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PARIS XII CRETEIL – TORCY – SENART
1er semestre 2019-2020 Patrick Razon
UE 1
BIOCHIMIE
FICHE DE COURS 5 : ENZYMOLOGIE
CPCM – 106 Bd Saint Germain 75006 PARIS – Tel : 01.46.34.52.25 [email protected] / www.prepa-cpcm.com
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ENZYMOLOGIE
Table des matières
1. Transformer : de l’importance des enzymes p.3
1.1.Généralités p.3
1.2.Différentes classes d’enzymes p.3
2. Nomenclature internationale p.3
3. Propriétés des enzymes p.4
4. Mécanismes généraux de la catalyse p.4
5. Cinétique enzymatique simple : modèle de Michaélis p.5
5.1. L’équation de Michaélis p.5
5.2. Inhibition en cinétique michaélienne p.6
6. Mécanisme d’action des protéases à sérine p.8
7. Neurotoxique inhibiteur de l’acétylcholinestérase : le gaz sarin p.8
8. Le contrôle de l’activité enzymatique p.8
9. Les enzymes allostériques : contrôle allostérique de l’activité enzymatique p.9
9.1.Généralités sur les enzymes allostériques et allostérie p.9
9.2. Mécanisme d’action de l’aspartate transcarbamylase p.10
10. Les cofacteurs enzymatiques p.10
10.1. Généralités p.10
10.2. Cofacteurs ioniques p.11
10.3. Coenzymes p.11
10.4. Métabolites p.11
ENZYMOLOGIE
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1. Transformer : de l’importance des enzymes
1.1. Généralités
La nature chimique de la transformation permet la classification des enzymes.
La transformation est donc la fonction spécifique des enzymes.
D’autres protéines peuvent cependant posséder une fonction de transformation (ex : myosine, canal ionique…).
Les enzymes sont des protéines qui catalysent la transformation d’un/de substrat(s) en produit(s).
Les ribozymes (ARN catalytiques) sont une exception.
Un substrat est une molécule à transformer
Un produit est une molécule qui a été transformée
Un produit peut être le substrat d’une autre transformation : notion de chaîne métabolique
1.2. Les différentes classes d’enzymes
Les différentes classes d’enzymes : 6 classes
1 Oxydoréductases Transfert d’électrons
2 Transférases Transfert de groupes chimiques sur le substrat
3 Hydrolases Réactions d’hydrolyse (avec H2O)
4 Lyases Création / suppression de liaisons doubles
5 Isomérases Gèrent les systèmes à double liaison et vont permettre l’obtention de différents isomères
6 Ligases Formation de liaisons covalentes C-C, C-S, C-O, ou C-N par condensation. Nécessite
ATP (énergie)
.
2. Nomenclature internationale
Différentes nomenclatures
Nom du substrat + ASE Nom du substrat +
réaction réalisée
Numéro matricule à 4 chiffres
X X X X
Réaction chimique Classe Sous-classe Caractéristique de
l’enzyme
3. Propriétés des enzymes
Les enzymes sont spécifiques du/des substrat(s) et du type de réaction. Par exemple :
La trypsine reconnait les résidus basiques chargés positivement (Lys, Arg)
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La chymotrypsine reconnait les résidus aromatiques (Phe, Tyr, Trp)
La spécificité d’une réaction enzymatique est liée à l’adéquation entre la structure du/des
substrat(s) et la structure de l’enzyme.
On appelle SITE ACTIF de l’enzyme, la partie de la protéine capable de RECONNAÎTRE
ET DE TRANSFORMER le/les substrats
Les enzymes sont des catalyseurs biologiques A structure protéique souvent globulaire
Qui agissent à 37°C
Qui ont une grande spécificité : choix du substrat et présentation (site actif)
Qui ont des capacités d’autorégulation (allostérie, enzymes souvent régulatrices des flux
métaboliques)
Qui agissent en diminuant l’énergie d’activation des réactions en permettant la formation d’intermédiaires réactionnels dont l’énergie d’activation est plus basse
Mais les constantes d’équilibres des réactions ne sont pas modifiées par les enzymes.
Qui sont (comme tout catalyseur) retrouvés inchangés en fin de réaction
4. Mécanismes généraux de la catalyse
Les mécanismes qui permettent d’abaisser l’énergie d’activation = ceux qui favorisent la catalyse, sont en
petit nombre
Effet de proximité Catalyse acide - base Interactions
électrostatiques Catalyse covalente
L’une des premières
fonctions des enzymes
est de rapprocher les
réactifs et donc de
favoriser leurs
interactions
Presque toutes les réactions enzymatiques utilisent la catalyse
ACIDE (donneur de proton,
électrophile) -BASE (accepteur
de proton, nucléophile) dans au
moins une étape.
