Comprendre La Biologie Moleculaire

7/23/2019 Comprendre La Biologie Moleculaire

1/23

Ann Fr Anesth R6anim 1999 ; 18 : 725-47

0 Elsevier, Paris

Revue gCnCrale

Comprendre la biologie mol6culaire

V. Laudenbach, 2, J. Mantz, J.M. Desmontsl

Dkpartement danesthksie-rtfanimation chirurgicale, hdpitaux Bichat-Claude Bernard-Robert Deb 75018 Paris ;

21aboratoire de neurologie du dkveloppement, unite E-9935, h6pital Robert-Deb 48, boulevard Seruriel; 7.5019 Paris, France

RiSUME

Objectifs : Exposer les bases theoriques et methodologi-

ques de la biologie moleculaire. lndiquer ses principales

applications dans le domaine medical.

Sources des don&es : Pour cette revue, les publications

en langues francaise et anglaise, parues dans les journaux

consacres a la recherche en biologie moleculaire et a

Ianesthesie-reanimation chirurgicale, referencees dans la

banque de don&es Medline@, ont ete analysees, ainsi que

les ouvrages de la specialite.

Selection des articles : Ont ete selectionnes : 1) les arti-

cles originaux correspondant aux principales avancees

ayant abouti a Ietat actuel de la specialite, en particulier

dans le domaine de Ianesthesie-reanimation chirurgicale ;

2) les revues et mises au point ; 3) certains chapitres

douvrage de synthese.

Extraction des donnbes : Les donnees extraites corres-

pondent : 1) aux connaissances actuelles concernant les

mecanismes de conservation et dexpression du genome ;

2) aux principes des techniques experimentales les plus

courantes ; 3) aux possibilites dexploitation de ces

connaissances et de ces techniques en anesthesie et en

reanimation chirurgicale ; 4) aux developpements les plus

recents et aux perspectives offertes par les techniques de

biologie moleculaire.

SyntMse des don&es : Le terme de biologie molecu-

laire employe en biologie medicale correspond essentiel-

lement a letude des acides nucleiques. Cette mise au

point rappelle les principes generaux selon lesquels le ge-

nome est organise. Elle decrit brievement la facon dont il

sexprime. Le developpement de la biologie moleculaire re-

pose sur Iutilisation doutils enzymatiques, dont les pre-

miers ont ete les enzymes de restriction bacteriennes. Ces

outils permettent de couper, lier, synthetiser et lire IADN.

Quelques-unes des techniques les plus representatives

Requ le 29 dkcembre 1998 ; accept6 aprhs hision le 19 avril 1999.

sont detaillees. Certaines, telles que la PCR, sont couram-

ment employees dans le domaine clinique. Lexperimenta-

tion in viv o a donne naissance a des modeles animaux

dont on sait modifier le genome. II devient possible dana-

lyser, sur un organisme entier, les consequences de ces

modifications. Recemment, la possibilite de cloner un

mammifere, puis celle de cultiver des cellules humaines to-

tipotentes, ont bouleverse les previsions en termes dap-

plications a Ihomme. Les principes de ces voies de recher-

the sont exposes. Le point est fait sur Ietat davancement

des programmes de therapie genique et de cartographic

du genome humain. 0 1999 Elsevier, Paris

biologie mol&ulaire

ABSTRACT

To understand molecular biology.

Objectives: To display theorical and methodological basis

of the molecular biology. To point out its main medical ap-

plications.

Data sources: For this review, we analysed the English

and French literature concerning the research and clinical

aspects of the molecular biology, especially in anaesthesio-

logy and intensive care, using the Medline@ database. The

current textbooks were also used.

Study selection: We selected: 1) the original articles cor-

responding to the main advances that resulted in the

present state of this discipline; 2) the reviews; 3) some

chapters of textbooks.

Data extraction: In this review, we report: 1) the current

knowledge concerning the conservation and the expres-

sion of the genome; 2) the principles of the most widely

used experimental techniques; 3) the medical applications

of this knowledge in anaesthesiology and intensive care;

4) the more recent developments of this research field.


2/23

726

V. Laudenbach et al.

Data synthesis: Within medical biology, molecular biology

essentially corresponds to the study of nucleic acids. In this

review, the general principles governing the organization

and expression of the genome are discussed. The expan-

sion of molecular biology has been a consequence of the

widespread use of enzymatic tools, of which bacterial re-

striction enzymes were the firs t. Numerous enzymes are

now available, permitting DNA strands to be cut, linked,

synthesized and sequenced. Several of the most repre-

sentative molecular biology techniques are described.

Some of them, such as PCR, are commonly used in clini-

cal situations. Animal experimental models have also been

generated by genome altering methods, in order to ana-

lyse the phenotypic consequences of these modifications.

Recent ly, a viable mammal, deriving from a differentiated

cell, has been cloned. Human embryonic totipotent stem

cells are now available in cultures. These advances have

important ethical implications whilst, at the same time, of-

fering new opportunities for medical applications. The state

of gene therapy and human genome sequencing pro-

grammes is discussed. 0 1999 Elsevier, Paris

molecular biology

Abreviations : ADN : acide dCsoxyribonuclCique ; ARN : acide

ribonuclkique ; ADNc : ADN complkmentaire ; ARNm : ARN

messager ; ARNr : ARN ribosomal ; ARNt : ARN de transfert.

La biologie moleculaire correspond a lintegration

de toutes les donnees moleculaires necessaires a la

comprehension des mecanismes biologiques. Le

terme de biologie moleculaire utilise couramment en

biologie medicale designe letude des acides nuclei-

ques, lacide desoxyribonucleique (ADN) et lacide

ribonucleique (ARN). Ces molecules sont a lorigine

des phbnomenes biologiques impliques dans la

structure et le fonctionnement des cellules et des or-

ganismes entiers. Ces phenomenes sont la synthese,

la modification et la degradation des proteines, lipi-

des et sucres, mais aussi des acides nucleiques eux-

memes. LADN est le support de linformation ge-

netique. Ses modifications peuvent Ctre a lorigine

de pathologies congenitales ou acquises. Les travaux

realids ces 30 dernieres annees ont permis une des-

cription extremement precise, quoique inachevee,

des bases moleculaires de phenomitnes observes

chez differents organismes. Lidentification de cer-

taines modifications pathologiques du genome peut

etre realisee en pratique courante. On peut detecter

la presence d ADN exogene, bacterien ou viral, dans

un organisme humain. 11 est desorrnais possible de


3/23

Tableau I. Le code genetique.

Comprendre la biologie moleculaire

727

I base

T

2 base 3 base

c A G

T

l-l-T

TTC

I

Phe

TTA

TTG I

Leu

CTT \

C

CTC

CTA

CTG

Leu

A

ATTTT

ATCTC I

Ileuleu

ACT

ACC

ATATA

Met

ACA

ATGTG

Met

ACG

G

GTC

GTA

I

Val

GTG

TCT

TCC

TCA

TCG

CCT

ccc

CCA

CCG

GCT

GCC

GCA

GCG

TAT

TAC

TAA

TAG

CAT

Ser

Pro

CAC

CAA

CAG

A AT

Thr

AAC

AAA

Ala

AAG

GAT

GAC

GAA

GAG

TY~

stop

TGT

TGC

TGA

TGG

His

CGT

CGC

Gin

CGA

CGG

Asn

AGT

AGC

LYS

AGA

AGG

Asp

GGT

GGC

I

Glu

GGA

GGG

CYS

T

C

stop A

V-J

G

T

Arg

C

A

G

Ser

T

C

Arg

A

G

T

GUY

C

A

G

Buses; T: thymine ; C : cytosine ; A : adenine, G : guanine ; Acide s a minb correspondant aux codons : Phe : phtnylalanine ; Leu : leucine ;

Ileu : isoleucine ; Met : methionine ; Val : valine ; Ser : serine ; Pro : proline ; Thr : threonine ; Ala : alanine ; Tyr : tyrosine ; His : histidine ;

Gin : glutamine ; Asn : asparagine ; Lys : lysine ; Asp : acide aspartique ; Glu : acide glutamique ; Cys : cysteine ; Trp : tryptophane ; Arg :

arginine ; Gly : glycine. Stop : codons


4/23

728

V. Laudenbach et al

5

jr- --

-

- 5

Figure 1. Double hClice de Watson, Crick et Wilkins [2].

tre, , e groupement OH sit& en 3 dun

desoxyribose et, , le groupement phos-

phate situ6 en 5 du desoxyribose suivant. Chaque

brin a une orientation, possedant un groupement 5

phosphate libre a une extremite et un groupement 3

hydroxyle (OH) libre a lautre. Lorientation 5 vers

3 est appelee


5/23

Comprendre la biologie molCculaire

729

nien est une sorte de chapelet de particules appelees

nucleosomes. Ce sont des groupes de prottines nom-

mees histones. Elles sont regroupees en octameres

autour desquels senroule 1ADN. Les histones per-

mettent ainsi un premier niveau de compactage de

1ADN. Elles ont Cgalement un role dans la rbgula-

tion de lexpression des genes [8, 91. Lagencement

de 1ADN et des histones realise une fibre dont le

diametre en microscopic Clectronique est de 10 na-

nometres. Cette fibre peut elle-mCme former une he-

lice, dont le diametre apparent est de 30 nanometres.

Lorganisation spatiale de la double helice participe

aux mecanismes de regulation de lexpression des

genes. Elle determine laccessibilite de 1ADN a di-

vers facteurs proteiques. Ces facteurs peuvent etre

impliques dans la transcription des genes ou dans la

replication. Le compactage de la molecule d ADN

permet Cgalement des interactions entre des sequen-

ces qui seraient distantes les unes des autres si

1ADN Ctait linearise [lo, 111.

Organisation g&hale des ghes

Lhomme possbde entre 60 000 et 70 000 genes.

