Laboratoire de Physiologie vegetale, Universite de Nice, 06034 Nice Cedex France

Cytokinines libres et liees dans les axes embryonnaires et les cotyledons des embryons dormants et non dormants de pommier

Bound and Free Cytokinin Levels in Dormant and After-Ripened Embryos of Pyrus malus 1. cv. Golden delicious

PH. BARTHE

Avec 5 figures

Re~u Ie 30 avril 1979 . Accepte Ie 5 juin 1979

Summary

The endogenous levels of free and bound cytokinins were studied in dormant and after­ripened embryos of Pyrus malus L. cv. Golden delicious. The postmaturation treatment was a three months stratification at 4 cC in the seeds. Qualitative and quantitative studies were made using paper mromatography, sephadex gel mromatography and tobacco callus bioassay.

In the embryonic axes from dormant or after-ripened embryos the cytokinins levels were found very similar: relatively important for the free forms, negligeable for the bound ones.

In the cotyledons of dormant embryos the bound forms were found in very high amounts, whereas the free forms existed in negligeable quantities. The postmaturation treatment induced a spectacular decrease of the bound forms with an important increase of the free forms, the latter being found in lesser quantities than could be deduced from the losses of the bound forms.

Our results showed that complex qualitative changes were also induced under the influence of the post maturation treatment.

Key words: free and bound cytokinins, dormant and after-ripened embryos, cytokinin levels, Pyrus malus.

Introduction

II est thabli depuis longtemps que la graine de pommier contient un embryon dormant qui necessite pour germer une longue periode de stratification froide (HAR­

RINGTON et HITE, 1923). Differents auteurs ont etudie les changements qu'entraine ce traitement de post­

maturation au niveau des hormones en do genes. Citons pour l'acide a:bscissique les

Abreviations: B.H.T. = 2,6-diter-butyl-4-methylphenol; Z = Zeatine; ZA = Riboside de la zeatine; 2iP = N 6(2-isopentenyl) adenine; 2iPA = N 6(2-isopentenyl) adenosine.

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travaux de RUDNICKI (1969 et 1973) ceux de BARTHE et BULARD (1978); pour les gibberellines ceux de SINSKA et al. (1973), SINSKA et LEWAK (1970), ISAIA et BULARD (1978); enfin pour les cytokinines ceux de LETHAM et WILLIAMS (1969), BORKOWSKA et RUDNICKI (1975), KOPECKY et al. (1975), RUDNICKI et BORKOWSKA (1973).

L'analyse des travaux consacres aux cytokinines etablissant une comparaison entre des graines dormantes et des graines ayant subi un traitement complet de postmatura­tion permet retenir les deux points essentiels suivants:

l'activite cytokinique due aux formes libres parah hre toujours beau coup plus eievee chez les graines dont la dormance a ete eliminee (BORKOWSKA et RUDNICKI, 1975; KOPECKI et aI., 1975). Les cytokinines liees, responsables de la majeure partie de l'activite mise en evi­dence chez les graines dormantes ne seraient plus decelables chez les graines ayant subi un traitement complet de post maturation (BORKOWSKA et RUDNICKI, 1975).

Ces resulrats meritant d'~tre approfondis, il nous a paru interessant de consacrer une nouvelle etude a ce m~me materiel. Nos methodes sont differentes de celles de nos predecesseurs. Nous n'avons pas en effet recherche l'activite cytokinique globale comme Ie faisaient ces auteurs aussi bien pour les cytokinines libres et liees, mais au contraire estime et rapporte la valeur de chaque zone d'activite biologique en essayant, dans quelques cas particuliers, de preciser la nature des cytokinines ainsi mises en evidence.

Par ailleurs nous n'avons pas utilise pour les extractions la graine entiere mais l'embryon isole chez lequel no us avons etudie les modifications induites par Ie traite­ment de postmaturation au niveau des cotyledons d'une part et de l'axe embryon­naire d'autre part. Ceci permet d'envisager l'eventualite de migrations se produisant au sein de l'embryon au cours du traitement de postmaturation.

Nous considerons ici comme cytokinines libres les substances actives qui sont directement solubles dans Ie n-butanol, Ie terme de cytokinines liees etant reserve aux formes conjuguees insolubles dans Ie n-butanol mais qui Ie deviennent apres une hydrolyse alcaline ou acide (DAVIES, 1976; YOSHIDA et ORITANI, 1972).

