Service de Biochimie :A.S. Bargnoux, J.P. Cristol

Service de Réanimation métabolique :L. Amigues, K. Klouche

Du stress Oxydant à la défaillance multiorgane

L. Amigues, K. Klouche

Stress oxydant : le paradoxe de l’oxygène !

O2

Oxygène :une nécessité

O2°-

Oxygène :Une toxicité

L’oxygène les éléments de toxicité

uv Métaux de transitionMétabolismeénergétique

O2°-O2

NADPH Oxydase Myeloperoxydase

Concept du Stress Oxydant :Concept du Stress Oxydant :rupture d’équilibre et toxicitérupture d’équilibre et toxicité

Activation

phagocytaireMétabolisme

énergétique

O2

O °-

NADPHOxydase

O2°-

O2°-

Oxydants

Nitrés Formesréactives de

l’oxygène

Oxydants

Chlorés

H2O2

O2

O2°-

Agressioncellulaire

Phagocytose

NADPHOxidase

Overproduction of Reactive Oxygen Speciesby activated phagocytes

iNOS

L-Arginine

NO° + O2°-

Lactoferrine

ONOO-

MPOClO-

OH°

Fe2+/ Fe3+

Oxidase

InflammationCytokines

Monocytes

O2 O2°-

Cellulesendothéliales

O2O2°-

NOX

NOX

SOD SOD

H2O2

MPO

ClO- ClO-

NADPH Oxydase et MPO :une nécessaire synergie

Cellules musculaires lisses

O2O2

°- PMNs

endothéliales

NOX

NOX

SODSODH2O2

MPO

O2O2°-

MPO

ClO-ClO-

ClO

StressOxydant

Protéines Glucides Lipides Facteurs deTranscription

Stress Oxydant : cibles moléculaires

ADN

AOPP AGEsFacteurs de

Transcriptionactivés

IsoprostanesMDA

Marqueurs de toxicité cellulaire Marqueurs durôle informatif ?

Basesmodifiées

CYTOKINES

LIPID NETWORK

NFKB

+NADPH

+

Stress oxydant et inflammation :Des boucles d’amplification

FRO

NFKBAP-1PPARHIF

++NADPH

Oxydase /MPO

+

Agression cellulaire

Dysfonctionmitochondriale

CYTOKINES

LIPID NETWORK

NFKB, AP-1

+

+Agression

Stress oxydant et Inflammation :Conséquences phénotypiques

+NADPH

OxydaseModificationsmétaboliques

+

FRO

NFKB, AP-1

HIF, PPARs++

Agressioncellulaire

+Oxydase

MPOmétaboliquesphénotypes

+

Dysfonction d’organes

Stress Oxydant : Evolution du concept

Bactéricidie

Transdifférenciation

Prolifération

Hypoxie Glucose Cisaillement

Cytotoxicité / Nécrose

ProapoptotiqueFacteur de transcription

ROS

EffecteuramplificateurSensor

Du stress Oxydant à la défaillance multiorgane

I) Au niveau du concept :

- La production d’oxydants est multifactorielle. Le Système NADPHOxydase/NOX joue un rôle déterminant dans la surproduction

- Le stress Oxydant a des actions toxiques, informatives et un rôle desensor

- Le stress oxydant et l’inflammation sont liés par des bouclesd’amplification et jouent un rôle clé dans les modifications phénotypiques

II) Le stress Oxydant : une composante du sepsis ?Comment explorer le stress oxydant ?

d’amplification et jouent un rôle clé dans les modifications phénotypiques

Les marqueurs du stress oxydatif

EOA(ROS)

Difficilementmesurables

in vivo

Systèmes producteurs :Dysfonction mitochondrialeActivité NADPH Oxydase

MPO

mesurablesin vivo

Produits deperoxydation

lipidique

Produitsd’oxydationdu glucose

Produitsd’oxydation

des protéines

Produitsd’oxydationde l’ADN

TBARS, MDA, IsoP AOPP AGEs

La dysfonction mitochondriale est associée àLa dysfonction mitochondriale est associée àla sévérité du choc septique :la sévérité du choc septique :

0,2

0,3

Activité Complexe I(citrate synthase activity)

Brealey D et al., Lancet 2002, 360: 219-223

0

0,1

0,2

CTRL Survivants DCD

L’inhibition du complexe I est liée au stressL’inhibition du complexe I est liée au stressoxydantoxydant

Brealey D et al., Lancet 2002, 360: 219-223

Le NO et les iNOS : une étape clé du sepsisLe NO et les iNOS : une étape clé du sepsis

