Chapitre 8 Structures tridimensionnelles des protéines

2. Les protéines fibreusesA. La kératine - Une hélice d'hélicesB. Le collagène - Un câble à trois hélices

3. Les protéines globulairesA. Interprétation des structures des protéines par rayons X et par RMNB. Structure tertiaireC. Bioinformatique structurale

2 LES PROTEINES FIBREUSES

Les protéines fibreuses sont des molécules insolubles, très allongées dont les structures secondaires sont les motifs structuraux dominants

Beaucoup de protéines fibreuses, comme celles de la peau, des tendons et des os servent de matériel structural jouant un rôle de protection, de connexion ou de soutien

D'autres, les protéines musculaires et ciliaires, ont des fonctions motrices, par exemple la myosine des muscles squelettiques, muscles lisses et muscles cardiaques

A. La kératine - une hélice d'hélices

On distingue les kératines , que l'on trouve chez les mammifères, et les kératines chez les oiseaux et les reptiles. Les kératines (> 30 gènes chez les mammifères) appartiennent à des familles de protéines relativement acides (Types I) ou relativement basiques (Type II)

Protéine fibreuse : kératine (cheveux, ongles, cornes)Sous-unités = hélices presque de bout en bout (≈ 310 acides aminés)Dimères = 2 sous-unités enroulées en super-hélice de pas gaucheProtofilamentsMicrofibrilleMacrofibrille

Liaisons disulfure à l’interface des protofilaments et microfibrilles (rigidité)

Maladies héréditaires - par exemple anomalies de séquence dans la kératine 14 ou dans la kératine 5 qui altèrent l'intégrité de la peau

Dimère protofilament microfibrille macrofibrille cheveu

Vue vers le bas dans l'axe de la spire montrant l'interaction entre les bords non polaires des hélices . Les hélices présentent une séquence heptamérique pseudo-répétitive dans laquelle les résidus a et d sont non polaires

Vue latérale - noter l'emboîtement des chaînes latérales non polaires en contact (sphères en rouge) dans le modèle compact

B. Le collagène- un cable à trois hélices

On trouve du collagène chez tous les animaux pluricellulaires. C'est une protéine extracellulaire organisée en fibres insolubles très résistantes à la tension

De nombreux types différents (une vingtaine)Présentes dans les os, le tissu conjonctif, les membranes basales, les dents, les cartilages, les tendons, les ligaments, les matrices fibreuses de la peau et des vaisseaux sanguinsI : peau, os tendon, cornée, vaisseaux

sanguins2 sous-unités 1 (type I)1 sous-unité 2 (type I)

II : cartilage, disques intervertébraux3 sous-unités 1 (type II)

III: vaisseaux sanguins, peau fétale3 sous-unités 1 (type III)

Molécule de collagène :

Bâtonnet de ≈ 300 nm x 1,5 nm Trois chaînes = "chaînes " ≠ hélice ;

- hélices à pas gauche- 3 résidus par tour de spire- pas = 0,94 nm; incrément = 0,31 nm- comportant un motif répétitif Gly-X-Y

X = souvent Pro; Y = souvent Pro ou 4- ou 3-hydroxyprolineou 5-hydroxylysine

Torsadées en une "superhélice" à pas droittrois chaînes décalées d’1/3 tour de spireGly occupant le centreliaisons hydrogène entre chaînes

Aux extrémités = éléments non hélicoïdaux intervenant pour guider l’assemblage

a. Le collagène a une structure en triple hélice

Le collagène a une composition en acides aminés particulière. Près d'un tiers des résidus sont des Gly; en outre entre 15 et 30% des résidus sont Pro et Hyp (4-hydroxyproline). On trouve également la 3-hydroxyproline et la 5-hydroxylysine (Hyl).

Les résidus hydroxylés sont sont formés après la synthèse du collagène quand certains résidus Pro sont transformés en Hyp par la prolyl hydroxylase. L'Hyp stabilise le collagène par intermédiare de liaisons hydrogène intramoléculaires. Dans des conditions qui inactivent la prolyl hydroxylase, le collagène est dénaturé à 24°C, alors que le collagène normal est dénaturé à 39°C pour former la gélatine. La prolyl hydroxylase nécessite de l'acide ascorbique (vitamine C)

Dans le scorbut, maladie due à une déficience en vitamine C, le collagène ne peut former des fibres correctement ce qui entraîne des lésions de la peau, une fragilité des vaisseaux sanguins, et des cicatrisations laborieuses

a. Le collagène a une structure en triple héliceLa séquence est une répétition de triplets Gly-X-Y sur une longueur de 1011 résidus sur 1042 résidus. X est souvent Pro et Y est souvent Hyp. Le contenu élevé en Gly, Pro et Hyp suggère que la conformation du squelette polypeptidique est analogue à celles des hélices de pas gauche de la polyGly et de la polyPro:

Dans la structure, chaque 3ème résidu de chaque chaîne polypeptidique passe au centre de la triple hélice, qui se trouve si encombré que seule la Gly peut occuper cette position:

Le N-H de chaque Gly établit une liaison hydrogène forte avec l'oxygène du carbonyl de d'un résidu X (pro) d'une chaîne voisine. Ces liaisons hydrogène intercaténaires contribuent à la stabilisation de la structure

b. Le collagène est organisé en fibrillesL'aspect strié en microscopie électronique provient de l'arrangement décalé des molécules de collagène:

Modifications post-traductionnelles du collagène

- Hydroxylation - de résidus proline en 3 et 4 hydroxyprolines (prolyl hydroxylase)- de résidus lysine en 5 hydroxylysinestabilisent le collagène = réactions se déroulant dans le réticulum endoplasmiquedépendantes de la vitamine C

Déficience en vitamine C = scorbutisme Fragilité capillaire, gingivite, hémorragies sous-périostées

- Conversion de lysine en allysine et pontage entre molécules

- Glycosylation de résidus hydroxylysine (glucose, galactose)

c. Les fibrilles de collagène sont réticulées par liaisons covalentesLa lysyl oxydase transforme les résidus Lys en allysine. Deux aldéhydes subissent une condensation aldolique pour donner l'aldol allysine. Ce produit peut réagir avec l'His d'une autre chaîne polypeptidique pour donner l'aldol His qui à son tour peut régir avec la 5-OHLys d'une autre chaîne et ainsi, par réactions croisées, réunir 4 chaîne latérales

Collagène

Stabilisation- abondance de Pro et de Hydroxyproline(polyproline forme spontanément hélice de pas gauche

avec incrément de 0,31 nm et pas de 0,94 nm)- pont hydrogène (entre gly et pro ou hydroxyproline)- pontage intermoléculaire - glycosylation

d. Des anomalies du collagène sont à l'origine de plusieurs maladies chez l'homme

- ostéogenèse imparfaite (mutations dans une des chaînes du collagène de type I ou de type III). Par exemple, le remplacement de la Gly centrale par Ala entraîne une distortion de la triple hélice et diminue sa température de dénaturation de 62°C à 29°C

3 LES PROTEINES GLOBULAIRES

Les protéines globulaires comprennent par exemple les enzymes, les protéines de transport et les récepteurs. Les relations structure-fonction des protéines globulaires sont le résultat des déterminations de structure par rayons X et par résonance magnétique nucléaire (RMN)

A. Interprétation des structures des protéines par rayons X et par RMNLa cristallographie par rayons X donne directement l'image des molécules. Un cristal de la protéine est exposé à un faisceau de rayons X et le spectre de diffraction est enregistre par un compteur de radiations. Les rayons X sont générés par des synchrotrons

a. La plupart des structures cristallographiques n'atteignent pas la résolution atomiqueLes cristaux de protéines sont fortement hydratés (40-60% d'eau en volume). Les molécules de protéine se présentent dans un désordre de plus d'un angström. On dit que le cristal a une limite de résolution de cette taille. Les cristaux protéiques ont des limites de résolution comprises entre 1,5 et 3Å

Les rayons X interagissent presqu'exclusivement avec des électrons, pas avec les noyaux. Une structure par rayons X est donc l'image de la densité électronique. Les analyses structurales modernes se font par ordinateur où les cartes de densité électronique d'une suite de sections parallèles apparaissent en trois dimensions

Coupe à travers la carte de densité électronique de résolution de 2Å de myoglobine de cachalot, qui contient un noyau hème. La densité électronique est représenté par de courbes de densité tout comme l'altitude est représenté sur une carte topographique. Le pic au centre de la carte représente l'atome de Fe dense en électronsLa possibilité d'obtenir des cristaux de résolution suffisante est le facteur limitant de détermination de structure tridimensionnelle par cet analyse

La qualité d'une carte de densité électronique varie selon sa limite de résolution. Pour une résolution de 1,1 Å, les atomes (sauf hydrogène) sont tout à fait visibles

6 Å 2.0 Å 1.5 Å 1.1 Å

La structure primaire de la protéine doit être connue - permet de faire coïncider la séquence et sa carte de densité électronique

b. La plupart des protéines sous forme de cristal gardent leurs conformations nativesLes protéines à l'état de cristal présentent pratiquement les mêmes structures que celles en solution

1. Une protéine à l'état de cristal baigne dans le solvant de cristallisation sur toute sa surface

2. Lorsque la structure d'une protéine a été déterminée à l'état de cristal, par rayons X, et en solution, par RMN, les deux structures sont essentiellement les mêmes