Leur expression aboutit a un nombre de proteines

differentes non determine. Les differents elements

dune meme sequence codante peuvent Ctre em-

ploy& de facon variable selon lenvironnement cel-

lulaire, aboutissant a differentes modalites de traduc-

tion. Cest le cas du gene de la calcitonine, proteine

produite par les cellules thyroidiennes. Ce gene peut

Cgalement coder pour le CGRP (calcitonin gene

related peptide), un neuropeptide, selon le choix des

exons effectivement transcrits [12]. En fait, la ma-

jeure partie de 1ADN total est non codant. Certaines

des sequences de cet ADN non codant ont un role

dans lorganisation de la structure de la chromatine

ou, au tours de la mitose, dans celle des chromoso-

mes.

On distingue trois classes de genes, definies en

fonction de la nature de IARN polymerase (I, II ou

III) assurant leur transcription. Les genes de classe I

sont les genes des ARN du ribosome (ARNr). Le ri-

bosome traduit les ARNm dans le cytoplasme. La

classe III est celle des ARN de transfert (ARNt),

Cgalement impliques dans la traduction. Les genes

de ces deux classes sont tres rep&es dans le genome.

Au contraire, la plupart des genes codant pour les

proteines, dits genes de classe II, sont presents en un

seul exemplaire. Leur organisation g&-i&ale est illus-

tree par la Jigwe 2. En amont (5) de la sequence

codante, on trouve une region appelee promoteur.

Cette region est celle sur laquelle se fixe 1ARN po-

lymerase. Cette enzyme fait partie dun complexe

proteique qui va transcrire en ARNm la sequence si-

tuee plus en aval. Elle se fixe au promoteur par lin-

termediaire de cofacteurs, au niveau dune sequence

particuliere, appelee


6/23

730 V. Laudenbach et al.

Initiation de Is

5

L__ I

. . . .

3

Promoteur -. 2. ..__ j. _.~

qui est traduit.

Le transcrit primaire, ou ARN pre-messager, de lARNm, doit subir une matura-

tion. Elle a egalement lieu dans le noyau. La pre-

miere &ape est la fixation dune coiffe nucleotidique

a lextremite 5. Sa presence est necessaire au trans-

port vers le cytoplasme et a linitiation de la traduc-

tion. Une fois la transcription achevee, une polyA

polymerase lie a lextremite 3 une sequence de

quelques centaines dadenosines. Cette sequence

polyA est impliquee dans la stabilisation du trans-

crit, cest-a-dire linhibition des systemes enzymati-

ques de degradation des ARNm [20-221. Enfin,


7/23

Comprendre la biologic moltculaire 731

1ARNm doit subir un Cpissage (splicing). Cet Cpis-

sage aboutit a lelimination des sequences non tra-

duites. A chaque extremite des introns, se trouvent

des sequences conservees, dites sequences consen-

sus.

Elles definissent un site donneur et un site accepteur,

au niveau desquels 1ARN pre-messager est clive.

Lintron est lib&C et les deux exons situ& de part et

dautre sont lies par une reaction de transesterifica-

tion. Lepissage necessite la cooperation des snRNP

(Small Nuclear RiboNucleoProteins), associant des

proteines et des ARN de petite taille, les snRNA

(pour Small Nuclear RNA). Lordre dans lequel les

introns et les exons sont elimines nest pas constant.

Les &apes successives de la maturation produisent

plusieurs transcrits intermediaires. Le choix des

exons elimines peut varier selon le contexte cellu-

laire, generant des transcrits specifiques de tissus.

Cette variabilite dans le choix des exons traduits est

appelee Cpissage alternatif [23, 241.

Traduction

LARNm est exporte vers le cytoplasme pour etre

traduit. Cest un processus actif qui necessite une

maturation complete de 1ARNm [25]. Dans le cas

de molecules dARN de tres grande taille, la traduc-

tion peut debuter avant quelles ne soient totalement

exportees. La synthese dune chaine peptidique fait

intervenir deux nouveaux acteurs : les ribosomes et

les ARNt. Le ribosome est form6 par lassociation

de proteines et dARNr. I1 comporte deux sous-

unites : la petite (coefficient de sedimentation 40s)

et la grande (60s). Sa fonction est de lier successi-

vement les acides amines correspondant aux codons

align& sur 1ARNm. 11coop&e avec les ARNt, ARN

de transfer-t. Ces ARN, constitues de 75 a 85 nucleo-

tides, ont une structure secondaire, cest-a-dire une

organisation spatiale qui realise une forme de feuille

de trefle. Lun des


8/23


RCgulation de lexpression des g&es

Elle permet de nexprimer que les genes requis selon

le stade du developpement de lorganisme, selon le

type cellulaire, ou en reponse a des stimuli externes.

Chez les eucaryotes, on distingue schematiquement

cinq niveaux de regulation possibles : chromatinien,

transcriptionnel, post-transcriptionnel, traductionnel

et post-traductionnel. La regulation de lexpression

des genes bacteriens est presque exclusivement

transcriptionnelle.

Conformation spatiale de la chromatine

Lexpression des genes necessite que des proteines

regulatrices accedent a 1ADN chromatinien, ce qui

est impossible en cas de compactage excessif . Les

regions actives, contenant des genes effectivement

exprimes, sont souvent delimitees par des zones

dancrage au feuillet interne de la membrane nu-

cleaire. Ces replis encadrent des boucles chromati-

niennes dont lorganisation peut ainsi Ctre modifiee

independamment des regions adjacentes. Certaines

sequences, comme le LCR (Locus Control Region)

du gene de la chaine B de la globine, sont impliquees

dans les variations de compaction de regions de la

chromatine [26]. Un gene peut Ctre a lorigine inac-

tif, en raison de lagencement de ses differents Cl&

ments. Une recombinaison peut etre necessaire a

leur expression. Cette recombinaison aboutit au de-

placement dune partie du gene sur la molecule

dADN. Elle se fait avec le contours de systemes

enzymatiques (recombinases) capables de cliver

1ADN double brin sur des sites specifiques (endo-

nucleases) puis de lier la sequence deplacee sur son

nouveau site (ligases). Un des modeles de ce meca-

nisme de regulation est le rearrangement des genes

codant pour les immunoglobulines ou pour les re-

cepteurs des lymphocytes T [27, 281.

Rbgulation de la transcription

La notion de sequence reconnue par des proteines

trans-regulatrices a emerge avec lidentification du

represseur du bacteriophage h. Les phages sont des

virus infectant les batteries. Le represseur est une

proteine codee par le genome viral. Lorsque celui-ci

est integre a 1ADN bacterien, cette proteine se fixe

aux elements regulateurs des genes viraux. Elle in-

hibe lexpression des proteines necessaires a la syn-

these de nouvelles particules virales. Son site de

fixation recouvre partiellement celui de 1ARN po-

lymerase, quelle empeche de se lier a 1ADN. Le

represseur autorise ainsi le virus a rester quiescent et

a beneficier de lappareil de replication de 1ADN

bacterien pour amplifier ses propres sequences [29].

Les facteurs proteiques truns-regulateurs eucaryo-

tes appartiennent a quatre grandes categories : pro-

teines helice-tour-helice, helice-boucle-helice, en

doigt de gant a ion Zinc (Zn++ finger) ou en

fermeture-eclair a leucines (leucine-zipper) [30, 3 11.

Ces facteurs peuvent agir sous forme de monombres

ou de dim&es, parfois en coop&ant avec dautres

proteines. Leur expression est elle-meme soumise a

une regulation. Lactivite de certains facteurs trans-

criptionnels necessite une induction par un signal

intra- ou extracellulaire. Differents mecanismes

dactivation sont decrits : dephosphorylations, pro-

teolyses, facteurs sequestres dans le cytoplasme et

qui gagnent le noyau apres lyse dune liaison pepti-

dique, facteurs qui ne peuvent gagner le noyau

quapres liaison avec leur ligand. Le recepteur des

glucocorticoides est une proteine cytoplasmique, as-

sociee a la proteine hsp 90. La fixation du ligand du

recepteur entraine la rupture de cette liaison. Le re-

cepteur se deplace alors vers le noyau et active les

genes dont le promoteur possede le GRE (Glucocor-

ticoid Responsive Element), sequence cis-regulatrice

(voir le chapitre sur lorganisation g&r&ale des ge-

nes). Cest le cas du gene IKB, codant une proteine

qui sequestre a son tour dans le cytoplasme un autre

facteur, FKB, capable dactiver les genes de differen-

tes cytokines [32]. Cette cascade devenements cel-

lulaires illustre la man&e dont le mode daction

dune molecule, ici anti-inflammatoire, peut etre dis-

sCquC a lechelon moleculaire.

R&ulation post-transcriptionnelle

La notion depissage alternatif a deja CtC abordee.

Lattenuation transcriptionnelle est un mecanisme

rencontre chez les adtnovirus ou le virus VIH. Lac-

tivite de 1ARN polymerase peut etre diminde,

voire interrompue au niveau de sites situ& en amont

du site de terminaison normal de la transcription.

Les ARN incomplets produits de cette facon ne peu-

vent pas etre polyadenyles. 11s exercent un retrocon-

trble negatif sur IARN polymerase. Ce retrocontrole

negatif peut Ctre 1evC par des facteurs proteiques

liant les ARN incomplets [33]. Dans dautres situa-

tions, les variations du site de coupure du transcrit


9/23

Comprendre la biologie mokulaire

133

primaire saccompagnent dune polyadenylation

normale par la polyA polymerase. Elles entrainent

des modifications de la portion carboxy-terminale

de la proteine. Cest le cas pour les immunoglobuli-

nes produites par les lymphocytes B. Dans les cel-

lules pluripotentes initiales, elles comportent une

portion COOH terminale hydrophobe, ancree dans

la membrane cellulaire. Ce sont alors des recepteurs

membranaires aux antigenes. Apres une stimulation

antigenique induisant une proliferation clonale, la

portion 3 du transcrit qui correspond aux acides

amines hydrophobes est clivee. La proteine est alors

secretee [33].

