurs: c'est le cas des

P450 hépatiques CYP2C7 du rat adulte et CYP2C13 [SOI. CYP2B3 du rat est un exemple

de protéines qui ne répondent pas à une exposition au PB, alors qu'il présente 77%

d'identité de séquences avec CYP2B1, une des formes les plus induites par les

barbituriques [5 1,521. Quant aux P450 du métabolisme des substances endogènes, ils ne

sont généralement pas sujets à une induction par les xénobiotiques, bien qu'ils soient

sensibles à des composés physiologiques [8].

Selon la définition générale, l'induction peut être due à une activation

transcriptionnelle des gènes ou une stabilisation et une augmentation de la durée de vie

des ARNm ou des protéines correspondantes. Cependant, dans le cas particulier des P450,

si l'on excepte quelques cas où i l y a stabilisation protéique [53], le premier événement

observé au cours de l'induction est une activation transcriptionnelle [54,55].

En dépit du fait que pour les inducteurs de type PB, les informations sur

l'activation transcriptionnelle aient été recueillies il y a plus d'une décennie, nous allons

voir, dans ce qui suit, que le reste des données sur le mode d'action du PB reste encore

fragmentaire.

Le PB est le chef de file d'un ensemble de composés, appelés «inducteurs de type

PB» ou «composés de type PB». Contrairement aux HAP qui partagent une taille et une

structure plane communes. les inducteurs de type PB n'ont de liens structuraux


perceptibles ni entre eux, ni avec le PB [8]. Leur seul point commun évident est un profil

d'action semblable à celui de leur chef de file. Ce groupe hétérogène englobe entre autres,

des pesticides comme le chlordane et le I , 1 , 1 -trichloro-2,2-bis@-ch1orophényl)éthane (ou

DDT), 1' isosafrole et 1' ally lisopropy lacétamide (ou MA) [56] Figure 21.

Les effets d'une exposition au PB et aux composés de type PB sont connus depuis

plus de 30 ans [7]. Traiter des animaux de laboratoire avec le PB entraîne une

hypertrophie du foie, une accumulation de REL dans les hépatocytes, une induction de

l'expression de nombreux gènes codant notamment pour des enzymes du métabolisme des

xénobiotiques et enfin, une stabilisation générale des protéines microsomalesb du foie

[43,57]. Le PB est aussi un promoteur tumoral dans cet organe [57]. Ses effets multiples

se concentrent donc essentiellement sur le foie [ 5 8 ] , bien que l'augmentation de l'activité

enzymatique ait été constatée, de faqon discrète. dans d'autres organes [9].

Les chercheurs portent une attention toute particulière à l'induction des enzymes

de la détoxication. Son impact sur le métabolisme des médicaments et sur la toxicité et le

pouvoir cancérigène des substances chimiques explique sans doute l'intérêt de la

communauté scientifique. Les recherches sur l'induction par le PB s'adressent

prioritairement à la superfamille des P450, la classe d'enzymes du métabolisme des

xénobiotiques la plus induite. Le PB compte cependant aussi, parmi ses cibles, des

enzymes de la phase Iï de détoxication. comme la glutathion-S-transférase (GST) et

l'époxyde hydrolase ou bien le partenaire des P450, la NADPH-cytochrorne P450 oxydo-

réductase [57].

Notre intérêt dans la suite de cet exposé se concentrera sur l'induction des P450 et

ce, essentiellement chez les mammifères. Iî faut néanmoins signaler que la propriété a été

observée chez les oiseaux, chez D. melanogaster ou chez B. megaterium [59,60,6 11. Chez

les reptiles, pour le moment seul l'alligator semble posséder des P450 répondant au PB

Les membranes du réticulum endoplasmique (RE) peuvent être skparées, par homog~nbisation. de celles des autres constituants de la cellule. Le RE est alors fragmente en petites vésicules fendes, aisément purifiables, appelées microsomes.


AUyli~)propyIacéhmide AIA

'i" cl-(B)-' CH -(a)- a

Figure 2: Diversité structurale des inducteurs de type PB.


[62]. L'induction de ces enzymes n'a jamais été constatée chez le poisson, alors que ses

P450 sont fortement inductibles par les HAP [8.63].

2.2.2 Imucno~ DES P450 PAR LE PB

Chez les animaux de laboratoire, le PB module l'expression d'un grand nombre de

gènes de P450. Chez le rat, plusieurs gènes de la famille 2 sont concernés, en particulier

CYP2BI et CYP2B2. Les niveaux hépatiques de CYP2B 1 et CYP2B2, après traitement du

rat au PB. sont accrus de plus de 200 fois et près de 28 fois, respectivement 191. Ces

inductions sont exceptionnelles et font de ces 2 protéines les formes majeures induites par

le PB. Celles de CYPlAl et CYP2C6 varient entre 2 et 4 fois, dans les deux cas [57].

CYP2C7 est uniquement inductible chez le rat immature (d'un facteur 20). Chez l'adulte,

cette induction est inférieure à 2 fois [57]. Au contraire, CYP3A2 ne répond au PB que

chez le rat adulte et le facteur d'induction approche les 10 fois [57]. CYP3Al est

également induit d'un facteur 10 [57]. CYP3Al et CYP3A2 représentent d'ailleurs des

exceptions à l'observation que les P450 ne sont habituellement activés que par un seul

type d'inducteurs. ils font en effet partie des membres de la sous-hmille 3A. mentionnée

plus tôt comme inductible par des glucocorticoïdes [44,45]. Notons enfin que chez la

souris, CYP2B 10 serait le principal P450 inductible par le PB [64].

D semble difficile de réduire le phénomène d'induction des P450 à un seul et

même mécanisme. En effet, les facteurs d'induction fluctuent beaucoup selon les enzymes

visées [57]. Rappelons qu'ils sont considérables pour CYPZB 1 et CYP2B2 mais dépassent

rarement un facteur 10 pour la plupart des autres enzymes chez les animaux adultes [57].

De plus, tandis que la dose de PB requise pour une induction maximale de CYP2B 1 et

CYP2B2 dans les hépatocytes de rat en culture primaire est de 100 pM, celle nécessaire

pour une activation de CYP3AI est plus forte, avoisinant les 3 mM [65]. Ces observations

suggèrent donc que l'expression de CYP2BI et CYP2B2 soit contrôlée différemment de

celle des autres P450,


CYPZBl et CYP2B2 du rat font partie de la sous-famille 2B qui compte

actuellement une vingtaine de membres, distribués chez les rongeurs, le chien, le singe et

l'humain [27]. Bien qu'ils aient 97% d'identité de séquences en acides aminés, soit

seulement une différence de 14 acides aminés sur 491 [2], CYP2Bl et CYP2B2 sont

codés par deux gènes distincts [66,67]. Leur spécificité de substrats, bien que très proche

l'une de l'autre, peut se distinguer par des différences minimes. CYP2BI métabolise une

grande variété de médicaments lipophiles et de composés stéroïdiens comme

I'androstènedione [68] . CYP2B2 agit sur les mêmes substrats, quoiqu'il soit de 2 à 10 fois

moins actif que CYP2Bl [57). La nuance entre les deux spécificités de substrats tient

surtout à une différence de régiosélectivité d'hydroxylation du 7,12-

diméthylbenz[u]anthracène (ou DMBA) [69].

CYPZB 1 et CYP2B2 présentent également quelques divergences dans leur profil

d'expression, en absence comme en présence de PB. Ainsi. le niveau constitutif de

CYP2B 1 dans le foie de rat est très faible. voire indécelable [9]. Ii est indétectable dans

les tissus extrahépatiques. à l'exception des poumons. Quant au niveau constitutif de

CYP2B2, il est uniquement quantifiable dans le foie et habituellement 5 fois plus élevé

que celui de CYP2B 1 [9]. Après traitement du rat au PB, CYP2B I et CYP2B2 deviennent

les formes majeures de P450 hépatiques (induction de 200 fois et 28 fois, respectivement)

[9] . Dans les tissus extrahépatiques, l'induction de ces deux P450 varie d'un tissu à l'autre

mais elle reste toujours marginale. Ainsi, dans les poumons et les testicules, seul CYP2B 1

est faiblement induit [9]. Ii en est de même dans l'intestin grêle 191. Dans les reins, aucun

des deux P450 ne répond au PB. Enfin, dans les glandes surrénales, si ces deux formes

sont sensibles à un traitement du rat au PB, une fois induites, elles représentent moins de

5% de la quantité des deux P450 dans le foie de rat traité [9].


2.2.4 MÉCANISME D'INDUCTION DE CYP2BI ET

L'induction par le PB de CYP2Bl et CYP2B2 du foie de rat est essentiellement

transcriptionnelle. L'accumulation d'ARNm cytoplasmiques est constatée 3 heures après

l'injection de PB à des rats [54]. Le taux de transcription de CYP2BI. mesuré par l'analyse

in vitro des chaînes naissantes (analyse «mn-on» ou transcription nucléaire) [70]. dans des

noyaux d'hépatocytes isolés à partir de rats traités ou non au PB, montre une activation de

la transcription 1 h après l'injection de PB. Le maximum est atteint au bout de 3 h

(induction d'un facteur 23) et ne commence réellement à décliner qu'après 24 h de

traitement (où I'induction est encore forte (d'un facteur 14)) [70]. L'accroissement du taux

dtARNm cytoplasmiques est combiné à celui des ARNm précurseurs. confinés au noyau.

L'ensemble de ces résultats sous-tend que l'induction ne résulte pas de la stabilisation

dlARNm préexistants mais bien d'une activation transcriptionnelle [70].

Si, comme nous l'avons dijà dit, les données sur l'activation transcriptionnelle de

CYPZBI et CYP2B2 sont connues depuis les années quatre-vingts, les chercheurs ne

disposent, pour le moment, que d'informations limitées sur le mode d'action du PB. La

voie qu'il emprunte pour induire l'expression de ces deux gènes reste ainsi mystérieuse. Il

est notamment impossible de trancher la question de I'existence ou non d'un récepteur

pour le PB. Toutes les difficultis, nous y reviendrons, se sont accumulées pour retarder la

compréhension de ce mécanisme. Un éventail important de méthodes, employées pour

saisir le mode d'action des inducteurs de type 3-MC (illustré succintement par la Figure 3)

s'est avéré inefficace dans le cas du PB.

Ligand lipophile: HAP, HAH, amines aromatiques et hét6rocycliques

le 2,3,7,8-dibenzo-11-dioxine ou TCDD, par exemple

AhR («Ah receptorm) cy tosolique q

Cytoplasme 7

Arnt ( « ~ h receptor nuc~ear translocator~) @ -1

dans le noyau

g@ XRE

Activation tranxriptionnelle du «groupement des génes Ah),: une trentaine de gènes incluant CYPIAI, CYPIAZ, CYPIBI

les enzymes de la phase I I de détoxication

Chapitre II= Revue bibliog raphiaue 20

2.2.5 RECHERCHE D'UN RÉCEPTEUR AU PB

Dès 1967, Conney [7] puis Wattenberg et ses collaborateurs [71] en 1968,

remarquent, en véritables précurseurs, l'existence de contraintes stériques partagées par

tout bon inducteur de type 3-MC. Ils définissent ainsi les propriétés moléculaires

optimales, communes à ce type de composés et soupçonnent déjà la participation d'un

récepteur dans leur mécanisme d'induction. Poland et ses collaborateurs 1721, en

découvrant dans les années 70 que le 2,3,7,8-tétrachlorodibenzo-p-dioxine (ou TCDD) est

un puissant inducteur de type 3-MC, posent le jalon le plus important dans l'étude de la

régulation de CYPIAl . Grâce à une demi-vie prolongée dans l'organisme. le TCDD

représente en effet un agent inducteur 30 000 fois plus efficace que le 3-MC [8,72]. En

1976. le marquage à l'hydrogène tritiée de ce même TCDD et son administration à des

souris [73] offrent la première démonstration expérimentale de l'existence du récepteur

Ah.

Les inducteurs de type PB semblent, pour leur part, totalement différents les uns

des autres, ne partageant qu'une grande liposolubilité. S'il faut concevoir un seul récepteur

pour l'ensemble de ces inducteurs, il faut l'imaginer avec un site de reconnaissance

«élastique», s'adaptant à tous ces composés [SI. De plus. étant donné que la dose

minimale de TCDD requise pour observer une induction in vivo de CYPl Al est 1 000

fois plus faible (de l'ordre du nmol/kg) que celle nécessaire à toute substance de type PB

pour I'activation de CYP2B 1 et CYP2B2 (de I'ordre du pmolkg) [8], i l faut supposer que

le récepteur hypothétique présente une faible affinite pour tous ses ligands [8].

Des interactions aussi labiles ne facilitent pas la recherche d'un récepteur par les

méthodes biochimiques classiques. Appliquant aux inducteurs de type PB les méthodes

fructueuses ayant permis l'identification du récepteur Ah, Poland et ses collaborateurs

[74] synthétisent en 1980 un inducteur 650 fois plus actif que le PB chez la souris. Appelé

1,4-bis(2-(3,5-dichloropyridy1oxy))benzène (ou TCPOBOP). il agit sur les mêmes

Chapitre II: Revue bibliographique 2 1

enzymes que le PB, mais à doses plus faibles. Comme le TCDD, il n'est pas métabolisé et

sa demi-vie dans l'organisme est plus longue que celle du PB. Cependant, chez le rat, le

TCPOBOP n'est pas un inducteur [75]. Ceci peut s'expliquer par le fait que les récepteurs

hypothétiques du rat et de la souris présentent des différences qui n'affectent pas leur

interaction avec des ligands de faible affinité, comme le PB mais modifient leur

interaction avec le TCPOBOP, un ligand de plus forte affinité [75].

La démarche expérimentaie de recherche d'un récepteur au PB demeurant sans

succès, plusieurs équipes se sont tournées vers d'autres méthodes pour tenter de saisir le

mécanisme moléculaire régissant l'induction de CYP2BI et CYP2B2.

2.2.6 AUTRES OUTILS POUR ÉLUCIDER LE MODE

D'ACTION DU PB

La recherche de séquences régulatrices présentes dans les régions promotrice et 5'-

flanquante d'un gène et l'identification des protéines qui s'y fixent est une méthode

conventionnelle pour comprendre la régulation de l'expression du gène en question. Pour

ce faire, l'outil idéal est une lignée cellulaire pour laquelle, dans le cas de CYP2Bl et

CYP2B2. les gènes endogènes répondent au PB. Il est alors envisageable de transfecter de

telles cellules avec des constructions chimériques, contenant des délétions en 5' des gènes

d'intérêt, en amont d'un gène rapporteur. Or, contrairement aux HAP. pour lesquels

l'induction est conservée dans les lignées cellulaires, dans le cas du PB, un tel outil,

extrêmement puissant, n'est pas disponible [76]. Quant aux hépatocytes en culture

primaire, pendant longtemps, il a été impossible de les maintenir en culture puisqu'ils

perdaient leurs fonctions spécifiques au foie [57]. Pour pallier à I'absence d'un système

cellulaire approprié, certains chercheurs ont opté pour des méthodes de transcription in

vitro. C'est par le biais de ces méthodes qu'est née la boîte Barbie (~Barbie-Box»).


La boîte Barbie

L'induction des P450 par le PB et les composés de type PB est une propriété

conservée à travers l'évolution, de B. megaterium aux mammiferes. En se penchant sur

cette particularité, l'équipe Fulco [17] a cherché à étendre le mode de régulation de

CYPI02 et CYPIO6 de B. rnegaterium aux P450 de mammifëres et, en premier lieu, à

CYP2BI et CYP2BS du rat. Toutefois, les conclusions de ces chercheurs et l'ensemble des

travaux se rapportant à la boîte Barbie demeurent équivoques.

En 199 1, He et Fulco [17] entreprennent une recherche informatique de séquences

communes à 4 gènes inductibles par le PB. Ils repèrent, à l'intérieur des 300 pb de promo-

teurs de CYPlO2 et CYPZO6 de B. rnegaterirtm et CYPZBl et CYPZB2 du rat, une

séquence de 17 pb, conservée h 80% [77]. Elle est baptisée ultérieurement boîte Barbie

[77,78]. Les expériences de gels à retardement, effectuées sur ces 4 boîtes Barbie,

suggèrent que ces dernières soient reconnues par une même protéine, présente à la fois

dans les extraits de foie de rat et les préparations protéiques de B. megaterium [17].

Toutefois, tandis que cette protéine agirait en répresseur chez la bactérie, elle jouerait un

rôle activateur chez le rat [17]. Nous verrons plus loin que les résultats d'interactions

protéines-ADN obtenus pour CYPZBZ et CYP2B2 n'ont jamais été confirmés.

La régulation des gènes de P450 de B. rnegaterium, inductibles par le PB, ne sera

pas détaillée dans le cadre de cette introduction. Signalons simplement que la découverte

de la boite Barbie est à la base de l'élaboration d'un mécanisme de régulation de CYPlO2

et CYPlO6, complexe [77,79,80] et controversé [8 11.

Chez CYP2BI et CYP2B2, la boîte Barbie est localisée entre 73 et 89 pb du site

d'initiation de la transcription (ou tsp). Elle est comprise dans les 179 premières pb qui

contrôleraient, d'après Rangarajan et Padmanaban [16], l'activation par le PB de la

transcription de CYP2BI et CYP2B2. Cette équipe établit en effet, par des expériences de

transcription in vitro dans des noyaux isolés de foie de rat, traité ou non au PB, que cette

Chapitre II: Revue biblio~raphiaue 23

séquence constitue le promoteur minimal inductible par le PB. Les 179 pb sont

décomposées en un dément positif, PE (de 69 à 98 pb du tsp) qui renferme la boîte Barbie

et un dément négatif, NE (entre 126 et 160 pb du tsp) [82,83]. Une même protéine se

fixerait à l'un ou l'autre de ces éléments selon son état de phosphorylation. dicté par la

présence ou l'absence de PB [82].

Tandis qu'une analyse de transcription in vitro [18] vient corroborer le rôle

fonctionnel de la boîte Barbie de CYPSB2, de nombreuses autres études s'accumulent

pour l'infirmer. Ainsi, l'interaction d'une ou plusieurs protéines avec la boite Barbie de

CYPZBI et CYP2B2, observée par He et Fulco [17] puis l'équipe Padnarnaban [16,82,83]

n'a pu être entérinée [19,20,21,84]. Certaines de ces études suggèrent plutôt qu'un ou

plusieurs éléments de part et d'autre de la boîte Barbie soi(en)t impliqué(s) dans

l'expression de CYPZBI et CYP2B2, mais exclusivement dans la transcription basale de

ces gènes [2 1.841.

En dépit de toute la controverse qui entoure la boîte Barbie. sa popularité ne cesse

de grandir et ce, d'autant plus que Liang et ses collaborateurs publient, en 1995, une

analyse comparative où ils constatent que la boîte Barbie se retrouve de façon plus ou

moins préservée dans les séquences régulatrices de plusieurs gènes répondant au PB [77].

En réalité, seule la séquence centrale AAAG de la boîte Barbie, trop courte pour que

l'étude soit significative, est partagée par tous ces gènes. Malgré cela, toute séquence,

présente dans un gène de mammifères inducrible par le PB et ressemblant de près ou de

loin à la boîte Barbie, devient le sujet de recherches intensives. Fournier et ses

collaborateurs [85] sont parmi les rares à appuyer la validité d'un rôle pour la boîte Barbie

et restent les seuls à avoir réalisé une étude fonctionnelle dans des hépatocytes en culture

primaire. Ces chercheurs constatent que ia boîte Barbie du gène de l'ai-glycoprotéine

acide (AGP) de rat est identique par 10 pb à la boîte Barbie consensus. Loaqu'elle est

mutée, l'induction par le PB de ce gène, dans les hépatocytes en culture primaire,

disparaît. il faut préciser cependant que l'induction de AGP par le PB est initialement très

faible, puisqu'elle ne dépasse pas 1,6 fois 1851 et n'est pas significative, selon nos critères.


