GUIZONNE Christine LACEMON Jessy Licence 3ème année Groupe TP BSS2Le 11 Octobre 2015

COMPTE RENDU DE TP DEBIOCHIMIE EXPERIMENTALE

Mr Willie CEI

SOMMAIRE

Lysozyme

Introduction

I) Matériel et méthode A) Extraction et purification du blanc d’œufB) Détermination de l'activité catalytiquevolumique C) Dosage des protéinesD) Contrôle de la purification parélectrophorèse

II) RésultatsA) Détermination de l'activité catalytiquevolumique B) Dosage des protéinesC) Dosage des protéines des différentesfractionsD) Contrôle de la purification parélectrophorèse

III) Discussion des résultats A) Extraction et purification du blanc d’œufB) Détermination de l'activité catalytique volumique C) Dosage des protéinesD) Contrôle de la purification par électrophorèse

Introduction Le but de cette manipulation est de purifier une protéine contenue dans le blanc d’œuf : le lysozyme. Sachant que dans le blanc d’œuf on retrouve divers éléments tels que :- l''Ovalbumine- le Lysozyme (7 à 8%)- l''Ovotranferrine- l''Ovomucoïde

- l''Avidine- l' Ovomucine- des glucides (0,9%)-des sels minéraux (0,5%)

Le lysozyme est une enzyme très répandue dans la nature. On le trouve chez l'homme dans la salive, les larmes, le sang , l'urine et le lait. On peut également le trouver dans le lait de vache, le blanc d’œufde nombreuses espèces d'oiseaux et chez les végétaux. Dans le blanc d’œuf de poule, le lysozyme représente une quantité non négligeable 3 à 5 g/l ce qui représente 7 à 8 % du total de protéines du blanc d’œuf. Plusieurs méthodes d'extraction ont été misent au point :- par précipitation à pH alcalin, puis en présence de NaCl ( Alderton et Fevold en 1946),- par chromatographie d'échange d'ions (Li-Chan et al. En 1986 ; Guérin et Brulé en 1992 ; Vachier et al. En 1994),- par chromatographie d'affinité - par ultrafiltration. Le lysozyme est actuellement décrit comme étant une N-acétyl hexoaminidase et est classée comme une muramidase. Cette protéine doit son nom au faite qu'elle est capable de lyser les parois bactériennes. La lyse se fait par hydrolyse des liaisons Béta (1,4) entre l'acide N-acétylmuramique et laN-acétylglucosamine qui sont les constituants du peptidoglycane, une protéine complexe présente dans la paroi externe de plusieurs bactéries. L'action bactéricide du lysozyme est importante sur les bactéries Gram-positive.

La chromatographie par échange d'ion.En sachant que le lysozyme représente uniquement 7 à 8 % des protéines du blanc d’œuf et que son pHi vaut 11 et est supérieur à celui des autres protéines du blanc d’œuf. On peut effectuer une purification par chromatographie échangeuse faible de cation à la CarboxyMéthylcellulose (CM-cellulose). A pH10 le lysozyme est encore chargé positivement, ainsi il « s'accroche » à la CM-cellulose ce qui permet l'extraction des autres protéines.En changeant de pH avec un ajout de NaCl (pH>11), cela permet le « détachement » du lysozyme sur la

CM-cellulose. La séparation est donc effectuée en fonction de la charge des protéines.

La spectrophotométrie.Le Micrococcus est un genre de bactérie Gram-positive. Ainsi les lysozymes lysent les parois du Micrococcus. La dégradation du Micrococcus peut être observée par la lecture d'absorbance et permet de contrôler l'extraction de la protéine.

L’électrophorèse.Elle nous permet d'étudier les migrations des protéines contenues dans le blanc d’œuf en fonction de leur poids, de leur taille et de leur charge grâce à un gel de séparation et un gel de concentration. Le gel de concentration a pour but de concentrer le dépôt fait dans le puits en une fine bande de protéines, ce qui permet de mettre un volume relativement grand sans perte de résolution. Il utilise lefait que le complexe protéines-sds ait une mobilité électrophorétique.La concentration en acrylamide du gel de séparation est déterminé en fonction des poids moléculairedes molécules à séparer. Comme nous utiliserons un gel à 12 %, toutes les protéines dont le poidsmoléculaire se situe entre 30 et 80 kDa seront biens séparées les unes des autres. La vitesse demigration des complexes protéines-SDS sera diminuée, car ils devront traverser les pores du gel. Cette méthode nous permet de contrôler la purification de la protéine.