Il s’agit en général de l’échange de
protons entre le substrat ou un
intermédiaire et des résidus de
l’enzyme.
Les résidus chargés
d’une protéine
interagissent avec
des atomes chargés
du substrat ou des
intermédiaires
réactionnels
Les résidus polaires
non chargés (Ser,
Cys…) d’une protéine
interagissent avec des
atomes non chargés
du substrat pour
former une liaison
covalente temporaire qui permet l’apparition
de groupement plus
réactifs
Le changement conformationnel et la flexibilité : la fixation d’un substrat produit un
changement de structure qui favorise :
Soit la fixation d’un autre substrat
Soit la catalyse.
Ex : cas de l’hexokinase qui catalyse la phosphorylation du glucose en glucose-6-phosphate
Enzyme en conformation ouverte : le glucose n’est pas fixé sur son site → pas de catalyse
Enzyme en conformation fermée : le glucose est fixé sur son site → il y a catalyse
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Le passage de la conformation ouverte à la conformation fermée implique des
déplacements de plusieurs Angströms
5. La cinétique enzymatique simple – Modèle de Michaelis
Les facteurs qui influencent la réaction enzymatique
Le pH La température Autres composés que le substrat
Les modifications du pH
modifient l’état d’ionisation de
ces résidus (en fonction de leur
pKa propre).
C’est pourquoi l’activité enzymatique dépend du pH et
cette dépendance est
spécifique à chaque enzyme
Les enzymes sont des protéines.
L’activité enzymatique dépend de la structure 3D.
L’augmentation de la température « dénature » l’enzyme et le rend inactif.
La température d’inactivation est
spécifique de chaque enzyme.
Ions, coenzymes en particulier
5.1. L’équation de Michaelis
On se place en condition de vitesse initiale de telle façon qu’on peut négliger la concentration
en produit P donc la réaction caractérisée par la constante k-2. Il reste :
On suppose que la décomposition du complexe ES en E + P est l’étape cinétiquement
déterminante de la réaction. On peut donc poser :
][2 ESkvi
Puis on applique le principe de l’état stationnaire à l’intermédiaire réactif ES (complexe enzyme
/ substrat) afin de pouvoir exprimer [ES] de façon simple : en phase stationnaire on peut écrire :
21
1
211
]][[][
][][]][[0][
][
kk
SEkES
ESkESkSEkdt
ESd
cteES
En combinant ces équations et en tenant compte de la conservation de la quantité totale
d’enzyme ([E]totale = [E]libre + [ES]) on en déduit l’équation de Michaelis ci-dessous
graphiquement représentée par une hyperbole.
1
21
2max
max
][
][
][
k
kkKm
EkV
SKm
SVv
totale
i
Remarques
1- Pour [S] = Km on a vi = ½ Vmax
2- A saturation de substrat la vitesse tend vers Vmax : la réaction est saturable (courbe hyperbolique)
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3- Pour [S] = 10Km on arrive à 90% de Vmax environ
4- Pour un substrat donné, Vmax ne dépend que de k2 et de [E]totale. Vmax est proportionnelle à la concentration en
enzyme
5- Pour un substrat donné, Km ne dépend que des constantes de vitesse k1, k-1 et k2
6- Km est représentatif de l’affinité d’une enzyme pour son substrat. Plus Km est petit plus l’affinité est élevée.
KM varie généralement de 10-1M à 10-7M
7- Km peut être assimilé à la constante de dissociation du complexe ES
8- La constante k2 (ou kcat) traduit l’efficacité de l’enzyme et s’exprime en s-1
9- Le rapport kcat/KM décrit la perfection cinétique de l’enzyme. Il est de l’ordre de 108 à 109 M-1.s-1 pour les
enzymes les plus parfaites
5.2. Inhibition en cinétique michaélienne
5.2.1. Les inhibiteurs compétitifs réversibles (non métabolisables)
On a le modèle d’inhibition suivant où I est l’inhibiteur :
On ne peut pas avoir simultanément I et S fixée à l’enzyme ce qui implique que I ne peut pas se fixer sur le complexe ES.
En conséquence on aura Km augmenté et Vmax constante.
Par définition, l’inhibiteur perturbe la fixation du substrat au site actif. On pourra distinguer deux cas : Il existe une analogie structurale de I avec S : alors on peut proposer que I se fixe au site actif et
empêche la fixation de S (donc Km est augmenté)
Il n’y a pas d’analogie structurale de S avec I : dans ce cas on ne peut rien conclure quant au site de
fixation de I sur E mais on aura toujours Km augmentée, Vmax constante et fixation de I et S sur E
mutuellement exclusive.