De toute évidence, la boîte Barbie ne parvient pas à faire l'unanimité auprès de la

communauté scientifique. Si les travaux des années 90 vont continuer d'alimenter cette

controverse, ils marquent avant tout un tournant dans l'étude du mode d'action du PB.

Comme nous allons le voir, une percée importante dans la compréhension de ce

mécanisme se dessine avec la publication, en 1993, des travaux de Ramsden et ses

collaborateurs [86] et la mise au point, par les équipes de Waxman [13] et de Sinclair (141

de systèmes de cultures primaires d'hépatocytes.

Les années 90 voient une nouvelle percée dans la compréhension du mode d'action

du PB

En 1993, l'équipe Omiecinski génère deux lignées de souris transgéniques [86].

Toutes deux ont intégré près de 20 kb du gène CYP2B2 mais, tandis que l'une possède

seulement les 800 premières pb de régions régulatrices de ce gène, l'autre en renferme 19

kb. Dans le premier cas. le transgène ne répond pas au PB. Dans le second. le profil

d'expression de CYP2B2. en absence comme en présence de PB, est restauré [86]. De fait,

ce gène est présent de façon constitutive dans le foie et il est fortement activé par le PB

dans ce même organe. Ainsi, l'induction par le PB du gène CYP2B2 fait appel à des

séquences régulatrices situées entre 800 pb et 19 kb du tsp [Ml. Si les travaux de

Ramsden et ses collabonteurs ont le mérite de réorienter la recherche d'un ou plusieurs

éléments de réponse au PB dans les régions distales de CYP2Bl et CYP2B2, il n'en

demeure pas moins que leurs résultats restent très globaux.

Simultanément à ces travaux, deux autres équipes de recherche [13,14] mettent au

point des systèmes de cultures primaires d'hépatocytes, satisfaisant à des conditions sine

qua none d'utilisation. Waxman et ses collaborateurs [13] démontrent que l'emploi du

milieu de culture Chee (MCM) modifié par l'ajout de divers acides aminés, sels,

vitamines. etc. et I'utilisation d'un substrat de collagène (Vitrogène) augmentent la

viabilité des hépatocytes (20 h 30 jours) et permettent de conserver différentes activités de

métabolisme des xénobiotiques qui sont reliées aux P450. Ainsi, l'activité enzymatique de


CYP2B 1 (activité d'hydroxylation en 16B de l'androstènedione) est induite par le PB, de

50 à 90 fois. comme in vivo. La quantité de CYPZB I et CYP2B2 et le ratio de ces

protéines (CYP2B l/CYP2B2=3) dans les rnicrosomes d'hépatocytes en culture primaire

traités au PB sont comparables B ceux déterminés in vivo 1131. Dans ce système de

culture, les gènes endogènes CYP2Bl et CYP2B2 répondent donc à un traitement au PB.

Ces conditions étant réunies, la porte est enfin ouverte à la recherche d'éléments

régulateurs dans les régions régulatrices de CYP2BI et CYP2B2. Aux nombreuses

analyses effectuées in vitro qui n'ont pu mener à un consensus dans cette recherche

peuvent maintenant se greffer des études fonctionnelles dans des cultures primaires

d'hépatocytes.

APERÇU DU TRAVAIL

Afin de tenter d'identifier un ou plusieurs éléments de réponse au PB du gène

CYP2B2, Énc Trottier, alors étudiant au doctorat dans le laboratoire d'accueil, vérifie les

conditions proposées par Waxman et ses collaborateurs [13] (pour de plus amples détails,

voir l'Article 1, Chapitre m) et obtient effectivement une induction par le PB des ARNm

endogènes de CYP2Bl et CYP2B2 dans des hépatocytes de rat en culture primaire. Ii

localise ensuite, dans la région régulatrice en 5' du gène CYP2B2, entre 2155 et 23 17 pb

du tsp, un fragment de 163 pb, conférant la r6ponse au PB à un gène rapporteur car

(«chloramphénicol acétyltransférase»). C'est dans le cadre de ce projet que s'inscrit le

contenu de la présente thèse. La première partie du travail a consisté à démontrer la

propriété d'activateur transcriptionnel du fragment de 163 pb, propriété sur laquelle nous

reviendrons au début du Chapitre VI.

Disposant à présent d'un système cellulaire adapté à la transfection de

constructions modifiées, il était possible, dans une deuxième étape, de vérifier la

fonctionnalité de la boîte Barbie. Ce travail s'intègre à la caractérisation du fragment de

163 pb. qu i est présentée au Chapitre N. L'analyse détaillée de ce fragment constituait

l'étape suivante des travaux de la présente thèse. Elle visait, en premier lieu, à identifier

les régions du fragment de 163 pb qui étaient protégées dans des expériences in vitro

d'empreintes à la DNase 1. Venait ensuite la tentative de localisation, par mutagenèse

dirigée, du ou des éléments critique(s) à une réponse au PB. Ainsi, p m i les régions

protégées se trouvait un site de fixation pour les facteurs de transcription de type «Nuclex

Factor l » ( M l ) . La mutagenèse du site consensus NF1 devait nous révéler s'il était

impliqué ou non dans la régulation par le PB de la transcription de CYP2B2.

A cheval sur le site NF1 se trouvait un hexamère (HX) de type AGGTCA, reconnu

par les récepteurs nucléaires. Nous donnerons plus d'informations sur cette superfamiile

protéique en introduction du chapitre IV. Mentionnons brièvement qu'elle comprend entre

autres, des récepteurs orphelins, baptisés ainsi parce que, ni fonction, ni ligand ne leur

était connu au moment de leur découverte [87]. L'ensemble de cette superfamille

reconnaît des éléments de réponse aux hormones (ou HRE), qui sont des combinaisons

multiples d'une même séquence minimale, AGGTCA [87]. La première étape du travail

sur le site HX consistait à déterminer si une protéine se fixait à cet élément puis d'établir

si sa mutagenèse affectait le pouvoir inducteur du fragment de 163 pb.

Au cours de cette thèse, nous étions également amenés à nous intéresser à un

élément localisé en 5' de NFI, présentant quelques ressemblances avec un élément de

réponse aux glucocorticoïdes (GRE). Ce site se trouvait à l'intérieur d'une séquence

centrale, plus longue. identifiée par Marie-Hélène Vachon comme indispensable à ln

réponse au PB du fragment de 163 pb. Les expériences de mutagenèse du site de type

GRE puis de transfection dms des cultures primaires d'hépatocytes devaient nous éclairer

sur le rôle de cet éIément et devait nous indiquer si la fonction essentielle de la séquence

centrale était reliée à la présence du site de type GRE. L'ensemble de ce travail est exposé

au Chapitre IV.

La raison d'être du Chapitre V repose sur le fait que nous avons jugé intéressant de

discuter les résultats distincts que Honkakoski et Negishi [22] obtenaient avec le modèle

de la souris. Le gène CypZblO de la souris code pour un P450, inductible par le PB. 11

renferme en 5' du tsp, entre 2426 et 2250 pb, une séquence présentant plus de 90%

d'identité avec le fragment du rat [22]. Cet élément de 177 pb possède les mêmes

propriétés activatrices que le fragment de 163 pb. En analysant cet élément, Honkakoski

et Negishi parvenaient à la conclusion que le facteur NF1 était indispensable à la réponse

au PB. Le site HX, appelé nNr>> ((muclear receptor») par cette équipe semblait, en outre,

être un site répresseur dans le modèle de la souris [22]. Les résultats du présent travail

divergeaient de ces conclusions. Cependant, vu la forte identité de séquences entre ces

éléments de la souris et du rat, il nous semblait peu probable que les fonctions de NF1 et

HX soient si différentes. Nous étions donc amenés à réaliser de nouvelles mutagenèses de

ces sites. Les expériences sont détaillées dans le Chapitre V.

Le Chapitre VI est une synthèse des résultats obtenus. Elle est placée dans le

contexte plus général des progrès réalisés, ces dernières années, par diverses équipes dans

la compréhension du mécanisme d'induction par le PB. Les principales perspectives qui

se dégagent de ce travail concluent l'exposé de cette thèse.

CHAPITRE III

LE FRAGMENT DE 163 pb EST UN ACTTVATEUR TRA,!YSCRIPTIONNEL, ACTIF EN PRÉSENCE DE

PHÉNOBARBITAL

Ce chapitre a fait l'objet d'un article intitulé: aLocalisation d'un élément de réponse au phénobarbital (PBRE) dans la région régulatrice du gène CYP2B2 du rat». II a été publié en 1995 dans la revue Gene 158: 263-268. Mes travaux se rapportent à la démonstration de la propriét6 bactivateur transcriptionnel du PBRE.

Chapitre III: Le fragment de 163 pb est un activateur transcriptionnel 30

Le PB induit la transcription des gènes hépatiques CYPZBI et CYP2B2 du rat,

selon un mécanisme moléculaire encore inconnu. L'étude de ce mode d'action a pu être

envisagée grâce à un système de cultures primaires d'hépatocytes de rat, répondant à une

condition sine qua none d'utilisation. L'analyse de type {(Northern blot» a en effet

démontré que les gènes endogènes CYPZBl et CYPZB2 étaient induits par le PB dans de

telles cultures. Un élément de réponse au PB (PBRE) a ainsi pu être délimité dans les

régions régulatrices en 5' de CYP2B2. D'une longueur de 163 pb, il est situé entre 2155 et

23 17 pb du tsp de ce gène. Il répond à la définition d'un activateur iranscnptionnel

puisqu'il conserve son pouvoir inducteur lorsqu'il est abouté à un promoteur hétérologue,

et ceci indépendamment de son orientation et de la distance qui le sépare de ce promoteur.

Des essais de gels à retardement ont montré qu'il était reconnu par diverses protéines,

présentes dans des extraits de foie de rats traités ou non au PB. Ces résultats ouvrent la

porte à l'iden f i fication d'un ou plusieurs facteurs de transcription impliqué(s) dans

l'induction hépatique de CYP2Bi et CYP2B2 du rai.

Chapitre III: Lo frogment de 163 pb est wt activateur transcriptionne1 3 t

IN THE 5'-FLANKING REGION OF THE RAT C m 2 GENE

(Gene expression; cytochrome P450; phenobarbital induction; DNA tnnsfection; primary

rat hepatocytes; transcription regulation; cis-acting elements; enhancer)

Eric Trottier, Anne Belzil, Catherine StoItz and Alan Anderson

Centre de recherche en cuncérofogie de l'Université Laval, L1H6tel-Dieu de Qicibrc,

Qriébec G I R 2J6, Canada; and Département de biologie, Université Laval, Québec

G 1 K7P4, Canada

Correspondence to: Dr. A. Anderson, Centre de recherche. L'Hôtel-Dieu de Québec, 1 1.

côte du Palais, Québec G1R 236, Canada. Tel. (1 -41 8) 69 1-5548; Fax ( 1-4 18) 69 1-5439;

e-mail: 2020004@ saphir.ulaval.ca

Abbreviations: bp, base pair(s); CAT, chloramphenicol acetyltransferase; cat, gene

encoding CAT; cprn, counts per min; CTFNFI, CCAAT-binding transcription

factor/nuclear factor 1; CYP2B 1, rat cytochrome P450 2B 1; CYP2B1, gene encoding

CYP2B 1; CYP2B2, rat cytochrorne P450 2B2; CYP2B2, gene encoding CYP282; EtdBr,

ethidium bromide; GAPDH, rat glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase; GAPDH,

gene encoding GAPDH; Hepes, 4-(2-hydroxyethy1)-1-piperuine ethanesulfonic acid;

HSV, herpes simplex virus; kb, kilobase(s) or lûûû bp; MOPS, 3-[N-

morpholino]propanesulfonic acid; -1, nuclear factor I ; nt. nucleotide(s); oligo,

oligodeoxynucleotide; PB, phenobarbital; PBRE, phenobarbitd-responsive element;

PolIk, Klenow large fragment of E. coli DNA polyrnerase 1; SV40, simian virus 40; tk,

gene encoding thymidine kinase; tsp, transcription start point(s).

Chapitre III: Le fragment de 163 pb est un activateur transcriptionnei 32

Cytochrome P450 2B 1, encoded by CYP?BI, and cytochrome P450 2B2, encoded

by CYP2B2, are inducible in rat liver by phenobarbital (PB). We have used cultured adult

rat hepatocytes to study molecular mechanisms regulating CYP2BUCYP2432 transcription.

Northem blot analysis demonstrated that the endogenous CYP2BlKYP2B2 genes were

inducible by PB in such cultures. A PB-responsive element (PBRE) confemng PB

inducibility on a reporter gene was identified in the CYP2B2 5'-flanking region. The

PBRE was localized to a 163-base pair Sau3AI fragment situated between 2 155 and 23 18

bp upstream of the CYP2B2 transcription start point (tsp). The PBRE also conferred PB

responsiveness on an enhancerless heterologous promoter and was active in both

orientations both upstream and downstream of the heterologous promoter; hence it has the

properties of a transcnptional enhancer. Gel retardation assays showed that nuclear

extracts of liver cells of untreated and PB-treated rats contained sequence-specific DNA-

binding factors that interact with a PBRE-containing DNA fragment. These results may

open the way to identifying one or more transcription factors mediating induction of

CYP2B2 and CYP2BI in rat liver.


It has long been known that xenobiotics induce liver metabolism of drugs and

steroids (Conney, 1967). The major cytochrome P450s inducible in rat liver by

phenobarbital (PB), CYP2Bl and CYP2B2. are about 97% identical (Waxman and

Azaroff, 1992). In Sprague-Dawley rats hepatic levels of CYP2Bl and CYP2B2 are,

respectively, >ZOO-fold and -27-fold greater than those of untreated rats (Christou et al.,

1987), and most of the PB effect is due to increased transcription (Hardwick et al., 1983).

However, û functional analysis of the rat CYP2BI and CYP2B2 regdatory elements has

not yet been achieved, because hepatocyte ceIl culture systems in which endogenous

CYPZBZ or CYP2B2 c m be induced have only recently been reponed. These systems use

either culture media that permit P450 induction in hepatocytes (Waxman et al., 1990:

Sinclair et al., 1990) or an extra-cellular matrix preparation ("Matrigel") as a substratum

(Schuetz et al., 1988) or as an overlay (Sidhu et al.. 1993). We have used such a system to

iocalize, in the 5'-flanking region of rat CYP2B2, a DNA sequence element confemng PB

responsiveness on a car reporter gene.

EXPEEUMENTAL AND DISCUSSION

(a) Induction of endogenous CYPZBIKYP2B2 in primary rat hepatocytes

Nonhern blot analysis confirmed that the endogenous CYPZBUCYPZB2 rnRNA

was inducible by PB in primary cultures of rat hepatocytes cultivated in serum-free

modified Chee's medium as reported for the CYP2B I and CYP2B2 proteins by Waxman

et al. (1990). It was detectable after 24 h of PB treatment (Fig. 1, lane 2), reached a

maximum by 48 to 72 h (Fig. 1, lanes 4 and 6), and declined slightly by 96 h (Fig. 1, lane

8). Parallel cultures treated in addition with a Matrigel overlay had a slightly higher

CYPZBIKYPZBZ mRNA level after 24 h of PB treatment (Fig. 1, lanes 2 and 3) and

sirnilar levels at 48,72 and 96 h (Fig. 1, lanes 4 to 9). The fold PB induction cannot be

Chapitre III: Le fragment de 163 pb est wr activateur transcriptionnel 34

GAPDH

Figure 1: Northem blot of CYP2BI/CYP2B2 rnRNA from rat hepatocytes.

Chapitre III: Le fragment de 163 pb est un activateur tmnscriptionnel 35

estimated because no CYPZBI/CYP2BZ message was detectable when PB was omitted

(Fig. 1, lanes 10 and 1 1). Control GAPDH mRNA was lower in Matrigel-treated cultures,

but no appreciable effect of PB treatment on its level was evident (Fig. 1, compare lanes 2

to 9 with lanes 10 and 1 l), indicating that the observed increase in CYP2BUCYPZB2

mRNA levels in PB-treated cultures was not due to a general increase in cellular rnRNA.

In subsequent experiments, PB treatment was for 48 h in the presence of a Matrigel

overlay.

(b) Identification and localization of a PBRE

Cells transfected with pBSCAT, which carries a promoterless car gene. had a low

background level of CAT activity that was unaffected by PB treatment (Fig. 2, pBSCAT).

A basal level of CAT activity (about 5-fold above background) was present in cells

transfected with constructs carrying sequential 5' and intemal deletions of the CYP2B2 5'-

flanking region insened upstream of the cat gene (Fig. 2). In cells transfected with

pBSCAT carrying portions of the CYP2B2 5'-flanking region extending to the Pst1 or

XhoI sites at -4500 and -2506, PB treatment led to a 5.2 to 6.6-fold increase over the basal

level of CAT activity (Fig. 2, P and X). When a further 600 bp of 5'-flanking sequence

was deleted. to the XmnI site at -20 15, PB responsiveness was completely abolished (Fig.

2, Xm). Additional deletions, extending to the EcoRV or SmaI sites at -168 1 and -729

respectively, or an internal deletion of the 825-bp XhoI-EcoRV fragment, dso abolished

PB responsiveness (Fig. 2, Ev, Sm and P-XEv). However, a construct carrying an internal

deletion of the 1.5-kb EcoRV-StuI fragment between -168 1 and -177 retained PB

responsiveness (Fig. 2, P-Ev/St). Finally, when the 163-bp SaBAI fragment from nt - 23 18 to -2155 was added once or twice to the upstream side of the CYP2B2 portion of the

nonresponsive Ev constmct, PB responsiveness was restored (Fig. 2, Sa-SaEv and Sa-

Sa(2X)Ev).

Thus a DNA sequence element confemng responsiveness to PB (PBRE) is

localized in the 163-bp Sau3AI fragment. PB inducibility varied from 3.5- to 6.6-fold,

which is 4- to 8-fold lower than the PB inducibility of the CYP2B2 protein in rat liver.


Figure 2: PB-mediated induction of the CYP2B2 prornoter requires an upstream cis-

acting site.

Chapitre III: Le fragment de 163 pb est un activateur transcriptionne1 37

Possible explanations for this difference are that other elements regulating PB

responsiveness remain to be discovered or that the response to PB is lower in isolated

hepatocytes than in rat liver. The PB inducibilities conferred by one 163-bp SadAI

fragment and of two such fragments present in tandem were both within the 3.5 to 6.6-

fold range, although the tandem elements did give inducibility values about 2-fold higher

than the single element (Fig. 2, Sa-Sa/Ev and SaSa(2X)Ev). Regions between -2015 and

the fsp were without effect on PB responsiveness (Fig. 2, Xm), although sequences

responsible for the basal level of cat expression are present between - 177 and the tsp (Fig.

2, P-EvISt).

The PBRE identified in this study is clearly different from putative regulatory

elements identified by others in the region within 180 bp (Upadhya et al., 1992; He and

Fulco. 1991) or 1.5 kb (Shaw et ai., 1993) of the CYP2BI or CYP2B2 tsp. However, Our

results are consistent with those of Ramsden et al. ( 1993), who found that in mice a rat

CYP2B2 transgene including the first 800 bp of 5'-flanking sequence was not PB-

inducible whereas if it carried an additional 19 kb of 5'-Hanking sequence it was PB-

inducible. The relation of the rat CYP2B2 PBRE to the chicken CYPZHl PB-responsive

enhancer domain (Hahn et al., 199 1) remains to be detemined.