La maturation de 1ARNm est un phenomene nu-

cleaire. La traduction necessite au prealable le trans-

port du transcrit vers le cytoplasme au travers des

pores de la membrane nucleaire. Ce transport se fait

de man&e active. 11 nest possible que si la matura-

tion est complete. Lexistence dune regulation du

transport nest pas demontree a ce jour, mais cha-

curie des modifications de 1ARNm requises peut

Ctre soumise a un mecanisme de controle [34]. Une

fois dans le cytoplasme, 1ARNm peut etre specifi-

quement adresse vers un compartiment cellu-

laire [35]. LARNm codant lactine chez les mam-

miferes est adresse au , region

riche en filaments dactine. Dans ce cas, le signal

dadressage est sit& dans la region 3 transcrite non

traduite. L ARNm peut etre stock6 dans le noyau ou

le cytoplasme. A la suite de signaux inducteurs, les

stocks peuvent &r-e mobilises et la traduction rapi-

dement augmentee saris necessiter de variations de

la transcription. La cellule peut aussi modifier la

concentration dARNm et le taux de traduction, saris

modification transcriptionnelle, en agissant sur la

stabilite metabolique des messagers [36]. Les se-

quences regulatrices impliquees dans les variations

de stabilite sont localisees dans les regions non tra-

duites. Elles fixent des facteurs capables de faciliter,

ou au contraire dinhiber, laction des endonuclea-

ses, enzymes responsables de la degradation des

messagers. Deux autres mecanismes de regulation

post-transcriptionnelle sont connus. 11s sont em-

ployes par le trypanosome, le protozoaire responsa-

ble de la maladie du sommeil. Le trans-Cpissage est

un Cpissage qui aboutit a la liaison de deux transcrits

differents. Les differentes combinaisons de transcrits

participent a lextreme variabilite des glycoprotei-

nes de surface qui permet au trypanosome dechap-

per au systeme immunitaire [37]. Rarement, on peut

observer une modification de la structure primaire de

1ARNm (RNA editing), par clivage-introduction

duraciles supplementaires. Des ARN y-

toplasmiques jouent le role de matrice et de 38].

R&&ion de la traduction

Linitiation de la traduction necessite la participa-

tion des facteurs dinitiation. Lun dentre eux, eIF2,

peut etre inactive par phosphorylation [39]. Les ki-

nases responsables de cette inactivation sont indui-

tes a la suite de signaux, tels que la production de

>. La consequence de ces si-

gnaux est une reduction du taux de traduction. Elle

nest pas equivalente pour toutes les proteines.

Linactivation des facteurs dinitiation est un des

mecanismes de reduction des syntheses proteiques

dans les cellules qui entrent en phase dite ,

cest-a-dire qui quittent le cycle proliferatif. Lini-

tiation de la traduction peut Ctre bloquee Cgalement

par la fixation de facteurs represseurs sur 1ARNm.

Dans certains cas, la petite sous-unite ribosomale

nidentifie pas le codon ATG situe en premiere place

en 5 comme &ant le codon initiateur. Cest alors le

second ou le troisieme ATG rencontre sur 1ARN qui

marque le debut de la chaine peptidique [40]. On

peut Cgalement trouver un site de fixation du ribo-

some interne a la phase codante, a distance du codon

initiateur [41]. Ces CX IRES) peuvent etre employ& a des fins expe-

rimentales. 11spermettent a un vecteur recombinant,

par exemple adenoviral, dexprimer simultanement

dans le meme tissu deux proteines distinctes. Pour

cela, il faut avoir introduit chacune des deux sequen-

ces dans le vecteur, separees par un IRES et placees

sous le controle dun meme promoteur.

Les differents systemes regulateurs que nous

venons de voir representent autant de moyens de

moduler le produit des informations du genome. On

peut les employer afin danalyser les effets de la

surexpression ou de linhibition dun gene dans un

organisme. 11 est necessaire de comprendre leurs

variations, qui peuvent Ctre a lorigine de maladies.

Leur exploitation thtrapeutique est possible, soit en

les considerant comme des cibles chez des agents in-

fectieux, soit, a lavenir, en cherchant a corriger

leurs erreurs chez Ihomme.


10/23

734


QUELQUES OUTILS ET TECHNIQUES

DE BIOLOGIE MOLkCULAIFW

Enzymes

Enzymes de restriction

Ce sont des endonucleases dorigine bacterienne, ca-

pables de couper IADN double brin apres avoir re-

connu des sequences specifiques (&we 4). Le site

de reconnaissance est appele site de restriction. Elles

permettent de cliver une molecule dADN en plu-

sieurs fragments, dont la taille est reproductible pour

un meme couple ADN-enzyme. On parle de diges-

tion de 1ADN. I1 sagit dun mecanisme de defense

des batteries vis-a-vis des virus bacteriophages. Les

enzymes bacteriennes clivent 1ADN viral et empe-

chent ainsi son integration au genome. Elles respec-

tent 1ADN bacterien car celui-ci est methyl6 sur les

adenines ou les cytosines des sequences qui pour-

raient etre reconnues comme sites de restriction, ce

qui les empeche dy acceder. La protection enzyma-

tique vis-a-vis des virus est restreinte a certaines

souches bacteriennes, en fonction des enzymes

quelles produisent, doti le terme denzymes de res-

triction Elles permettent de determiner le profil de

restriction dun ADN, cest-a-dire la repartition des

sites de coupure, reflet de la sequence nucleotidique.

En fonction de cette repartition, la digestion enzy-

matique va produire un nombre donne de fragments

dADN, dont la taille peut etre determinCe par mi-

gration en Clectrophorese sur gel. Une autre applica-

tion frequente est le clonage de sequences, par

coupure-ligation dans un vecteur.

Polymerases dacides nucleiques

Les polymerases sont capables de lier entre eux une

succession de nucleotides et ainsi de synthetiser un

acide nucleique.

Les ADN polymerases synthetisent le brin com-

plementaire dune matrice (ADN monobrin) a partir

dune amorce (ARN ou ADN).

La transcriptase inverse est une ADN polyme-

rase ARN dependante. Elle est employee pour pro-

duire des banques dADN dits complementaires

(ADNc) a partir des ARN extraits de cellules ou de

tissus.

La Taq polymerase est une ADN polymerase ex-

traite de batteries du genre Thermus aquaticus, de-

couvertes dans des sources chaudes. Elle est stable a

Mw

IkMophor~se SW gel dagmse

color.6 ubromured&hidiwn

nae 111

5 GG CC 3

(3c enzyme emaite

dH. inq7uenzar)

3CC

I

GG 5

Coupure B bous francs

(blunt ends)

Figure 4. Digestion de IADN par des enzymes de restriction. Cer-

taines enzymes de restriction coupent IADN au niveau du site de

restriction, dautres a distance de ce site. Seules les premieres ont

une utilisation courante. Deux types de coupure peuvent etre obser-

ves . Les coupures a bouts f rancs (blunt ends) correspondent a une

coupure realisee au m&me niveau sur les deux brins dADN. II ne

peut pas y avoir de reassociation spontanee des deux brins. Les cou-

pures a bouts cohesifs (sticky ends) sont des coupures realisees en

un point different sur chaque brin, les deux points &ant separes de

quelques bases. Les fragments simple brin situ& de part et dautre

de la zone de coupure peuvent se reapparier spontanement.

des temperatures depassant 90 C. Sa principale ap-

plication est la methode damplification par reaction

de polymerisation en chaine ou PCR.

Les ARN polymerases sont capables de transcrire

un des brins dun ADN double brin.

Ligases

Elles sont capables de creer des liaisons phospho-

diester entre des molecules dacides nucleiques. La

T4 DNA ligase, produite a partir de batteries infec-

tees par le phage T4, peut lier deux molecules

dADN double brin. Elle est necessaire au clonage

dune sequence.

Clonage

Cloner une sequence dADN consiste a lintegrer

dans un vecteur, de facon a pouvoir lamplifier et la

conserver a des fins experimentales. Le vecteur est

lui-meme une sequence dADN, dont la fonction est

dincorporer la sequence que lon souhaite cloner,

puis dautoriser sa multiplication dans une cellule-

h8te. Ce vecteur doit done etre replique dans la cel-

lule-hate. 11 doit posseder des proprietes permettant


11/23


735

de lidentifier de faGon certaine, telles que la pre-

sence dun gene de resistance a certains antibioti-

ques. Afin de faciliter la manipulation des sequences

recombinantes, il doit etre de taille aussi petite que

possible et posseder un grand nombre de sites de res-

triction uniques. Un

CColylinker

>> succession de si-

tes de restriction uniques) peut y etre introduit. Dif-

ferents vecteurs peuvent Ctre employ& : plasmides,

phages, autres virus, cosmides, chromosomes artifi-

ciels de levure. Leur choix depend de la taille de

linsert desire, les plasmides &ant capable dintegrer

des sequences dont la taille nexcede pas 10 kiloba-

ses, contre plusieurs centaines pour les chromoso-

mes de levure. Un vecteur peut etre destine a la mul-

tiplication et a lanalyse de linsert, mais il peut aussi

exprimer une proteine dont il renferme le gene. La

nature de la cellule-hate du vecteur varie. Dans la

majorite des cas, les batteries de type E. cob sont

employees. Elles ont lavantage dun faible coQt et

dun temps de doublement court (20 minutes a

37 C), autorisant une amplification rapide de la se-

quence clonee. Lemploi des cellules eucaryotes (le-

vures, cellules animales ou humaines) est necessaire

si lon veut obtenir lexpression dune proteine ne-

cessitant des modifications post-traductionnelles

specifiques des eucaryotes. Elles constituent Cgale-

ment le stade initial de la generation dorganismes

gtnetiquement modifies.