5.2.2. Les inhibiteurs non compétitifs réversibles (non métabolisables)
On a le modèle d’inhibition suivant où I est l’inhibiteur :
5.2.3. Les inhibiteurs incompétitifs réversibles (non métabolisables)
On a le modèle d’inhibition suivant où I est l’inhibiteur :
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On peut avoir simultanément I et S fixée à l’enzyme ce qui implique que I peut se fixer sur le
complexe ES. Mais I ne peut se fixer que sur ES. En conséquence on aura Km diminué (puisque
la fixation de I sur ES déplace l’équilibre dans le sens de la formation de ES à partir de E + S)
et Vmax diminuée
5.2.4. Représentations graphiques en doubles inverses
6. Mécanisme d’action des protéases à sérine : chymotrypsine,
trypsine, élastase
La chymotrypsine est une protéase à sérine de 25kDa appartenant à la superfamille des protéases à sérine.
Elle est composée de 3 chaînes polypeptidiques liées par ponts disulfures inter-chaînes et intra-chaînes.
Elle fonctionne avec la triade catalytique sérine / histidine / aspartate au site catalytique : spécificité
d’action.
La chymotrypsine coupe les peptides en C des acides aminés aromatiques (Phe, Tyr, Trp).
D’autres acides aminés assurent la spécificité de reconnaissance du substrat. Cette spécificité ne dépend
que de quelques résidus d’acides aminés
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La liaison avec le substrat met en jeu des interactions non spécifiques
Et des interactions spécifiques (poche formée par les résidus Serine 189, Glycine 216 et Glycine 226)
Pour la trypsine, la sérine 189 est remplacée par Asp189
L’élastase est spécifique de résidus hydrophobes
7. Neurotoxique inhibiteur de l’acétylcholinestérase : le gaz
Sarin
Le gaz Sarin réalise une liaison covalente, irréversible, avec une sérine du site actif de l’acétylcholinestérase.
L’acétylcholine ne peut plus être hydrolysée et stimule en permanence ses récepteurs post-synaptiques → paralysie respiratoire.
Il existe de nombreux inhibiteurs enzymatiques, utilisés en médicine humaine. Des activateurs d’enzymes
existent mais sont plus rares (Ex : barbituriques = activateurs enzymatiques au niveau hépatique
8. Contrôle de l’activité enzymatique
Protéolyse ménagée Modification covalente réversible
Il s'agit donc d'un mécanisme de régulation
assez précis qui permet de maintenir un taux
normal de protéine dans le sang. On a donc un
pool de réserve de protéines, qui une fois
qu’elles deviennent nécessaires, vont être
activées.
C’est le cas de :
L’activation des enzymes digestives (trypsine et chymotrypsine) produites sous
forme de zymogènes inactives. On
appelle zymogène le précurseur inactif
d'une enzyme activée par protéolyse.
Des protéines plasmatiques de la cascade de coagulation du sang.
Essentiellement contrôle par phosphorylation / déphosphorylation en cascade sur des résidus sérine, thréonine
ou tyrosine.
Une phosphorylation (par kinases) peut être activatrice ou
inhibitrice.
De même pour les déphosphorylations (par phosphatases).
Mécanisme retrouver dans le diabète :
Absence d’insuline dans le diabète type I → le récepteur
à tyrosine kinase de l’insuline ne peut plus être activé
Diabète de type 2, dû à une résistance périphérique à
l'insuline : les récepteurs à l’insuline fixent l’insuline
mais ne peuvent plus transduire le signal. Une
phosphatase déphosphoryle le récepteur à l'insuline à
activité tyrosine kinase qui ne fonctionne donc plus.
L’activation de la chymotrypsine repose sur le principe de la protéolyse ménagée.
Initialement sous forme de zymogène, le chymotrypsinogène, cette endoprotéase va
subir une coupure via la trypsine donnant une chymotrypsine légèrement active, la
chymotrypsine .
Puis, une chymotrypsine active va encore cliver la chymotrypsine permettant d'obtenir
la chymotrypsine finale totalement active, la chymotrypsine α.
Contrôle par synthèse – dégradation Rôle de l’environnement de l’enzyme
Variation des concentrations cellulaires et / ou de la
localisation cellulaire
L’activité enzymatique dépend :
Du pH
De la température
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De la force ionique.
Coenzymes, cofacteurs, ions, vitamines
Concentrations en substrats, inhibiteurs
Existence de paramètres optimaux mais aussi de pH et
température de dénaturation.
