TE;CHNIQU&;S D bXIPKuCTIOH ET DE DOSAGE;

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- 2 -

Les matières grasses végétales - essentiellement' constituées par des triglycerides simples et mixtes - sont extraites, 8. partir des tissus, par des solvants appropries.

Dans le C ~ S d'une étude sur le métabolisme d'une plante et les mécanismes de lipogenèse et de ligolyse, il est impossible de se contenter des rGsul-tats obtenus par p e d e de l'extrait total apres épuisement par un solvant. kn effet,' cet extrait, non seulement risque de ne pas contenir la totalité des glycérides des tissus traite's, mais il renferme en outre d'autres substances n'ayant que peu.ou pas de rapports avec les glyc&rides, surtout quand il s'agit d'organes chlorophylliens. Les erreurs peuvent ê%re enormes dans certains cas (jusqu'à 9Oy0 de la matière grasse engage'e). Pour cet ordre de recherches il faut utiliser des méthodes plus complexes et plus selectives qu'une extraction simple par solvant: saponifi- cation de l'extrait alcoolique;' separation et dosage des acides gras totaux, libres, ou combines à l'etat de glycérides; se'paration et dosage de l'insaponifiablesdes matibres grasses (alcools gras su- pe'rieurs; s t é r o l s ; alcools triterp6niques; vitamines liposolubles: A, D,, E;, K ; caroténoEdes; autres hydrocarbures; etc.) On complete ces dosages par ceux des stGrols, 6valués à part (complexés avec la digi-tonine); du phosphore lipidique des phosphoaminolipides, etc. Quelques indications bibliographiques concernant ces techni- ques applicables 8. de vraies recherches de physiologie ou de chimie végétale figurent ci-dessous (re'f. Il] [2J et ).

On n'envisagera ici que le cas d'organes non chlorophylliens très riches en lipides, c'est 8. dire l'estimation de la teneur globale en matières grasses des gr'aines ol6agineuses ou'des fruits oléagineux, forme pratique sous laquelle pourra se poser l e plus souvent le problème du dosage des lipides pour des g6neticiens. Dans ce cas, le dosage par pese'e de l'extrait total apres épuise- ment par un solvant est valable.

On peut utiliser divers solvants: &her, ether de pétrole, t6trachlorure de carbone , etc. On peut opérer trichloréthylène

p a r percolation à froid (cette niéthode peut presenter un .interet dans le cas d'une matiere grasse particulièrement oxydable). O n '

opere le plus gen6ralement par extraction à chaud au Soxhlet OU au Kumagawa. On emploiera ici cette m6thode sous sa forme classique, utilise'e couramment pour ce genre de travail et admise dans les normes officielles d'analyse des matières grasses (ref, f4] et b] ).

- 3 -

Cette me'thode - sûre e t précise dans l e domaine oÙ e l l e e s t ~ applicable - e s t longue, assez d i f f i c i l e B appliquer en s é r i e , e t

exige un matér ie l coateux e t dé l i ca t . I1 y a des cas (dosages sur l e s graines ou l e s f r u i t s &col tés dans l e s champs d'expérience pour l e tri des var ié tgs l e s plus interessantes , e t c . ) ou des mé- thodes de dosage prat icables en se r i e avec w e approximation suf- f i s an te peuvent rendre d ' u t i l e s services (ref. [6] e t 573 ):

Prkparation de l i echan t i l l on

Eliminer, p a r un -triage à l a main, l e s f r u i t s avar iés , l e s graines br i sees , les matiëres Btrangères. Mélanger avec soin l'e'chan- t i l l o n i n i t i a l dont on dispose, a f i n de l'homogénkiser, ?relever , p a r reductions successives, un l o t moyen de 100 fruits' sur lequel on déterminera l a valeur du r a p p o r t arain,e S i

l ' é chan t i l l on i n i t i a l e s t t r o p important, prélever de l a meme ma- n ière w? échant i l lon r6dui t (Pour l ' a r ach ide , opérer sur 500g, environ de graines d-cortiqu6es). Décortiquer. Broyer dans un broyeur approprié, de façon à obtenir , en plusieurs s tades , l a mouture l a plus f i n e possible compatible avec des conditions ne provoquant n i per te d 'hu i le , n i per& sensible d1hwnidi t6 ( l 'op&- ra t ion d o i t e t r e f a i t e sans &chauffement).