I) Matériels et méthodes

A) Extraction et purification du blanc d’œuf1 -Préparation de la solution F0On a utilisé 1 blanc d’œuf pour toute la classe. On l'a dilué dans du Tp10 jusqu'à obtenir un volume total de 200 ml. Ensuite pour avoir une dilution au 1/4 avec un volume final de 20 ml. On a prélevé : 20 / 4 = 5 ml de solution de blanc d’œuf + 20 - 5 = 15 ml de Tp10C'est la Solution F0

2 -Purification La purification se fait en 6 étapes, selon l'organigramme suivant :

1- On prend 10 ml de F0, on y ajoute 1 g de CM-cellulose puis on agite. On laisse reposer 15 minutespuis on centrifuge à 1500g à 4°C pendant 10 minutes . On récupère le surnageant nommé fraction 1 :F1. Le culot reste dans le tube de centrifugation, C'est le culot 1.2- On prend le culot 1, on y ajoute 20ml de Tp10, puis on agite. On laisse reposer 10 minute puis on centrifuge à 1500g à 4°C pendant 10 minutes . On récupère le surnageant nommé fraction 2 :F2. Le culot reste dans le tube de centrifugation, C'est le culot 2.3- On prend le culot 2, on y ajoute 20ml de Tp10, puis on agite. On laisse reposer 10 minute puis on centrifuge à 1500g à 4°C pendant 10 minutes . On récupère le surnageant nommé fraction 3 :F3. Le culot reste dans le tube de centrifugation, C'est le culot 3.4- On prend le culot 3, on y ajoute 20ml de Tp10, puis on agite. On laisse reposer 10 minute puis on centrifuge à 1500g à 4°C pendant 10 minutes . On récupère le surnageant nommé fraction 4 :F4. Le culot reste dans le tube de centrifugation, C'est le culot 4.5- On prend le culot 4, on y ajoute 10ml de Tp10 NaCl, puis on agite. On laisse reposer 5 minute puis on centrifuge à 1500g à 4°C pendant 10 minutes . On récupère le surnageant nommé fraction 5 :F5. Le culot reste dans le tube de centrifugation, C'est le culot 5.6- On prend le culot 5, on y ajoute 10ml de Tp10 NaCl, puis on agite. On laisse reposer 5 minute puis on centrifuge à 1500g à 4°C pendant 10 minutes . On récupère le surnageant nommé fraction 6 :F6.

- L'étape 1 est une étape dite d'ADSORPTIONÀ ne pas confondre avec l’absorption, est un phénomène de surface par lequel des atomes se fixent sur une surface solide selon divers processus plus ou moins intenses grâce aux interactions de Van der Waals. -Les étapes de 2 à 4 sont des étapes dites de LAVAGESCes étapes servent à enlever toutes les protéines chargées positivements ,et autres que le lysozyme.-Les étapes 5 et 6 sont des étapes dites de DESORPTIONSC'est la transformation inverse de la sorption, par laquelle les molécules sorbées se détachent du substrat. Dans ce cas par l'ajout de Tp10NaCl il y a détachement des lysozymes qui se retrouvent dans le surnageant.

