Confirmation microbiologie des cas

d’Ulcère de Buruli

Cours International

Centre Pasteur du Cameroun

Yaounde, 23-30 janvier 2006

F. Portaels

Confirmation microbiologique des cas d’Ulcère de Buruli

I. Pourquoi ?

1. En zone d’endémie:• augmenter la qualité du diagnostic clinique• confirmer la qualité des excisions chirurgicales• confirmer des cas d’échecs, de rechutes• confirmer l’efficacité d’éventuels traitements

antimycobactériens• analyser les souches de M. ulcerans

2. En zone non endémique• confirmer la présence de l’UB

II. Comment ?

• Examen direct • Culture• PCR• Histopathologie

Un vrai cas d’UB est confirmé par au moins 2 résultats positifs (OMS, 2001)

N.B. Pour les centres qui ont une excellente expérience dans le diagnostic clinique de l’UB un seul résultat positif pourrait suffir.

III. Recueil des échantillons

1. Formes non ulcérées

Echantillons prélevés à partir des tissus excisés chirurgicalement.

Prélever au centre du tissu excisé (ex: graisse nécrosée)

Placer les fragments de tissus (2 4 mm3) dans le milieu de transport (MT)

Enfoncer au fond du MT

(Le MT doit complètement entourer le f’ragment)

2. Formes ulcérées

2.1. Ecouvillons

Ecouvillonnages multiples sous les bords décollés de l’ulcère (la répartition des bactéries peut être très hétérogène)

Ne pas écouvillonner le centre de l’ulcère

2.2. Tissus prélevés à partir d’une excision

chirurgicale

cf. formes non ulcérées

3. Formes osseuses

3.1. Diagnostic microbiologique

Uniquement dans des centres de référence.

Produits de curetages, fragments d’os, “gelée” à placer dans le milieu de transport (cf. les autres formes).

3.2. Facteurs de risque d’atteinte osseuse

I. Facteurs microbiologiques

1. Charge bacillaire des lésions cutanées à l’examen anatomo-pathologique:

– patients avec atteintes osseuses: 95.8% Z+

– patients sans atteintes osseuses: 52.4% Z+

2. Rôle des germes de surinfection (staphylo, strepto)? NEANT !

3. La virulence des souches pourrait jouer un rôle important. – Souches africaines: les plus virulentes

atteintes osseuses– Souches australiennes, américaines: moins

virulentes pas d’atteintes osseuses

4. Survie à 37°C des mycobactéries isolées des os? NON ! – Les souches des os survivent moins bien

“in vitro” à 37°C que celles de la peau!– Les souches des os poussent moins bien

“in vitro” à 33°C que celles de la peau!

Analyses microbiologiques

Culture positive

Examen direct lésion cutanée lésion ossseuse

4+ 16/17 (94.1%) 5/12 (41.7%)

3+ 7/13 7/13

2+ 5/12 4/11

1 2/8 1/12

- 3/11 6/22

Total 33/61 (54.1%) 23/70 (32.9%)

Facteurs de risque d’atteinte osseuse

II. Facteurs liés à l’hôte

1. Le délai à la consultation joue un rôle primordial!– médiane pour patients sans atteinte osseuse: 46

jours– médiane pour patients avec atteinte osseuse: 91

jours

2. Présence d’une ancienne cicatrice– guérison naturelle– guérison après traitement traditionnel

3. Infection par le VIH

4. Autres maladies (schistosomiase, drépanocytose, … )

5. Autres facteurs (génétiques? immunitaires?

IV. Positivité des tests en fonction des formes cliniques(cas définis par au moins 2 tests positifs) Résultats de Zagnanado (Benin)

Formes Nombre de cas positifs (%+)cliniques ZN Culture PCR Histopathologie

Nodule 20 (62.5) 16 (59.3) 29 (93.5) 18 (94.7)Oedème 4 (80.0) 4 (80.0) 6 (100.0) 3 (100.0)Plaque 268 (82.7) 201 (83.4) 314 (98.8) 79 (98.8)Ulcère 125 (72.3) 91 (65.9) 167 (98.7) 83 (94.3)Os 24 (63.2) 7 (20.6) 38 (100.0) 24 (85.7)Forme mixte 274 (85.1) 201 (75.0) 306 (98.7) 98 (96.1)Ulcère en voiede guérison 20 (74.1) 15 (78.9) 26 (100.0) 3 (100.0)Autres - 1 (50.0) 2 (100.0) -

TOTAL 735 (79.6) 536 (73.0) 888 (98.7) 308 (95.1)

Formes ulcéréesvs formes non p=<0.001 0.004 NS NSulcérées

V. Nombre d’échantillons à prélever par patient

Résultats de Zagnanado (Benin)