La situation la plus simple est celle dun insert de

quelques kilobases que lon veut cloner dans un

plasmide (figure 5). Le plasmide est une molecule

dADN double brin circulaire, qui doit dabord etre

linearise par coupure enzymatique. Pour Cviter la re-

fermeture du plasmide sur lui-meme, ses extremites

sont traitees a la phosphatase alcaline, qui dephos-

phoryle les nucleotides en 5. Le vecteur ne peut se

recirculariser quen integrant linsert, dont les extre-

mites sont phosphorylees. La ligation de linsert au

vecteur est assuree par une ligase. Le plasmide re-

combinant est alors introduit dans des batteries,

prealablement fragilisees pour etre permeables a

IADN (on parle de ).

Lintroduction de lADN, ou transformation bacte-

rienne, est obtenue par un choc thermique bref. Les

batteries transformees sont etalees sur une boite de

Petri. Lidentification des clones recombinants ne-

cessite un marqueur de selection. Le plus courant, le

gene de resistance a lampicilline, est present dans

de nombreux plasmides commerciaux. Sur un mi-

Coupure par un ou plusieurs

enzyme(s) de restriction

Ghe

Gist

A lampicil l ine

Plasmide linhts~

5 P

OH

OHS

I

P 3

Phosphatase

t

alcaline

Ligase

-I

:: OH OHS

OH OH 3

5 p OHs

OH P 1

ADN B cloner _I

Transfection et amplification dans E. coli

sur milieu ampicilline+

Figure

5. Clonage dun ADN double brin dam un plasmide. On

doit disposer au moins dun site de coupure unique pour une en-

zyme de restriction. Dam ce cas, Iinsert est orient6 au hasard par

rapport au plasmide. Si on veut sassurer de IJorientation de linsert,

il fau t choisir deux enzymes a sites uniques. A condition que chaque

extrtmite de Iinsert ait une sequence compatible avec un seul des

deux sites, le clonage ne pourra se faire que dam un seul sens. Si

Iinsert est une sequence codant pour une proteine que Ion souhaite

exprimer, Iexpression ne peut se faire correctement que si les CIC-

ments de la construction dADN sont agences dans le bon ordre

avec la bonne orientation.

lieu de culture contenant de lampicilline, seules les

batteries ayant integre le plasmide peuvent pousser.

On peut alors les repiquer sur un autre milieu, les

laisser se multiplier et extraire ensuite 1ADN desire,

dont la quantite aura CtC augmentee de facon expo-

nentielle.

Le terme de clonage peut avoir un sens plus large,

puisquil peut designer lamplification, non seule-

ment dune sequence dADN, mais aussi dune li-

gnee cellulaire ou dun organisme entier. Dans tous

les cas, il sagit dexpandre lobjet analyse sous for-

mes de copies parfaitement identiques.

Analyse du projil de restriction dun ADN :

la mt%hode du Southern Blotting

Cette methode a Cte mise au point par Southern [42].

Elle necessite de posseder une sonde nucleotidique

capable de shybrider sur une portion de 1ADN ana-

lyse, dont elle possede la sequence complementaire.

Cette sonde est marquee par un compose permettant

sa detection. 11 existe differents systemes de mar-

quage reposant sur lutilisation de composes ra-

dioactifs (marquage G chaud >>) ou non (marquage


12/23


G froid >x). LADN est dig&C par une ou plusieurs

enzymes de restriction. On fait migrer le produit de

cette digestion enzymatique en Clectrophorese sur

gel, qui &pare les differents fragments en fonction

de leur poids molbculaire. Afin de pouvoir hybrider

la sonde, on transfere les fragments du gel de migra-

tion a une membrane de nitrocellulose ou de nylon

(blotting). Lhybridation de la sonde radioactive est

rCvClCe en autoradiographie. Chaque fragment

contenant la sequence complementaire de la sonde

apparait sous la forme dune bande dont la taille, qui

determine lemplacement sur le gel, depend de la po-

sition des sites de restriction.

Lanalyse du profil de restriction permet de detec-

ter des modifications du genome. 11 peut sagir de

deletions, qui diminuent la taille de certains frag-

ments, ou de mutations, supprimant ou g&Grant un

site de coupure pour une enzyme. Dautre part, les

variations dans la repartition des sites de restriction

constituent des marqueurs, transmis de facon stable

dune generation a lautre. On parle de polymorphis-

mes de restriction ou RFLP (Restriction Fragment

Length Polymorphism). Ce sont des alleles, transmis

sur le mode mendelien. 11s permettent des analyses

de liaison gtnetique. 11 existe Cgalement des poly-

morphismes de repetition. Ce sont des variations

dans le nombre de copies de sequences de quelques

nucleotides rCpCtCes en tandem. On parle de sequen-

ces minisatellites ou VNTR (Variable Number of

Tandem Repeats).

En clinique, cette methode pet-met daffirmer le ca-

ractere Cpidemique dune serie dinfections a un

germe donne. Si les ADN genomiques des differents

isolats bacteriens ont un profil de restriction super-

posable, il sagit t&s probablement de la meme sou-

the. Dans le cas contraire, sauf mutation, il sagit de

souches differentes du meme germe et non pas dune

Cpidemie [43].

Amplification du matkriel g&ktique :

rt action de polymbisation en chafne

(polymerase chain reaction-PCR)

Cette technique a CtC developpee en 1985 par Mul-

lis [44]. Elle a offert une solution au probleme des

quantites dacides nucleiques disponibles pour lex-

perimentateur. Elle permet deviter un grand nombre

de clonages. Elle est aujourdhui employee dans pra-

tiquement tous les laboratoires de bacteriologic et vi-

rologie hospitaliers. Le principe de la PCR est indi-

quC dans la$gure 6. La reaction necessite plusieurs

composants : a) lechantillon contenant 1ADN a

amplifier ; b) la Taq ADN polymerase ; c) des de-

soxyribonucleotides libres ; d) des amorces, sequen-

ces dADN simple brin, courtes, complementaires

des deux extremites de la sequence a amplifier. Len-

semble des composants est soumis a des variations

thermiques cycliques. Ces variations entrainent une

succession de denaturation-renaturation de 1ADN.

Comme les oligonucleotides amorces sont presents

en large excbs et sont beaucoup plus courts que les

brins dADN natif, ils vont shybrider de facon pre-

ferentielle aux regions flanquant la sequence a am-

plifier. A partir de ces amorces, la Taq ADN poly-

merase synthetise le brin complementaire de chacun

des brins matrices. La repetition des cycles permet,

par duplications successives, une augmentation

quasi-exponentielle de la quantite dADN total. En

fait, le rendement de chaque cycle est plutot de lor-

dre de 80 % initialement et diminue progressive-

ment. Cette diminution est due a lhybridation dune

partie des brins dADN entre eux plutot quavec les

amorces, et a une baisse du rapport des concentra-

tions entre les composants de la reaction, en particu-

lier la Taq polymerase et 1ADN amplifie. Lampli-

fication dune sequence de 1 000 bases est assez

aisee. Des appareils automatises assurent maintenant

en routine et avec une grande precision les variations

cycliques de temperature. Cette methode extreme-

ment sensible peut detecter des concentrations

d ADN inferieures au fentomolaire ( lo-l5 molLi).

La PCR peut etre appliquee a toutes sortes de prelit-

vements susceptibles de contenir de 1ADN : liqui-

des biologiques, cultures bacteriennes, coupes histo-

logiques, cheveux, voire fossiles. Plusieurs virus

(CMV, herpes) ou batteries (BK, coqueluche) peu-

vent Ctre recherches en pratique courante. Les conta-

minations et les amplifications parasites, principal

ecueil a Cviter, sont le prix de lefficacite de cette

mtthode. Pour les prevenir, des conditions experi-

mentales rigoureuses doivent Ctre respectees : choix

des amorces autorisant un minimum de


13/23


731

ADN B amplifier

Tampon+Mg++

Amorces

(OligonuclCotides)

dATP, dGTP

dCTP, dTTP

Dhatura tion ( 94C)

lmin

(Sparation des brins dADN)

17

J

Hybridatio;{xnorc es ( 60C)

n Cycles

5 - 5

3 -

3

Elongation ( 72C)

5

min / IOOOpb)

3

Figure 6. Amplification dun ADN par polymerisation en chaine

(Polymerase Chain Reaction, PCR). Le melange est soumis a une

denaturation par chauffage a 94C. A cette temperature, les deux

brins de IADN a amplifier sont stpares par rupture des liaisons hy-

drogene. 11souent le role de matrices pour la Taq polymerase. On

ram&e ensuite la temperature a une valeur de lordre de 55 a 60 C,

de facon a rehybrider les brim complementaires. La temperature

dhybridation optimale varie selon la nature des amorces choisies et

de IADN pourront transmettre le transgene a leur

descendance. Toutefois, lintegration dun transgene

nest pas toujours synonyme dexpression. Selon le

site dinsertion dans le genome, les conditions loca-

les sont plus ou moins favorables (conformation de

la chromatine, interactions avec des sequences voi-

sines ou des facteurs de regulation transcription-

nelle). La presence du transgene peut Ctre detectee

par PCR sur 1ADN de lanimal, extrait dun tissu

(en pratique courante, on preleve un bout de queue).