B) Détermination de l'activité catalytique volumique Nous avons réalisé les dilutions de nos fractions selon le tableau suivant :Tableau 1

Fraction F0 F1 F2 F3 F4 F5 F6

Dilution 1/10 - - - 1/5 1/5 1/2

Solution ( enml ) 0,2 - - - 0,4 0,4 1

Tp 6,2 ( enml) 1,8 - - - 1,6 1,6 1

Pour lire l'absorbance on a eut besoin de faire un blanc ou zéro pour le spectrophotomètre.Pour faire le zéro, nous avons préparé un blanc avec: 2,9 ml de Micrococcus + 0,1 ml d'eau distillée

Pour préparer la fraction F0 à la lecture d'absorbance, nous avons mis : 2,9 ml de Micrococcus

+ 0,1 ml de préparation enzymatique F0puis nous avons lu l'absorbance à 450 nm toutes les 15 secondes pendant environs 3 minutes. Puis nous avons fait de même pour les solutions F1, F2, F3,F4,F5 et F6.

C) Dosage des protéines1 -Préparation de la solution cuproalcalinePour pouvoir réaliser toutes les manipulation nous avons évalué qu'il nous faut environs 100 ml de solution cuproalcaline.Elle est composée de : 20 x 5 = 100 ml de solution A+ 1 x 5= 5 ml de solution B+ 1 x 5= 5ml de solution C

110 ml de solution cuproalcaline.→

2 -Dilution du réactif de Folin au 1/2On veut 10 ml de solution donc : 5 ml de réactif de Folin + 5 ml d'eau distillée

10 ml de réactif de Folin au 1/2→

3 -Préparation de la gamme d'étalonnage Nous avons réalisé une gamme d'étalonnage de 6 points compris entre 0 et 0,100 mg de protéine. Nous avons choisit : 0 ; 0,02 ; 0,04 ; 0,06 ; 0,08 ; 0,100 mg . Les différentes solutions ont été réalisées selon le tableau suivant :Tableau 2

Concentration en mg 0 0,02 0,04 0,06 0,08 1

Pour 1 mlVolume de BSA 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

Volume d'eau distillée 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0

Pour 2ml Volume de BSA 0 0,4 0,8 1,2 1,6 2

Volume d'eau distillée 2 1,6 1,2 0,8 0,4 0

4 -Dosage des protéines des différentes fractionsNous avons réalisé les dilutions suivantes :Tableau 3

Fraction F0 F1 F2 F3 F4 F5 F6 F '0 F '1 F '5

Dilution 1/50 1/50 1/10 1/5 3/10 1/2 0 1/100 1/100 1/2

Pour 1ml Prise (en ) 20 20 100 200 300 500 1000 / / /

Eau distillée (en ) 980 980 900 800 700 500 0 / / /

Pour 2mlPrise (en ) 40 40 200 400 600 1000 2000 / / /

Eau distillée (en ) 1960 1960 1800 1600 1400 1000 0 / / /

Nous avons aussi préparé les faction F ' 0, F '1 et F '5. Pour F '0 :- Dilution au 1/50 On prend 0,04ml de F0 qu'on dilue dans 1,96 ml d'eau. - Dilution au 1/100On prend 1ml de la solution diluée au 1/50 qu'on dilue dans 1 ml d'eau.

Pour F '1 : on fait de même :- Dilution au 1/50 On prend 0,04ml de F0 qu'on dilue dans 1,96 ml d'eau. - Dilution au 1/100On prend 1ml de la solution diluée au 1/50 qu'on dilue dans 1 ml d'eau.

Pour F '5 :- Dilution au 1/2On prend 1 ml de F5 qu'on dilue dan 1 ml d 'eau .

Enfin nous avons mesuré les absorbances à 700 nm . Voir courbe 2 Gamme d'étalonnage avec détermination des concentrations des fractions

D) Contrôle de la purification par électrophorèse1 -Préparation du tampon de migration Pour remplir la cuve d'électrophorèse nous avons évalué qu'il nous faut environs 1 litre des tampon de migration.

-On veut du Tris 25 mMOn a du Tris à 121,14g/l, on considère que c'est une mole donc on fait 121,14 x 25.10^-3 = 3,0285g

-On veut de la glycine à 192mMol On a de la glycine à 75,07g/l, on considère que c'est une mole donc on fait 75,07 x 192.10^-3 =14,41g

-On veut du SDS à 0,1 % On a du SDS à 10 % c'est-à-dire 10g/100ml On prend 10g 100 ml →

0,1g X→X= (0,1 x 100) / 10 = 1On prend 1 ml de SDS qu'on dilue dans 990ml d'eau.