Nombre Nombre de cas % casd’échantillonsconfirmés par au confirmés

moins 2 tests+/total

1 375 / 797 47.1 %

2 277/410 67.6 %

3 87/112 77.7 %

>4 156 / 180 86.7 %

VI. Hétérogéneité des tissus. un exemple.

Patient n° Fragment Histopathologiede tissu ZN PCR Culture BAAR

nécrose

1 1 - - - - -

2 - - - - -

3 - + - + +

4 - - - - -

5 + + - + +

2 1 + + - + -

2 + + - + +

3 + + - + +

4 + + - + +

5 + + - + +

6 + + - + +

7 - + - + +

VI. Hétérogéneité des tissus. un exemple. (suite)

Patient n° Fragment Histopathologiede tissu ZN PCR Culture BAAR

nécrose

3 1 + + + - +2 + + - - +3 + + - - +4 + + - - +5 - + - - +6 - + - - -7 + + - - +8 + + + - +9 + + + - +

4 1 - - - - +2 - + + + +3 - + + - +4 - - - - -5 + + - + +

VI. Hétérogéneité des tissus. un exemple. (suite)

Patient n° Fragment Histopathologiede tissu ZN PCR Culture BAAR nécrose

5 1 + + + + +2 - + + + +3 + + + + +4 - + + - +5 - + - + +

6 1 - - - - +2 - + - - -3 + + + - +4 + + + + +5 - + + - -

TOTAL 19 30 12 16 18%+ 52.8 83.3 33.3 44.4 77.8

Distribution hétérogène des bacilles: résumé

Nombre de biopsies punch positives pour 2 tests chez 6 patients

Patient n° Nb+/total %+

1 2/5 40

2 6/7 86

3 8/9 89

4 3/5 60

5 5/5 100

6 3/6 50

VII. Quelques questions

Q1. Faut-il 2 tests positifs pour confirmer un cas ?

Q1. Faut-il 2 tests positifs pour confirmer un cas ?

R1. - Oui, pour éviter un diagnostic erroné

(faux positif, faux négatif)

- Néanmoins: risque de ne pas pouvoir confirmer une forme paucibacillaire

(ex: ulcère avec granulome)

Q2. La sensibilité des tests varie-t’elle en fonction des formes cliniques ?

Q2. La sensibilité des tests varie-t’elle en fonction des formes cliniques ?

R2 Oui - ZN et culture plus fréquemment positifs pour

les formes non ulcérées - PCR et histopathologie: pas de différence

Q3. Si un seul test est utilisé, lequel faut-il choisir ?

Q3. Si un seul test est utilisé, lequel faut-il choisir ?R3 * la PCR IS2404 en premier choix car: - sensibilité de 93.5% à 100% suivant les formes

cliniques - peut être appliqué à des écouvillonnages - peut être appliqué sur des échantillons conservés dans l’alcool - test compliqué, coûteux - nécessité d’un laboratoire bien équipé - risques de faux positifs (matériel à usage unique

indispensable) * l’histopathologie car - sensibilité de 84.3% à 100% - importante pour les formes paucibacillaires - peut fournir un diagnostic différentiel

Q4. Combien faut-il prélever d’échantillons pour confirmer un diagnostic d’UB ?

Q4. Combien faut-il prélever d’échantillons pour confirmer un diagnostic d’UB ?

R4.Au moins 2 échantillons car: - distribution hétérogène des bacilles - augmente la positivité des patients

VIII. Conservation et transport des échantillons

1. Analyse immédiate:

récipient stérile sans additif

2. Echantillons à transporter

2.1. Analyse dans les 24 heures

garder à +4°C ou au froid dans un “frigo-box” (avec glace)

2.2. Au-delà de 24 heures (cas le plus fréquent)

utiliser un milieu de transport (MT)

garder les MT à +4°C jusqu’au moment de l’envoi

IX. Milieu de transport semi-solide (SEMI) 1. CompositionMiddlebrook 7H9 + PANTA (Becton-Dickinson)(Polymixine B, Amphotéricine B, acide Nalidixique, Triméthoprime, Azlocilline) + 0.5% agar

2. Avantages• Transport à t° ambiante• Contrôle des contaminations (PANTA)• Survie de M. ulcerans pendant longtemps (> 1 mois)Remarque: ce n’est PAS une raison pour laisser traîner les échantillons !• Survie des autres mycobactéries (M. tuberculosis, M. chelonae)

3. Nos résultats après transport dans le SEMI

Cultures positives à partir d’échantillons des pays suivants:• Bénin• Côte d’Ivoire• République Démocratique du Congo• Angola• Papouasie-Nouvelle Guinée• Australie

PCR, séquençages positifs pour M. ulcerans à partir des échantillons (négatifs en culture) des pays suivants• Soudan• Ouganda• Pérou

X. Diagnostic microbiologique de l’UB

Comparaison des résultats de 2 laboratoires:

1. Le Laboratoire de Référence des Mycobactéries

(LRM) de Cotonou

(Prof. S. Anagonou et Dr. D. Affolabi)