Son expression peut Ctre recherchee par differents

moyens tels que lhybridation in situ, qui detecte

1ARNm sur coupes histologiques, ou limmunomar-

quage avec un anticorps specifique de la proteine


14/23

738


RLeioo

RCioa

Promat eur codante nanqunote

I I

dans Put us -

I

I

dune fe melle pseudo-g ante

r

Souris transghiques

(PCR+)

Figure 7. La transgenkse (voir texte).

exprimee. Parmi les nombreuses lignees danimaux

transgeniques produites, citons les animaux surex-

primant le peptide b amyloide, implique dans la ma-

ladie dAlzheimer [47]. Dans le domaine des xeno-

greffes, une approche testee consiste a exprimer chez

le port les genes de proteines humaines regulatrices

du complement (CD46, CD55, CD59), dans le but

de prevenir les reactions de rejet vasculaire hyper-

aigu [48].

Recombinaison homologue in vivo :

invalidation dun gtne ou H knock-out M

Au lieu dintroduire un transgene dans un orga-

nisme, il sagit ici de supprimer un gene endogene,

puis detudier les consequences de cette suppression.

11 est ainsi possible de creer des modeles de mala-

dies genetiques transmises sur le mode autosomique

recessif. Le prealable a la production danimaux re-

combinants a CtC la possibilite de cultiver des cellu-

les embryonnaires totipotentes. Ces cellules sont ex-

traites du blastocyste, la pat-tie de lceuf feconde en

tours de division destinee a devenir le fetus. Le sys-

t&me le plus robuste est celui des cellules ES de sou-

ris (Embryonic Stem CeEls). La strategic employee

est resumte par la$gure 8. Elle consiste a inoculer

aux cellules ES en culture une construction dADN

appelee vecteur dinsertion. La recombinaison est

effectuee par les recombinases cellulaires. Ces enzy-

mes font partie des systemes de


15/23


739

GENE >

I

/ -Y

Celuleri ES

0

rugion 5 banalogue i

,.... ;i

.Y R ion 3 hmologue

Cdulea

,./ ;

ES @

.,..... ,; /.

R DINSERTION

ccKNOCK OUT P

Descendaoce chimhique

Nee-R: g e de r stance P a nhomycine

NLS-hcZ: ~Galactosidax

TK : thymidine kinnse virnle

egn KO fond ice

Figure 8. La recombinaison homologue in vivo (knock-ours). On

introduit dans des cellules ES un vecteur de recombinaison. Cette

construction dADN comporte un ou plusieurs marqueurs de selec-

tion encadres par deux sequences, homologues a celles si tuees de

part et dautre du gene (>est le cat-act&e l&al de la mutation, si

le gene recombine est critique pour le developpe-

ment embryonnaire. On peut contourner cette diff i-

cult& en produisant des


16/23


ThCrapie gCnique

Le decryptage des mecanismes moleculaires de ma-

ladies a conduit a envisager la correction des ano-

malies responsables au niveau de IADN. Cette ap-

proche permettrait deviter le recours a des drogues

defficacite limitee, aux effets secondaires parfois

graves. Elle se heurte a de nombreuses difficult&

methodologiques. Ses applications en clinique sont

limitees a des protocoles de recherche dont les re-

sultats sont encore tres preliminaires. 11apparait plus

simple de tenter de corriger une perte de fonction,

enzymatique par exemple, en apportant a lorga-

nisme un gene exogene qui code pour la proteine de-

ficiente, que de > directement lanomalie

de 1ADN. Un gene peut alors devenir .

Le premier probleme a resoudre est celui du choix

du gene sur lequel on doit agir. Ce probleme est as-

sez facilement resolu dans le cas de maladies gene-

tiques a Iorigine dun deficit en une proteine. Tou-

tefois, si lon cherche a apporter un gene sain pour

pallier ce deficit, on doit pouvoir controler son ni-

veau dexpression, afin deviter une surproduction

deletere. Lexpression du gene apporte doit souvent

etre limitee a un tissu. Dans certains cas, elle devrait

pouvoir &i-e regulee.

Dans le traitement des cancers, plusieurs voies de

recherche sont possibles. Certaines Cquipes ont tent6

dinduire une reponse immune antitumorale en

transferant les genes codant pour differentes cytoki-

nes (IL2, IL4, IL7, GM-CSF) dans des cellules ma-

lignes, prelevees puis reinoculees [59]. Dautres ont

cherche a surexprimer un anti-oncogene (gene sup-

presseur de cancer), comme le gene de la proteine

~53. Cette proteine est normalement impliquee dans

linduction de la mort cellulaire. La mutation ou la

deletion du gene correspondant est a lorigine de cer-

tains cancers [60, 611. On peut Cgalement tenter

dinhiber lexpression dun oncogene, ou gene im-

plique dans la naissance de tumeurs, en inoculant un

ARN antisens, cest-a-dire un ARN capable de shy-

brider avec 1ARNm de loncogene et ainsi den em-

p&her la traduction [62]. On peut donner un avan-

tage selectif aux cellules saines en transferant un

gene dit > hepatite B, virus

influenza, VIH). La voie dinoculation depend du


17/23

Comprendre la biologie molkulaire

741

vecteur et de lindication : greffe de moelle, injec-

tions, aerosols, etc.

Environ 300 protocoles devaluation clinique sont

en tours [65]. Un seul a atteint le stade des essais de

phase III. 11 sagit de limplantation intratumorale,

dans des glioblastomes, de cellules murines infec-

tees par un retrovirus porteur du gene HSV-tk [68].

Dans la plupart des autres protocoles, les benefices

se sont pour linstant limit& a certains patients

consider& incurables par une prise en charge

conventionnelle. En revanche, la faisabilite et lin-

nocuite de ce type dapproche ont pu &tre demon-

trees dans de nombreux cas. Le cas du deficit conge-

nital en adenosine-desaminase (ADA), a lorigine

dune immunodepression severe (severe combined

immunodeficiency syndrome, SCID), doit Ctre sou-

ligne. Deux enfants, atteints de cette maladie rare et

jusqualors toujours fatale, ont Cte trait& par inocu-

lation ex vivo de retrovirus ADA + dans leurs lym-

phocytes T [69]. Letude a debut6 en 1990, avec suc-

c&s a ce jour. Plusieurs autres enfants ont CtC inclus

depuis cette date. En dehors des maladies genetiques

et candreuses, la rest&rose arterielle apres angio-

plastie est un exemple de theme de recherche. Dans

des systemes experimentaux, les phenomenes dhy-

perplasie intimale et de remodelage arteriel peuvent

etre inhibes par expression locale de facteurs cytos-

tatiques (proteines Rb, Gax, NO synthase endothe-

liale) ou cytotoxiques (gkne tk) [70]. Si le grand

nombre detudes experimentales et cliniques off re

des espoirs, lessor de la therapie genique est actuel-

lement limit6 par les difficult& rencontrees pour in-

fetter un grand nombre de cellules, de facon stable

et definitive. Les problemes de cotit sont incontour-

nables et le recul pris sur les applications cliniques

reste insuffisant a ce jour.

Biologie molbculaire, anesthbsie et &animation

Sur le plan experimental, la comprehension des me-

canismes daction dagents anesthesiques a pu Ctre

facilitee par le clonage des recepteurs des neuro-

transmetteurs et par lemploi de lignees animales ge-

netiquement pures ou modifiees. Lexpression de re-

cepteurs des neurotransmetteurs dans des systemes

in vitro (ovocytes de x&rope) permet danalyser la

contribution respective de leurs differentes sous-

unites aux effets des anesthesiques [71, 721. Par

ailleurs, lutilisation de lignees animales pures per-

met des etudes de liaison genetique entre un poly-

morphisme du genome et la sensibilite aux anesthe-

siques [73]. Simpson et al. ont identifie un locus,

Lorpl, sit& sur le chromosome 7, dont le polymor-

phisme de restriction est associe a un delai de reveil

variable apres injection de propofol chez la sou-

ris [74]. Lidentification de la sequence du gene en

cause devrait foumir des informations sur les voies

de signalisation cellulaire, impliquees dans laction

des anesthesiques ou sur leurs voies delimination.

Les lignees employees (souris LSX-SS et LSX-LS

pour Short Sleep et Long Sleep) ont Cgalement une

sensibilite differente a lethanol, a la k&amine, a

letomidate, a lisoflurane et a lenflurane [75]. En

revanche, leur comportement en reponse a lhalotane

est identique. Ces observations plaident en faveur

dun determinisme polygenique de la sensibilite aux

agents depresseurs du systeme nerveux central.

Plusieurs Cquipes ont produit des lignees de souris

mutantes, deficitaires en recepteurs de neurotrans-

metteurs ou de neuromodulateurs. Les genes des re-

cepteurs des opidides (p, K) ont ainsi CtC invali-

d& [76, 771. Letude des animaux porteurs de ces

mutations a permis detablir la responsabilite respec-

tive de ces differents recepteurs dans les mecanis-

mes controlant la douleur, lanxiete et lactivite lo-

comotrice spontanee. Le


18/23

742

V. Laudenbach et al

domaine des maladies infectieuses. Le profil de res-

triction du genome de batteries responsables din-

fections nosocomiales a CtC realise dans differentes

structures (reanimations medicales, chirurgicales,

neonatales). Les informations recueillies, sajoutant

aux caracteres phenotypiques (antibiogramme) et

immunologiques des souches isolees, permettent de

distinguer une Cpidemie de lemergence simultade

de plusieurs souches du meme germe. On peut ainsi

Cvaluer limpact des mesures de prevention ou des

traitements employ& [ lOO-1021. Sur un plan plus

fondamental, les mecanismes cellulaires de situa-

tions graves et complexes (traumatismes cerebraux,

chocs septiques, syndromes de detresse respiratoire

aigus

de ladulte) peuvent maintenant etre

decrypt& [ 103- 1051. Plusieurs travaux cliniques ont

cherche a Cvaluer la valeur pronostique du niveau

dexpression de proteines impliquees dans ces mt-

canismes [106, 1071. Leurs resultats doivent toute-

fois etre consider& avec prudence car ils sont obser-

ves sur des effect ifs de patients relativement limit&.