Szabo C., Br. J. Pharmacol., 1993

Activation systémique de la NADPH oxydasechez les patients septiques

45 pts en ICUseptiquesnon septiquesvolontaires

Production d’O2°- par les phagocytes

Durant R., Shock 2004;22:34

10

30

50

70

90

5

15

25

35

AO

PP,µ

mo

l/l

Résultats comparablesSoriano FG et al. CCM 2006;34:1073Abiles J et al. CC 2006;10:146

* p<0.05 vs témoins

** p<0.05 vs témoins

et non-septiques

*** *

La NADPH Oxydase en ICU : un lien avecLa NADPH Oxydase en ICU : un lien avecl’inflammation ?l’inflammation ?

600

Activité NADPH OxydasePMA/Basal (%)

80

100

AOPP (µmol/L)266,9+437,4

200

300

IL-6

L. Amigues, Protocole CIRAH

0

200

400

CTRL ICU0

20

40

60

CTRL

3+5

0

100

CTRL ICU ICU

Le sepsis stimule la MPO tissulaire

Foie

2

MP

O(U

/gd

etissu

) Reins

4

6

8

Intestin0,4

0,6* *

Chiu WC et al., Journal of Nutritional Biochemistry 2009

0

1

T0 T6h T24h

MP

O(U

/gd

etissu

)

0

2

4

T0 T6 T240

0,2

T0 T6 T24

1 000

1 500

MPO (pmol/L)

MPO plasmatique : un marqueur (accessible) desepsis ?

IC(BNP> 100)

IRCHD

Diabétes Sepsis Témoins0

500

1 000

MPO : Les limites préanalytiques :Influence de l’héparine

1200

1600

MPO (pmol/L)

X 5

0

400

800

Av Hép 15 minAp Hép

Scheffer PG et al.,Clinical Biochemistry, 2009; on line

Les antioxydants

EOA(ROS)

Enzymatiques:SOD, Catalase, GPx

…Antioxydants …Non enzymatiques

Antioxydants

Produits deperoxydation

lipidique

Produitsd’oxydationdu glucose

Produitsd’oxydation

des protéines

Produitsd’oxydationde l’ADN

Systèmes de protection

H2O2O2°-

Productiond'anion superoxyde

H2OSOD GPx

CatalaseChélateur

OH°ONOO-ClO-

Stress Oxydant

Chélateurdes métaux

Vitamines E/C

CaroténoïdesGSHMannitol...

Polyphénols

Les systèmes antioxydants : une interprétationdifficile

• Variables en fonction de l’organe :• parfois de la localisation de l’organe

• Variables en fonction de la nature des antioxydants :• Enzymatiques : possibilité d’adaptation (induction)• Non enzymatiques : dépend uniquement des apports nutritionnels• Non enzymatiques : dépend uniquement des apports nutritionnels

• Variables en fonction de la durée de l’agression :• Consommation• Induction

• Variable en fonction de l’état antérieur :• l’âge :• l’état nutritionnel

Le système enzymatique : un déficit relatif

Production de ROSDéfenses antioxydantes

Yang et al., J. Physiol., 2007

Le déficit relatif antioxydant :Influence des conditions initiales

Femmes

Hommes

600

800

Plasma Gpx (U/L)

1,10

1,12

1,14

1,16

1,18

Pro

du

cti

on

O2°-

(cp

s/le

uc

o) P<0.05

Artur et al.,Free Radicals and Aging. 1992.

Ans

400

600

******

10 30 50 70 90

1,00

1,02

1,04

1,06

1,08

1,10

60-77 77-83 83-92

Age (ans)

Pro

du

cti

on

O2

E. Ventura,Free Radic Biol Med, 2009

Du stress Oxydant à la défaillance multiorgane

II) Le stress Oxydant est une composante du sepsis :

- Les systèmes de production d’oxydant sont suractivés :

dysfonctionnement mitochondrial, NOS, NADPH Oxydase

I) Le stress oxydant :

- Rôle de sensor, informatif d’amplification du signal inflammatoire,effecteur de la toxicité.

dysfonctionnement mitochondrial, NOS, NADPH Oxydase

- Les systèmes antioxydants sont dépassés :

le déficit relatif peut-être amplifié par l’état antérieur

- Les marqueurs d’atteinte oxydative sont tous élevés

III) Le stress Oxydant est –il impliqué dans la défaillancemultiorgane ? L’exemple de la dysfonction myocardique septique

Dysfonction myocardique septique

- Dysfonction systolique du Vg

- Dysfonction diastolique du Vg- Dysfonction diastolique du Vg

- Dysfonction systolique du Vd

Dysfonction biventriculaire précoce et réversible (7j)

