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D-Biotine 3-Suflo-N-Hydroxysuccimide grade GMP:
Nouvel outil de choix pour le marquage des cellules sanguines humaines
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Déclaration de Conflit d’Intérêt
Employment No conflict of interest to disclose
Research support No conflict of interest to disclose
Scientific advisory board No conflict of interest to disclose
Consultancy No conflict of interest to disclose
Speakers bureau No conflict of interest to disclose
Major stockholder No conflict of interest to disclose
Patents No conflict of interest to disclose
Honoraria No conflict of interest to disclose
Travel support No conflict of interest to disclose
Other ChemConnection/Ardena Group, BV, Oss, The
Netherlands
McSAF, Tours, France
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Marquage des cellules sanguines humaines et suivi in vivo: état de l’art
Avantages
Depuis 1950, l’étude de la survie des cellules sanguines a été évaluée en utilisant des marqueurs radioactifs
Inconvénients
Coût élevé
2 isotopes (51Cr & 111In)
Gestion de la radioprotection
Non adapté à des protocoles > 1 mois
Non conseillé dans les populations
vulnérables
« Gold standard »
Disponibles en grade GMP
Acceptés et largement utilisés
Protocoles de marquage standardisés
Bonne reproductibilité entre centres
évaluateurs
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Sulfo-NHS leaving groupLater removed by washings
BiotinylatedBiotin Sulfo-NHS
Marquage des cellules sanguines humaines et suivi in vivo: état de l’art
Depuis 1990, un nouveau marqueur non radioactif est apparu: la Biotine Sulfo-NHS
Cytométrieen flux
Streptavidine/ FITC
Chez l’homme
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Caractéristiques méthodologiques Biotine 51Cr
Radioprotection (autorisations ASN, zone contrôlée, gestion des déchets radioactifs) NON OUI
Utilisable dans les populations vulnérables (nouveau- né, femme enceinte, personne âgée) OUI NON
Analyse simultanée de plusieurs populations de cellules OUI NON
Correction du comptage (décroissance radioactive) NON OUI
Durée de recirculation des cellules sanguines in vivo >120 jours 30 jours
Développement d’anticorps (Biotine > 20µg/mL) OUI NON
D.M MOCK et al./ Transfusion Medicine Reviews (2014) R.L. SCHMIDT et al./ Transfusion (2017)D.M. MOCK et al./ Transfusion (2018)
Comparaisons méthodologiques des marquages Biotine vs 51Cr
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Enjeu: obtention d’une Biotine en grade GMP
A ce jour……
Biotine Sulfo-NHS injectable non disponible
Les autorités de santé n’autorisent pas l’utilisation de BiotineSulfo-NHS grade (RUO) actuellement disponible pour lesprotocoles de recherche cliniques transfusionnelles
Désintérêt des grands groupes pharmaceutiques de proposerce marqueur en grade GMP: marché de niche, échelle deproduction en grammes et non en kilos voir en tonnes
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Synthèse de Biotine Sulfo-NHS grade GMP
ChemConnection: small chemical company using apilot facility which complies to all Western QA, GMPstandards to produce small batches of ActivePharmaceutical Ingredient (API).
Originated from a former MERCK lab
Operational since 2000
4 reactor suites, class D air quality
Specialty lab
2 dry powder handling rooms
Process R&D lab
QC lab
HVAC system
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(D+)-BiotinGMP grade (1 eq)
N-Hydroxysulfo-Succinimide
GMP grade (1 eq)
AnhydrousN,N DMF
24h00 underargon gas
DCC
Filtration and washing of urea
salts WhiteCrystals
Grade GMP D+ (enantiomère naturel: Vitamine B8) Très haute pureté (>98%) Soluble en phase aqueuse Sous forme de cristaux de sodium Peu sensible à l’humidité contrairement à la biotine
commerciale (RUO) uniquement disponible sous formelyophilisée
Synthèse de Biotine Sulfo-NHS grade GMP
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Contrôle Qualité selon les recommandations GMP
Method Test Method Criterion ResultsAppearance Visual inspection White to white powder White powder
Identity 1H-NMRIn agreement with
structure
In agreement with
structure
Assay 1H-NMR ≥95 % (m/m) 98 % (m/m)
Purity by UPLC CC-AM-2016.490 v01 Report result % (a/a) 97.7 % (a/a)