I graine t enveloppe

Dosage de 1 1 h w n i d i t 6

Aussitôt après l e broyage, placer une p r i se de 59. environ de graines broyées dans une bofte à t a r e séchee e t pesée, Nettre 8. l ' e tuve à ?00-105°pendant 3 heures, l a i s s e r r e f r o i d i r dans un dessicateur e t peser. Remettre l l & t u v e une heure. Laisser r e f ro i - d i r e t peser Bans l e s memes conditions. S i n&cessaire , recoamencer llop6rakion jusqu'à p o i d s constant.

P o i d s i n i t i a l prise-Poids pr ise séche'e x loo= p eau des ,graines Poids i n i t i a l p r i s e dee ortiqu6 e s ,,

Dosage de l ' h u i l e

AussitBt aprBs l a f i n du broyage, peser 10 g, environ d e graines broye'es, B l a balance de precision, Placer im6diatemen-b

* * a

- 4 - la prise d'essai dans la cartouche de l'appareil d'extraction (pour Qviter les variations d'h izidité ou l'oxydation de la prise d'essai)

serait un solvant carbure d'hydrogène pur: pentane ou héxane normal. Actuellement le commerce ne le fournit pas couramment. Utiliser donc de l'éther de petrole distillant entre 40 et 6 O o C et ayant un indice de brorne inférieur B 1.

b k b i icLt *canL*Jc', &z L GLEcr&ìLlL 3-Lct & c o d o & & * Les extracteurs continus sont recoimandés. Le meilleur solvant

i

La suite des opérations telle qu'elle est décrite ici s'en- tend pour un extracteur de Soxhlet de faible capacité (dimensions du ballon extracteur pour la pesée), Si l'on dispose d ' u n appareil- lage différent, les niatières grasses extraites ne peuvent ê-tre pes6es directement dans le ballon extracteur. I1 fau% les -brans- vaser pour la distillation (appareil de Kumagawa) , ou pour la pesée finale. I1 est gvident qu'on évite des risques d'erreur en évitant les transvasements,

Le ballon H devant recueillir les produitSIde l'extraction est préalablement &ch6 et pesé 8. la balance de précision, prati- quer l'extraction pendant 4 heures. bortir alors la carhouche de l'appareil et la placer dans un courant d'air afin que la majeure partie du dissolvant qui imprègne la farine de graines soit expul- sée. (Dans le cas d'huiles siccatives ou semi-siccatives qui ris- quent de s'oxyder à l'air, il vaut mieux opérer dans un courant de gaz inerte,)

Vider la cartouche. Triturer aussi finement que possible la farine dans un mortier,, aprks addition d'un peu de sable siliceux firì. Placer 8. nouveau la farine ainsi trituree dans la cartouche, puis dans le meme extracteur, en utilisant le ballon fi. Extraire pendant deux heures.

Dans des conditions identiques, triturer 8. nouveau la farine et procéder à une troisième extraction d'une durée de deux heures, le produit de l'extraction étant recueilli à part dans un ballon B pr6alablemen-t &ché et taré.

De chacun des deux ballons A et B, chasser par distillation sur bain-marie bouillant, ia majeure partie du dissolvant,

Eliminel: les dernières traces en chauffant .( A l'etuve p a r exemple) 8. une température voisine de l u O ° C et n'excedant pas 1 0 5 O C (il peut etre efficace aussi, 2 la fin de la distillation, de plonger brusquement le ballon jusqu'au col dans l'eau bouillante,

...

- 5 -

pendant quelques instants) Faciliter l'expulsion, soit en insuf- flant par instants de l'air (ou un gaz inerte), soit en soumettant le ballon au vide, Le chauffage ne doit pas etre prolongé plus de 20 minutes. Laisser refroidir dans *un dessicateur et peser. Renou- veler l'operation dans les mêmes conditions, jusqu'à ce que deux pesées successives ne diffèrent pas de plus de 10 mg,

Si la masse de l'huile contenue dans le ballon B n'est pas sup6rieure à I O mg. , on peut considerer 1' operation comme terminé'e.

Si la masse.de l'huile contenue dans le 'ballon B est superieure à 10 mg, recommencer le cycle des opérafions: nouvelles extractions pr6c6dées de nouveaux broyages, jusqu'à obtention d'une masse d huile nouvelle au plus égale à 1 O mg.

Vérifier que l'huile extraite est bien limpide.'

Déterminer la masse' de l'huile extraite en tenant compte de' la dernière pesee. La masse d'huile ,contenue dans la prise d'essai est la some des masses des huiles recueillies dans les ballons A et B.