11pourrait exister un determinisme genetique des ca-

pacites de defense dun individu vis-a-vis des agres-

sions responsables de telles situations. En particu-

lier, en pathologie infectieuse, certaines mutations de

proteines des systemes de defense immunitaire, ex-

posant a un risque particulier, ont et& identi-

frees [108]. Les genes, dont lexpression est activee

ou reprimee dans ces circonstances, pourraient cons-

tituer des cibles therapeutiques.

AVANCtiES RlkENTES

Projet gCnome humain

I1 a CtC lance en 1986. Trois tendances compltmen-

taires se sont developpees. La cartographic des loci

morbides, cest-a-dire pour lesquels il existe un lien

genetique avec une pathologie, repose sur lanalyse

des RFLP et des polymorphismes de repetition. Le

sequencage des banques d ADNc, obtenues par

transcription inverse a partir des ARNm, limite

lanalyse a 1ADN codant. Le clonage de fragments

dADNc de grande taille est rendu possible par les

vecteurs de type YAC (Yeast Artijcial Chromoso-

mes) ou cosmides. Enfin, en parallele du genome hu-

main, la cartographic et le sequencage dautres ge-

nomes sont realises, en raison de la conservation

dun grand nombre de sequences entre les especes.

Lensemble des resultats publies est regroup6 dans

plusieurs banques de don&es, dont certaines sont

generales (GenBank/NIH/EMBL) et dautres specia-

lisees (Fly Base, Mouse Genome Informatics, Sac-

charomyces Genome Database, etc.). A ce jour, en-

viron 5 % du genome humain ont CtC entierement

sequences.

Les marqueurs de polymorphisme ont

permis detablir une carte physique de 30 18 1 genes

humains. La demiere carte physique avait CtC Ctablie

en 1996 et ne comportait que 16 000 genes envi-

ron [109].

Clonage dun mammifke

Jusquen 1997, seul le clonage damphibiens a partir

de cellules differenciees avait CtC rapport& Lequipe

de Campbell a reussi a obtenir le developpement

dune brebis a partir du noyau dune cellule Cpithe-

liale mammaire [ 1 o]. Les ovocytes de brebis ges-

tantes ont CtC preleves puis CnuclCCs. Le noyau de

cellules Cpitheliales differenciees, provenant dune

autre lignee de brebis, a CtC transfere dans ces ovo-

cytes Cnuclees. Les ceufs ont CtC ensuite reimplantes.

Le developpement dune descendante normale de la

lignee a laquelle appartenait la cellule mammaire a

montre que le genome dune cellule differenciee

contient toute linformation necessaire au develop-

pement dun organisme entier. La possibilite de dis-

poser de >dun individu produites a partir

de cellules somatiques conduit a sinterroger sur les

applications medicales Cventuelles.

Cultures de cellules embryonnaires humaines

Plusieurs lignees de cellules souches totipotentes ont

tte developpees a partir de tissus embryonnaires

(cellules ES) ou de cellules germinales (cellules

EG), chez la souris et chez dautres mammiferes,

dont le singe. Jusqua une date tres recente, aucune

lignte totipotente humaine netait disponible. Deux

Cquipes ont finalement reussi, de facon indepen-

dante, a produire des cellules souches >.Une Cquipe a extrait des cellules de blastocys-

tes humains produits par fecondation in vitro [ 1111.

Ces cellules ont un caryotype normal. Elles ont mon-

tre leur capacite a se differencier en tissu musculaire,

neural, digestif ou renal. Shamblott et al. ont publie

parallelement la production de cellules humaines

totipotentes d&iv&es de cellules germinales,


19/23


743

precurseurs dovocytes et de spermatozoides, ex-

traits de produits dinterruption de grossesse [ 1121.

Ces resultats offrent des perspectives tres larges, en

particulier en ce qui conceme les greffes de tissus ou

dorganes. 11 est envisageable, dans un avenir pro-

the, que des banques de tissu soient creees et mises

a disposition des malades (cellules neuronales, os-

seuses, hCmatopoii%iques). De telles banques per-

mettraient detablir, en dehors de lurgence, le phe-

notype HLA des tissus .On peut meme

imaginer de modifier le phenotype HLA des cellu-

les, par recombinaison et transgenese, de faGon a of-

frir le plus faible degre de au patient

receveur. Toutefois, dimportantes questions Cthi-

ques devront etre prises en compte avant den par-

venir a ce stade.

AUTRES CHAMPS DAPPLICATION

DE LA BIOLOGIE MOLlkULAIRE

MCdecine ICgale

Lanalyse du profil de restriction de 1ADN genomi-

que est employee pour des etudes de liaison. On re-

cherche, par la technique de Southern Blot, les simi-

litudes entre deux ADN, en comparant les

polymorphismes de restriction et de repetition. On

peut ainsi etablir une filiation ou determiner le profil

dun suspect. Lamplification par PCR est un autre

outil developpe par les laboratoires de medecine cri-

minelle. Son extreme sensibilite autorise la detec-

tion dADN depose sur une surface par simple

contact de la peau.

Industrie

Industrie biomhdicale

La liste des medicaments et hormones produits dans

des systemes recombinants aprbs clonage du gene

correspondant sallonge regulierement (tableau ZZ).

Ce mode de production permet de limiter les proble-

mes de purification des proteines ou de contamina-

tion par des agents infectieux dans le cas de mole-

cules times, a lorigine, dorganismes vivants.

Lhormone de croissance recombinante est venue

ainsi remplacer lhormone humaine, extraite dhypo-

physes de cadavres, a lorigine de la transmission

Tableau II.

Exemples de molecules recombinantes employees en

clinique.

Insuline

Hormone de croissance

Erythropoietine

Interferons

tPA (activateur tissulaire du plasminogene)

Urokinase

Facteurs VIII et IX

Antithrombine III

G-CSF (Granulocyte Colony Stimulating Factor)

ctl-antitrypsine

Vaccin antihepatique B (HB VAX DNA)

aux malades dagents infectieux non conventionnels.

La plupart des enzymes employees en biologie mo-

leculaire sont Cgalement produites a partir de vec-

teurs recombinants.

Zndustrie agro-alimentaire

Lutilisation dorganismes transgeniques a Cte deve-

loppee afin dameliorer les rendements. 11 sagit

dintegrer au genome un gene codant pour un carac-

t&e qui augmente les capacites dadaptation a Ien-

vironnement. Cest le cas des mais, soja et coton

transgeniques, deja commercialist%. Dans le cas du

mais, le transgene code pour une toxine, extraite de

Bacillus thurengiensis, active sur les parasites habi-

tuels de la plante. Des lignees de tomates et de pom-

mes de terre surexprimant une anti-protease sont a

letude. Cette anti-protease inhibe les mecanismes

de la digestion des insectes qui colonisent ces plan-

tes. Un des objectifs de ces travaux est la reduction

de la consommation de pesticides chimiques dans

lagriculture industrielle. Neanmoins, un debat pas-

sionne entoure la mise de ces produits a la disposi-

tion du public. Un des arguments avancts par leurs

detracteurs est le risque dun transfert de genes vers

une autre espece. Le probleme pourrait se poser, par

exemple, pour le gene de resistance a lampicilline,

utilise comme marqueur de selection lors de la rea-

lisation des constructions dADN. Le risque de re-

combinaison dans des batteries de la flore digestive

est diffkilement Cvaluable.

CONCLUSION

En moins de trente ans, les techniques de biologie

moleculaire ont permis detablir une carte de la


20/23


moitie des genes humains. A lhorizon des annees

2010, on pense disposer de lensemble des sequen-

ces d ADN humain codant et de marqueurs genoty-

piques pour la plupart des 5 000 maladies genetiques

dont les genes sont actuellement inconnus. On aura

obtenu en mCme temps des informations sur les ma-

ladies polygeniques, telles que lhypertension arte-

rielle essentielle ou le diabete. Lautomatisation des

techniques, en particulier pour lamplification de

1ADN et le sequen$age, permet une acceleration

constante du rythme des recherches. La therapie ge-

nique conserve actuellement un champ dapplication

restreint. En revanche, les outils a vi&e diagnosti-

que font dores et deja partie des pratiques courantes

en infectiologie, en onto-hematologie et dans les

maladies genetiques. Les traitements, en particulier

hormonaux, font appel a un nombre croissant de mo-

lecules recombinantes. Les programmes de recher-

the decryptent quotidiennement les mecanismes de

conservation et de regulation de notre patrimoine ge-

netique. 11s ont developpe des outils puissants pour

lanalyse in vivo (transgenese, recombinaison homo-

logue, cultures de cellules totipotentes). Actuelle-

ment, les limitations techniques a une progression

accClCrCe des connaissances semblent Ccartees. Mais

le volume total dactivite developpe pose un pro-

bleme de financement. En outre, les modeles expe-

rimentaux employ& et lacces direct a linformation

contenue dans le genome humain soul&vent des

questions Cthiques extremement diffrciles.

&&ENCES

Kaplan JC, Delpech M. Biologie moltculaire et mtdecine,

2e edition. Paris: Medecine-Sciences Flammarion ; 1993.

p. 1-11.

Watson JD, Crick FH. Molecular structure of nucleic acids. A

structure for deoxyribose nucleic acid. 1953. Ann N Y Acad

Sci 1995 ; 75 : 13-4.

Nirenberg M, Leder P, Bemfield M, Brimacombe R, Trupin J,

Rottman F, et al. RNA codewords and protein synthesis, VII.

On the general nature of the RNA code. Proc Nat1 Acad Sci

USA 1965 ; 53 : 1161-8.