Pour 1 litre de tampon de migration il faut donc : 3,0285g de Tris à 121,41g/l+ 14,41 g de glycine à 75,07 g/l+ environ 1 litre de SDS à 0,1 %

2 -Préparation du gel de séparation à 12 %Pour 30 ml de solution, il faut : 9ml d'acrylamide+ 11,25 ml de Tris Hcl pH 8,8+ 0,30 ml de SDS 10 %+ 9,12 ml d'eau Au dernier moment pour la polymérisation, on y ajoute : 0,03 ml de TEMED + 0,3 ml de Persulfate d'Ammonium à 10 %

3 -Préparation du gel de concentration à 5 %

Pour 10 ml de solution il faut : 1,25 ml d'Acrylamide + 1,25 ml de Tris Hcl pH 6,8+ 0,10 ml de SDS 10 %+ 7,29 ml d'eau Au dernier moment pour la polymérisation, on y ajoute : 0,01ml de TEMED + 0,1 ml de Persulfate d'Ammonium à 10 %

Pour réaliser l'électrophorèse, nous avons dénaturé les protéines présentes dans nos échantillons. En effet nos protéines qui étaient sous formes tertiaires voire quaternaires ont été dénaturées sous l'effet du tampon de Laemmeli. Ainsi nous avons obtenu des protéines sous forme primaire qui ont pu être utilisées pour l’électrophorèse.Le tampon Laemmeli est très toxique.

II) RésultatsA) Détermination de l'activité catalytique volumique Nous avons lu les absorbances à 450nm toutes les 15 secondes pendant 3 min 30s. Et nous avons obtenu le tableau suivant :Tableau 4 :

F0 F1 F2 F3 F4 F5 F6

0 0,444 0,542 0,469 0,617 0,622 0,616 0,614

0:15 0,437 0,531 0,468 0,605 0,618 0,604 0,606

0:30 0,422 0,521 0,466 0,604 0,618 0,555 0,578

0:45 0,407 0,514 0,467 0,608 0,614 0,519 0,551

1 0,395 0,505 0,466 0,609 0,612 0,477 0,530

1:15 0,373 0,491 0,467 0,605 0,610 0,442 0,489

1:30 0,361 0,481 0,466 0,607 0,614 0,419 0,470

1:45 0,345 0,473 0,465 0,608 0,611 0,391 0,451

2 0,331 0,462 0,464 0,605 0,616 0,368 0,431

2:15 0,317 0,455 0,464 0,605 0,605 0,349 0,412

2:30 0,305 0,442 0,466 0,609 0,612 0,330 0,400

2:45 0,289 0,431 0,466 0,601 0,612 0,309 0,378

3 0,277 0,420 0,466 0,594 0,609 0,301 0,366

3:15 0,268 0,412 0,461 0,603 0,616 0,282 0,363

3:30 0,257 0,400 0,461 0,598 0,615 0,270 0,364

Ce qui nous a permis de tracer les courbes suivantes :Courbe d'absorbance en fonction du temps des fractions en présence du Micrococcus( courbe 1)

B) Dosage des protéinesNous avons lu les absorbances à 700nm des solution préparés pour la gamme d'étalonnage.Tableau 5

Concentration en mg/2ml 0 0,02 0,04 0,06 0,08 1

Absorbance à 700nm 0 0,045 0,069 0,111 0,135 0,159

Ce qui nous a permis de tracer la courbe suivantes :

Gamme d'étalonnage avec détermination des concentrations des fractions ( courbe 2)

C) Dosage des protéines des différentes fractionsLe schéma ci dessous représente les différentes étapes de l'organigramme avec les protéines présentesdans chacune des fractions réalisées.