Plusieurs modes de contrôles peuvent être associés
9. Les enzymes allostériques : contrôle allostérique de l’activité
enzymatique
9.1. Généralités sur les enzymes allostériques et l’allostérie
Les enzymes allostériques permettent une réponse rapide et fine aux variations des conditions intracellulaires.
Les enzymes allostériques sont des protéines allostériques et en partagent les caractéristiques.
Ce sont des protéines complexes possédant généralement plusieurs sous-unités
La fixation d’un modulateur allostérique modifie la conformation de l’enzyme et, donc, la fixation du
substrat, d’autres modulateurs et /ou l’activité.
Il existe donc une coopérativité du modulateur et/ou du substrat pour l’activité
Dans les enzymes allostériques, il existe généralement au moins un site de fixation pour le substrat (site catalytique) et au moins un site de fixation pour un modulateur (site régulateur).
Très souvent les enzymes allostériques se placent à une étape clé d’une chaîne métabolique.
Le produit final de la chaîne métabolique exerce souvent un rétrocontrôle négatif sur l’enzyme allostérique qui régule le flux
9.2. Mécanisme d’action de l’aspartate transcarbamylase
(ATCase)
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Catalyse une étape clé de la synthèse des bases pyrimidiques
Deux substrats : l’aspartate et le carbamoyl-phosphate
L’enzyme possède 6 sous unités catalytique (2 trimères catalytiques)
L’enzyme possède 6 sous unité régulatrices qui fixent l’ATP ou le CTP (3 dimères régulateurs)
La liaison des substrats est coopérative
L’enzyme est inhibée par le CTP qui diminue l’affinité de l’enzyme pour les substrats sans changer la Vmax
L’enzyme est activée par l’ATP qui indique que l’énergie est disponible pour la synthèse d’ADN
Comme l’hémoglobine, l’ATCase présente deux états extrêmes : un état T et un état R et un grand nombre d’états intermédiaires. L’état précis de l’enzyme dépend des rapports de concentrations des substrats, de l’ATP et du CTP.
L’état T est défavorable à la catalyse et est stabilisé par le CTP.
L’état R est favorable à la catalyse et est stabilisé par l’ATP ou les substrats
La fixation sur une sous-unité régulatrice d’un modulateur positif écarte les sous unités catalytiques en les faisant pivoter autour d’un axe de symétrie 3. Ce changement conformationnel les rend plus actives. La fixation d’un
modulateur négatif a l’effet inverse.
La cinétique des enzymes allostériques ne suit plus l’équation de Michaelis-Menten. Elle est comparable à celle
de la fixation de O2 sur l’hémoglobine.
La courbe de la vitesse initiale en fonction de la concentration en substrat est une sigmoïde. Elle traduit la
coopérativité.
10. Les cofacteurs enzymatiques
10.1. Généralités
Les cofacteurs sont des molécules organiques ou inorganiques indispensables à l’activité de certaines enzymes
Apoenzyme = enzyme (-) cofacteur
Holoenzyme = enzyme (+) cofacteur
Cofacteurs inorganiques = ions essentiels à l’activité
Cofacteurs organiques = coenzymes
10.2. Cofacteurs ioniques
Les ions activateurs se lient à l’enzyme et participent souvent à la fixation du substrat
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Ions métalliques des métallo-enzymes = cations qui sont fixées de manière forte à l’enzyme et participent directement à la catalyse (Fe, Zn, Cu, Co)
Enzymes activées par des métaux qui nécessitent leur stimulation par addition de métaux
10.3. Coenzymes
Co-substrats Groupements prosthétiques
Altérés durant la réaction et régénérés en son mode
originel dans une réaction annexe
Dissociés du site actif de l’enzyme
Font partie de la structure de l’enzyme
Doivent retourner à leur forme originelle dans la même réaction
Co-substrats et groupements prosthétiques confèrent à la structure enzymatique des résidus réactifs qui ne sont
pas normalement présents sur les chaines latérales des acides aminés composant l’enzyme.
Coenzymes vitaminiques
Fournis par la nourriture
Synthétisés par des microorganismes
Leur absence aboutit à des pathologies (Scorbut (C), Beri Beri (B1), Pellagre (NAD), anémie (B12)…)
Doivent être initialement transformés pour fonctionner comme des coenzyme
10.4. Métabolites
Synthétisés à partir de métabolites classiques
Nucléotides triphosphate (ATP…) = donneurs de P, de PP, de groupements adenosyl
SAM (S-adenosyl methionine) = donneur de CH3
Nucléotides sucres (UDP Glucose…) = donneurs de sucres