Nirenberg M, Caskey T, Marshall R, Brimacombe R, Kellogg

D, Doctor B, et al. The RNA code and protein synthesis. In:

Cold Spring Harb Symp Quant Biol. Vol 3 1. New York: Cold

Spring Harbor Laboratory; 1966. p. 1124.

Baltimore D. RNA-dependent DNA polymerase in virions of

RNA tumour viruses. Nature 1970 ; 226 : 1209-I 1.

Temin HM, Mizutani S. RNA-dependent DNA polymerase in

virions of Rous sarcoma virus. Nature 1970 : 226 : 12 11 13.

Sanger F, Coulson AR. A rapid method for determining se-

quences in DNA by primed synthesis with DNA polymer&. J

Mol Biol 1975 ; 94 : 441-8.

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

29

30

Steger DJ, Eberharter A, John S, Grant PA, Workman JL. Pu-

rified histone acetyltransferase complexes stimulate HIV-1

transcription from preassembled nucleosomal arrays. Proc Nat1

Acad Sci USA 1998 ; 95 : 12924-9.

Utley RT, Ikeda K, Grant PA, Cote J, Steger DJ, Eberharter A,

et al. Transcriptional activators direct histone acetyltransferase

complexes to nucleosomes. Nature 1998 ; 394 : 498-502.

Kaplan JC, Delpech M. Biologie moleculaire et medecine. 2e

edition. Paris : Medecine-Sciences Flammarion ; 1993.

p. 20-25 ; 95-9.

Alberts B, Bray D, Lewis J, Ra ff M, Roberts K, Watson JD.

Molecular biology of the cell, third edition. New York : Gar-

land Publishine Inc : 1994. D. 342-6. 405-6.

Rosenfeld M< Mermod JJ: Amara SG, Swanson LW, Saw-

chenko PE, Rivier J, et al. Production of a novel neuropeptide

encoded by the calcitonin gene via tissue-specific RNA pro-

cessing. Nature 1983 ; 304 : 129-35.

Orphanides G, Lagrange T, Reinberg D. The general transcrip-

tion factors of RNA polymerase II. Genes Dev 1996 ; 10 :

2657-83.

Roeder RG. The role o f general initiation factors in transcrip-

tion by RNA polymerase II. Trends Biochem Sci 1996 ; 21 :

327-35.

Verrijzer CP, Tjian R. TAFs mediate transcriptional activation

and promoter selectiv ity. Trends Biochem Sci 1996 ; 21 :

338-42.

Svejstrup JQ, Vichi P, Egly JM. The multiple roles of

transcription/repair factor TFIIH. Trends Biochem Sci 1996 ;

21 : 346-50.

Bjorklund S, Kim YJ. Mediator of transcriptional regulation.

Trends Biochem Sci 1996 ; 21 : 335-7.

Kornberg RD. RNA polymerase II transcription control.

Trends Biochem Sci 1996 ; 21 : 325-6.



land Publishing Inc ; 1994. p. 366-8.

Coller JM, Grav NK, Wickens MP. mRNA stabilization bv

poly (A) binding protein is independent of poly (A) and re-

auires translation. Genes Dev 1998 : 12 : 3226-35.

Takagaki Y, Ryner LC, Manley JL. Separation and character-

ization of a poly (A) polymerase and a cleavage/specificity

factor required for pre-mRNA polyadenylation. Cell 1988 ;

52 : 731-42.

Wickens M. How the messenger got its tail: addition of poly

(A) in the nucleus. Trends Biochem Sci 1990 ; 15: 277-S 1.

Kaplan JC, Delpech M. Biologie moleculaire et mtdecine,

2 edition. Paris : Medecine-Sciences Flammarion ; 1993.

p. 73-7.




Spector DL. Nuclear organization of pre-mRNA processing.

Curr Onin Cell Biol 1993 : 5 : 442-7.

Enver T, Ebens AJ, Forrester WC, Stamatoyannopoulos G. The

human beta-globin locus activation region alters the develop-

mental fate of a human feta l globin gene in transgenic mice.

Proc Nat1 Acad Sci USA 1989 ; 86 : 7033-7.

Blackwell TK, Alt FW. Mechanism and developmental pro-

gram of immunoglobulin gene rearrangement in mammals.

Annu Rev Genet 1989 ; 23 : 605-36.

Strominger JL. Developmental biology o f T cell receptors.

Science 1989 ; 244 : 943-50.

Ptashne, M, Gann A. Transcriptional activation by recruitment.

Nature 1997 ; 386 : 569-77.

Prendergast G, Zi ff E. DNA-binding moti f. Nature 1989 ; 341 :

392.


21/23


745

31

32

33

34

35

36

37

38

39

40

41

42

43

44

45

46

47

48

49

50

51

52

53

Pabo CO, Sauer RT. Transcriptionfactors: structural families

and principles of DNA recognition. Annu Rev Biochem 1992 ;

61 : 1053-95.

Barnes PJ, Adcock I. Anti-inflammatory actions of steroids:

molecular mechanisms. Trends Pharmacol Sci 1993 ; 14 :

436-41.




Maquat LE. Nuclear mRNAexport. Curr Opin Cell Bioll991 ;

3 : 1004-12.

Kislauskis EH, Singer RH. Determinants of mRNA localiza-

tion. Curr Opin Cell Biol 1992 ; 4 : 975-8.

Sachs AB. Messenger RNA degradation in eukaryotes. Cell

1993 ; 74 : 413-21.

Agabian N. Trans-splicing of nuclear pre-mRNAs. Cell 1990 ;

61 : 1157-60.

Sollner-Webb B. RNA editing. Curr Opin Cell Biol 1991 ; 3 :

1056-61.

Rhoads RE. Regulation of eukaryotic protein synthesis by ini-

tiation factors. J Biol Chem 1993 ; 268 : 3017-20.

Lindahl L, Hinnebusch A. Diversity o f mechanisms in the

regulation of translation in prokaryotes and lower eukaryotes.

Curr Opin Genet Dev 1992 ; 2 : 720-6.

Oh SK, Samow P. Gene regulation: translational initiation by

internal ribosome binding. Curr Ooin Genet Dev 1993 : 3 :

295-300.

Southern EM. Measurement of DNA length by gel electro-

phoresis. Anal Biochem 1979 ; 100 : 319-23.

Davin-Regli A, Monnet D, Saux P, Bosi C, Charrel R, Barthe-

lemy A, et al. Molecular epidemiology of Enrerobacter aero-

genes acquisition: one-year prospective study in two intensive

care units. J Clin Microbial 1996 ; 34 : 1474-80.

Mullis K, Faloona F, Scharf S. Snecific enzymatic amulifica-

tion of DNA in vi tro: the polymeiase chain reaction. In: Cold

Spring Harb Svmp Quant Biol. Vo15 1. New York: Cold Surina

Harbor Laboratory; 1986. p. 26373.

. .,

Dieryck W, Pagnier J, Poyart C, Marden MC, Gruber V, Bour-

nat P, et al. Human haemoglobin from transgenic tobacco.

Nature 1998 ; 386 : 29-30.

Estruch JJ, Carozzi NB, Desai N, Duck NB, Warren GW, Ko-

ziel MG. Transgenic plants: an emerging approach to pest con-

trol. Nat Biotechnol 1997 ; 15 : 137-41.

Price DL, Sisodia SS, Borchelt DR. Genetic neurodegenera-

tive diseases: the human illness and transgenic models.

Science 1998 ; 282 : 1079-83.

Platt JL. New directions fo r organ transplantation. Nature

1998 ; 392 Supp16679 : 11-7.

Grass S, Arnold HH, Braun T. Alterations in somite patterning

of Mvf-5-defic ient mice: a nossible role for FGF4 and FGF-6.

Development 1996 ; 122 : -141-50.

Patapoutian A, Yoon JK, Miner JH, Wang S, Stark K, Wold B.

Disruption of the mouse MRF4 gene identifies multiple waves

of myogenesis in the myotome. Development 1995 : 121 :

3347-58.

Acampora D, Mazan S, Lallemand Y, Avantaggiato V, Maury

M, Simeone A, et al. Forebrain and midbrain regions are de-

leted in Otx2-I- mutants due to a defec tive anterior neuroecto-

derm specification during gastrulation. Develonment 1995 :

121 : 3279-90.

Snouwaert JN, Brigman KK, Latour AM, I raj E, Schwab U,

Gilmour MI, et al. A murine model of cystic fibrosis. Am J

Respir Crit Care Med 1995 ; 151 : S59-64.

Kano T, Shimizu-Sasamata M, Huang PL, Moskowitz MA, Lo

EH. Effects of nitric oxide synthase gene knockout on neu-

rotransmitter release in v ivo . Neuroscience 1998 ; 86 : 695-9.

54

55

56

57

58

59

60

61

62

63

64

65

66

67

68

69

70

71

Paszty C, Brion CM, Manci E, Witkowska HE, Stevens ME,

Mohandas N, et al. Transgenic knockout mice with exclusively

human sickle hemoglobin and sickle cell disease. Science

1997 ; 278 : 876-8.

Lam, KP, Rajewsky K. Rapid elimination of mature autoreac-

tive B cells demonstrated by Cre- induced change in B cell

antigen receptor specifici ty in v ivo . Proc Nat1 Acad Sci U S A

1998 ; 95 : 13171-5.

Sauer B. Inducible gene targeting in mice using the Cre/lox

system. Methods 1998 ; 14 : 381-92.

Tsui LC, Buchwald M, Barker D, Braman JC, Knowlton R,

Schumm JW, et al. Cystic fibrosis locus defined by a geneti-

cally linked polymorphic DNA marker. Science 1985 ; 230 :

1054-7.

Crawford I, Maloney PC, Zeitlin PL, Guggino WB, Hyde SC,

Turley H, et al. Immunocytochemical localization of the cys tic

fibrosis gene product CFTR. Proc Nat1 Acad Sci USA 1991 ;

88 : 9262-6.