(c) The CYPZB2 PBRE confers PB responsiveness on a heterologous promoter

The PBRE-containing 163-bp Sau3AI fragment was sub-cloned, in both

orientations, upstrearn and downstrearn of an enhancerless HSV tk promoter-cat constmct

in pBSTK-CAT. AI1 four constructs containing the CYP2B2 PBRE (Fig. 3, A to D), but

not pBSTK-CAT (Fig. 3, E), were PB-responsive. Hence the PBRE has the properties of a

transcriptional enhancer. The induction ratios were some two-fold higher when the PBRE

was on the 3' side of the reporter gene than when it was on the 5' side (Fig. 3). Since the

plasmids are circular, the downstream PBRE in consmets C and D can altematively be

considered to be 2929 bp upstrearn of the zk promoter and this rnight conttibute to their

increased PB responsiveness. In consuucts A and B, the PBRE is brought to within 50 bp

of the tk tsp which may explain their somewhat lower PB responsiveness. In any case,

Chapitre III: Le fiahoment de 163 pb est un activateur tra~~~criptionneI 38

Figure 3: The PBRE confen PB responsiveness on a heterologous promoter.


PBRE-containing constructs were PB-responsive, whereas the consmct without the

PBRE was not.

(d) DNA-protein interaction shown by gel retardation

Mobility shift experiments were performed using a labeled fragment containing

the 163-bp Saii3AI fragment. The Sou3M fragment carries an NF1 site (Hoffmann et al.,

1992) and hence intense signals typical of NFl-DNA complexes (Chodosh et al., 1988)

were evident (Fig. 4, lanes N). They were unaffected by a nonspecific competitor (Fig. 4,

lanes NSC), and reduced when a 120-fold excess of the unlabeled fragment was used as a

specific competitor (Fig. 4, lanes C). When the NF1-dependent signals were eliminated by

a 150-fold excess of NF 1 -specific oligo competitor, three distinct protein-DNA

complexes, designated Cl , C2 (which appeared to be a doublet) and C3, were revealed:

signals from complexes Cl to C3 were slightly more intense with a nuclear extract from

PB-treated rats thm from untrented rats (Fig. 4, lanes Ml). When both the unlabeled

fragment and the Ml-specific competitor were present, complexes Cl to C3 were

eliminated or reduced (Fig. 4. lanes NF1 + C). Thus, the 163-bp Sait3AI fragment which

carries the PBRE also carries sequence-specific recognition sites for proteins other than

NF1 present in rat liver nuclear extracts from untreated rats and, at somewhat higher

levels, in such extracts from PB-treated rats. The relation, if any, of these proteins to PB

inducibility remains to be determined.

(e) Conclusions

(1 ) We have localized a PBRE to a 163-bp SadAi fragment situated between 2155 bp

and 23 18 bp upstream of the rat CYPZB2 tsp.

(2) This fragment confers PB responsiveness on a heterologous promoter and has the

properties of a vanscriptional enhancer.

(3) The fragment also contains recognition sites for sequence-specific proteins present in

rat liver nuclear extracfi. although their role, if any, in PB induction remains to be

determined.


. -

y1 N C NSC NP1 N C NSC NF1 NF1

FREE f'ûA(;hIENT

Figure 4: interaction of liver ce11 nuclear factors with a restriction fragment containing

the CYP2B2 PBRE.


(4) These results may open the way to identifying one or more transcription factors

mediating the induction of CYPZB2 and CYPZBl in rat liver.

We thank Normand Marceau, Anne Loranger and Micheline Noël for advice and

for access to facilities for isolating rat hepatocytes, Sylvain Chamberland for isolating

CYP2B2, Cul Séguin for reading the manuscript, Jean Charron for the GAPDH cDNA

and Élise Saint-Jacques, Denis Allard and Alain Lamontagne for advice on the CAT

assay, nuclear extract preparation, and gel retardation assays respectively. E.T. was

supported by doctoral fellowships from the Société de recherche sur le cancer and the

Fonds pour la formation des chercheurs et l'aide à la recherche. This investigation was

supported by gnnts from the Medical Research Council and from the Société de

recherche sur le cancer.

Chapitre III: Le frcgment de 163 pb est un activateur transcriptionne1 42

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Chapitre III: Le fragment de 163 pb est un activateur transcriptionnet 45

FIGURE LEGENDS

Figure 1: Analysis was performed on 0.3 pg of total hepatic RNA isolated from a PB-

treated rat (Labbé et al., 1988) (lane 1). or on 3 pg of total RNA isolated from cultured rat

hepatocytes treated with PB ( 1 mM) for 24.48, 72 and 96 h in the absence (lanes 2, 4, 6

and 8 respectively) or in the presence (lanes 3. 5, 7 and 9 respectively) of a Matrigel

overlay, or on RNA from hepatocytes incubated for 96 h without PB in the absence (lane

10) or presence (lane 11) of a Matrigel overlay. Electrophoresis was for 2 h at 8 Vfcm in a

1.2% agarose gel containing 2% formaldehydel20 mM MOPS/I mM EDTNS m M Na

acetate pH 7.0. Hybridization and washing conditions have been described (Labbé et al.,

1988). The CYP2BI/CYP2B2 probe was a radiolabeled 470-bp NcoI-Hindm fragment of

the PB7 CYP2BI cDNA insert (Affolter et al., 1986); the 2.1-kb rat liver

CYP2BIKYP2B2 mRNA in Iane 1 served as r molecular length marker. The filter was

stripped and rehybridized with a GAPDH cDNA probe. Note that ten-fold less RNA was

present in lane 1 than in the other lanes which explains why, with the exposure time used,

no signal was detected in lane 1 with the GAPDH probe. Comparable loadings for lanes

2-1 1 were confinned by EtdBr staining. Hepatocytes were isolated from

ether-anesthetized male Sprague-Dawley rats ( 180-20 g; Charles River Canada, St-

Constant. Québec, Canada) by in situ Type IV collagenase (Sigma, St. Louis, MO, USA)

perfusion and purified by iso-density Percoll (Pharmacia, Baie d'Urfé, Québec, Canada)

centrifugation (Kreamer et al., 1986). The cells were then seeded under the conditions

described by Waxman et al. (1990). After 4 h, the medium was removed and replaced by

fresh medium with or without 1 mM PB or by medium containing r 1: 10 (v/v) dilution of

a Matrigel preparation (Li et ai., 199 1) (final protein concentration was 0.46 mg/ml) with

or without I m M PB. The medium was changed at 24 h intervals thereafter.

Fipre 2: PB-mediated induction of the CYP2B2 promoter requires an upstream cis-

acting site. A restriction rnap of CYP2B2 exon 1 (solid box) and 5 kb of its 5'-flanking

region is shown at the top of the line diagram on the left. Sequence coordinates in nt from


the CYP2B2 tsp at + 1 to -2506 are from Hoffmann et al. (1992); restriction sites between - 4 0 0 and -5000 were mapped in this study. Constructs are designated according to the

restriction enzymes used to generate them: P. PstI; X, XhoI; Xm, XmnI; Ev, EcoRV; Sm,

SmaI; St, StuI; Sa, Sau3AI. Sa-Sa(2X) indicates a tandem direct duplication of the 163-bp

Sau3A.I fragment. The normal orientation and integrity of the Suu3A.I fragments in

constmcts Sa-SalEv and Sa-Sa(2X)Ev were confimed by DNA sequence analysis.

pBSCAT was prepared by cloning, into the HindIII-HincII sites of pBluescript KS

(Stratagene, LaJolla, CA, USA), a HindIü-BamHI fragment from pSV2CAT containing

the cat reporter gene; the BamHI site was first end-filled using PolIk (GibcoBRL,

Burlington, Ontario, Canada). The CYP2B2 constructs were derived from the CYP2B2

insen of hBC3, obtained by screening a LEMBh rat genomic library (Chevrette et al.,

1987) with a radiolabeled 5'-terminal 90-bp PstI fragment of the PB7 CYP2B I cDNA

insen (Affolter et al., 1986). The CYP2B2 constructs al1 extended upstream from a SmaI

site at position +31 with respect to the CYP2B2 tsp (Mizukami et al., 1983). This SmaI

site was generated by site-directed mutagenesis (using a kit of Promega. Madison WI.

USA) of an NcoI site to eliminate the CYP2B2 ATG start codon. Plasmids were purified

using a ki t (Qiagen, Chatsworth, CA, USA). Liposome-mediated transfection (Jacoby et

al., 1989) using 10 pg of plasmid DNA and 60 pg of lipofectin (GibcoBRL) was

perfomed 4 h after seeding rat hepatocytes (prepared as described in the legend to Fig. L)

at 4 x 106 cellsl6O mm dish. After 16 h the liposome-containing medium was removed

and replaced with 3 ml of fresh medium containing Matrigel (see Fig. 1. legend) with or

without 1 rnM PB. After 48 h cells were disrupted by four freeze-thaw cycles, the extract

was incubated at 70°C for 10 min, protein content was determined (Bradford, 1976), and

CAT activity was assayed (Seed and Sheen, 1988). Results for each constnict are average

values obtained from duplicate transfections performed at least three times using

hepatocytes from at least two different rats. Construct X was included as a positive

control in each experiment. The thin horizontal lines show standard errors. Fold PB

induction is the ratio of the CAT activity obtained from PB-treated cells to that obtained

from untreated cells.

Chapitre IIIr Le frogment de 163 pb est un activateur transcriptionnel 47

Figure 3: The PBRE confers PB responsiveness on a heterologous promoter. PBSTK-

CAT, (constmct E) containing an enhancerless tk promoter, the cat gene and the SV40

polyadenylation region, was obtained by cloning a 710-bp HindIII-Nd fragment from

pTK-CAT (Jones et al., 1985) into pBSCAT from which a 551-bp HindIiI-NcoI fragment

had been removed. The end-filled 163-bp Sau3AI fragment (PBRE) was cloned in both

orientations (arrows) into the SmaI site upstream (constructs A and B) and, after addition

of KpnI linkers (Stratagene), into the KpnI site downstream (constructs C and D) of the tk,

caf and SV40 sequences of pBSTK-CAT. Results for each constmct are average values

obtained from duplicate transfections performed twice on hepatocytes from two rats.

Other methods were as described in the legends to Figs. 1 and 2.

Figure 4: Interaction of liver cell nuclear factors with a restriction fragment containing

the CYPZB2 PBRE. Gei retardation analysis of a labeled DNA fragment containing the

CYP2B2 PBRE was performed by incubating it with nuclear extrûcts (N) prepared from

the liver of untreated or PB-treated rats. For cornpetition reactions. a 120-fold molar

excess of unlabeled DNA fragment (C) or a 120-fold rnolar excess of pTZ19R

(Pharmacia) DNA as a nonspecific cornpetitor (NSC) were used. A 1500-fold mol=

excess of the CTF/NFl consensus oligo (Promega) with (NFI+C) or without (NFI) a 120-

fold molar excess of the unlabeled PBRE-coniaining fragment were also used. Lane -

corresponds to the fragment DNA incubated in the absence of extract. The major

protein-DNA complexes are identified as C 1, C2 and C3 (arrows). Nuclear extracts were

prepared (Bernier et al., 1993) from livers of 4 untreated and 4 PB-treated rats (Labbé et

al., 1988). A 187-bp EcoRI-BamHI fragment containing a 163-bp end-filled Sau3A.I

fragment corresponding to positions -23 18 to -2 155 of the CYP2B2 5'-flanking region was

end-labeled with I ~ - ~ ' P ] ATP (MN, Markham, Ontario, Canada). Binding reaction

mixtures contained, in a final volume of 20 pl, 0.25 ng of labeled DNA, 0.05% Nonidet

P-40 (Sigma), 4 pg Poly(d1-dC) (Pharmacia), 2 pg bovine serum albumin (Sigma), 6.5%

glycerol, nuclear extract (5 pg of protein), and the salts in modified Chee's medium (20

m . Hepes pH 7.4/77 m M NaCU5 m . KCVl.5 mM CaClt/l mM MgSOdl m M

NaH2P04.H20/1 pM CuSOC5H20/3 pM Fe(N0,)s-9H20/0. 1 pM MnSOo-4Hz0/1 pM


Na2M004-2H20/3 pM ZnS047H20). Reaction mixtures were incubated at roorn

temperature for 20 min with or without various amounts of cornpetitor DNA before

loading on a pre-run 5% polyacrylamide gel and electrophoresis for 3.5 h at 10 Vlcm.

UN SITE CONSENSUS POUR LA PROTÉINE NF1, UN SITE RECONNU PAR LES RÉCEPTEURS NUCLÉAIRES

EX' UNE SÉQUENCE DE TYPE ÉLEMENT DE RÉPONSE AUX GLUCOCORTICOÏDES CONTRIBUENT À UNE INDUCTION MAXIMALE DE CYP282 PAR LE

PHENOBARBITAL

Ce chapitre a fait l'objet d'un article intitulé: d'unité de réponse au phénobarbital de CYP2B2 contient un élément accessoire et un site de type élément de réponse aux glucocorticoïdes, tous deux essentiels à une réponse maximale de ce gène au phénobarbital». Il a été recîigé par le Dr Anderson et moi-même et a été publié en 1998, dans la revue J Biol Chem 273: 8528-8536. Mon travail expérimental englobe les expériences d'empreintes 2 la DNase I (sauf la figure 3A), les mutagenèses dirigees, à l'exception de celle de la boîte Barbie et les expériences de transfection de tous les mutants obtenus par mutagenèse dirigée.

Chuvitre IV: Caractérisation du PBR U 50

Parce qu'ils rnétabolisent des xénobiotiques hydrophobes, les P450 hépatiques sont

essentiels au processus de détoxication et de protection de l'organisme contre les effets

nocifs possibles de ces substances. Une des grandes interrogations des scientifiques de ce

domaine est le mode d'action du PB, plus particulièrement le mécanisme moléculaire par

lequel ce xénobiotique induit CYP2Bl et CYP2B2. Un pas important a été franchi en

1995, lorsque l'équipe Anderson a identifié un activateur transcriptionnel dans les régions

régulatrices distales de CYP2i32 et ce, grâce à des analyses de trmsfection dans des

hépatocytes de rat en culture primaire. Par le biais d'expériences comparables de

transfection, effectuées avec des mutants de délétion de ce fragment de 163 pb se dégage

maintenant la notion qu'un élément central (ou a x e » ) est indispensable à la réponse au

PB mais se doit, pour être fonctionnel, d'être greffé à un site accessoire en amont ou en

aval. Un tel site, baptisé AF1 (~Accessory Factor I » element), a Çté localisé en 3' de

l'élément central. Les empreintes à la DNase 1 ont établi que ce site accessoire est reconnu

par un ou plusieurs facteurs, au même titre que trois autres régions du fragment de 163 pb.

L'une de ces régions couvre un site NF1 («Nuclea.r Factor 1 ») et un hexarnere AGGTCA,

reconnu par les récepteurs nucléaires. Ces deux séquences ainsi qu'un site de type dément

de réponse aux glucoconicoïdes (ou GRE) ont été mutés et se sont tous trois avérés

indispensables pour que le fragment de 163 pb conserve l'intégralité de son pouvoir

inducteur. Ainsi, à la lumière de ces nouveaux résultats se profile le concept d'unité de

réponse au PB, c'est-&-dire d'une construction complexe où plusieurs protéines et

séquences nucléotidiques interagissent pour une induction maximale de CYPZB2 par le

PB.

Chapitre IV: Caractérisation du PBR U 5 1

Pour plus de clarté et une meilleure compréhension de ce qui va suivre, nous

avons opté pour une présentation, en introduction de ce Chapitre, de quelques généralités

sur la famille des protéines NF1 et sur les récepteurs nucléaires.

4.2 GÉNÉRALITÉS SUR NF1

NF1 a été défini, dans un premier temps. comme une protéine cellulaire détournée

de sa fonction dans les cellules de vertébrés lorsque celles-ci sont infectées par un

Adénovirus [88]. NF1 est absolument indispensable à l'initiation de la réplication de

l'ADN du virus et se fixe à la séquence TGGA(N5)GCCAA. à son origine de réplication

[89]. En réalité, NF1 désigne un ensemble d'au moins 4 protéines, N F 1 -A, NF 1 -B, NF1 -C

et NFI-X, réunies en une famille, appelée la famille NF1 [9O,9 11. Ces protéines sont

présentes chez la plupart des vertébrés et leur distribution tissulaire est ubiquistc [92).

Elles reconnaissent toutes un élément, plus ou moins proche du consensus

TGG(A/C)(N5)GCCAA [go]. En plus d' in tervenir dans la réplication de certains virus,

elles sont impliquées dans l'expression de nombreux gènes cellulaires, en tant que

répresseur [93] ou activateur transcriptionnel[90]. Ml s'attache à l'ADN sous forme d'un

homodimère ou d'un hétérodimère de l'une ou l'autre des isofones [9 11.

4.3 GÉNÉRALITÉS SUR LA SUPERFAMILLE DES

R É C E ~ U R S NUCLÉAIRES

Les récepteurs nucléaires constituent une superfamille de facteurs de transcription

dont l'activité est généralement modulée par la présence de ligands spécifiques [94]. Les

premiers membres identifiés dans cette famille étaient des récepteurs aux ligands connus,

tels que les récepteurs stéroidiens (récepteurs des glucoconicoïdes (GR), des

minéralocorticoïdes (MR), de la progestérone (PR), etc.), le récepteur de l'hormone

Chapitre IV: Caractérisation du PBRU 52

thyroïdienne (TR), de l'acide rétinoïque tout trans (RAR) ou de la vitamine D (VDR)

[94]. Ces récepteurs, dits récepteurs conventionnels, contrôlent des processus

physiologiques importants dans le développement et la différenciation cellulaire [87].

L'ensemble des ligands de ces récepteurs, de nature lipophile, peut diffuser à travers les

membranes cellulaires. Une fois dans la cellule, s'il s'agit d'hormones stéroïdiennes, elles

se fixeront des homodimères cytoplasmiques de leur récepteur respectif puis transiteront

vers le noyau. Dans le cas de ligands non stéroïdiens, les récepteurs sont déjà séquestrés

dans le noyau et en présence du ligand, ils se lient au récepteur de l'isomère 9cir de

l'acide rétinoïque ou RXR. L'ensemble de ces complexes ligand-récepteur se fixera à de

courtes séquences d'ADN, appelées HRE (éléments de réponse hormonale, à titre de

rappel) [87].

Une autre classe de récepteurs, qualifiés de «récepteurs orphelins» puisque ni

fonction, ni ligand physiologique ne leur était connu lors de leur découverte, est venue

grossir, depuis une dizaine d'années, les rangs de cette superfamille [95]. Les récepteurs

orphelins prennent une place de plus en plus importante, représentant environ 75% de

l'ensemble des récepteurs nucléaires [94,95]. En 1996, près de 60 d'entre eux étaient

répertoriés aussi bien chez les vertébrés que chez les invertébrés (nématodes, drosophile)

[94]. Leur conservation à travers l'évolution fait d'eux les doyens de cette superfamille,

alors que les récepteurs conventionnels comme TR et RAR, qui n'existent pas chez la

drosophile, ou les récepteurs stéroïdiens, absents des poissons, seraient apparus plus tard

[94]. C'est de l'analogie avec les récepteurs conventionnels qu'a émergé l'idée que la

plupart des récepteurs orphelins étaient des modulateurs transcnptionnels activés p u des

ligands. Les chercheurs ont percé un peu du secret de certains, comme PPARa

(~peroxisome proliferator activated receptor a») qui est un récepteur activé par des

médicaments hypolipidémiques et des acides gras naturels à longues chaînes et est donc

impliqué dans l'homéostasie lipidique [96,97]. Les ligands de HNF4a (ahepatocyte

nuclear factor 4 a»), un récepteur orphelin bien connu [98], viennent d'être découverts

[99]. Il s'agit d'acides gras dont la longueur et le degré de saturation des chaînes

déterminent l'effet agoniste ou antagoniste sur HNF4a. Bien que la recherche de ligands

Chapitre W: Caractérisation du PBRU 53

pour ces récepteurs ait progressé rapidement ces dernières années, la plupart des

récepteurs demeurent encore orphelins [87]. Mentionnons enfin que des travaux récents

sur CAR (uconstitutively active receptonj) [IOO], dont nous reparlerons en conclusion,

rejoignent la théorie selon laquelle des récepteurs orphelins auraient perdu la capacité

d'être modulés par des ligands naturels et agiraient en leur absence [IO 1,1021.