Mécanismes potentiels de l’altérationMécanismes potentiels de l’altérationde la fonction myocardique au cours du sepsisde la fonction myocardique au cours du sepsis

SO

Flierl MA et al. Mol Med. 2008

SO

* p< 0,05 vs CTRL

Activation de la NADPH Oxydase dans un modèleanimal (rat) de choc endotoxinique

LPS IV( 10mg/kg)mesure TBARS plasmatiques et anion superoxyde tissualire

0,30

0,401

Cœur O2°-(mv/mg VG) Aorte O2°

- (mv/mg Ao)

**

*

* **1,0

TBARS pl (nM/mL)

**

*

Klouche K, ESICM 2006

0,00

0,10

0,20

0,30

0,2

0,6

*

0,2

0,6

CTRL LPS90

LPS180

LPS360

*

CTRL LPS90

LPS180

LPS360

CTRL LPS90

LPS180

LPS360

Dysfonction myocardique septique

Modèle animal (rat) de CS par LPC

Barth E et al. CCM 2006; 34:545

Modèle animal (rat) de CS par LPCCLP, iNOS-/-, inhib iNOS

déficit génétique iNOS ou blocage pharm.amélioration FS Vg, réponse

aminespas d’effet sur la fonction

diastolique

MYOCARDIOPATHIE SEPTIQUERôle du stress oxydant?

CYTOKINES

+ +

Mol d’adhésion

Facteurs transcriptionnels

TOXICITE

NO

+ +

stress oxydant

Exploration biologique de la myocardiopathis septique :Est-elle modifiée par la connaissance de la physiopathologie ?

-Repose sur les marqueurs de lésion :

Les troponinesamélioration des sensibilités fonctionnelles ?

Nouveaux marqueurs de lésionvalidation dans la dysfonction cardiaque ?

- Repose sur les marqueurs de fonction :Les peptides natriurétiques

- Place pour des marqueurs de production de radicaux libres ?

Dysfonction myocardique septiquePeptides natriurétiques

Roch A., , Critical care, 2007. Charpentier J. et al., Crit Care Med, 2004

La myéloperoxydase : un facteur prédictif de lacardiomyopathie septique ?

Brennan et al.,

N Engl J Med Octobre 2003

DCD81+28

DCD56+23

Dominguez -Rodriguez etal.,

A. J Cardiol 2008

La myéloperoxydase : un facteur prédictif de lacardiomyopathie septique ?

?

Brennan et al.,

N Engl J Med Octobre 2003

Du stress Oxydant à la défaillance multiorgane

II) Le stress Oxydant est une composante du sepsis :

I) Le stress oxydant : du sensor à la toxicité

III) Le stress Oxydant est impliqué dans la dysfonctionmyocardique septique

IV) Perspectives : Peut-on moduler le stress oxydant au cours dusepsis ?sepsis ?

Les marqueurs du stress oxydant dans le sepsis et le SIRS

Berger MM et al., Crit Care Med, 2007

Le preconditionning corrige le déficit relatif enantioxydant

Yang et al., J. Physiol., 2007

-Chronic Hypoic preconditionning

-LPS

-Kidney injury

L’hypothermie module les systèmes producteurs(rat +LPS)

Scumpia et al., Chest, 2004.

La modulation du stress oxydant là où on nel’attend pas

- Le pouvoir antioxydant des statine ?

- Le Ngal ?- Le Ngal ?

Un pouvoir antioxydant pour les statines ?

Modèle murin de CS (LPC)

**

*

simvastatine (SVT)

60

100

Merx MW et al. Circulation 2005; 112:117

PMA PMA+SVT ctle

p21 rac 2

actine

p67 phox

CTRL ICU SEPSIS

20

Durant R. et al., Shock 2004;22:34

NGAL : un effet antioxydant ?

Schmidt-Ott et al, JASN, 2007

Activation de voies métaboliquesdépendantes du fer :Prolifération/différentiation tubulaireHeme oxygenase 1« Cytoprotection »

CHO-NGAL : cellules transfectéesavec NGAL

Dysfonction myocardique septique

- Facteurs dépresseursmyocardiques circulants :

TNFaTNFa

IL6, IL1, C5a ….

- NO :Originaire des iNOSEffet inotrope négatif :

(via cGMP)Effet toxique direct :

(via le ONOO-)-Origine du NO

SystémiqueIn situ (réaction avec l’O2°

-)Parillo E et al. J Clin Invest 1985; 76:1539

La myéloperoxydase : un facteur prédictif de lacardiomyopathie septique ?