2. L’Institut de Médecine Tropicale (IMT) d’Anvers

(Prof. F. Portaels)

1. Matériel et méthodes

• Patients cliniquement suspects d’UB

• Fragments de tissus prélevés lors des excisions

• Chaque fragment est coupé en 2

- un morceau pour le LRM

- un morceau pour l’IMT

• Chaque morceau est placé dans le milieu de

transport

• Conservation à +4°C jusqu’au moment de l’envoi

2. Résultats

2.1. Examen direct

LRM: Auramine + : 234/359 = 65.2%

IMT: Ziehl + : 179/359 = 49.9%

IMT + -

+ 158 76 234

LRM

- 21 104 125

179 180 359

Coefficient kappa: 0.46

2.2. Culture

Cultures positives sur LJ / total non contaminé

LRM: 90/233 = 38.6%

IMT: 101/233 = 43.3%

IMT + -

+ 65 25 90

LRM

- 36 107 143

101 132 233

Coefficient kappa: 0.46

Contaminations

LRM: 77/404 = 19.1%

IMT: 63/404 = 15.6%

3. Comparaison LRM-IMT: conclusions

• La coloration à l’Auramine donne de meilleurs

résultats que le Ziehl (65% vs 50%)

• La positivité des cultures est comparable

(39% vs 43%)

• La concordance est moyenne

hétérogénéité des tissus !

• Taux de contaminations légèrement plus élevés au

LRM qu’à l’IMT (19% vs 16%)

MAIS: LRM: hotte aspirante au moment de l’étude!

Maintenant: flux laminaire !

Le transfert de technologie est réussi:

Le LRM est un excellent laboratoire pour la

confirmation microbiologique des cas d’UB par

examen direct et par culture

XI. Analyse des échantillons négatifs par examen

direct, culture et PCR• UB confirmé sur des échantillons antérieurs

• UB non actif ou guéri

• Infections secondaires

• Autres: 12 / 404 = 3%

plaques: 5

nodules: 3

ulcères: 3

tuméfaction: 1

Mycobacterium ulcerans Disease

(Buruli Ulcer) in Rural Hospital,

Southern Benin, 1997-2001

Debacker et al. Emerg Infect Dis 2004; 10: 1391-1398

XII. L ’ulcère de Buruli dans un centre de santé

rural au Bénin

CSNG Zagnanado

• Le Centre Sanitaire et Nutritionnel Gbemoten (CSNG)

• Premier cas traité en 1977• aujourd’hui: plus de 4000 patients

L’étude

• 1700 patients UB admis entre 1997-2001• autres affections:13 patients• rechutes: 57 patients (3.3%)

• 1630 patients UB pour l’analyse

1630 patients

13 patients: confirmation d’une maladie autre que l’UB

abcès à M. chelonae: 4

tuberculose cutanée: 5

diphtérie cutanée: 1

mucormycose: 2

ostéosarcome: 1

% positivité des examens de laboratoire en fonction des formes cliniques

Forme Ziehl+ Cult+ PCR+ Histo+

ulcère 65.2 63.0 96.3 96.4

nodule 45.8 56.5 91.3 95.0

oedème 66.7 50.0 100 100

plaque 81.9 75.2 96.7 100

os 64.5 28.0 100 92.0

formes

mixtes 79.7 74.2 97.1 95.8

XIII. Pourquoi les échantillons sont-ils négatifs ?

1. C’est un vrai cas d’UB !• le choix du fragment n’est pas bon:

- trop superficiel (ex: Guinée)- tissus prélevés en dehors des lésions nécrosées

• tissus trop contaminés- lors du prélèvement- pendant le transport

(tissus non enfoncés au fond du milieu de transport)• lésions en voie de guérison, en voie de cicactrisation• erreurs de n°s, erreurs au laboratoire

2. L’UB est présent dans la région mais ce n’est pas un cas d’UB !

Autres affections cf diagnostic différentiel (guide à l’usage des professionnels de la Santé)

3. L’UB n’est pas présent dans la région

XIV. Quelques derniers conseils

1. Demander au chirurgien de prélever lui-même les tissus nécrosés. Les placer dans un récipient stérile (plateau ou boîte de Pétri)

2. Prélever plusieurs échantillons (au moins 2) par patient (répartition hétérogène des BAAR dans les lésions)

3. Marquer les n°s sur les boîtes de Petri et milieux de transport au crayon ou stylo à bille sur un sparadrap (les marqueurs s’effacent à l’humidité !).

4. Prévoir un flacon avec formol pour l’histopathologie (très important pour le diagnostic différentiel)

XIV. Quelques derniers conseils (suite)

5. En routine, faire d’abord un examen direct (ED)

6. Si ED négatif → PCR recommandé

7. Culture: peu sensible surtout pour les lésions osseuses.

Importante pour l’évaluation des traitements antimycobactériens, pour la recherche (empreintes génétiques).