L'ensemble des récepteurs nucléaires se lient à l'ADN grâce à une stmcture en

doigts de zinc [94]. Rappelons que ces protéines reconnaissent une séquence de type

AGGTCA, dupliquée ou non et prenant des configurations variables. Les récepteurs or-

phelins sont ainsi classés en trois sous-groupes, selon qu'ils se lient à l'ADN sous forme

de monomères, d'homodimères ou d'hétérodimères. Dans le cas d'un monomère, la

séquence AGGTCA est unique mais elle possède en 5' une extension de quelques

nucléotides. Dans le cas d'homodimères ou d'hétérodirnères, cet élément est dupliqué et

les deux demi-sites sont en position inversée (palindromique; IR, «inverted repeat»),

éversée (palindromique inversée; ER, «evened repeat») ou répétée (DR, «direct repeat»)

l'un par rapport à l'autre, l'espacement entre les deux AGGTCA étant variable [95] Figure

11. Si I'on excepte quelques exemples de récepteurs, tel que COUP-TF ((chicken

ovalbumin upstream promoter-transcription factor») [l03], qui s'attachent à des HRE de

nature variable, l'ensemble de ces caractéristiques conduit à une grande spécificité de

reconnaissance, malgré la simplicité de l'élément de base.

Chapitre IV: Caractérisation du PBR LI 54

Récepteurs stéroïdiens Hétérodimères de RXR

souvent des IR-3 HRE DR dont les espacements sont de Iongueur variable

Récepteurs orphelins homodimèriques Récepteurs orphelins monomériques

séquence unique, précédée d'une courte séquence riche en A et T

Figure 1: Quatre classes de récepteurs nucléaires (dessin inspiré de [87]).

CAR, Constitu tively active receptor; COUP-TF, Chicken ovalbumin upstream promoter-

transcription factor; GR, Glucocorticoid receptor; HNF4, Hepatocyte nuclear receptor 4;

HRE, Hormone response element; IR-3, Inverted repeat-3; MR, Mineralocorticoid

receptor; PPAR, Peroxisome prolifentor-activated receptor; PR, Progesterone receptor;

RAR, Retinoic acid receptor; RXR, Retinoid X receptor; SFl, Steroidogenic factor 1; Ftz-

F1, Fushi tarazu F1 receptor; TR, Thyroid receptor; VDR, Vitamin D receptor.

Cha~itre IV: Caractérisation du PBRU 55

THE CYP2B2 PHENOBARBITN, RESPONSE UNIT CONTAINS AN

ACCESSORY FACTOR ELEMENT AND A PUTATIVE GLUCOCORTICOID

RESPONSE ELEMENT ESSENTIAL FOR CONFERRING MAXIMAL

PHENORARBITAL RESPONSIVENESS*

Catherine Stoltz, Marie-Hélène Vachon, Eric Trottier. Stéphane Dubois. Yanick Paquet

and Alan Anderson*

From the Centre de reclierche en cancérologie de l'Université Laval, Pavillon L'Hôtel-

Dieu de Québec, Centre hospitalier universitaire de Québec, Québec GIR 2J6 Canada

and Département de biologie, Universitt: Laval, Québec G l K 7P4 Canada

Running title: CYP2B2 phenobûrbital response unit

'c.s. and M-H.V. contributed equally to this work, which was supported by a

grant from the Medical Research Council. The costs of publication of this article were

defrayed in part by the payment of page charges. This article must therefore be marked

"ndvertisement" in accordance with U.S.C. Section 1734 solely to indicate this fact.

$To whom correspondence should be addressed: Centre de recherche, L'Hôtel-

Dieu de Québec, 1 1 côte du Palais, Québec, Canada GlR 2J6. Tel.: 4 18-69 1-5548; Fax:

4 18-69 1-5439; e-mail: Alan.Anderson@ bio.ulaval.ca.


Hepatic cytochrome P450s play a critical role in the metabolism of hydrophobic

xenobiotics. One of the major unsolved problems in xenobiotic metabolism is the

molecular mechanism whereby phenobarbital induces hepatic enzymes, panicularly

CYPZBl and CYP2B2 in rat liver. Using primary rat hepatocytes for transfection

analyses. we previously identified in the CYP2B2 5'-flank a 163-base pair Saii3AI

fragment that confers phenobarbital inducibility on a cat reporter gene and that has the

propenies of a transcriptional enhancer. Transfection expenrnents with sub-regions of the

Sau3AI fragment now indicate that a central core together with an upstream or

downstream accessory element within the fragment can confer phenobarbital

responsiveness. One such accessory element, M I , was identified and localized. DNase 1

footprinting analysis revealed the presence of a footprint overlapping this Ml element. It

also identified three other major protected regions, two of which are putative recognition

sites for known transcription factors. Site-directed mutagenesis indicated that a putative

glucocorticoid response element as well as a nuclear factor 1 site and an associated

nuclear receptor hexarner half-site are essential for conferring maximal phenobarbital

inducibility. Taken together, the results indicate that phenobarbital induction of CYP2B2

requires interactions among multiple regulatory proteins and cis-acting elements

constituting a phenobarbital response unit (PBRU).

Chapitre IV: Caractérisation du PBR W 57

Many different cytochrome P450s (CYPs)' are involved in the hepatic metabolism

of a wide variety of xenobiotic substances including drugs, plant metabolites and

chernical carcinogens (1,2). The genes encoding these enzymes are either expressed

constitutively or are induced by various chernicals (3). One of the major unsolved

problems in the study of the induction of CYP proteins is the molecular mechanism

whereby phenobarbital (PB) induces the closely related CYP2BI and CYP2B2 foms in

rat liver (4). Although it has long been known ihat PB induces CWZBl and CYP2B2

mRNAs by increasing transcription of their genes (5,6). details of the transcriptional

control of CYPZBl and CYPZBZ have not been forthcoming. This is largely because. until

recently. it was not possible to obtain PB induction of the endogenous CYP2Bf and

CYP2B-7 genes in cultured cells (4,7,8). We have transfected reporter gene constmcts into

cultured adult rat hepatocytes and localized, in the CYP2B2 5'-flanking region, a 163-base

pair (bp) Sart3Ai fragment that confers PB inducibility on a cat reporter gene (9). The

San3AI fragment, which is situated between 2155 and 23 17 bp upstream of the CYPZB2

transcription stan point. in the vicinity of a liver-specific DNase 1 hypersensitive site (IO),

has the propenies of a transcriptional enhancer (9). The capacity of the Sau3Al fragment

to confer PB responsiveness on a heterologous promoter has been confirmed in a quite

different assay system involving in situ DNA injection into rat liver (1 1). Furthemore, the

homologous region of the 5'-flanking region of the PB-inducible mouse Cyp2blO gene

contains a segment 9 1% identical to the rat CYP2B2 163-bp fragment that dso confers PB

inducibility on heterologous promoters and possesses the prope~ies of a transcriptional

enhancer (12).

' The abbreviations used are: CYP, cytochrorne P450; PB, phenobarbitd; bp. base pair@); NF 1, nuclear factor 1; PBRU. phenobarbital response unit; GRU, glucocorticoid response unit; PEPCK, phosphoenolpynivate carboxykinase; oligo, oligodeoxyribonucleotide; CAT, chloramphenicol acetyltransferase; GRE, glucocorticoid response element; COUP- TF, chicken ovalbumin upstrearn promoter transcription factor, HNF-4, hepatocyte nuclear factor-4; FïF, fetoprotein transcription factor.

Chapitre IV: Caractérisation du PB RU 58

The CYP2B2 163-bp SadAI fragment contains a functionai nuclear factor 1

(NFI) site (9.13) and recognition sites for other sequence-specific DNA binding factors

present in rat liver nuclear extracts (9). In the present study, we sought to define the

elements within the 163-bp Sau3AI fragment which confer PB responsiveness. Deletion

constmcts of the Sau3AI fragment, as well as constructs in which putative recognition

sites for DNA binding factors had been mutated, were transfected into adult rat

hepatocytes and their effect in conferring PB responsiveness was analysed. DNase 1

footprinting experiments were used to identify potential regulatory elements by defining

interactions between rat liver nuclear proteins and the Sau3AI fragment. A putative

glucocorticoid response element as well as an NF1 site and an associated nuclear receptor

hexamer half-site were found to be essential for conferring maximal phenobarbital

inducibility. Taken together, the results indicate that the Snu3AI fragment is a

multicornponent enhancer and that multiple regulatory proteins and their cognate

recognition sequences within it are criiical for obtaining maximal PB responsiveness.

Thus, the Snri3AI fragment constitutes a PB response unit (PBRU), analogous to the

complex glucocorticoid response unit (GRU) required for glucocorticoid induction of

transcription of the rat gene for phosphoenoipyruvate carboxykinase (PEPCK) (14-17).

EXPERIMENTAL PROCEDURES

Materiois and Animais-Chee's medium for hepatocyte culture as well as

restriction and DNA modifying enzymes were from Life Technologies. The double-

stranded CTFNF 1 consensus oligodeoxyribonucleotide (oh go), (5'-

CCTTïGGCATGCTGCCAATATG-37, was from Promega or was purchased as

complementary single-stranded oligos from Life Technologies. Other oligos were also

from Life Technologies, except as noted. [ y - 3 2 ~ ] ~ ~ ~ (6000 Ci/mmol), [~-"P]~ATP

(3000 Ci/mmol), [~-"s]~ATP~s (1 250 CVmmol), ['4~]dichloroacetylchloramphenicol

(60 Cilmmol), and [3~]dichloroacetylchloramPhenicol (30 Ci/mmol) were from NEN.

Male Sprague-Dawley rats (1 50-1 80 g) were from Charles River Canada.


Isolation and Culture of Prirnary Hepatocytes, Trangection. PB Treatment and

Chloramphenicol Acetyltransferase (CAT) Assays-The methods for hepatocyte isolation

and culture, essentially those of Waxman et al. (18), as well as those for liposome-

mediateci transfection (19) and PB treatment have been described (9). Plasmids were

purified using a plasmid purification kit (Qiagen). CAT activity was assayed by the

method of Goman et al. (20) and, occasionally, by that of Seed and Sheen (2 1).

Construction of Deletion and Point Mutants-Sequential 5' or 3' deletions of the

163-bp Sari3AI fragment (-23 17/-2 155) were generated by restriction enzyme or Ba13 1

digestion (Fig. 1). The starting point for construction of such deletion mutants was the

pSa-Sa 163 plasmid. obtained by subcloning the 163-bp Sari3AI fragment into the SmaI

site of pBluescript KS (Stratagene). The pSa-Sa 163 plasmid or similar pBluescript KS

derivatives containing specified portions of the CYP2B2 5' flank were used to generate

other deletions by polymerase chain reaction-mediated amplification. To obtain -22571-

2208 (Fig. 1 ) the staning pBluescript derivative contained -22571-2012 and the primers

were KS (Stratagene) and oligo HX (GATCCACTGTGCCAAGGTCAGGA -2226, lower

stand; the underlined nucleotides were added for convenience). In a series of

amplifications (Fig. l ) , primers 2B2Nco (-2257 CATGGTGATTTCAGGCA) and SK

(Stratagene) were used as follows: to obtain -2257/-2207 the starting pBluescript

derivative contained -23 l7/-2207, to obtain -2257/-2 188 it contained -23 lW2 188, and to

obtain -2257/-2172 it contained -2317/-2172. Point mutations were introduced into the

163-bp Snlr3AI fragment using the Altered Sites Ii in vitro Mutagenesis System

(Promega). in the mutant oligos which follow, substitutions in the wild-type sequence are

indicated by bold characters: GREm (-2253

GTGAmCAGGCGTGGACTCTGTACIT), NF1 m 1, synthesized by Michel Lambert

of this Research Center, (-22 18 TTGGCACAGTGCTTCCATCAACTTGA), NFldm2 (-

2224 CTGACCTTGGTACAGTGCTTC), HXm (-2232

GTACïTTCCTGAGAïTGGCACAGT), HXm-NF 1dm2 (-2232

GTACiTïCCTGAGATITiGTACAGT). Oligo HXm-NF 1 dm2 contains, in addition to

the HXm mutation, a single mutation in the NF1 sequence; since it was used to mutate a

S a d A I fragment that already carried NFlml, it generated a triple mutant sequence. A 3-


bp tandem point mutation was also introduced into the AAAG core of the Barbie box of

the CYP2B2 promoter using oligo BBm (-94

AGTGAATAGCCAGCTCAGGAGGCGTGA). Deletion and point mutants were

subcloned by blunt-ended ligation into the EcoRV site of the non-PB responsive Ev

construct which contains 168 1 bp of the CYPZB2 5' flanking region cloned upstrearn of

the cat reporter of pBSCAT (9). The strategy employed to obtain deletions by Ba131

digestion and by amplification generated an additional 8-nucleotide sequence (5'-

GGGGGATC) or. for the deletions obtained with oligo HX, and additional 12-nucleotide

sequence (5'-GATCGGGGGATC), between the 3' end of the deleted portion of the 163-

bp Sau3AI fragment and the EcoRV site used for subcloning. The normal orientation and

integrity of the subcloned fragments in the reporter constructs were confirmed by DNA

sequence anal ysis.

Nuclear Ertracts and DNase I Footprinring Analyses-Nuclear extracts were

prepared (22) from pooled livers of two or three untreated or PB-treated (23) rats. Where

noted, nuclear protein extracts were fractionated by chromatography on heparin-

Sepharose using Hitnp Heparin columns (Pharmacia). The fragments used for DNase 1

footprinting analyses were prepared from pSa-Sa163, or from similar plasmids contdning

a mutated 163-bp Sail3AI fragment, by releasing a 230-pb fragment with EcoRI and EagI

digestions. After 3'-end-labeling using the Klenow fragment of E. coli DNA polymerase 1

or 5'-end-labeling using T4 polynucleotide kinase, the fragment was purified by

electrophoresis on a 5% polyacrylarnide gel. DNase 1 footprinting was performed (22) in

12.5 mM Hepes, pH 7.6,70 mM KCI, 3.5 rnM MgC12, 5 phi ZnS04, 1 m . EDTA, 5%

glycerol, 0.5 rnM NaMoo~, 0.075 mM Nonidet P-40, 0.5 mM DTT, 0.25 mM

phenyimethylsulfonyl fluonde containing 5 pg of poly (dI-dC). Reaction volumes were

typically 70 pl. Na2 P-glycerophosphate, when present, was at 10 to 20 rnM.

Chapitre IV: Caractirisation du PBR U 61

Functional Analysis of the 163-bp Sau3AI Fragment-Transfection analysis was

perforrned with sub-fragments of the 163-bp Sau3AI fragment to identify sequences

within it that might confer PB responsiveness. Sequential deletions from the 5' end up to

the intemal NcoI site (coordinate -2257) were ail active in conferring PB responsiveness,

although the response conferred by construct -2257/-2 155 was reduced by about two-fold

as compared to that of the full length fragment (Fig. 1 A, constructs with a common 3' end

point of -2 155 and 5' end points of -2290, -2283, -2273, -2264 or -2257). Funher deletion

from the 5' end, io an intemal RsaI site (coordinate -2230) or to -2180, led to complete

loss of activity (Fig. 1A). Similady, sequential 3' deletions up to -2207 were also active,

although the response conferred by constmcts -23 171-2 188 and -23 171-2207 was again

reduced by about two-fold as compared to that of the full-length fragment (Fig. lA,

constmcts with a common 5' end point of -23 17 and 3' end points of -2172, -2188 or - 2207). Further deletion from the 3' end. to the RsaI site (coordinate -223 1; Fig. IA) or to

-2753 (construct -2600/-2253; data not shown), led to complete loss of activity.

These results suggested that DNA sequence elements that are essential for PB

responsiveness are localized in the 51-bp central core between -2257 and -2207.

However, constmct -2257/-2208 was completely inactive (Fig. l), although its 5'

extremity is the same as that of the active -2257/-2155 construct and its 3'extremity is one

bp upstrearn of that of the active -23 17/-2207 construct. Since construct -22571-2207 was

also inactive (Fig. IB), the single bp difference at the 3' ends of the -2257/-2208 and - 23 17/-2207 constmcts does not account for the inactivity of the former. Hence, the central

core is insufficient by itself to elicit PB responsiveness.

Funcrional Evidence for an Accessory Element-The deletion analysis presented

above suggests the following mode1 to account for the PB responsiveness conferred by the

163-bp Sau3A.I fragment. A central core, together with an element or elements extending

upstream of coordinate -2257 or with an element or elements extending downstnarn of

Chapitre TV: Caractérisation du PBRU 62

t (10) Not Detectable

(3) Not Detectable

(a) Not Detectabte 1 1 1

! I 1 1 I 1 # I

% Wild Type PB Response

(2) Not Detectable

(2) Not Oetectable (3) Not Detectable

O 20 40 60 80 100


Figure 1: Functional analysis of the CYP2B2 163-bp Sau3A.I fragment.


coordinate -2207, can confer PB responsiveness. In support of this model, although

construct -2257f-2 188 was inactive, constmct -22571-2 172 was active in eliciting a PB

response (Fig. IB). This result indicated that there is a DNA sequence element between

coordinates -2188 and -2172 that confers PB responsiveness when combined with the

central core. The element between -2188 and -2172 is insufficient to elicit PB

responsiveness by itself, because it is present in the inactive -2230/-2 155 construct (Fig.

IA). Hence, it is an accessory site for confemng PB responsiveness, and we have

designated it as AFI (Figs. IB and 2).

Physicai Evidence for Proteins Bindhg io AFI and to Other Sites Within the 163-

bp San3AI Fragment-To ascenain whether an accessory factor binds to the AF1 site. as

well as to look for evidence of other protein-DNA interactions. the 163-bp Sau3AI

fragment was subjected to DNase i footprinting analysis using rat liver nuclear extracts.

First. the fragment was labeied on the lower strand at the 3'end (Fig. 3A). Analysis using

crude extract revealed a series of almost continuous footprints over some 85 bp extending

from about -2285 to about -2200 (Fig. 3A). Use of heparin-Sepharose-fractionated

extracts facilitated resolution of protected regions F1, F2, F3 and F4 within this segment:

protected region F2 was virtually undetectable with the fractionated extracts. whereas FI,

F3 and FJ remained visible (Fig. 3A). An additional protected region, FO, was revealed

after 5'end labeling of the lower strand (Fig 38). FO is also visible above the FI footprint

in Fig. 3A (crude extract lane). Protected regions Fl', F2' and F3: corresponding to F1,

F2. and F3 plus f4 respectively, were identified by labeling the 5' end of the upper strand

(Fig. 3C). Protected region FO' (corresponding to FO) is also evident above Fl ' in Fig. 3C.

The positions of the FO and FO' footprints overlap with the AFl site defined by

transfection analysis (Fig. 2).

Addition of PB to incubation mixtures did not appreciably change the footprints

obtained with cmde nuclear extracts of untreated rats (data not shown) or with a nuclear

extract partidly purified by heparin-Sepharose fractionation (Fig. 3A, lanes PB) and

similar footprints were generated by crude nuclear extracts from untreated and PB-treaied

rats (Fig. 3B and data not shown).

lr3 ' I Fa ' b

Sau3Al * 1 b i - - - - - - - - - .