1 000

1 500

MPO (pmol/L)

Brennan et al.,

N Engl J Med Octobre 2003

IC(BNP> 100)

IRCHD

Diabétes SepsisTémoins0

500

Dysfonction myocardique septiqueMarqueurs cardiaques

BNPANP

CRP

cTnI

Day 1 ICU Day 2 ICU

Yucel T.. et al., Exp Clin Cardiol, 2008

Apache

Production de radicaux libres :Production de radicaux libres :IsoformesIsoformes NADPH oxydaseNADPH oxydase

(Ray et Shah 2005) Bedard, K. et al., 2007

Stress Oxydant : Evolution du concept

BactéricidieProlifération(CMLV)

Sensor

Hypoxie Glucose Cisaillement

Cytotoxicité / Nécrose(foyer inflammatoire)

Proapoptotique(CMLV)Facteur de transcription

(NFkB, AP-1, PPARs …)

Transdifférenciation(CMLV, EC, Mph)

361 pts admispour inf. dont 82 st.

5353 pts bactériémiques

11362 pts suivis sur 3 ans50% statinesmortalité liée à l’infection

Intérêt potentiel des statines dans le sepsisEtudes Cliniques Rétrospectives

Thomsen RW et al CCM 2006;34:1080

Réduction risque: 16%

Almog Y et al CCM 2007;35:372Almog Y et al Circ 2004;110:880

438 pts MV>96h, 38 st.50% statines

Marqueur de sévérité?Fernandez R et al ICM 2006;32:2743

Mécanismes potentiels de sécrétion de cTn et BNPdans le sepsis

Dysfonction myocardique septiqueévaluation biologique

lésions myocardiques élev. Troponines (structurel)

tension Vg élev. BNP (fonctionnel)SEPSIS

Recommandations

1. Élévation cTn: dysfonction myocardique et mauvais pronosticsélection de pts à risque: échocard., monitoring card

2. Élévation BNP ? Dilatation VG et baisse FE ?

Le système enzymatique : les difficultés de lacinétique !

Cu/Zn SOD : rein de rat Mn SOD : rein de rat

Leach M., B Pharmacol J., 1998

Dysfonction myocardique septiquemécanismes

Modèle animal (rat) :

ctl

Chagnon F et al. CCM 2006; 34:127

Modèle animal (rat) :Choc Sep. (LPS IP)

Troubles de la microperfusionmyocardique

Œdème et hyperperméabilté

Perfusion de la paroi du segm. ant du myocarde (C11-acétate)

sepsis

VG O2°- (mv/mg VG)

0,6

0,8

1,0

TBARS plasmatiques (nM/mL))

§

0,2

0,3 * *

§

Modulation négative de la NADPH oxydase

Modèle animal (rat) de choc endotoxinique (LPS iv) prétraité 15 min avant LPS

0,0

0,2

0,4

0,6

0

0,1

0,2

* p< 0,05 drogue vs choc septique 6h; § p< 0,05 choc septique vs contrôle

Les marqueurs du stress oxydant dans le sepsis et le SIRS

Berger MM et al., Crit Care Med, 2007

La myéloperoxydase : un facteur de mauvaispronostic en cas de choc cardiogénique

Dominguez -Rodriguez A. J Cardiol 2008

DCD81+28

DCD56+23

Production de radicaux libres :Production de radicaux libres :Un coproduit du métabolisme énergétiqueUn coproduit du métabolisme énergétique

O2°-

Antioxydants Prooxydants

2 O2 2 O2°-

PKC

Modèle d'activation de la NADPH oxydase :

Phosphorylation et géranylgéranylation

gp 91

p22

rap 1A

NADPH

NADP+

+ H +

p67

p47

p40

PP

P

P

P

PP

PKCp38

MAPK

(Lynch 2000; Viedt 2000; Ward 2000)

rap 1A

rac 2

GDP

p67

p47

p40

PPP

PP

P

rac 2

GDP

Acetyl CoA

Isoprenyls

Cholesterol

GTP

rac 2

2 O2 2 O2°-

gp 91p22

rap 1A

Statins prevent Geranylgeranylation ofStatins prevent Geranylgeranylation ofracrac--2 and NADPH Oxidase activation2 and NADPH Oxidase activation

x

x

p67

p47

p40

PP

P

P

P

PP

rac 2

GTPGDP

NADPH

NADP+ + H +

rap 1A

rac 2

Acetyl CoA

Isoprenyls

Cholesterol

P

Statins

x

x

GTP

rac 2x