Nous avons lu les absorbances à 700 nm des solutions préparées selon le tableau 3. Ainsi nous avons pu déterminer la concentration des différentes solutions. Voir courbe 2 Gamme d'étalonnage avec détermination des concentrations des fractions.Tableau 6

Fraction F0 F1 F2 F3 F4 F5 F6 F'0 F'1 F'5

Dilution 1/50 1/50 1/10 1/5 3/10 1/2 0 1/100 1/100 1/2

Absorbance à 700 nm 0,339 0,26 0,276 0,180 0,093 0,463 0,347 0,240 0,303 0,633

Dans le tableau suivant, nous exposons les différents résultats obtenus au cours de la manipulation. Etaussi certains résultats obtenus par divers calculs.Exemples de calculs :Pour F0.Concentration en mg/ml (concentration lue sur la gamme d'étalonnage en mg/2ml x le facteur de dilution ) / 2 = (0,204 x 50) /2 = 5,1 mg/ml

Quantité de protéines par tube en mg sachant que dans un tube on a 2 ml.

(concentration en mg/ml) x 2 = 5,1 x 2 mg

Nous avons donc obtenu le tableau suivant :Tableau 7

Fraction F0 F1 F2 F3 F4 F5 F6 F'0 F'1 F'5

Volume (en ml) 9,5 5,2 19,5 18,5 11 10 10 2 2 2

Dosage desprotéines

Dilution effectuée 1/50 1/50 1/10 1/5 3/10 1/2 - 1/100 1/100 1/2

Absorbance à700nm 0,339 0,26 0,276 0,180 0,093 0,463 0,347 0,240 0,303 0,633

Concentration enmg/ml de fraction 5,1 4 0,84 0,275 0,095 0,28 0,104 7,3 5,45 0,382

Quantité par tubede dosage en mg 10,2 8 1,68 0,55 0,19 0,56 0,208 14,6 10,9 0,764

Dans le tableau suivant, nous exposons les différents résultats obtenus au cours de la manipulation. Etaussi certains résultats obtenus par divers calculs.Exemples de calculs:Pour F0.Activité en unité /ml de fraction. Sachant qu'une unité de lysozyme est représenté par une diminution de 0,001 unité d'absorbance à450 nm par minute. Pour une variation de 0,056 unité par minute on a :( (0,056 x 1) / 0,001) / 2 = 28 unités de lysozyme/ml de fraction.Tableau 8

Fraction F0 F1 F2 F3 F4 F5 F6

Activitévolumique

Variation del'absorbance par

minute 0,056 0,041 0,001 0,008 0,004 0,105 0,083

Activité enunité/ml de

fraction 28 20,5 0,5 4 2 52,5 41,5

Quantité totale de protéines parfraction 48,45 20,8 16,4 5,09 1,045 2,8 1,04

Nombre d'unité total delysozyme par fraction 266 106,6 9,75 74 22 525 415

Activité spécifique en unité delysozyme/ mg de protéine 0,58 0,49 0,03 0,78 1,91 18,75 39,90

Calculs de rendement de purification-Pour F4/F0= 0,0216 = 2,16 %-Pour F5/F0= 0,058= 5,8 %-Pour F6/F0=0,021=2,1 %

Exemple de calcul de rendement :pour F4/F0 on a 1,045/48,45 = 0,02160,0216 x 100 = 2,16 %

D) Contrôle de purification par électrophorèseDans le tube F0 on observe 4 tâches de migrations. Ces taches correspondent a toutes les protéines contenus dans le blanc d’œuf. Durant les étapes de lavages :Tube F1, on observe 3 tâches de migration qui correspondent à 3 des protéines les plus lourdes du blanc d’œuf : ovotranseferrine, ovalbumine et ovoflavoprotéine.Tube F2, on observe 2 tâches de migrations qui correspondent aux 2 protéines les plus lourdes du blanc d’œuf : ovotranseferrine et ovalbumineTube F3, on observe 1 tâche de migration qui correspond à la 2ème protéine la plus lourdes du blanc d’œuf : ovalbumine.

Tube F4 on observe aucune tâche de migration .On peut donc dire que l'ovalbumine est la protéine qui est présente en plus grande quantité dans le blanc d’œuf, après viennent l'ovotransferrine, et ovoflavoprotéine. La dernière étape nous montre que les étapes de lavage on été très efficace. Durant les étapes de désorption :Tube F5, on observe une tâche de migration qui correspond au lysozyme.Tube F6, on observe une tâche de migration qui correspond au lysozyme on peut donc dire que les étapes de lavages ont étés efficaces car aux étapes de désorption on récupère que du lysozyme.