TG GACACAACCT TCAAGAAGTG CACTTCAGTG ATTTCAGGCA CAGA

CTGTGTTGGA AGTTCTTCAC TAAAGTCCGT GTCT - - - - - - - - - - -

P l i 1 FO ' 1 1 b AP1 i

I - - - - L - - - - - - . v Sau3Al CTCTGT ACTTTCCTGA CCTTGGCACA GTGCCACCAT CAACTTGACT cl!-'I' GCCAGGCT0G G

GAGACA

I 1 Fl

- ro

Chapitre W: Caractérisation du PBR U 66

The 163-bp CYPZB2 Sau3AI Fragment is a Multicomponent Enhancer-The DNA

sequence of the 163-bp Sau3A.I fragment (13) (see also Fig. 2) reveals that it contains

putative recognition sites for several transcription factors, only some of which are shown

in Fig. 2. Potential regulatory motifs were identified by inspection and by application of

MatInspector (matrix similarity threshold, 0.85), a search tool for scanning DNA

sequences for matches to nucleotide distribution matrices for transcription factor binding

sites accessible in the TRANSFAC database (24). Immediately adjacent to a perfectly

symmetrical NF1 site (-22 17 TGGN7CCA) (25), previously identified (9,13), is a perfect

hexamer half-site (AGGTCA -2223, lower strand) for orphan members of the nuclear

receptor superfamily (26,271. We refer to the combined hexarner half-site and NF1 site

(Fig. 2) as the HX-N'FI complex. There are also, in an unusual evened repeat arrangement

with a 7-bp spacing (ER-7), two other AGGTCA sequences (coordinates -2282 to -2264)

(Fig. 2). In addition. between the intemal NcoI site and the HX-NF1 complex,

Matinspector finds on each strand a match to a glucocorticoid receptor binding site

(TRANSFAC matrix GR-Q6; coordinates -2244 to -2226 on the upper strand and -2246

to -2228 on the lower strand) (Fig. 2). The 5 1 -bp central core between -2257 and -2207

defined by the transfection analyses described above excludes ER-7 but includes the

candidate glucoconicoid receptor binding sites and most of the HX-NF1 complex.

The Fi and FI' footprints extend from -2230 to -2192, a region which includes

and extends beyond the HX-NF1 complex (Fig. 2). Most of the F1 footprint was

eliminated by a CTF/NFl consensus oligo cornpetitor (Fig. 3A. lane MI). Therefore, it is

caused in part at Ieast by an NF1 protein. The positions of F3F4 and F3'correspond to the

two halves of the ER-7 sites and both F3 and F4 were competed by oligo HX (Fig. 3A.

lane HX). Hence F3/F4 and F3' are presumably caused by protein(s) of the nuclear

receptor superfamily binding to the two halves of ER-7. No good candidates for the

protein(s) responsible for the F2 and F2' footprints are yet available.

The region of the FI' footprint was analyzed using varying amounts of nuclear

protein. At lower protein levels, a reduced protected region was observed with the wild-

type sequence. presumably as a result of binding of an NF1 protein, whereas at higher


protein levels, the footprint was extended in both directions (Fig. 4A). Similar results

were obtained with protein extracts from untreated and from PB-treated rats (Fig. 4A).

When a mutant sequence in which NF1 binding was abolished was analyzed, the extended

protection on the upstream side was still evident at higher protein levels (Fig. 4B). Thus,

the extended protection on the upstream side is due to binding of a protein or proteins to a

sequence including the nuclear receptor hexamer half-site. Consistent with this conclusion

is the observation that only a part of the F1 (Figs. 3A and SA) and the F1' (Fig 5B)

footprints were eliminated by competition with an NF1 consensus oligo.

PB responsiveness is reduced but not eliminated by mmrrtating either or both

elements of the HX-NFI cornplex-To investigate the role of the HX-NF1 complex in

conferring PB responsiveness, the NF1 site was mutated in two steps, first in the distal

ponion (NFlm 1 ; Fig. 6) and then in both the distal and proximal portions (NFldm3; Fig.

6). The N F l m 1 mutation created a new DNase 1 hypersensitive site at -2207 and modified

the FI footprint but did not abolish it; furthemore, the portion of the modified FI

footprint corresponding to NF1 sequences was eliminated by competition with an NF1

consensus oligo (Fig. SA). With the NFldmZ mutant sequence, the Fi ' footprint was

reduced to that seen with the wild type sequence in the presence of an NF1 consensus

oligo competitor (Fig. 5B). Hence, the NFldm2 mutation completely eliminated

detectable NF1 binding, but it left a footprint on the upstream side, corresponding to the

anticipated binding of a protein or proteins to a sequence including the nuclear receptor

hexamer half-site (Figs. 4B and 5B). Here, as elsewhere, identical results were obtained

using nuclear extracts prepared from livers of untreated and PB-treated rats (Fig. 5B).

The NF1 m 1 and NFldm2 mutations, as well as two additionai mutations of the

HX-NF 1 complex, HXm (mutated in the hexarner half-site) and HXm-NFldm2 (mutated

in the hexamer half-site and in M I ) , al1 reduced but did not abolish PB responsiveness

when tested by transfection analysis (Fig. 6). None of these mutations increased the basal

level of CAT activity (data not shown). These results demonstrated that both elements of

the HX-NF1 cornplex rnust be intact to elicit a maximal response to PB.

Chapitre iV: Caroctérisution du PBR U 68

Wild type

Figure 4: Analysis of the Fl' footprint with various amounts of protein.

Chapitre N: Caractérisation du PBRU 69

BS A

control

control

PB

PB

control

PB

Figure 5: Effect of mutations in the NF1 site on the FI and Fl ' footprints.

Chapitre IV: Caractérisation du PBR U 70

Mutation of a candidate glucocorticoid receptor binding site dramatically reduces

PB responsiveness-The consensus sequence for the glucocorticoid response element

(GE) is GGTACAnnnTGTTCT (28). The two candidate glucocorticoid receptor binding

sites found by MatInspector within the central core defined by transfection anaiysis

contain putative GREs, one of which, -2244 GGCACAgacTCTGTA on the upper strand.

matches the consensus at 7 of 12 positions. This sequence was mutated to

GGCGTGgacTCTGTA, thereby reducing the match to 4 of 12. This led to vimial

abolition of the PB response (Fig. 6). This suggests that a protein binding in the region of

the putative GRE is required to confer PB responsiveness.

Mutation of the CYP2B2 Barbie Box Does Not Affect PB Inducibility-It h a been

suggested that the Barbie box (29) is involved in confemng PB responsiveness on the rat

CYP2Bl and CYP2B2 genes (30). However, when the core sequence (5' AAAG 3') of the

CYP2B2 Barbie box was mutated, PB responsiveness was retained (Fig. 6).

Our previous work has shown thai an upstream enhancer element. located between

-23 17 and -2 155 in S'flanking region, confers PB responsiveness on the rat CYP2B2 gene

(9). This element is situated in the vicinity of a liver-specific DNase 1 hypersensitive site

in chromatin (10). Such sites are a hallmark of regulatory regions (31). Furthemore, in

transgenic rnice a rat CYP2B2 transgene including only the fkst 800 bp of the 5' flank was

not PB-inducible, whereas a transgene carrying 19 kb of 5' flank (and hence the -23 17/-

2 1 55 segment) was normally inducible (32). Furthemore, the experiments described in

our previous report (9) and in subsequent reports from two other laboratories (1 1,12), as

well as those described here, provide a strong body of evidence indicating that upstrearn

control elements confer PB responsiveness on the rat CYPZB2 and mouse Cyp2610 genes.

The mouse Cyp2610 active sequences are situated between -2426 and -2250 and display

91 % sequence identity to those of CYP2BZ (12). Particularly important in this context is

5'GGC gacTCTGTA-3' GREm 1 ACA- GTG )

% Wild Type PB Response NF1

I i ' HX t 1

CTTTCCTGACC TTGGCACAGTGCCACCATCAACl-rGACT l

GAAAGGACTGGAACCGTGTCACGGTGGTAGTTGAACTGA


the observation that generally similar results have been obtained in three different

laboratories using different experimental approaches and PB inducible CYPZB genes of

two different rodent species.

The results presented here, showing that at l e s t three and probably more sequence

elernents within the 163-bp Sau3A.I fragment are required to confer maximal PB

responsiveness, reveal the surprising complexity of this multicomponent enhancer.

According to the now classical model for steroid hormone action, the Iiganded receptor

binds to one or more response elements upstream of the target gene and acts as a

transcriptional enhancer (26). However, synergistic interaction of a variety of transcription

factors with steroid hormone response elements have been known for some time (33), and

in a number of genes several cis-acting elements function in concert to activate

transcription (34). The best studied such case is that of the rat PEPCK gene. Full

glucocorticoid induction of PEPCK transcription is rnediated by a complex GRU

consisting of two glucocorticoid response elements, as well as three accessory factor

binding sites (14.17). We originally referred to the CYP2B2 Sau3A.I fragment as a PB-

responsive element (9), but, in the light of its complexity, we now refer to it as a P B R U ~

(35). The homologous mouse CypZblO sequence has been terrned a module (12,36).

Proteins that can serve as accessory factors in the PEPCK glucocorticoid response include

hepatocyte nuclear factor-3 (16) and the orphan receptors chicken ovalbumin upstream

promoter transcription factor (COUP-TF) ( 1 5,17) and hepatoc yte nuclear factor-4 (HNF-

4) (15). The application of the PEPCK GRU model to PB regulation of CYP2B2 does not

imply that any particular recognition site is shared between the two response units, but

merely that PB induction of CYP2B2 requires interactions among multiple regulatory

proteins and cis-acting elements constituting a PBRU.

The essential element of the PBRU model then is that more than one sequence

element within the 163-bp SadAI fragment is required to confer PB responsiveness.

E. Trottier, S. Dubois, M.-H. Vachon, C. Stoltz, A. Belzil and A. Anderson, Xïth International Symposium on Microsornes and Drug Oxidations, Los Angeles, July 21 to 24,1996 (Absuact P-149).

Chapitre Nr Caractérisation du PBR U 73

From our results we conclude that a central core of the fragment, between coordinates - 2257 and -2207, is inactive alone, but c m confer PB responsiveness when combined

either with upstream or downstrearn accessory elements within the fragment. In support of

this hypothesis, one such accessory site, designated A H , has been locaiized between

coordinates -2188 and -2172. AFl presumably represents an accessory factor binding site.

The protein(s) responsible for the FO/FO' footprint may also be responsible for AFl

activity, since these footprints overlap with the AFI sequence.

The level of PB responsiveness of construct -2257/-2172 (Fig. IB) is essentially

the same as that of constmct -2257/-2155 (Fig. 1 A), and both are about two-fold lower

than the wild type -23 17/-2 155 constmct. This indicates that sequences between -2 172

and -2 155 are not essential for maximal PB responsiveness and, moreover, suggests that a

second accessory element may be present between -2317 and -2257. Since full PB

responsiveness is retained in 5' deletion constructs up to -2264, the putative second

accessory element mriy lie between -2264 and -2257. However, it is also possible that the

reduced responsiveness of the -2257/-2 155 constmct (and of the -22571-2 172 constmct) is

a consequence of partial inactivation of essential sequences at the 5' end of the central

core. Experiments are currently underway to resolve these issues. In any case. that the

absence of one (or the other) of the putative PBRU accessory sites but does not abolish

PB responsiveness is in accord with the effets of eliminating one of the PEPCK GRU

accessory sites on glucocorticoid responsiveness.

Our results indicate that the HX-NF1 complex is required for m ~ i m a l PB

responsiveness (Fig. 6). NF1 proteins are abundant, ubiquitous transcription factors (37),

different isoforms of which are products of a rnultigene family (38). The Ml consensus

binding sites are composed of two motifs, TGG and GCCAA, separated by a 6-bp or 7-bp

spacer, and the protein protects a 25-bp to 30-bp region surrounding this sequence from

DNase 1 digestion (25). An NF1 protein is clearly responsible for part of the FlIF1'

footprint and the role of NF1 is positive, because mutations which reduce (e.g., NFlml)

or abolish (e.g., NFldm2) NF1 binding reduce but do not abolish PB responsiveness (Fig.

6). This result is similar to that of Honkakoski and Negishi (12) with a different NF1

Chapitre N: Caractérisation du PBR U 74

mutation that reduced but did not eliminate PB responsiveness conferred by a sub-

fragment of the mouse Cyp2610 homolog of the CYP2B2 163-bp Sau3AI fragment. In our

hands, mutations of the nuclear receptor half-site element, as in HXm, or of both that

element and NF1, as in Mm-NFldm2, also reduce PB responsiveness, that is they have

similar effects to those of mutational inactivation of NF1 alooe (Fig. 6). In the mouse

CypZblO system, Honkakoski and Negishi (12) reported a more dramatic effect of such

mutations in reducing PB responsiveness. Hence, the HX-NF1 complex is clearly

essential for conferring maximal PB responsiveness.

The protein binding to the hexamer half-site creating the HX portion of the FI/Fl'

footprint is unknown, but there are several possibilities. inspection of the sequence

surrounding the HX-NF1 complex reveals a recognition site for the orphan nuclear

receptor, fetoprotein transcription factor (FTF) (22,39), and MatInspector finds a match to

recognition sites for three other orphan receptors. including COUP-TF and HNF-4.

Preliminary experiments have revealed binding of both HNF-4 (40) and FTl? to the

double-stranded HX oligo. Which of these or other proteins interacts functionally with the

HX-NF1 complex to elicit maximal PB responsiveness remains to be deterrnined.

The nature of the proteins responsible for the FO/FOT and F2/F?' footprints is

currently unknown. They are of particular interest because F2/F2' overlaps the central core

identified as essential for PB responsiveness whereas FO/FO' overlaps the accessory AFI

site.

The protein responsible for the F3-F4/F3' footprints is presumably a mernber of

the nuclear receptor superfarnily, because of the overlap with ER-7 site and because the

F3-F4 footprint is competed by the HX oligo containing the AGGTCA hexamer half site.

The ER-7 region is not required for PB responsiveness, so it is clearly not an essentiai

site, although it may be an accessory site. Similar conclusions were reached by

Honkakoski and Negishi (12) with regard to the corresponding Cyp2blO pB sequence.

C.Stoltz, L. Galameau, L. Bélanger and A. Anderson, unpublished results.

Chapitre IV: Caractérisation du PB R U 75

Our observation that mutation of a putative GRE leads to a major reduction in PB

responsiveness is particularly intriguing, as it raises the possibility that a glucocorticoid

receptor-like molecule may be involved in confemng PB responsiveness. The putative

PBRU GRE matches the GRE consensus at only 7 of 12 positions. Hence, like the GREs

forming part of the PEPCK GRU (14), it is not a typical GRE.

Much previous effort has been concentrated on promoter-proximal sequences,

particularly the Barbie box (29,30) and their possible role in confemng PB responsiveness

on the rat CYP2Bf and CYP2B2 genes. However. mutation of the Barbie box sequence in

the context of the CYP2B2 promoter and 5' flank does not affect PB responsiveness either

in rat hepatocytes transfected by injection in sitli (1 1) or in transfected prirnary nt

hepatocytes (Fig. 6). Hence. while promoter-proximal sequences are doubtless required

for basal transcriptional activity (9,36), there is at present no convincing evidence for their

invol vement in con ferring PB responsiveness.

The nucleotide sequences of the coding regions of CYP2BI and CYPZB2 are about

97% identical (41,42) and this extends over at least 1 kb of their 3'-flanking regions (43)

and over some 2.3 kb of their 5'-flanking regions (13.44). This, plus the fact that the

responses of liver CYP2BI and CYP2BZ to PB treatment are very similar (although the

basal level of CYP2B2 is somewhût higher than that of CYP2B 1 (45.46)). explains why

CYP2B I and CYPZB2 are sometimes treated as though they were a single gene (47'48).

Nevertheiess. there are striking di fferences in the tissue-speci fic expression of CYPZBI

and CYP2B2, most notably in lung where CYP2B2 is not expressed whereas CYP2Bl is

expressed constitutively but is not PB-inducible (46). Because the 163-bp Sau3Ai

fragment is similarly positioned and, except for a single nucleotide difference, identical in

sequence in CYP2BI and CYP2B2 (13,44) (see aiso Fig. 2), we will have to look

elsewhere to explain the differences between CYPZBl and CYP2B2 expression in the

lung. It seems likely that the CYP2B2 PBRU and CYPZBl PBRU are both inactive in the

lung. and that CYPZBI expression is tumed on because of the constitutive presence of

some other transcription factor, the activity of which depends on one of the subtie

sequence differences between the CYPZBl and CYP2B2 5'-flanking regions.

Chapitre IV: Caractérisation du PB R U 76

The molecular details as to how the presence of PB leads to activation of

transcription via the PBRU remain to be determined. However, a recent report of results

obtained by in vivo footprinting suggests that PB may modify the interaction of

transcription factors with the PBRU in chromatin (48). Aithough this provides further

support for the role of the PBRU in transcriptional activation, further characterization of

the proteins that bind to it will be necessary to elucidate the mechanism.

Ac>btowledgments-We thank Normand Marceau and members of his laboratory for

advice and access to facilities for isolating rat hepatocytes, Cul Séguin for carefully

reading the manuscript, Simon Labbé for advice on DNase 1 footprinting, Anne Belzil for

technical assistance, Pierre Paquin and Guy Langlois for photographie work, and Jacques

Côté, Josée Aubin and rnembers of the Luc Bélanger laboratory for advice.


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FIGURE LEGENDS

Figure 1: Functional analysis of the CYP2B2 163-bp Sau3AI fragment. Primary

hepatocytes were transfected in parallel with a plasmid containing the 163-bp Sau3AI

fragment (-23 171-2155) as a positive control and with plasmids containing sub-fragments

thereof, then incubated with or without 1 m M PB. Al1 transfections were performed in

duplicate. On the lefi, the line diagrams and sequence boundaries show the extents of the

various deletion fragments. On the right, CAT assay results are expressed as normalized

per cent increase after PB treatment, with the per cent increase obtained in a given

transfection using the wild type 163-bp Sau3AI fragment set at 100. Fold induction for the

wild type fragment varied from 3.8 to 10.7. White niimbers represent the number of

different rats used for hepatocyte preparations and the error bars are the standard error of

the mean. For constmcts where n = 2. the error bars are the range. For constnicts marked

"Not Detectable", one or more assays gave negative values of fold induction and for those

with positive values the average for al1 values in no case exceeded 4%. A. definition of the

central core between -2257 and -2207, delimited by the region between the two verrical

lines. ' ~ h e standard error of the mean for construct -23 17/-2 172 was 42. B. definition of

the AFI site.

Figure 2: DNA sequence of the CYP2B2 163-bp Sait3AI fragment. The DNA sequence is

from Hoffmann et al. (13), except that Our cloned sequence has three not four T residues

immediately 5' of nucleotide -2225 (vertical arrowhead). The sequence of the CYP2B2

fragment is identical to that of the corresponding CYP2BI fragment (44) except for a

single base difference at CYP2B2 nucleotide -2299 (mterisk), which is C in CYPZB2 and

G in CYPZBl. Protected regions on the upper and lower strands are shown by upper and

lower brackets respectively. The SadAI restriction sites and the intemal NcoI site are

boxed. Nuclear receptor hexarner half-sites in the ER-7 arrangement and forming part of

the HX-Ml complex are identified by horizontal arrows, the NF1 site is overlined, and

the sequence of the M l site is shaded. Candidate glucoconicoid receptor binding

Chapitre IV: Caractérisation du PBRU 8 1

sequences on the upper and lower strands are denoted by a dotred overline and a dotted

underline respectively. The central core sequence between -2257 and -2207 is delimited

by the region between the two vertical fines. Footprint coordinates on the lower strand

are: FO, -2 17 1 to -2 180; Fi, -2202 to -2234; F2, -2239 to -225 1 ; F3, -226 1 to -227 1 ; F4, - 2272 to -2285. Footprint coordinates on the upper strand are: FO', -2 171 to -2184; FI ', -

2 19 1 to -2229; F2', -2242 to -2257; F3', -2262 to -2283.