Impurities by UPLC CC-AM-2016.490 v01 ≤5% 2.3 % (a/a)
Biotin 1H-NMR 0.9 % (m/m)
Residual solvent
Diethyl ether by GC-HS CC-AM-2014.034 v03 ≤5000 ppm (m/m) <100 ppm (m/m)
Ethyl acetate by GC-HS CC-AM-2014.034 v03 ≤5000 ppm (m/m) <100 ppm (m/m)
Acetone by GC-HS CC-AM-2014.034 v03 ≤5000 ppm (m/m) 336 ppm (m/m)
DMF 1H-NMR ≤880 ppm (m/m) 320 ppm (m/m)
Content of drug substance 1H-NMR N/A 98 % (m/m)
Content of active entity 1H-NMR N/A 93.1 % (m/m)
Bioburden* EP 2.6.12 ≤100 CFU/g <1 CFU/159.5mg
Endotoxin* EP 2.6.14 ≤0.25 EU/mg <0.06 EU/mg
* Data generated by bactimm, BV, The netherlands
Solvant Classe 1: non
Solvant Classe 3
Solvant Classe 2
Classification des solvants selon les recommandations ICH Q3C (R5), impuretés: recommandations pour les solvants résiduels
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Biotinylation de cellules sanguines (Globules Rouges ou Plaquettes)
2- Etapes de lavages (tampons stériles)
Biotinylation reagent concentrations
Low Medium High
1- Sang citraté
3- GR ou plaquettes
7- Mesure de la biotinylation par
Cytometrie en Flux
4- Addition de BiotineSulfo-NHS grade GMP
6- Etapes de lavages (élimination de la
biotine libre)
8- Suivi simultané de plusieurspopulations cellulaires marquées
avec des différentes [Biotine]
Low Medium High5- Marquage
avec différentesconcentrations
MediumLow
High2018
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Comparaison de marquage des Globules Rouges avec différentes biotines
SSC
Biotine GMP Biotine Non GMP
SSC
Biot 0 4 18 70100
101
102
Strep PE
103
Strep PE
Biot 0 4 18 70
Strep PE
100 101 102 103 100 101 102 103
100
101
102
103
100 101 102 103
Co
un
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600
900
Biot 04
18
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Comparaison de marquage des Plaquettes avec différentes biotines
Biotine GMP Biotine Non GMP
SSC
Biot 0 2 20 80
SSC
100
101
102
Strep PE100 101 102 103
Biot 0 2 20 80
103
Strep PE100 101 102 103
100
101
102
103
Strep PE100 101 102 103
Co
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L’utilisation de Biotine GMP dans un protocole de marquage doit respecter les règles de stérilité
Contrôle par CMF
Respect des règles transfusionnelles
Tampons de lavages (grade injectable)
Incubation de la Biotine Sulfo-NHS grade GMP (milieu stérile)
Environnement
Tampons de lavages (grade injectable)
Aliquotage stérile pour le CQ
Etapes de lavage cellulaire
Dilution de la Biotine Sulfo-NHS grade GMP (milieu et solution stérile)
Biotinylation
Arrêt de la biotinylation
Prélèvement d’échantillon sanguin
Connections stériles
Préparation des solutions de marquage
Cellules marquées injectables
1) Culture Bactérienne2) Test de pyrogénicité
Glove-Box ISO 5
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ConclusionsBiotine Sulfo-NHS de grade GMP: un nouveau marqueur offrant de nombreux avantages
Marqueur non-radioactif
Sans danger et utilisable y compris dans les populations vulnérables (femme
enceinte, nouveau-né, personne âgée)
Devrait faciliter l’acceptation des autorités de santé pour l’utilisation dans les
études de recherche clinique (première étude FDA approuved en cours)
Faible coût
Utilisation d’un seul instrument (Cytomètre en Flux)
Analyse simultanée de plusieurs populations cellulaires
Large champ d’application: Evaluation de nouveaux PSL Médecine transfusionnelle Hématologie et Onco-hématologie
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![u u ] î ì î ì r î ì î í h>/^ r } o o ] v h>/^ (» GºK D» HK ELekladata.com/BKWUFIPhgE3EoFhpkH2Go1oYyhE/Grammaire... · 2020. 7. 27. · ' u u ] î ì î ì r î ì î](https://img.pdfslide.fr/doc/110x75/60df0c3c6e5fbd55c7045e4f/-u-u-r-h-r-o-o-v-h-gk-d-hk-2020.jpg)
![ï ì r:h> r î ì î ì ì ñ r 'K r î ì î ì U · W P ] v í í M /'K W ' r&Z r ì í ó rs ï EKd/&/ /ME WKZ s/^K } v ( } u ] } v o _ µ o } ò õ o > Ç í ð ï ó î ì í](https://img.pdfslide.fr/doc/110x75/5fb5f3f1800a81782e2cf81f/-rh-r-r-k-r-u-w-p-v-m-k-w-rz.jpg)
![î ì í õ r î ì î ì ^zE ,ZKE/ ^< d/E' d ,E/ > Z Yh/Z D Ed^ WZ …...î ì í õ r î ì î ì ^ Ç v Z } v ] Ì ^ l ] v P d Z v ] o Z µ ] u v n W r: µ À v ] o t µ o](https://img.pdfslide.fr/doc/110x75/5ebb212e8adce850a460003d/-r-ze-zke-de-d-e-z-yhz-d-ed-wz-.jpg)
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