Materiel et Methodes

I. Materiel vegetal

Les experiences sont realisees a partir de graines de pommier Pyrus malus cv. Golden delicious, isolees des fruits a leur maturite des la recolte, c' est a dire fin septembre.

Les graines sont n!parties en deux lots. Celles ne necessitant pas de stratification sont immediatement utilisees afin d'eviter tout phenomene de dessiccation. Le second lot est aussit8t mis a stratifier dans la vermiculite hum ide a 4 ac.

La levee de dormance des embryons est contr8lee par des cultures sur papier filtre imbibe d'eau. Apres trois mois de stratification dans les graines les embryons sont isoles et imme­diatement soumis a l'extraction. Ainsi les graines de pommier ne sont jamais dessechees ou conservees sechees, ceci afin d'ecarter tout risque de modification du metabolisme au sein de la graine. Durant les operations pn!cedant l'extraction Ie materiel vegetal est maintenu a 4 ac.

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Chaque experience est realisee a partir de lots de 1600 embryons. Les travaux ont porte sur les recoltes des annees 1974, 1975, 1976.

Les embryons sont separes en deux parties, axes embryonnaire et cotyledons, qui sont chacune traitee selon Ie m&me protocole experimental.

II. Extraction

Le tissu vegetal est homogeneise a froid (4°C) dans un broyeur Sorvall (10 mn) en presence de methanol a 80 % et de B.H.T. comme anti-oxydant. Le volume final de methanol a 80 Ofo utilise est pour un lot de 1600 embryons de 800 ml pour les axes embryonnaires et de 1600 ml pour les cotyledons.

Apres centrifugation les surnageants sont concentres sous pression reduite a 35°C au 1/5 de leur volume, de fa~on a eliminer complhement Ie methanol.

La phase aqueuse restante, ajustee a pH 8, est mise en presence d'un m&me volume de n-butanol satun: d'eau pendant 5 mn, cette operation etant repetee 4 fois. Au cours de cette extraction la majeure partie des cytokinines libres (bases et ribosides) migrent dans la phase organique. Cette phase aqueuse restante est alors ajustee a pH 11 et maintenue a 60°C durant 30 minutes afin de realiser une hydrolyse alcaline des cytokinines dites liees; apres reajustement a pH 8, les cytokinines sont extraites par 4 volumes de n-butanol. Les phases butanoliques sont ensuite concentrees a sec et Ie residu repris dans un minimum d'ethanol a 80 Ofo.

Ill. Techniques de separation

1 - Chromatographie

Les extraits sont generalement purifies par deux chromatographies succeSSlves sur papier Whatman 3 M et nO 1 a 19°C. Les solvants retenus ctant: a - butanol secondaire sature d'eau b - n-butanol ammoniaque (25 Ofo) 4-1 c - acetate d'ethyle - acide formique - eau 60-5-35

A l'issue de la chromatographie avec Ie solvant (a) il est possible de recuperer l'ensemble des cytokinines a un Rf eleve; la zone comprise entre Ie Rf 0,60 et 0,95 est eIuee par de I\~thanol a 80 0/0. L'eluat con centre est remromatographie soit avec Ie solvant (b), soit avec Ie solvant (c). Cette seconde chromatographie assure la separation des cytokinines en deux groupes: - La zeatine et son riboside d'une part - La 2iP et son riboside d'autre part.

2 - Filtration sur gel de Sephadex La technique retenue est celIe dec rite par ARMSTRONG (1969). Le remplissage des colonnes

etant realise selon Ie procede de McMILLAN et WELS (1973). Les colonnes (2,4 cm X 20 cm) sont remplies de Sephadex LH 20 (25 g) et eluees par de

l'ethanol a 35 Ofo a raison de 25 mllh. Des fractions de 5 ml sont recueiIlies.

IV. Test biologique

L'activite cytokinique des extraits est rechermee a I'aide du test utilisant la moelle de tabac (LINSMAIER et SKOOG, 1965).

A l'issue de la deuxieme chromatographie sur papier, les chromatogrammes sont decoupes en 10 ban des egales chacune etant reparties en 6 tubes. Un fragment de 150 mg environ de cal de tabac est repique dans macun des tubes contenant 16 ml de milieu gelose.

Lorsque Ie Sephadex LH 20 est utilise comme derniere etape de purification, chaque fraction recueiIlie (5 ml) est evaporee a sec sous azote. Le residu dissous dans 10 ml d'eau est reparti comme precedemment dans 6 tubes.