Ce tableau nous a permis d'identifier les différentes protéines contenus dans le blanc d’œuf de poule . Nous avons fais correspondre chaque tâche de migrationavec une ou des protéines de la listes en fonction de leur poids moléculaire

Schéma : Electrophorégramme et Courbe de log(masse moléculaire) en fonction de la distance de migration(Courbe 3)Tableau 9 de la courbe 3

Distances demigrations en cm

2,4 4,2 5,4 6 7,5 8,3 9,7

Poids moléculaireen Da 66000 45000 36000 29000 24000 20100 14200

Nous disposons d'un gel témoin qui est lesuivant :Sur le gel témoin, on observe :- Dans le tube F0, 3 tâches de migrationsbien distincts dont la dernière tout en basest celle laissée par le lysozyme.- Dans le tube F1, 2 tâches de migrations.Et entre et en dessous des tâches demigrations, on observe des traînées. - Dans le tube F2, 2 tâches de migrationsbien distincts.- Dans le tube F3, 2 tâches de migrationsbien distincts.- Dans le tube F4, 1 tâche de migration- Dans le tube F5, 1 tâche de migration, une tâche qui représente le lysozyme.

- Dans le tube F6, aucune tâche de migration

III) Discussion des résultats A) Extraction et purification du blanc d’œufL'extraction des protéines se fait à travers différentes étapes de lavage.La perte de protéines lors des lavages est importantes car on observe une diminution de la concentration en protéines entre les fractions F2, F3 et F4. On passe d'une concentration de 1,68mg/ml pour F2 à une concentration de 0,19 mg/ml pour F4.L'étape de lavage où on obtient la fraction F4 est la 3ème et dernière étape de lavage.

Selon nous, il n'est pas raisonnable de supprimer cette dernière étape de lavage ( F4) car elle permet d'éliminer les derniers restes d'enzymes chargées négativement dans le milieu.Et il n'est pas non plus raisonnable de supprimer la dernière étape de désorption (F6) car elle permet de récupérer le reste de lysozyme.

À chaque étapes de lavages on enlève des enzymes chargées négativement jusqu'à ce qu'il n'en reste presque plus ; donc ces enzymes ne se retrouvent pas dans les étapes suivantes.À chaque étapes de désorptions on enlève les lysozymes donc s'il y avait des étapes suivantes on ne les retrouverait pas.

B) Détermination de l'activité catalytique volumique Dans le tube F0, l'absorbance diminue rapidement au cours du temps. A t0= 0s, l'absorbance à 450 nm vaut 0,444 et à tf= 3 min 30 s elle vaut 0,257. Cette diminution importante de l'absorbance illustreune importante activité catalytique.Dans le tube F1, on observe une forte diminution de l'absorbance à 450 nm. A t0= 0s l'absorbance vaut 0,542 et à tf=3min 30s elle vaut 0,400. Cette diminution illustre une légère activité catalytique.Dans les tubes F2, F3 et F4 l'absorbance varie très peu voire pas du tout. Ce qui illustre une activité catalytique quasi-inexistante. Dans le tube F5, on observe une forte diminution de l'absorbance à 450 nm. A t0= 0s l'absorbance vaut 0,616 et à tf=3min 30s elle vaut 0,270. Cette forte diminution illustre une forte activité catalytique.

Dans le tube F6, on observe une diminution assez importante de l'absorbance à 450 nm . A t0= 0s l'absorbance vaut 0,614 et à tf= 3 min 30s elle vaut 0,364. cette diminution de l'absorbance illustre uneactivité catalytique cependant elle reste moins importante que pour le tube F5. Ces différentes variations de l'absorbance sont observables sur le graphique :Courbe d'absorbance en fonction du temps des fractions en présence du Micrococcus ( Courbe 1)

Le Micrococcus est une bactérie, le lysozyme lyse les parois de cette bactérie. Ainsi la dégradation du Micrococcus est observable par la lecture de l'absorbance à 450 nm.