Figure 3: Binding of liver nuclear proteins to the CYPZB2 PBRU. DNase 1 footprinting

assays were perfonned as described under "Experimental Procedures". Protected regions

FO through F4 on the lower strand and Fl' through F3' on the upper strand are represented

by boxes. BSA denotes DNase 1 treatment in the absence of nuclear proteins. A, the

fragment was 3'-end-labeled on the lower strand and incubated with a heparin-Sepharose

fraction eluted at 0.7 M KCI (50 pg of protein) or with 100 pg of unfractionated nuclear

protein (denoted cnide extract) from untreated rats. +NFI and +HX denote the presence

of a 500-fold molar excess of the CTF/NFl consensus oligo or of the double-stranded HX

oligo cornpetitors respectively. and +PB denotes preincubation of fractionated proteins

with 4 rnM PB (left lane, 1.5 h on ice without the probe and right lane, 2h on ice with the

probe). Protected regions corresponding to proteins binding to the NF1 and ER-7 sites and

to the hexamer half-site, as detenined from Maxarn-Gilbert sequencing ladders (not

shown). are indicated by brackets labeled NFI, ER-7 and HX respectively. B, the

fragment was 5'-end-labeled on the lower strand and was treated with unfractionated

nuclear extract ( 100 pg of protein). G+A denotes the Maxam-Gilbert sequencing ladder,

and control and PB denote DNase 1 treatment with nuclear extracts from untreated and

PB-treated rats respectively. C, the fragment was 5'-end-labeled on the upper strand and

was treated with unfractionated nuclear extract ( 100 pg of protein), denoted control.

Figure 4: Analysis of the FI' footprint with various amounts of protein. DNase 1

footprinting assays were performed using unfractionated rat liver nuclear extract. The

fragment was 5'-end-labeled on the upper strand. Only the region of the F1' footprint is

shown. BSA denotes DNase I treatrnent in the absence of nuclear proteins, and control and

PB denote DNase 1 treatment with nuclear extracts frorn untreated and PB-treated rats


respectively. Brackets labeled NF1 and HX denote protected regions caused by proteins

binding to the NF1 site and to a sequence including the nuclear receptor hexarner haIf-site

respectively. A, the wild-type fragment was used. Incubations were performed in the

presence of 20 m M sodium fbglycerophosphate and the amounts of nuclear extract

protein per assay were 2.5 ,5 , 7.5, 10, 25, 50.75 and 100 pg. B, the fragment carrying the

NFldm2 mutation was used. Incubations were performed in the presence of 10 rnM

sodium P-glycerophosphate and the amounts of nuclear extract protein per assay were 2.5,

5-7.5, 10, 25,50, and 75 pg.

Figure 5: Effect of mutations in the NF1 site on the F1 and Fl' footprints. A, the wild-

type fragment or the fragment canying the NFlml mutation was ireated with

unfractionated nuclear extract (100 pg of protein) from livers of untreated rats. Fragments

were 3'-end-labeled on the lower strand. NF1 denotes the presence of a 500-fold molar

excess of the NF1 consensus oligo competitor. The position of the F1 footprint is shown

by a box, and HS at coordinate -2207 denotes a hypersensitive site. B. the wild-type

fragment or the fragment carrying the NFldm2 mutation was used. Fragments were 5'-

end-labeled on the upper strand. BSA denotes DNase I treatment in the absence of nuclear

proteins, and control and PB denote DNase 1 treatment with nuclear extracts (100 pg of

protein) from untreated and PB-treated rats respectively. NF1 denotes the presence of a

500-fold molar excess of the NF1 consensus oligo competitor. The position of the FI'

footprint is shown by a box and that of the footprint remaining after NF1 binding was

eliminated by cornpetition or mutation is denoted by a bracket labeled HX.

Figure 6: Mutations of CYP2B2 PBRU sequence elements reduce PB responsiveness, but

mutation of the Barbie box does not. Transfection experiments as well as analysis and

presentation of CAT assay results were as described in the legend to Fig. 1. DNA

sequences within the shaded panel at lefi represent the wild type F1' protected region,

denoted WT, and various mutants of the HX-NF1 complex as shown. The mutated

venions of the putative GRE and of the Barbie box are also shown at lefr as well as their

sequence coordinates. For al1 mutant sequences, the upper strand is shown and


substitutions in the wild type sequence are underlined. The FI' protected sequence is

shown in double-stranded form at the bottom. Brackets labeled HX and NF1 delimit the

footprints attributed to proteins binding to the hexamer half-site and to the NF1 site

respec tively.

LE SITE CONSENSUS POUR LA PROTÉINE NF1 ET L'HEXAMERE AGGTCA QUI LE CHEVAUCHE

AGISSENT TOUS DEUX EN ÉLEMENTS ACTIVATEURS DE L'INDUCTION PAR LE PHÉNOBARBITAL DE

CYP2B2

Ce chapitre a fait l'objet d'un article intitulé: «Régulation positive de l'unité de réponse au phénobarbital de CYP2B2 du rat par le complexe formé d'un site pour la protéine NF1 (aNuclear Factor ln) et d'un hexamère reconnu par les récepteurs nucléaires». Il a été rédigé par le Dr Alan Anderson et moi-même et a été publié en 1999, dans la revue Biochern Pharmacol 57, 1073-1076.

Chapitre V: NF1 et HX sont des sites activateurs et accessoires 85

L'activation transcriptionnelle du gène CYP2B2 du rat par le phénobarbital (PB)

est assurée par l'interaction de plusieurs composants nucléotidiques au sein d'une unité cie

réponse au PB (ou PB RU). Un site consensus pour la protéine NF 1 («Nuclear factor 1 ») et

l'hexamère AGGTCA qui le chevauche constituent l'un de ces composants. Il est présent à

la fois dans le PBRU de CYP2B2 du rat et dans la séquence correspondante du gène

CypZblO de la souris. Les analyses de mutagenèses dirigées puis de transfection dans des

hépatocytes en culture primaire indiquent que le site AGGTCA agit en élément positif

chez le rat alors qu'il serait un élément négatif chez la souris. Afin d'exclure la possibilité

que ces divergences fonctionnelles soient reliées aux différences de mutations introduites

dans l'hexamère de ces deux espèces, le site AGGTCA du PBRU du rat est modifié de la

même façon que la séquence de CypZblO de la souris. Cette mutation réduit mais n'abolit

pas le pouvoir inducteur du PBRU. De plus, aucune augmentation du niveau basal

d'activité n'est constatée. Quant à la mutation de l'élément NF1 e n ses deux demi-sites

consensus, elle réduit mais n'abolit pas non plus la réponse au PB. Ainsi le site consensus

pour NF1 et l'hexamère AGGTCA agissent en éléments accessoires, uniquement

nécessaires pour une induction maximale de CYP2B2 par le PB et les protéines qui s'y

fixent sont des activateurs de la transcription de ce gène chez le rat.


POSITIVE REGULATION OF THE RAT CYP2B2 PHENOBARBITAL

RESPONSE UNIT BY THE NUCLEAR RECEFTOR HEXAMER HALF-

S1TE.NUCLEA.R FACTOR 1 COMPLEX

Catherine Stoltz and Alan ~nderson'

CENTRE DE RECHERCHE EN CANCEROLOGIE DE L'UNIVERSITÉ LAVAL, PAVILLON

LHÔTEL-DIEU DE QUÉBEC, CENTRE HOSPïïALIER UNIVERSITAIRE DE QUÉBEC, QUÉBEC

G 1 R 216 CANADA AND DEPARTEMENT DE BIOLOGIE, UNIVERS~TÉ LAVAL, QUÉBEC G 1 K

7P4 CANADA

Running title: Positive regulation of CYP2B2 phenobarbital response unit

' Corresponding author: Dr. Alûn Anderson, Centre de recherche, L'Hôtel-Dieu de

Québec, 1 1 côte du Palais. Québec, Canada G 1 R 276. Tel.: 4 18-69 1-5548; Fax: 4 18-69 1 -

5439; e-mail: Alan.Anderson @ bio.uIaval.ca.

§Abbreviations: CYP, cytochrome P450; PB, phenobarbital; NFl, nuclear factor 1; oligo,

oligodeoxyribonucleotide; CAT, chloramphenicol acetyl tnnsferase; HNF-4, Hepatocyte

nuclear factor-4; and FTF, fetoprotein transcription factor.

STrottier E, Dubois S, Vachon M-H, Stoltz C, Belzil A and Anderson A, Functional

analysis of a muliicomponent enhancer conferring phenobarbital responsiveness on the rat

CYP2B2 gene. In: XIth International Symposium on Microsornes und Drug Oxidations,

p.200. Los Angeles Organizing Cornmittee, Los Angeles, CA, 1996.


A distai 163-bp fragment mediates phenobarbital responsiveness of the rat

CYP2B2 gene. Multiple cis-acting elements in this fragment cooperate to form a

phenobarbital response unit (PBRU). A nuclear factor 1 binding site and an rissociated

nuclear receptor hexamer half-site are present in both the rat CYP2B2 PBRU and the

homologous mouse CypZblO sequence. Based on mutational analyses, the hexamer half-

site has been reported to act positively in CYP2B2 and negatively in Cyp2610. However,

the specific mutations introduced into the rat and mouse hexamer half-sites were

different, raising the possibility that the different roles attributed to the element may be a

consequence of the different mutations used. We introduced into the rat CYP2BZ hexamer

half-site the specific mutational change previously introduced into the CypZblO sequence,

where its effect was to increase the basal level of expression and to abolish phenobarbital

responsiveness. In the rat context. this mutation reduced but did not abolish phenobarbital

responsiveness and decreased, rather than increased, the basal level of expression. The

residual phenobarbital responsiveness of the hexamer half-site mutant, as well as that of

nuclear factor 1 mutants, indicates that these elements behave as positive accessory sites,

suggesting that factors binding to them function as activators of phenobarbital-dependent

transcription.

KEY WORDS. CYP2B2, phenobarbital response unit; nuclear receptors; positive

regulation; nuclear factor 1 ; accessory site


t Many CYPs are selectively inducible by xenobiotic compounds. For example.

CYPIAI is induced by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin and stmcturally sirnilar aryl

hydrocarbons [l], and the rnechanism by which this occurs has been characterized in

detail [2]. Progress has also been made toward understanding the molecular mechanism

underlying inducibility of the homologous rat CYPZBZ and mouse Cyp2bIO genes in

response to PB [3-81.

We identified a 163-bp Sau3A 1 fragment in the CYP2B2 5'-flanking region that

confers PB inducibility on a car reporter gene [3]. The Sau3AI fragment, at coordinates

-23 171-2 155 has the properties of a transcriptional enhancer [3]. Further analysis of the nt

163-bp Sau3A 1 fragment led us to conclude that it contains a PBRU [6,9,$] whereas the

homologous mouse Cyp2b IO sequence has been tenned a module [5, IO]. Our dissection

of the CYP2B2 163-bp Sau3AI fragment revealed. notably, that an NF1 binding site and

an associated nuclear receptor hexamer (HX) half-site, AGGTCA, are essential for

maximal PB responsiveness, such that the mutation of either or both of the HX or NF1

sites decreases PB inducibility [6 ] . However, these mutations do not totally abolish the PB

response, implying that, in the rat CYPZB2 PBRU, the two components of the HX-NF1

complex play the role of accessory elements. in contrast, Honkakoski and Negishi [5]

reported that in the homologous mouse CypZblO sequence, mutation of the equivalent HX

site (therein referred to as the Nr site, but hereinafter referred to as the HX site) abolished

PB responsiveness. Furthemore, a 221% increase in the basal level of expression was

observed, suggesting that in the mouse system a nuclear receptor-like factor that binds to

the HX site acts as a repressor of PB responsiveness [5] . Results from other laboraiories

with both the rat CYP2B2 PBRU [8] and the mouse Cyp2610 sequence [5] suggest that

NF1 is an activator.

Hence. results obtained to date suggest that a protein(s) binding to the HX portion

of the HXWI complex act as an PB-dependent activator in the rat CYP2B2 gene and as a

repressor in the homologous Cyp2b10 gene. However, the specific mutations introduced

into the rat and mouse HX sites were different [7,8], which raises the possibility that the

different roles attributed to the element may simply be a consequence of the different

Chapitre V: NF1 et HX sont des sites activuteurs et accessoires 89

mutations used. a possibility that must be taken seriously. given that the LS6 mutation of

Liu et al. [8] changed two bases of the HX site. yet was without apparent effect on PB

responsiveness. We report here results of expenments designed to test this possibility by

introducing the same HX mutation into the CYP2B2 PBRU as had previously been

introduced into the homologous mouse Cyp2610 sequence followed by transfection

analysis of its effects on PB responsiveness.

5.2.2 MATERIALS AND METHODS

Rat hepatocytes were isolated. cultured, transfected and treated with PB as previously

described [6] , except that Matrigel was omitted. CAT activity was assayed by the method

of Gorman et al. [ I l ] . The following oligos were synthesized by Life Technologies:

NF 1 dm3, 5'-ACTTTCCTGACCITTTC ACAGTGCTTCCAT-3'; and HXm2. 5'-

ACTCTGTACTTTCCTCTGGTTGGCACAGTGCCACCA-3'. Substitutions in the wild-

type sequence are indicated by bold characters. To generate the construct HXm2, the pSa-

Sa163 plsrnid [fi] was mutated using the oligo HXm2 and the Altered Sites JI in Vitro

Mutagenesis System (Promega). To generate the double mutant NFldrn3, we used a

mutant pSa-Sa163 plasmid which already carried a mutation in the distal motif of the NF1

consensus sequence (NFlml ) [8] and the oligo NFldm3. The fragments carrying the

mutations were then subcloned into the non-PB responsive Ev construct, which contains

168 1 bp of the CYPZBZ 5' flanking region cloned upstrearn of the CAT reporter of pBScat

[3]. The normal orientation and integrity of the subcloned fragments in the reporter

constructs were confined by DNA sequence analysis.

5.2.3 RESULTS AND DISCUSSION

As previously mentioned, based on mutational analyses, the HX half-site seems to

act positively in rat CYP2B2 and negatively in mouse Cyp2blO. To determine whether

this apparent difference might be due to the different mutations introduced into the rat and

mouse sequences, we generated an HXm2 mutant which carries the exact 4-bp subtitution


(AGGTCA + ACCAGA) introduced into the mouse half-site [5]. As we found

previously with the HXm and HXm-NFldm2 mutations [6], the HXm2 mutation reduced

but did not abolish PB responsiveness (Fig. 1). Furthemore, there was no increase, but

rather a decrease, in the basal level of CAT activity (Fig. 2), suggesting that the factor(s)

binding to the HX site act as an activator(s) in the rat PBRU.

The perfectly symrnetncal binding site for NF1 (-2217 TGGCACAGTGCCA or

TGG NICCA) in the 163-bp PBRU is predicted to be a high affinity NF1 recognition site

[12]. In out previous work [6], we constructed a mutant, NFlml, with tandem base

substitut ions in the distal NF 1 half-si te (TGGCACAGTGCCA + TGGCACAGTGCTT),

and from this derived a double mutant, NFldm2, with an additionai substitution adjacent

to the proximal half-site (TGGCACAGTGCTT + TGGTACAGTGCTT). Transfection

analyses of the NFlml and NFldm2 mutants revealed that PB responsiveness was

reduced but not abolished [6] . To test the possibility that the residual PB responsiveness

conferred by the NFldmZ mutant sequence is due to the intact 5' TGG half-site, we

generated NF 1 dm3 (TGGCACAGTGCTT + TTTCACAGTGCTT). Hence, in NF 1 dm3.

both the 5' NF1 half-site, which is known to be of major importance for the binding

affinity of NF1 [13], and the 3'half-site, were modified. Transfection analysis of NFldm3

reveded that, as for the NFlml and NFldm2 mutants tested previously [6], PB

responsiveness was reduced but not abolished (Fig. 1). Taken together, these results

indicate that NF1 is an accessory factor in the PB induction of the rat CYP2BZ gene.

The results presented here, in accord with those presented previously, indicate that

NF1 acts positively to assure PB-dependent transcription of the rat CYP2B2 [6,8] and

mouse CypZblO [SI genes. The situation with respect to the role of the HX nuclear

receptor half-site is less clear. According to the model of Honkakoski and Negishi [7], a

protein binding to or in the region of the HX site acts as a transcriptional repressor. This

model was based on the observation that in the Cyp2610 system, the precise equivalent of

the HXm2 mutation led to an increase in basal level accompanied by an abolition of PB

responsiveness. According to the results presented here, however, the HXm2 mutation

Chapitre V: NF1 et liX sont des sites activareurs et accessoires 91

-2229 -2191

CITCCTGACCTTGGCACAGTGCCACCATCAACTTGACT

O 20 40 60 80 100


Figure 1: Effects of mutation of either NF1 or HX on PB rrsponsiveness.

Chapitre V: NF 1 et HX sont des sites activateurs et accessoires 92

Figure 2: Effect of the Mm2 mutation on basal levels of CAT activity

Chapitre V: NFI et HX sont des sites activateurs et accessoires 93

reduces the basal level and diminishes but does not abolish PB responsiveness. Hence, in

the rat CYP2B2 gene, protein(s) binding in the region of the HX site appears to act as a

transcriptional activator(s) rather than a repressor(s). The reasons for the apparent

discrepancy in the role of the HX sequence between the otherwise very similar CYP2B2

and Cyp2blO genes are not entirely clear, but they may be related to differences in the

conditions of hepatocyte culture, to subtle species differences in sequence outside the

HX-NF1 complex, or to use of the homologous promoter for the analyses of CYP2B2 and

of a heterologous tk promoter for the analyses of Cyp2blO. It is notewonhy however, that

the replacement of six nucleotides. including one in the HX site, in Cyp2blO by

comesponding nucleotides of Cyp2b9 (which is not PB inducible) resulted in loss of PB

responsiveness, but no increase in basal level [5 ] . This suggests that even in the mouse

Cyp2610 gene, the role of HX as the site of action of a repressor is not unarnbiguous.

Multiple sequence elements cooperate to form the CYP2B2 PBRU, and one such

element, AFl, has been identified and localized [6]. According to the results presented

here, both elements of the HX+JF1 complex act as accessory sites necessary for maximai

PB responsiveness of the rat CYP2B2 gene and therefore factors binding to them [6]

shouid function as activators of PB-dependent transcription.

The nature of the proteins that interact functionally with the HX site to elicit

maximal PB responsiveness remains to be detemined, although both the orphan nuclear

receptor, FïF [14,15], and HNF-4 bind to a double-stranded oligo containing the HX

sequence [6] . When primary cultures of rat hepatocytes were cotmsfected with the wild

type CAT reporter plasmid and expression vecton for FTF and HNF-4, no increase in PB

responsiveness was observed with the FTF expression vector, and a modest 2-fold

increase was observed with the HNF-4 expression vector (data not shown). Further

experirnents will be required to clarify the role of FTF, HNF-4, NFl, and other proteins

binding to the HX-NF1 complex in the activation of PB-dependent transcription of

CYP2B2.

Chapitre V: NF1 et H X sont des sites activateurs et accessoires 94

This work was supported by the Medical Research Council. We thank Eric Trottier for

careful reading of the manuscript. Pierre Paquin and Guy Langlois for photographie

work. Frances Sludek for the H M cDNA, and Luc Beianger for the FTF expression

vector.

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~ G U R E LEGENDS

Figure 1: Effects of mutation of either NF1 or HX on PB responsiveness. Pnmary

hepatocytes were transfected in parallel with the standard CAT reporter plasmid

containing the 163-bp Sau3AI fragment (-23 171-2155) as a positive control or with

plasrnids containing NFldm3 or HXm2 mutants as shown, and then incubated with or

without 1 mM PB. Al1 transfections were perforrned in duplicate. On the nght, CAT assay

results are expressed as normalized percent increase after PB treatment, with the percent

increase obtained in a given transfection using the wild type 163-bp Sau3AI fragment set

at 100. White numbers represent the number of different nts used for hepatocyte

preparations and the error bars are the standard enor of the mean. DNA sequences at left

represent the wild type Fl ' protected region [6], denoted WT, and the NFldm3 and HXm2

mutants as shown. For al1 sequences, the upper strand is shown and substitutions in the

mutant sequences are underlined.