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Les poids frais et les poids sees des cals obtenus SOnt determines apres un mois de culture. Un calcul statistique applique it macun des resultats obtenus a partir des poids frais permet de determiner ceux qui sont significativement differents du temoin au seuil de probabilite de 1 Ofo et de 5 Ofo. Les histogrammes des figures 1 a 5 representent la valeur moyenne des poids frais des cals obtenus apres 1 mois de culture.

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- Axes embryonnaires avant (A) et apres hydrolyse (B)

- Cotyledons avant (C) et apres hydrolyse (D) La zone foncee represente l'activite statistiquement differente du temoin au niveau de 1 Ofo. T = Temoin.

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Resultats

I. Embryons dormants

1 - Axes embryonnaires

- Forme fibre: Les histogrammes correspondant aux extraits purifies par deux chromatographies successives sur papier montrent qu'une activite est presente au Rf de la zeatine (Fig. 1, 2). Ce resultat est confirme avec I'extrait purifie sur LH 20 (Fig. 3).

- Forme liee: L'extrait hydrolyse ne presente aucune activite significative que ce soit apres chromatographie sur papier (Fig. 1,2) ou apres passage sur LH 20 (Fig. 3).

2 - Cotyledons

- Forme libre: Vne faible activite seulement significative au seuil de 5 % est decelable sur I'histogramme au niveau de la zeatine (Fig. 1). On la retrouve un peu plus importante apres passage sur LH 20 (seuil de 1 Ofo, Fig. 3).

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Fig. 2: Activite cytokinique correspondant a un extrait d'embryons dorm ants (recolte 1976) purifie par 2 chromatographies successives sur papier (solvant a, puis solvant b). - Axes embryonnaires avant (A) et aprcs hydrolyse (B) - Cotyledons avant (C) et apres hydrolyse (D) La zone foncee represente l'activite statistiquement diffcrente du temoin au niveau de 1 0/0. T = Temoin.

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Fig. 3: Distribution de l'activite cytokinique apres passage sur LH 20 d'un extrait correspon­dant a des embryons dorm ants (nkolte 1976). Cet extra it ayant auparavant subi une chroma­tographie sur papier (solvant a).

- Axes embryonnaires avant (A) et apres hydrolyse (B)

- Cotyledons avant (C) et apres hydrolyse (D)

La zone foncee represente l'activite statistiquement differente du tcmoin au niveau de 1 0/0. T = Temoin.

- Forme life: Contrairement aux axes embryonnaires, la fraction obtenue apres hydrolyse des extra its cotyledonaires se revele tres active apres la deuxieme duoma­tographie sur papier. Les composes actifs migrent au niveau de la zeatine, de la 2iP et de leurs ribosides (Fig. 1, 2). La mobilite de ces composes sur LH 20 est encore sembI able a celIe de la zeatine, de la 2iP et de la 2iP A (Fig. 3).

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II. Embryons ayant subi trois mois de stratification

1 - Axes embryonnaires

- Forme libre: Que ce soit apres chromatographie sur papier (Fig. 4) ou apres LH 20 (Fig. 5) on observe trois zones actives correspondant a la zeatine, a son riboside et a la 2iP.

- Forme liee: Une faible activite est decelee sur l'histogramme de la figure 4 au niveau de la 2iP et de la 2iPA. Elle n'a pas etC retrouvee apres passage sur LH 20 (Fig. 5).

2 - Cotyledons

- Forme libre: L'activite principale observee, que ce soit apres chromatographie sur papier (Fig. 4) ou apres LH 20 (Fig. 5), semble devoir etre attribuee a la zeatine

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T = Temoin.

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Fig. 5: Distribution de l'activite cytokinique apres passage sur LH 20 d'un extrait correspon­dant a des embryons non dormants (recolte 1974). Cet extrait ayant auparavant subi une chromatographie sur papier (solvant a). - Axes embryonnaires avant (A) et apres hydrolyse (B) - Cotyledons avant (C) et apres hydrolyse (D) La zone fonree represente l'activitc statistiquement differente du temoin au niveau de 1 0/0. T = Temoin.

et a son riboside. On trouve en outre apres LH 20 un compose, non identifie ici, s'eluant plus tardivement que la 2iP (Fig. 5).