Saffran DC, Horton HM, Yankauckas MA, Anderson D, Bar-

nhart KM, Abai AM, et al. Immunotherapy of established tu-

mors in mice by intratumoral injection of-interleukin-2 plas-

mid DNA: induction of CD8+ T-cell immunitv . Cancer Gene

Ther 1998 ; 5 : 321-30.

Lang FF, Yung WK, Raju U, Libunao F, Terry NH, Tofilon PJ,

et al. Enhancement of radiosensitivity of wild-type ~53 human

glioma cells by adenovirus-mediated delivery of the ~53 gene.

J Neurosurn 1998 : 89 : 125-32.

Spitz FR, Nguyen D, Skibber JM, Meyn RE, Cristiano RJ,

Roth JA, et al. Adenoviral-mediated wild-Tvpe ~53 gene ex-

pression sensitizes colorectal cancer cells to i&izmg ridiation.

Clin Cancer Res 1996 ; 2 : 1665-1671.

Bos JL. ras oncogenes in human cancer: a review. Cancer Res

1989 ; 49 : 4682-9.

Mannoni P. La tberapie genique du cancer: d&sir mythique ou

realitt thtrapeutique de demain? MM Sci 1996 ; 12 : 68-72.

Brenner MK, Heslop HE, Rill D, Li C, Nilson T, Roberts M, et

al. Gene transfer and bone marrow transulantation. In : Cold

Spring Harb Symp Quant Biol. Vol 59. New York : Cold

Surinz Harbor Laboratorv : 1994. o. 691-97.

Anderson WF. Human gene therapy. Nature 1998 ; 392 Suppl

6679 : 25-30.

Langer R. Drug delivery and targeting. Nature 1998 ; 392

Supp16679 : 5-10.

Mahvi DM, Sondel PM, Yang NS, Albertini MR, Schiller JH,

Hank J, et al. Phase I/IB study of immunization with autolo-

gous tumor cells transfected with the GM-CSF gene by

particle-mediated transfer in patients with melanoma or sar-

coma. Hum Gene Ther 1997 ; 8 : 875-91.

Oldfield EH, Ram Z, Culver KW, Blaese RM, Devroom HL,

Anderson WE Gene therapy for the treatment o f brain tumors

using intra-tumoral transduction with the thymidine kinase

gene and intravenous ganciclovir. Hum Gene Ther 1993 ; 4 :

39-69.

Blaese RM, Culver KW, Miller AD, Carter CS, Fleisher T, Cle-

rici M, et al. Treatment of severe combined immunodeficiency

disease (SCID) due to adenosine deaminase deficiency with

CD34+ selected autologous peripheral blood cells transduced

with T lymphocyte-directed gene therapy for ADA- SCID: ini-

tial trial results after 4 years. Science 1995 ; 270 :475-80.

Feldman LJ, Steg PG. Perspectives de thtrapie gtnique de la

restenose. Medecine Sciences 1996 ; 12 : 47-55.

Flood P, Ramirez-Latorre J, Role L. Alpha 4 beta 2 neuronal

nicotinic acetylcholine receptors in the central nervous system

are inhibited by isoflurane and propofol, but alpha 7-type nico-

tinic acetylcholine receptors are unaffected. Anesthesiology

1997 ; 86 : 859-65.


22/23


72

73

74

75

16

71

18

79

80

81

82

83

84

85

86

87

88

89

90

Violet JM, Downie DL, Nakisa RC, Lieb WR, Franks NP. Dif-

ferential sensitivities of mammalian neuronal and muscle nico-

tinic acetylcholine receptors to general anesthetics.

Anesthesiology 1997 ; 86 : 866-74.

Crowder CM: Mapping anesthesia genes: why and how?


Simpson VJ, Rikke BA, Costello JM, Corley R, Johnson TE.

Identification of a genetic region in mice that specifies sensi-

tiv ity to propofol. Anesthesiology 1998 ; 88 : 379-89.

Marlev RJ, Miner LL, Wehner JM, Collins AC. Differentia l

eff ect s of central nervous system depressants in long- sleep

and short-sleen mice. J Pharmacol Exp Ther 1986 ; 238 :

1028-33. _

Matthes HW, Maldonado R, Simonin F, Valverde 0, Slowe S,

Kitchen I, et al. Loss of morphine-induced analgesia, reward

eff ect and withdrawal symptoms in mice lacking the mu-

opioid-receptor gene. Nature 1996 ; 383 : 819-23.

Simonin F, Valverde 0, Smadja C, Slowe S, Kitchen I, Dierich

A. et al. Disruption of the karma-opioid receptor gene in mice

enhances sens itivi ty to chemical visceral pain, impairs phar-

macological actions of the selective kappa-agonist U-50,4888

and att&uates morphine withdrawai. Embo J 1998 ; 17 :

886-97.

Homanics GE, Ferguson C, Quinlan JJ, Daggett J, Snyder K,

Lagenaur C, et al. Gene knockout of the alpha6 subunit of the

gamma-aminobutyric acid type A receptor: lack of effec t on

responses to ethanol, pentobarbital, and general anesthetics.

Mol Pharmacol 1997 ; 51 : 588-96.

Boswell MV, Morgan PG, Sedensky MM. Interaction o f

GABA and volatile anesthetics in the nematode

Caenorhabdi-

tis elegans. Faseb J 1990 ; 4 : 2506-10.

Crowder CM, Shebester LD, Schedl T. Behavioral effect s of

volatile anesthetics in

Caenorhabditis elegans.

Anesthesiology

1996, 85: 901-12.

Morgan PG, Sedensky MM, Meneely PM, Cascorbi HF. The

effect of two genes on anesthetic response in the nematode

Caenorhabditis elegans. Anesthesiology 1988 ; 69 : 246-51.

Morgan PG. Sedenskv MM. Mutations conferr ing new pat-

terns of sensit ivity to- volatile anesthetics in Caenorhabditis

eleaans. Anesthesiologv 1994 ; 81 : 888-98.

Morgan PG, Sedensky?MM. Mutations affecting sensitiv ity to

ethanol in the nematode

Caenorhabditis elegans.

Alcohol Clin

Exp Res 1995 ; 19 : 1423-9.

Morgan PG, Usiak MF, Sedensky MM. Genetic differences af-

fecting the potency o f stereoisomers of isoflurane.


Rajaram S, Sedensky MM, Morgan PG. Uric-1 : a stomatin ho-

mologue controls sensiti vity to volatile anesthetics in Cae-

norhabditis elegans. Proc Nat1 Acad Sci USA 1998 ; 95 :

8761-6.

Sedensky MM, Cascorbi HF, Meinwald J, Radford P, Morgan

PG. Genetic di fferences affecting the potency o f stereoisomers

of halothane. Proc Nat1 Acad Sci USA 1994 ; 91 : 10054-8.

VanSwinderen B, Shook DR, Ebert RH, Cherkasova VA, Jo-

hnson TE, Shmookler Reis RJ, et al. Quantitative trait loci con-

trolling halothane sens itivi ty in

Caemic fingerprinting of epidemic and endemic

strains of

Stenotrophomonas maltophilia

(formerly Xantbomo-

nas maltophilia) by arbitrarily primed PCR. J Clin Microbial

1995;33: 1289-91.

Khatib

R, Thirumoorthi MC, Riederer KM, Sturm L, Oney

LA, Baran J Jr. Clustering of Candida infections in the neona-

tal intensive care unit: concurrent emergence of multiple

strains simulating intermittent outbreaks. Pediatr Infect Dis J

1998; 17: 130-4:

Remick DG. Applied molecular biology of sepsis. J Crit Care

1995; 10: 198-212.

Deheinzelin D, Jatene FB, Saldiva PH, Brentani RR. Upregu-

lation of collagen messenger RNA expression occurs immedi-

atelv after lung damage. Chest 1997 ; 112 : 1184-8.

Yakovlev AG,-FadeniI. Molecular biology of CNS injury. J

Neurotrauma 1995 ; 12 : 767-77.

Kaufmann P, Tilz GP, Lueger A, Demel U. Elevated plasma

levels of soluble tumor necrosis factor receptor (sTNFRp60)

reflect severi ty of acute pancreatitis. Intensive Care Med

1997 ; 23 : 841-8.

Groeneveld PH, Kwappenberg KM, Langermans JA, Nibbe-

ring PH, Curtis L. Nitric oxide (NO) production correlates

with renal insuff tciency and multiple organ dysfunction syn-

drome in severe sepsis. Intensive Care Med 1996 ; 22 :

1197-202.

Bredius RG, Derkx BH, Fijen CA, De Wit TP, DeHaas M,

Weening RS, et al. Fc gamma receptor IIa (CD32) polymor-

phism in fulminant meningococcic septic shock in children. J

Infect Dis 1994 ; 170 : 848-53.


23/23


747

109 Deloukas P, Schuler GD, Gyapay G, Beasley EM, Soderlund

C, Rodriguez-Tome P, et al. A physical map of 30,000 human

genes. Science 1998 ; 282 : 744-6.

110 Wilmut I, Schnieke AE, McWhir J, Kind AJ, Campbell KH.

Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells.

Nature 1997 ; 385 : 810-3.

111 Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, Waknitz MA,

Swiergiel JJ, Marshall VS, et al. Embryonic stem cell lines de-

rived from human blastocysts. Science 1998 ; 282 : I 145-7.

112 Shamblott MJ, Axelman J, Wang S, Bugg EM, Littlefield JW,

Donovan PJ, et al. Derivation of pluripotent stem cells from

cultured human primordial germ cells . Proc Nat1 Acad Sci

USA 1998 ; 95 : 13726-31.

Documents

Comprendre La Biologie Moleculaire