Figure 2: Effect of the HXm2 mutation on basal levels of CAT activity. Results of a

representative series of CAT assays with a single preparation of hepatocytes for the

HXm2 mutant are shown. In these assays, the average CAT activity levels (counts per

minute per microgram per hour) without and with PB were 52.4 and 346.4. respectiveiy,

for the wild type and 37.2 and 76.3, respectively, for the HXm2 mutant.

Les cinq principaux résultats de ce travail sont: i) la démonstration que le fragment

de 163 pb. responsable de la réponse au PB de CYP2B2, est un activateur transcriptionnel,

fonctionnant indépendamment de son orientation et de la distance qui le sépare d'un

promoteur hétérologue (Article 1, Chapitre III); ii) la mise en évidence, par transfection de

mutants dans des hépatocytes en culture primaire. de l'absence d'un rôle quelconque pour

la boîte Barbie dans la réponse au PB du gène CYP2B2 (Article II, Chapitre IV); iii) la

mise en évidence, par des expériences d'empreintes à la DNase 1, que le fragment de 163

pb est reconnu par des protéines sur une bonne partie de sa longueur (Article II, Chapitre

N); iv) I'implication de deux sites activateun et accessoires, NF1 et HX. afin que

l'amplificateur transcnptionnel fonctionne pleinement (Article II, Chapitre IV et Article

DI, Chapitre V); v) l'apport des premières données de mutagenèse suggérant Ir

participation d'un autre site activateur en 5' de HX et NF1 (Article II, Chapitre IV).

Dans ce qui suit. nous commenterons de façon plus détaillée chacun de ces points.

il est à noter qu'ils sont placés dans le contexte plus général des progrès réalisés ces

dernières années par diverses équipes, dans la compréhension du mode d'action du PB.

Chapitre VI: Conclusions et Perspectives 98

i) Le fiagrnent de 163 pb est un activateur transcriptionnel.

dépendant du PB

L'objectif de la première partie du présent travail était de démontrer que le

fragment de 163 pb, situé entre 2155 et 2317 pb du tsp du gène CYPZB2, répondait à la

définition d'un amplificateur transcriptionnel. Éric Trottier avait démontré qu'il activait la

transcription du gène rapporteur cat en présence des 168 1 premières pb (inactives) de la

région régulatrice en 5' de CYP2B2 (construction Ev-car). Le fragment de 163 pb devait

cependant se soumettre à d'autres critères. ii fallait s'assurer qu'il constitue une entité

fonctionnelle, capable d'agir en absence des 1681 pb. Plus généralement, il devait

conserver son pouvoir inducteur lorsqu'il était abouté à un promoteur hétérologue, le

promoteur de la thymidine kinase (tk) du virus de l'Herpès simplex (HSV). et ceci, quelles

que soient son orientation et la distance qui le séparait de ce promoteur. Ainsi, dans

l'Article 1. nous avons démontré que dans les hépatocytes en culture primaire, seules les

constructions plasmiques contenant le fragment de 163 pb, placé en 5' ou en 3' de tk-car et

en orientation directe ou inverse (constmctions A, B. C, D), répondaient à un traitement

au PB. L'induction de I'activité CAT variait d'un facteur de 2.7 à 8'8, selon la position de

ce fragment d'ADN par rapport au promoteur tk. Ainsi, il semblait plus efficace lorsqu'il

était placé à distance du promoteur hétérologue, plus précisément à 2929 pb de tk-cat

(constructions C et D) [15]. Au terme de l'ensemble de ces travaux, l'élément était baptisé

PBRE ou dément de réponse au PB».

L'équipe Kemper 1211 confirmait, par une méthode distincte de la transfection

dans des C U ~ N ~ ~ S primaires d'hépatocytes, que le PBRE pouvait activer un promoteur

hétérologue. Ces chercheurs greffaient l'amplificateur transcriptionnel de CYP2B2 à

diverses longueurs de séquences régulatrices en 5' de CYPZCI, un gène inductible par le

PB. Ils injectaient directement dans un lobe de foie de rat («injection in situ») ces

constructions plasmiques, contenant egalement le @ne rapporteur luc (luciférase). Après

l'intervention, ils traitaient ou non le rat au PB et le sacrifiaient 24 h après. Alors que 272


pb et 3500 pb de régions 5'-flanquantes de CYP2CI ttaient sans effet sur l'activité LUC,

l'ajout du PBRE en amont de ces différents segments nucléotidiques induisait l'activité

LUC de façon significative. Cette dernière était. là encore, indépendante de l'orientation

du PBRE et qui plus est, proportionnelle au nombre de copies ajoutées [2 11.

Par la suite. Honkakoski et Negishi 1221 constataient que le gène Cyp2610. un

gène inductible par le PB et le TCPOBOP dans le foie de souris, possédait une séquence

de L7? pb, identique à 9 1 % au PBRE de CYPZBZ. Elle était localisée en région distale,

entre 2250 et 2426 pb en amont du tsp. Cette séquence détenait, vis-à-vis des promoteurs

hétérologues de SV40 (<<sirnian virus 40») et HSV, les mêmes propriétés d'activateur

transcriptionnel dépendant du PB, qui ont été attribuées au PBRE [22].

Ce premier travail permettait donc de démontrer que le fragment de 163 pb

conservait un pouvoir intrinsèque d'activation de la transcription en présence de PB.

quelle que soit la nature du promoteur auquel i l était jumelé. Il possédait donc les

propriétés d'un amplificateur transcriptionnel. Cette conclusion rejetait ainsi la possibilité

qu'il ait un effet amplificateur général sur des éléments de réponse au PB (notamment la

boite Barbie) localisés dans le promoteur de CYP2B2.

ii) La boite Barbie n'est pas requise pour une induction par le PB du

géne CYP2B2

La boîte Barbie est. rappelons-le, la séquence la plus populaire du promoteur de

CYPZBl et CYPZB2. Selon l'équipe F U ~ C O ~ elle remplirait un rôle d'activateur

transcriptionnel dépendant du PB [17]. Le résultat dTÉric Trottier, montrant que les 1681

premières pb de la région régulatrice de CYP2B2 étaient inactives, s'opposait à un rôle des

régions proximales dans la réponse au PB. En réalité, les résultats du laboratoire

appuyaient plutôt les conclusions de Ramsden et ses collaborateurs 1861 sur les animaux

transgéniques qui, comme nous l'avons souligné dans la Revue Bibliographique,

excluaient les 800 pb en amont du fip de CYP2B2 de la régulation de I'expression


dépendant du PB de ce gène. Ils impliquaient plutôt des séquences nucléotidiques entre

800 pb et 19 kb du tsp. Des études plus récentes de la même équipe (datant de 1999)

réduisent d'ailleurs la région critique à l'induction par le PB à 800 pb, situées entre 2500 et

1700 pb du tsp de CYP2B2 [ 1041.

A la lumière des résultats obtenus au laboratoire d'accueil, il était donc clair que la

boîte Barbie n'était pas un amplificateur transcriptionnel activé par le PB. Cependant,

cette séquence était présente dans toutes les constructions réalisées au laboratoire

d'accueil, lesquelles renfermaient les 1681 premières pb de CYP2B2. il n'était donc pas

illogique de penser que sa présence puisse éventuellement amplifier la réponse au PB du

PBRE. Afin de tester cette hypothèse, la stnicture centrale («tore>,) de la boîte Barbie était

mutée dans le luboratoire d'accueil. Les transfections d'une construction, contenant le

PBRE et les 1681 premiéres pb de CYP2B2 avec la boîte Barbie mutée (construction

BBm) en amont du gène cat. étaient effectuées dans le cadre de la présente thèse (Article

II, Chapitre IV). La réponse au PB était conservée pour la construction BBm. La boîte

Barbie ne jouait donc aucun rôle dans l'activation transcriptionnelle de CYPZB2 par le PB.

Cette conclusion rejoignait celle de l'équipe Kemper, qui réalisait le même type

d'expériences en transformant la boîte Barbie de CYPZBI et ne constatait aucune

modification de la réponse au PB du gène Iuc [2 11.

La controverse, dont nous faisions mention dans la Revue Bibliographique,

entourant la fonction des régions proximales de CYP2BI et CYP2B2, en particulier celle

de la boîte Barbie, contrastait avec l'unanimité à convenir d'un rôle pour une région

distale. Pour la première fois en effet, trois équipes s'accordaient pour reconnaître un rôle

d'activateur transcriptionnel à un élément défini dans la région 5'-flanquante de CYP2B2

et présent aussi chez CYPZBl et CypZblO, et ceci quels que soient le mode de transfection

employé et l'espèce considérée (souris ou rat) [15,2 1,221. Notons qu'une partie de cet

élément a également été localisée chez CYP2B6 de l'humain, vers 1700 pb du tsp [105].

Aucun autre PBRE ou élément présentant une forte identité de séquence avec le PBRE

n'a été trouvé chez les autres gènes inductibles par le PB, qui appartiennent aux sous-

familles 2A, 2C ou 3A [22, recherche sur la base de donnkes BLAST].


De façon générale, les amplificateurs transcriptionnels n'ont pas de localisation

préférentielle. Ils peuvent être situés en 5' comme en 3' du gène et en position proximale

ou distale. Cette dernière position a été constatée pour un grand nombre de gènes,

exprimés dans le foie ou ailleurs [106]. De plus, les activateurs transcriptionneis peuvent

également être constitués en des unités, où plusieurs sites régulateurs sont reconnus par

des protéines dont l'action se combine pour assurer une expression génique spécifique au

tissu [106]. L'étape suivante du travail de la présente thèse allait contribuer à établir que

cette propriété s'appliquait aussi au PBRE. Le PBRE devenait ainsi, au fil des travaux, un

PBRU ou unité de réponse au PB. Dans la suite du Chapitre, nous emploierons

uniquement le terme PBRU. Quant au qualificatif PBREM. ou module de réponse au PB,

i l a été choisi par l'équipe Negishi pour désigner I'activateur transcriptionnel du gène

Cyp2blO de la souris. Comme nous le verrons plus loin, elle le réserve maintenant B une

séquence plus courte (d'une longueur de 5 1 pb) du fragment de 177 pb.

iii) La caractérisation du PBRU

Le PBRU s'étendait donc sur 163 pb. 11 était protégé sur près de 85 pb (de 2200 à

2285 pb) d'une digestion in vitro à la DNase 1. Quatre empreintes (FO à ~ 3 ) ' étaient

identifiées dans le cadre de cette thèse. Aucune d'entre elles ne présentait de différence,

que l'expérience soit réalisée avec des extraits protéiques nucléaires de foie de rats

témoins ou de rats traités au PB. Cette observation était d'ailleurs partagée par l'ensemble

des équipes ayant effectué des analyses in vitro d'interactions protéines-ADN

[22,104,107]. Elle suggérait que les facteurs de transcription se fixant à l'ADN et requis

pour l'induction de CYP2B2 par le PB étaient tous présents. à la même concentration,

dans le noyau de I'hépatocyte non traité.

Notons brièvement que seules, les expériences d'empreintes in vivo, réalisées par

Kim et K e m p [107], révélaient des changements importants dans une région du PBRU,

suite ii un traitement au PB de noyaux d'hépatocytes de rat. Le PB semblait donc affecter

'Les empreintes F3 et F4 sont consid6rks comme une seule empreinte, appelde F3.


la structure chromatinienne du PBRU. L'équipe Kemper proposait plusieurs modèles

[107,108], notamment celui où toutes les protéines impliquées dans l'induction des gènes

CYP2B étaient capables de s'attacher à l'ADN en absence de barbituriques. L'ajout de PB

entraînait un remodelage de la chromatine qui permettait ensuite le recrutement de

protéines supplémentaires, la substitution de corégulateun négatifs par des corégulateun

positifs ou enfin un changement conformationnel des protéines, qui devenaient dors

actives [107].

Cependant, à la lumière de nos résultats d'empreintes in vitro, il n'était pas

possible de désigner une région du PBRU qui soit plus particulièrement la cible du PB. Le

principal objectif du travail de caractérisation du PBRU était alors d'identifier. par

mutagenèse, la ou les séquences critique(s) pour l'induction par le PB de CYP2B2.

i ~ ) Les sites NF1 et HX sont requis pour une induction maximale de

CYP2B2 par le PB

Une des quatre empreintes identifiées était fortement protégée. quelle que soit la

concentration d'extraits utilisée. Elle couvrait une séquence de type TGGC(Ns)GCCA.

considérée, de part sa parfaite symétrie, comme un site de très haute affinité pour NFl,

une protéine abondante dans le foie [go]. Étant donné sa distribution ubiquiste dans les

tissus de mammifères, sa présence constitutive dans le tissu hépatique et dans les lignées

cellulaires [92], il était peu probable que la protéine NF1 explique à elle seule une

induction par le PB, qui est essentiellement restreinte au foie et absente dans les lignées

cellulaires. Cependant NFI a déjà été décrit comme un cofacteur, agissant de concert avec

d'autres protéines pour contrôler l'expression de certains gènes [IO!?, 1 101. Afin d'évaluer

le rôle de ce t'acteur dans l'induction de CYPZB2 par le PB, son site de reconnaissance

était muté. Plusieurs modifications devaient d'ailleurs être introduites afin d'en abolir

l'attachement de N'FI. Testée en transfection dans les hépatocytes en culture primaire,

l'ultime mutation (NFldm2) de cet élément entraînait une perte substantielle de la

réponse au PB. La protéine NF1 se comportait donc en activateur. Une activité CAT

Chapitre VI: Conclusions et Perspectives 1 03

résiduelle persistait cependant, suggérant que la protéine était importante pour que le

PBRU conserve l'intégralité de son pouvoir inducteur mais qu'elle n'était pas critique

pour la réponse au PB. Des séquences supplémentaires devaient intervenir.

Lorsque l'attachement de la protéine NF1 à son site était aboli, les expériences

d'empreintes à la DNase 1 mettaient en lumière la présence dune deuxième région

protégée. à cheval sur le site NF1. Elle couvrait un demi-site de type AGGTCA, appelé

HX (ou Nr et NRlb chez la souris). Certains récepteurs orphelins. comme par exemple

HNF4, susceptibles de reconnaître une séquence formée en partie par ce demi-site ont été

impliqués dans l'activation transcriptionnelle de nombreux gènes exprimés

spécifiquement dans le foie [98]. Ainsi. les expériences de mutagenèse de HX puis de

transfection de la construction de 163 pb modifiée en HX devaient nous informer sur le

rôle de ce site au sein du PBRU. Elles établissaient que le site HX était requis, au même

titre que le site NFI, pour une induction maximale de l'activité CAT mais n'était pas

crucial il la réponse au PB. Cette conclusion était appuyée par le fait qu'une mutation

conjointe de HX et NF1 n'abolissait pas l'induction de l'activité CAT. De plus. la ou les

protéines, qui s'y Fixai(en) t, agissai(en)t en tant qu'activateur(s) (Article II, Chapitre IV).

Liu et ses collaborateurs [1 I l ] analysaient le fragment de 163 pb de CYPZB2 par

la méthode d'injection in situ, mentionnée précédemment [2 11. ils ne reconnaissaient

aucun rôle à HX. Ils modifiaient 2 pb de la séquence consensus et ne constataient aucune

altération de la réponse au PB (le site AGGTCA devient AGGgtA; mutant LS6). Quant au

site NFI, son rôle demeurait ambigu. Les conclusions de l'équipe Kemper changeaient en

effet selon que les transfections étaient effectuées avec une copie ou trois copies des

mutants Ml. Ainsi, le site passait respectivement d'un rôle d'élément indispensable à

l'induction par le PB, sa mutation abolissant la réponse au PB, 2i celui de site accessoire,

dont la mutation réduisait I'induction de l'activité CAT mais ne la supprimait pas. Vu les

résultats divergents que l'équipe Kemper obtenait selon les conditions appliquées, ces

travaux étaient difficilement interprétables. Si la méthode d'injection in situ permettait de

reconnaître un rôle au fragment complet, elle semblait manquer de sensibilité pour une

caractérisation plus poussée du PBRU.

Chapitre VI: Conchions et Perspectives 104

Honkakoski et Negishi [22] analysaient I'arnplificateur transcriptionnel de la

souris et établissaient que l'induction par le PB de Cyp2blO faisait appel aux sites N'FI et

HX. Cependant, plutôt que d'être accessoires comme dans le cas du PBRU, les sites NF1

et HX de la souris semblaient critiques à l'activité du PBREM. Selon ces chercheurs en

effet, la mutation de l'un ou l'autre des sites abolissait toute induction de l'activité CAT

due au PB. D'autre part, si NF1 était un activateur, HX semblait agir en répresseur, la

mutation de ce site entraînant une augmentation de 221% du niveau constitutif de

l'activité CAT.

Des divergences fonctionnelles importantes semblaient donc exister entre les

déments de réponse au PB de la souris et du rat et ce. malgré une identité de séquence

quasi-totale. Considérant la possibilité que ces différences puissent être reliées à la nature

des mutations introduites dans les sites NF1 et HX, de nouvelles mutagenèses étaient

effectuées dans le cadre de cette thèse. Les résultats qui en dtcoulaient nous confortaient

dans nos premières interprétations (Article III, Chapitre V). La substitution des

nucléotides AGGTCA du site HX du rat par AccagA. telle que l'avaient réalisée

Honkakoski et Negishi chez CypZblO de la souris [22], n'entraînait pas d'augmentation du

niveau basal d'activité CAT. D'autre part, ni cette modification, ni une mutation plus

drastique du site NFI, à la fois en TGG et en GCCA, n'abolissait In réponse au PB

(Article m, Chapitre V). NF1 et HX étaient donc bien des sites accessoires, nécessaires

pour une activité maximale du PBRU en présence de PB.

Les conclusions de Honkakoski et Negishi [22] se rapportant aux sites HX et NF1

différaient cependant de l'analyse que nous en faisions. Nous remarquions en effet que la

mutation introduite par l'équipe Negishi dans le site NF1 n'abolissait pas complètement

l'induction par le PB de l'activité CAT [figure 7 de la référence 221. Quant la mutation

du site HX' nous constations qu'elle n'affectait le niveau basal de l'activité CAT que de

façon sporadique, c'est-à-dire uniquement dans certaines expériences. Ainsi, ce niveau

basal d'activitd CAT restait inchangé dans une expérience o l les chercheun tentaient de *

consolider l'hypothèse selon laquelle la région importante du PBREM était celle de NF1

Chapitre VI: Conclusions et Perspectives 1 05

et HX [22]. Ils observaient, en premier lieu, que Cyp269, un gène de souris non inductible

par le PB, possédait vers 900 pb en amont du tsp une séquence identique à 70% au

PBREM. Testé en transfection en amont de tk-cat, ce segment d'ADN n'avait aucun

pouvoir inducteur en présence de PB. Constatant que les sites HX et NF1 de cette

séquence renfermaient des différences nucléotidiques importantes par rapport à ceux du

PBREM, ils suggéraient que l'absence de réponse au PB de Cyp2b9 incombait à ces

différences. Pour le démontrer, ils substituaient aux sites HX et NF1 du PBREM les

nucléotides de Cyp2b9 qui le distinguaient de Cyp2blO. Le PBREM ainsi modifié était

testé en transfection et. comme l'équipe Negishi le prévoyait. il perdait tout pouvoir

inducteur. Par contre. l'augmentation de 221% du niveau basal d'activité CAT

n'apparaissait plus.