- Forme liee: La fraction obtenue apres hydrolyse des extraits cotyIedonaires ne manifeste qu'une faible activite au niveau de la zeatine et de son riboside (Fig. 4, 5). Apres LH 20, on note en outre la presence d'un pic de faible activite (P = 5010) au niveau de la 2iP.

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Discussion

Au niveau des axes embryonnaires Ie traitement de postmaturation ne semble pas modifier de fa<,:on notable la teneur en cytokinines libres, bien qu'il provoque des changements qualitatifs: la zeatine est seule presente dans les embryons dormants alors qu'elle est associee a son riboside et a la 2iP dans les embryons stratifies. Quant aux formes liees elles n'apparaissent qu'en quantites negligeables que les embryons soient ou non dormants.

Au niveau des cotyledons les formes libres, en quantite tres faible dans les em­bryons dormants, augmentent nettement sous l'influence de la stratification, at­teignant des teneurs comparables a celles signalees dans les axes. Elles semblent devoir ~tre rapportees seulement a la zeatine et a son riboside. Le poids frais des axes embryonnaires representant environ 1/50 de celui des cotyledons, il est evident que la teneur en cytokinines libres par unite de poids frais est beaucoup plus elevee dans les axes que dans les cotyledons des embryons stratifies.

Les cytokinines liees presentes en quantite tres elevee dans les embryons dorma~ts ne se rencontrent plus qu'en faibles concentrations dans les embryons stratifies. Leur nature ne semble d'ailleurs pas homologue dans les deux cas. Dans Ie premier elles liberent apres hydrolyse la zeatine et la 2iP (et eventuellement leurs ribosides) alors que dans Ie deuxieme seule la zeatine (et eventuellement son riboside) est mise en evidence.

La comparaison de ces resultats avec ceux des auteurs anterieurs, BORKOWSKA et RUDNICKI (1975), KOPECKY et al. (1975) permet de souligner certaines similitudes:

a) - Nous avons comme eux rencontre des teneurs elevees en formes liees chez les embryons dormants et observe une diminution spectaculaire de ces m~mes formes chez les embryons en fin de stratification. Notre travail a permis de preciser que ces formes liees, generalement plus stables que les formes libres correspondantes, comme cela a ete demontre po~r certains derives glucosyles PARKER et LETHAM (1973), LETHAM et al. (1977), LALOUE et al. (1975), LALOUE et al. (1977), HORGAN (1975), etaient localisees aux seuls cotyledons. L'importance des cotyledons en tant qu'organe de stockage des cytokinines chez l'embryon de pommier est ainsi demontree.

II sera it interessant, a la suite des travaux de LETHAM et WILLIAMS (1969) et de PARKER et LETHAM (1973) de determiner si c'est au niveau cotyledonaire que se produit en fin de maturation la transformation des cytokinines libres en cytokinines liees.

b) - Nous avons egalement trouve comme eux qu'une stratification de trois mois a 4 °C induisait chez l'embryon entier une augmentation de la teneur en cytokinines libres. Nous avons montre que celle-ci intervenait essentiellement au niveau cotyle­donaire. Cette augmentation en cytokinines lib res s'explique-t-elle uniquement par l'hydrolyse de la forme liee ou doit-on faire intervenir egalement une biosynthese comme Ie suggeraient BORKOWSKA et RUDNICKI (1975) et VAN STADEN et al. (1972). Si celle-ci se produit reellement en cours de stratification, ce que nous n'avons pu verifier, elle doit s'accompagner d'un catabolisme tres actif pour justifier la diminu-

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tion de la teneur totale en cytokinines mise en evidence apres 3 mois de stratification. Connaissant la repartition des cytokinines libres et liees dans les differentes parties

de l'embryon et les modifications qu'entralne un traitement de postmaturation est-il possible de preciser si ces hormones sont ou non impliquees dans Ie mecanisme de levee de dormance? La teneur en cytokinines libres ctant sensiblement la m~me au niveau des axes, avant et apres stratification, ce n'est apparemment pas un manque de disponibilite en ces hormones qui constitue l'obstacle a la germination. Doit-on alors Ie rechercher dans les differences qualitatives et quantitatives mises en evidence au niveau cotyledonaire? II parait difficile de repondre a cette question tant que nous ne connaissons pas les modalites d'hydrolyse des cytokinines liees lors de l'im­bibition des embryons dormants places aux temperatures de germination.

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