La présence de lysozyme dans les tubes F0 , F1, F5 et F6 est donc indiscutable. De même l'absence de lysozyme dans les tubes F2, F3 et F4 est indiscutable.

En théorie nous ne devons pas observer d'activité catalytique au tube F1 cependant c'est le cas. On peut donc considérer que :Hypothèse 1 :La quantité de CM-cellulose ( 1g) ajouté dans le tube n'était pas suffisante pour accrocher tout le lysozyme présent dans dans la fraction F0. Donc une partie du lysozyme se retrouve dans le surnageant.Hypothèse 2 :La CM-cellulose étant un échangeur faible de cation, il n'est pas suffisamment puissant pour accrocher tout le lysozyme.

C) Dosage des protéinesLe réactif de Folin est une méthode de dosage colorimétrique des protéines. Nous avons réalisé des dilutions des solutions F0, F1, F5 . Cependant lors de la lecture des absorbances nous observons que les absorbances des solutions diluées sont plus élevées que celles des solutions mères. En théorie en devrions observer des absorbances moins élevées que celles des solutions mères.Donc on pourrait se demander pourquoi ?Hypothèse : peut-être que lors du prélèvement des solutions mères nous n'avons pas agité ainsi nous avons récupéré la majorité des protéines présentes dans la fraction.

RendementEn général, le lysozyme représente 7 à 8 % des protéines du blanc d’œuf. Pour les fractions F5 et F6 nous obtenons des rendements respectifs de 5,8 % et 2,1 %. En regroupant F5 et F6, nous obtenons une quantité équivalente à la proportion de lysozyme présente dans le blanc d’œuf. Dans le cas de la fraction F4 nous avons un rendement de 2,2 %, ce qui correspond aux 2,2 % de protéines chargées positivement restantes en fin de lavage.Donc nous pouvons regrouper les fractions F5 et F6 mais pas F4. D) Contrôle de la purification par électrophorèseSur l'Electrophorégramme et sur la courbe de log(masse moléculaire) en fonction de la distance de migration, on observe que plus la distance de migration est importante, plus le poids moléculaire est faible. Ainsi les protéines les plus légères tels que le lysozyme se retrouve en bas vers la borne +. il y a donc une certaine relation de proportionnalité entre la distance de migration et la masse moléculaire des protéines.

Comparaison des gelsOn a donc des distances de migrations différentes selon les poids moléculaires des protéines . Mais en observant notre gel et le gel témoin, il y a quelques différentes en ce concerne les migration et les

taches obtenues.En effet pour le puits F0 on ne trouve pas le mm nombre de tache c'est certainement dû à une erreurde notre part.Hypothèse 1 : Peut-être que notre gel possède 3 taches pour le puits f0 (comme le gel témoin) et que ce que nous considérons comme une 3ème tache a 5,4 cm n'est qu'une traînée.Hypothèse 2 : Ça peut être dû à une différence de concentration entre les 2 fractions f0 .

Même hypothèses pour le puits F2 des 2 gels.

Pour le puits F4 du gel témoin on obtient une tâche contrairement à notre gel qui n'en possède aucune, on en déduit que le lavage a été moins efficace lors de la purification destiné au gel témoin ou c'est tout simplement une erreur de manipulation. Tout le surnageant F3 n'aurai pas été récupéré d’où le fait de trouver une petite tâche pour le puits de F4 sur le gel témoin.

De plus, en comparant de nouveau les 2 gels, il y a une différence au niveau du puits F6 du gel témoin, on observe pas de tâche tandis que sur notre gel si, c'est certainement du encore une fois à unmauvais prélèvement de la fraction précédente causant ainsi une tâche pour a fraction suivante ou c'est peut être dû à une différence de concentration en lysozyme.En effet selon les résultats obtenues les manipulations pour notre gel aurai été effectué avec une concentration en lysozymes plus élevée que celle s pour le gel témoin d’où le fait de trouver un reste d'enzymes (taches) dans F6 ou pas.