Signalons pour conclure que dans un nouvel article paru en 1998, Honkakoski et

ses collaborateurs se rangeaient à nos conclusions [112]. Les nouvelles mutations qu'ils

réalisaient sur les sites HX et NF 1 n'abolissaient plus l'activité CAT. Le site NF 1 n'était

donc pas critique à la réponse au PB du PBREM. Quant à la fonction répressive de HX,

elle était omise et cédait dorénavant la place à un rôle activateur au sein du PBREM

[112].

Ainsi. les sites HX et NF1 remplissent les mêmes fonctions activatrice et

accessoire pour la réponse au PB des gènes CYP2B2 et Cyp2blO. Quant aux protéines qui

s'y fixent, elles agissent en cofacteurs. Comme nous l'avons souligné dans les pages

précédentes, de façon générale, il n'est pas rare que NF1 soit un cofacteur dans la

régulation de la transcription de gènes hépatiques et soit nécessaire pour qu'un gène

réponde pleinement ii divers stimuli [log, 1 IO]. Son action se combine B celle de deux

types de protéines: les protéines qui, comme elle. ont une distribution ubiquiste (par

exemple. AP-1) et celles dont la présence est limitée il un nombre restreint d'organes, en

I'occurence le foie (clEBP, HNF 1, KNF4. HNF3) [106].

Chuvitre VI: Conclusions et Persvectives 106

Expériences préliminaires visant à identifier le ou les facteur(s) se liant

au site HX

Un récepteur orphelin connu ou encore inconnu, présent essentiellement dans le

foie, pouvait être un bon candidat pour expliquer l'induction hépato-spécifique de

CYP282 en présence de PB. Cette hypothèse nous conduisait à réaliser des expériences

préliminaires de CO-transfection, dans les hépatocytes en culture primaire, d'une

construction contenant le PBRU et le gène rapporteur cat avec un vecteur d'expression

pour HNF4 et le récepteur orphelin ETF (<ifetoprotein transcription factor»). HNF4

reconnait des répétitions directes imparfaites de type DR 1 (ou «direct repeat 1 ». à titre de

rappel) [98] et FïF se lie au site AGGTCA, précédé d'une extension TCA [113]. Or,

l'empreinte HX couvre un DR1 imparfait. qui peut aussi être considéré comme un demi-

site unique, reconnu par exemple par R F . Les expériences de CO-transfection avec FTF

ne modifiaient pas la réponse au PB. Quant aux expériences avec HNF4. elles entraînaient

une légère augmentation de l'activité CAT (d'un facteur 2 au maximum) (Article IIi,

Chapitre V). Il est difficile' ii ce stade des expériences, de tirer une conclusion de ce

dernier résultat. il est aussi difficile de \'interpréter étant donné que le récepteur orphelin

HNF4 est abondant dans le foie et dans les hépatocytes en culture primaire.

Honkakoski et ses collaborateurs identifiaient, pour leur part. un hétérodimère

protéique qui, selon eux, serait le médiateur de l'action du PB. Ce complexe était capable

d'activer la transcription du gène car en se fixant à une séquence du PBREM, plus large

que le site HX [112]. La nature de la séquence en question sera décrite plus longuement

dans les pages suivantes. Notons brièvement qu'il s'agit d'une répétition directe

imparfaite de type DR4, baptisée NRl (TGTACTttccTGACCT)? L'hétérodimère

reconnaissant ce site était formé de RXR et d'un nouveau récepteur orphelin abondant

dans le foie, appelé CAR [112,100]. il est important de souligner ici que les expèriences

de CO-transfection, dans les lignées cellulaires HepG2 (cellules issues d'hépatômes

humains) ou HEK293 (cellules embryonnaires de rein humain), du PBREM en amont de

' Les 6 nuclCotides soulignCs correspondent au site HX (demi-site AGGTCA) identifité chez le rat.

Chapitre VI.- Conclusions et Perspectives 1 07

tk-cat avec les vecteurs d'expression de RXRa et hCAR (human CAR) conduisaient à

une induction de l'activité CAT (de l'ordre de 15 fois) uniquement en absence de PB

[ 1 121. Ces expériences n'ont pas été validées par des essais en présence de PB, sans doute

à cause de l'absence de réponse au PB des lignées cellulaires. Or, I'activité constitutive de

CAR n'a rien de surprenant puisqu'elle définit précisément ce récepteur orphelin,

découvert chez l'humain (human CAR ou MB67) par Baes et ses collaborateurs [100].

Ces chercheurs établissaient en effet que hCAR activait la transcription d'un gène

rapporteur en absence de ligand ajouté et ils le baptisaient, de ce fait, aonstitutively

active receptor».

Les analyses les plus récentes d'interactions protéines-ADN, effectuées par

Honkakoski et ses collaborateurs [112], montraient que l'hétérodimère RXR-CAR se

fixait à NRl en réponse à un traitement au PB. Or, comme nous l'avons déjà mentionné,

jusque là, aucune équipe de recherche. y compris celle de Negishi [22], n'avait constaté de

différences entre les expériences in vitro d'empreintes à la DNase 1 faites avec des extraits

de foie de rat contrôle et celles réalisées avec des extraits de foie de rat traité au PB

[Article II, 104.1. De plus, si les expériences de gels à retardement effectuées avec NRl

montraient clairement que cet élément était reconnu par un complexe protéique formé en

partie de RXRa (expérience de supershift avec un anti-corps anti-RXRa), l'anticorps

anti-CAR était, quant à lui, inactif dans ce type d'expériences et ne permettait donc pas

d'établir clairement la participation de CAR. Que RXR s'attache à une séquence de type

DR4 n'est pas unique et spécifique à CAR. RXR reconnaît également des DR4 lorsqu'il

est associé, par exemple, à TR («thyroid receptom) ou LXR (&ver-X-receptor»), qui est

un récepteur orphelin abondant dans le foie de rongeurs [l 14,1151.

Comme nous le verrons dans la section Perspectives, l'ensemble de ces

considérations nous amène & suggérer la réalisation d'études plus approfondies de la

nature du ou des facteurs se liant au site HX.

Chapitre VI= Canclusions et Perspectives 108

V) Un site de type GRE est impliqué dans la r6ponse au PB de

c m 2

Marie-Hélène Vachon, étudiante au doctorat dans le laboratoire d'accueil, tentait

de décrypter l'organisation du PBRU. Elle transfectait, dans des hépatocytes en culture

primaire, des mutants de délétion du fra,ment de 163 pb et localisait en son centre, entre

2208 et 2257 pb du tsp de CYP2B2, une séquence indispensable à la réponse au PB

(score») [Figure 11. Cependant, seule, cette région était totalement inactive. Pour être

fonctionnelle, i l fallait lui greffer un ou plusieurs élément(s). du coté 5' ou du coté 3'.

Marie-Hélène Vachon identifiait, coté 3', un tel élément, baptisé AF1 («Accessory Factor

1 »). A H correspondait à l'empreinte FO, déterminée dans le cadre de la présente thèse. A

l'intérieur de ladite séquence, en 5' de HX et NFl, entre 2230 et 2244 pb du tsp, se

trouvait un site ressemblant à un GRE (élément de réponse aux glucocortic~ïdes). Afin de

mesurer l'importance de la présence de ce site au sein du PBRU, celui-ci était modifié

dans le cadre de cette thèse (mutant GREm). Il était d'autant plus intéressant de le muter

que Waxman et ses collaborateurs [ 131 avaient démontré en 1990 que l'ajout de DEX au

milieu de culture augmentait de façon significative la réponse au PB des gènes CYP2B1 et

CYP2BZ. Le nombre de nucléotides identiques à ceux de la séquence consensus GRE était

ainsi réduit de 7 à 4 (sur 12). Cette mutation produisait un effet remarquable sur

l'induction, PB dépendante, de l'activité CAT. Elle atténuait de façon importante cette

activité, dont il ne subsistait que 10% du niveau habituel.

En 1997, un travail similaire de dissection du fragment de 177 pb de la souris

menait à des conclusions opposées [22]. Honkakoski et Negishi définissaient une région

centrale identique, à quelques nucléotides près, à celle caractériske chez le rat. Cette

séquence correspondait aux empreintes PB* et pC et s'étendait de 2297 à 2364 pb du tsp

de CypZb IO (2193 ii 2260 pb en coordonnées du PBRU) Figure LI. Nous l'appellerons

PB'-pC pour plus de commodité. Alors que la séquence centrale du PBRU était inactive,

PB'-pC conservait un pouvoir inducteur sur l'activité CAT correspondant à environ 30%

(induction d'un facteur 3) de celui obtenu pour le fragment complet [Figure 21.


Honkakoski et Negishi établissaient ensuite que la partie importante de PB'-pC était pC,

une séquence de 33 pb, renfermant le site NF1. Ils testaient, pour ce faire, des mutants de

PB', appelés pB'mutl et pB'mut2, et ne constataient aucune réduction du pouvoir

inducteur du segment pBt(modifié)-pC. Or, en réalisant le mutant pB'mut2, Honkakoski

et Negishi modifiaient également le site de type GRE [Figure LI.

Contrairement à nous, cette équipe n'accordait donc au site de type GRE aucune

fonction dans la réponse au PB. Comme nous allons le voir, cet élément était également

partiellement exclu du nouveau PBREM dont les limites étaient redéfinies en 1998 [116].

Nous avons jugé nécessaire de présenter une analyse poussée des travaux de l'équipe

Negishi en rapport avec le site de type GRE. Elle incite à penser que le rôle exact qui

incombe 4 cet élément n'est pas encore connu et va mériter des investigations

supplémentaires.

1 Induction 1


Analyse du PBREM

En 1998, Honkakoski et ses collaborateurs [116] réexaminaient les limites du

PBREM caractérisé en 1997 [22]. Celui-ci était alors d'une longueur de 132 pb (de 2265 à

2397 pb du tsp) et comprenait les 4 empreintes PB-PB'-pC-pD [Figure 21. Son pouvoir

inducteur sur l'activité CAT était maximal (de 6 à 8 fois). Rappelons qu'à l'intérieur de ce

premier PBREM se trouvait le segment PB'-pC, qui exhibait une activité partielle (de

l'ordre de 3 fois). Honkakoski et ses collaborateurs émettaient alors l'hypothèse que

l'activité inductrice de PB'-pC pourrait être complète si on ajoutait des nucléotides de part

et d'autre de ce dernier. A l'aide de nouvelles constructions amputées, ils incluaient ainsi,

en 3'' une séquence appelée NR2b et réduisaient, en 5' ' la participation de PB' à 6

nucléotides (TCTGTA) [Figure 21. Le nouveau PBREM faisait maintenant 51 pb,

comprises entre 2289 et 2339 pb du tsp. Il renfermait le site NF1 central et, de part et

d'autre, deux répétitions directes imparfaites, de type AGGTCA, avec un espacement de 4

nucléotides (DR4). Ces éléments étaient appelés NR 1 et NR2. Les deux demi-sites étaient

appelés NR 1 a et NR2a en 5' et NR 1 b et NRZb en 3'. Dans ce nouveau modèle, le site HX

du rat correspondait au demi-site NRl b. Il ne représentait donc qu'une partie du DR4

appel6 NRl . Le nouveau PBREM était capable d'induire l'activité CAT d'un facteur 10 et

ce, en présence du PB et d'one quinzaine d'autres inducteurs de type PB [116].

La mutation conjointe des demi-sites «a» de NR 1 et NR2 (mutant NRla2a) ou des

demi-sites b de NRl et NR2 (mutant NRl b2b) produisait un effet drastique sur le pouvoir

inducteur de ce nouveau PBREM [ I 161. Un changement du nombre de nucléotides

séparant les deux demi-sites de NRl (on passe de 4 nucléotides à 2, 3, 5 ou 7) entrainait

des réductions plus ou moins importantes de l'activité CAT [112]. La modification de

NRla en NRla mut (TGTACT devient TcTggT) réduisait de 80% la réponse au PB [112].

Bien que ces données suggéraient un rôle important de NRLa au sein d'un PBREM qui

écartait le site de type G E , des résultais contradictoires que nous exposons dans le

paragraphe suivant, venaient confirmer la nécessite d'expériences supplémentaires


Figure 2: Organisation du PBREM de la souris.


(envisagées dans la section Perspectives) pour saisir pleinement l'implication de la region

du site GRE dans l'organisation du PBREM ou du PBRU.

Les données mentionnées dans le paragraphe précédent divergeaient en effet d'un

résultat présenté en 1997 par Honkakoski et Negishi [22]. Afin de déterminer les rôles

respectifs de PB' et pC à l'intérieur du fragment de 177 pb, ces chercheurs extrayaient ces

deux éléments du fragment complet (constructions 15 et 16). Us devaient, pour ce faire,

insérer un site de restriction «GAATTC» entre les deux. ils substituaient ainsi une courte

séquence du fragment de 177 pb, située à l'intersection de PB' et pC, par «GAATTC»

(constmction 14) [Figure 31. Dans un souci de rigueur, ils s'assuraient que ces 6

nucléotides n'altéraient pas la réponse au PB du gène car. Transfectée dans des

hépatocytes de souris en culture primaire, la construction 14 présentait, comme

Honkakoski et Negishi I'escomptaient, la même activite que la construction sauvage. Or,

la séquence NRla, dont I'imponance pour la réponse au PB ne sera révélée que I'année

suivante, était modifiée par cette substitution [Figure 31.

Dans l'hypothèse où les deux pb mutées dans la construction 14 ne jouent aucun

rôle pour la fonction de NRI, il failait supposer que la chute de 80% de l'activité CAT,

observée dans le cas de la construction 15, laquelle était dépourvue de PB', reposait sur la

modification d'un seul nucléotide. le premier NT» de TGTACT changé en «a>> (aGaAtT)

[Figure 31. Or, chez le mutant NRl a mut de Honkakoski et Negishi. le nucléotide en

question n'était pas mute [112]. L'autre hypothèse est l'implication de pb de l'empreinte

PB'. adjacentes en 5' à NRla, (entre autres «TC») dans la réponse au PB. Ii faut donc

considérer la possibilité que l'élimination de PB' dans la construction 15 soit à l'origine

de la réduction importante du pouvoir inducteur de cette construction. Ceci conduirait

donc à reconsidérer le rôle de la région en 5' du PBREM, c'est-à-dire de la zone

renfermant le site de type GRE.

Nous ne discuterons pas ici des limites du PBREM coté 3'. Nous pouvons

toutefois noter qu'une autre mutation a été introduite dans NR2a, dans le même contexte


Figure 3: Insertion d'un site de restriction dans le PBREM.

Chavitre VI: Conclusions et Pers~ectives 115

d'une insertion d'un site de restriction entre pC et PD. Une seule paire de bases est alors

mutée mais elle semble sans conséquence sur le pouvoir inducteur du PBREM [22].


L'activation transcriptionnelle de CYP2B2 par le PB implique donc la participation

d'un facteur de transcription ubiquiste NFI. Celui-ci doit agir de concert avec, entre

autres, un récepteur nucléaire de nature inconnue et probablement un facteur de

transcription s'attachant à un site adjacent en 5' des sites HX et NFI. Ainsi pris dans leur

ensemble, les résultats de la présente thèse nous font percevoir la complexité de

l'organisation de cet activateur transcriptionnel. Si les objectifs de notre travail de thèse

ont été en grande partie atteints, ces résultats et ceux de l'équipe Negishi nous amènent à

nous poser de nouvelles questions, auxquelles il sera intéressant de répondre à moyen et

plus long termes.

i) Le site de type GRE participe-t-il à la réponse de CYPZB2 au PB?

ii) Quelle est la stmcture exacte du site HX? Le demi-site AGGTCA fait-il partie

d'un DR4 qui serait reconnu par un hétérodimère de type RXR-CAR?

Appartient-il plutôt à un DR1 reconnu par un récepteur nucléaire

homodimérique de type HM4 ou est-il un demi-site unique (précédé de

quelques nucléotides importants) reconnu par un récepteur nucléaire de type

monornérique, comme FTF?

iii) L'hétérodimère RXRa-CAR est-il impliqué dans la reconnaissance du DR4?

Afin de répondre à la première question, il faudra réaliser, dans un premier temps,

de nouvelles mutagenèses de la région englobant le site de type GRE, afin d'une part, de

mesurer précisément la part qui incombe à cette zone dans la réponse au PB, d'autre part,

de délimiter clairement l'ensemble de la région impliquée dans la réponse au PB. il sera

pertinent de corroborer ces résultats par des expériences d'empreintes à la DNase 1 avec

les mutants du site de type GRE.

En parallèle à ces expdriences et ceci, afin de concilier nos résultats avec ceux de

Honkakoski et ses collaborateurs, il sera intéressant de tester le PBREM dans un contexte


différent de celui utilisé par l'équipe Negishi jusqu'à présent. Il n'est pas impossible, en

effet, qu'un site important pour la réponse au PB ait été créé immédiatement en amont du

PBREM, lors de la construction du vecteur PBREM-tk-cat. Dans cette optique, il sera

possible de joindre par exemple, à l'extrémité 5' du PBREM, dans le vecteur tk-car,

différents fragments nucléotidiques quelconques et d'observer leur effet sur la réponse au

PB du PBREM. Une autre alternative intéressante sera de tester le PBREM dans le

vecteur employé au laboratoire d'accueil. Il conviendra également d'évaluer les effets de

l'adjonction, en 5' du PBREM, de la séquence qui aura été délimitée par le laboratoire

d'accueil, dans la région du site de type GRE.

L'existence de contradictions. ou tout au moins de faiblesses, dans les résultats de

Honkakoski et ses collaborateurs nous encouragent à effectuer des travaux dans ce sens.

Si les expériences proposées nous donnent raison quant à la participation dans la réponse

au PB d'un élément en 5' des sites HX et NFI. il sera pertinent de poursuivre les analyses

d'identification du facteur se fixant cette région. Nous ne disposons en effet pour le

moment d'aucune preuve nous permettant d'affirmer qu'un récepteur des glucocortic~ïdes

se fixe à cette région.

Il sera égaiement nécessaire de nous attarder aux limites du site HX. Le demi-site

NRla appartient-il encore au site HX ou fait-il déjà partie d'un élément en 5' de HX,

impliqué lui aussi dans la réponse au PB? Quelques réponses seront sans doute apportées

par les investigations dont fera l'objet le site de type GRE. Iî sera également intéressant

d'effectuer des mutations touchant à NR 1 a.

Enfin, afin d'apprécier le rôle de I'hétérodimère RXRa-CAR dans la réponse au

PB du PBRU, il sera aisé de traiter les hépatocytes de rat en culture primaire avec de

I'androstanol ou de I'androsténol, deux inhibiteurs de l'activité transcriptionnelle de

RXRa-CARB [ 1 171. Ces composés stéro'idiens semblent agir en inhibiteurs en entraînant

la dissociation des CO-activateua de l'hétérodimére. Si cet hétérodimère est impliqué dans

la réponse au PB, le traitement des hépatocytes avec ces inhibiteurs devrait réduire de

fqon importante, voire totale, le pouvoir inducteur de PBRU.


Le cas échéant, il faudra déterminer la nature des protéines qui s'attachent à cette

région, par des expériences de gels à retardement à l'aide d'anticorps anti-récepteurs

orphelins ou des essais de chromatographie sur colonnes. L'ensemble de ces expériences

nous conduiront progressivement à démêler le jeu complexe d'interactions protéiques

mises en œuvre dans la régulation du gène CYP2B2. La question de l'existence d'un

récepteur pour le PB sera inévitablement abordée et il ne fait pas de doute qu'elle trouvera

une réponse dans un avenir proche.

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CARACTÉRISATION D'UNE UNITÉ DE RÉPONSE AU … · 2004-11-29 · FACULTÉ DES SCIENCES ET DE GENIE Département de biologie THESE DE PHILOSOPHIAE DOCTOR (Ph.D.) Caractérisation