3. De nombreuses enzymes, une fois cristallisées, sont toujours catalytiquement actives. Les enzymes cristallisées actives doivent par conséquent avoir des conformations très proches de celles en solution c. Détermination de la structure des protéines par RMNLa détermination des structures tridimensionnelles de petites protéines globulaires en solution aqueuse est possible grâce à la spectroscopie par RMN à deux dimensions (2D). Ces techniques fournissent les distances interatomiques de protons distants de < 5 Å dans une protéine de séquence connue. Les mesures de des distances entre protons n'étant pas très précises, ne permettent pas d'en déduire une structure unique. La structure d'une protéine obtenue par RMN est souvent un ensemble de structures compatibles avec les contraintes géométriques

Spectroscopie nucléaire par effet Overhauser (NOESY) d'une protéine donnant des courbes de niveau le long des deux axes de fréquence 1 et 2. Les lettres a à d donnent la position de 4 protons représentés par des petits cercles. Les flèches en pointillés indiquent les pics correspondants sur la diagonale de RMN. Les pics de croisement i, j et k situés aux intersections des lignes horizontale et verticale à travers deux pics de la diagonale, indiquent qu'il y a un NOE entre les deux protons correspondants et qu'ils sont distants de < 5 Å

Structure par RMN du domaine SH3 de la protéine Src (64 résidus)

1. Les méthodes actuelles de RMN ne permettent pas de déterminer la structure d'une protéine > 40 k Da

2. Les techniques par RMN permettent de déterminer les structures de protéines qui ne cristallisent pas

3. L'RMN peut suivre des mouvements dans l'étude du repliement et de la dynamique des protéines

d. Les structures moléculaires des protéines sont simplifiées

Les quelques centaines d'atomes autre que l'hydrogène d'une protéine rendent la compréhension de sa structure détaillée très difficile

Une façon de représenter la squelette peptidique est de se limiter à des atomes C (squelette des C)

Représentation de la structure par rayons X de la myoglobine de cachalot

Protéine constituée que d'hélices séparées par courts segments de liaison de conformation enroulée

1-100101-200201-300301-400401-463

Représentation de la structure par rayons X de l'hexokinase

1-100101-200201-300301-400401-463

Glu, AspLys,Arg

TyrPheTrp

Résidus liant le glucose

B. Structure tertiaireLa structure tertiaire d'une protéine est le repliement de ses éléments à structure secondaire

Représentation de la structure par rayons X de la concanavaline A du haricot sabre

Les flèches dirigées vers l'extrémité C-terminale indiquent le feuillet plissé antiparallèle

a. Les protéines globulaires peuvent présenter à la fois des hélices et des feuillets

Représentation de la structure par rayons X de la carbonic anhydrase humaine

La plupart des protéines ont des quantités significatives des deux types de structure secondaire (en moyenne, environ 31% d'hélice et 28% de feuillet le reste en tournants et boucles

Hélice amphipathiquehélice H de la myoglobine

b. La disposition des chaînes latérales varie avec leur polarité

1. Les résidus non polaires Val, Leu, Ile, Met, Phe se trouvent à l'intérieur de la protéine, à l'abri de l'eau par interactions hydrophobes

2. Les résidus polaires chargés Arg, Lys, His, Asp et Glu sont situés à la surface en contact avec l'eau

3. Les groupements polaires non chargés Ser, Thr, Asn, Gln, Tyr et Trp sont habituellement à la surface. A l'intérieur, ces résidus établissent des liaisons hydrogène avec des groupements accepteurs enfouis

Hélice amphipathique:hélice H de la myoglobine

L'intérieur d'une protéine se rapproche d'un cristal moléculaire plutôt qu'une goutte d'huile: il est efficacement rempli. Les chaînes latérales hydrophobes au coeur de la protéine prennent des conformations relâchées avec des angles de torsion décalés de faible énergie

c. Les protéines de grande taille forment des domaines

Les chaînes polypeptidiques de plus de 200 résidus se replient généralement en deux blocs qu'on appelle des domaines qui confèrent à ces protéines une forme bi-lobée

Dans la glycéraldehyde déshydrogenase ici à droite, le NAD+ se lie au domaine inférieur (en rouge)

d. Les protéines sont faites de structures supersecondaires

En se combinant, des groupes de motifs supersecondiares peuvent former la structure tertiaire d'un domaine appellé "pli" ("fold")

Motif ß--ßhélice-boucle-hélice

Épingle à cheveux

C. Bioinformatique structurale

Les coordonnées atomiques des structures des protéines sont reprises dans la Banque de Données des Protéines ("Protein Data Bank" PDB:http://www.rcsb.org/pdb/

Les structures peuvent être examinées en utilisant un programme de graphisme moléculaire, par exemple RasMol:http://www.umass.edu/microbio/rasmol/index.htm

On peut superposer la séquence d'une protéine d'intérêt sur une structure connue à partir d'un alignement de structure primaire en utilisant le programme de graphisme moléculaire Cn3D: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/CN3D/cn3d.shtml

• Rasmol download

• Features

• Stereo vision !

http://biochemistry.utoronto.ca/steipe/bioinformatics

L R1DRO.PDB, model 1

http://ncbi.nih.gov/Structure/CN3D/cn3dtut.shtml