( Lorsque le dosage de l'huile est effectué SUT un materiel trks humide, souaettre la cartouche remplie, avant de la placer dans l'extracteur, 8. un séchage par'tiél r8menm-b le taux d'humidite & 'I O@ environ),

Pour obtenir des données' sur la composi-kiion et le degr6 de puret6 d'une matihre grasse et, dans certains cas, pour l'identifier, on procède B l'e'tude de ses propriét6s physiqueset chimiques,

Les methodes physiques d'examen pour l'analyse des corps gras s'attachent surtout 8. la détermination de la densité, du point

de fusion, des points de solidification et de congélation; 8. l'indice de r6fraction; .à la solubili%& et B la température critique de 'dissolution; à la viscosité; etc...

Les me'thodes chimiques d'examen, à côté de l'étude approfondie a

des constituants de la matière grasse, comportent la détermination de certains "indicesf9, dont la valeur dépend de la nature et des proportions des différents constituants.

- 6 -

Les methodes d'examen physique ne seront pas abordees ici. Bt seules seront décrites les techniques de deterraination de trois des, principaux indices, Pour les méthodes d'étu.de des caractères phy- siques, les définitions et les techniques relatives auxi autres in- dices, se reporter au chap. III du Tome III du Traité pratique de chimie végétale de Brunel et aux publications relatives aux m6thodes' normalisges ( r e f , c47 et t5-j >. .

Détermination de l'acidité et de l'indice d'acide. (Réference: kFflOH - NF - T - 60 - 204 )

La determination de l'aciditi: des c o r p s gras renseigne sur leur degré' d'hydrolyse. Les matières grasses fraîches ne;contiennent que trhs peu d'acides gras libres. L'aciditG est une variable qui depend essentiellement des conditions de conservation et d'extraction.

Il y a deux manières d'exprimer la teneur d'une matière grasse

Ces deux caracteristiques d'une meme propriété sont mesur6es

en acides gras libres: l'acidite et l'indice d'acide,

de la meme façon. Seuls les rksultats du dosage sont exprim6s dif- féremment. Dans tous les cas, ces déterminations se font sur la ma- %ihre grasse sechge et purifiée.

Cependant, pour les produits contenant des acides gras volatils, on détermine l'acidité sur le produit tel quel, en precisant, 8. part, le degre d'hmidit6 et en rapportat l'acidit6 au produit sec, Bn présence d'acides mingraux librea ou combines, on peut @tre' conduit 8. faire des déterminations spéciales.

D6finitions. L'acidité est le pourcentage d'acides gras l i b r e s expri- mé conventionnellement, selon la nature des corps gras,

en acide oléique, palmitique ou laurique.

L'indice d'acide est le nombre de milligrammes de potasse caus- tique KOH nkcessaire pour neutraliser ltacidit6 libre de un gramme de matibe grasse séchie et purifige.

Principe. Titrer l'acidit6 de produit dissous par une solution alca- line alcoolique en presence de phénol-phtaléine,

d'oxyde d'gthyle, neutralis6 8. ll'aide d'une liqueur al- Réactifs. Pielange 8. parties &gales d'alcool e'thylique à 95O et

caline dkcinormale (quelques gouttes devront suffire). Ou, à défaut,

I

- 7 -

alcool ethylique 8. 9T0 neutralis&. bans le cas des substances à haut point de fusion, il pourra etre bon de remplacer l'alcool gthylique pdr l'alcool butylique]

- Solution alcaline alcoolique (got2sse ou soude) ii/2 (ou iV/lO dans le cas d'une faible acidit&).

-. Phenolphtaldine en solution 8. I$ dans l'alcool.

Mode opératoire. Pre'lever 10 g. environ de la matihre grasse St ti- trer, d6cantde et filtrée sur papier. Les dissou-

dre dans 100cc. du m6lange alcool-oxyde d'hthyle (ou 1OOcc alcool).

Agiter et prockder au titrage avec la solution alcaline alcoo- lique, en prLsence de ph&olphtaldïhe, à la temperature ordinaire.

La coloration rouge doit subsister quelques secondes apres l'addition des demihres gouttes de rdactifs.

3 Xxpression des rGsu1t.;Lts. L'acidite peut etre exprimde convention- nellement, selon la nature des huiles, en

acides oleique, palmitique ou laurique, d'après le tableau de cor- rgspondance suivant: Poids moleculaire de l'acide olkique: 262

I1 II I! palmitique: 256 II II 11 II laurique: 200

Soient u la masse en grambs de la prise dtessai, n le volume de liqueur alcaline neceasaire 8. la neutralisa- tion et exprim4 en cc. de liqueur norffiale;

Les diff6rentes expressions de l'acidits seront données par les formules : *(oliique) = n x 0,282-x 100

lìì

= n x 0,256 x I00 m (concerne particulièrement l'huile '(palmitique)

de palme) = El x 0,200 x 100

m (concerne particulierement les huiles A (laurique )

de coprah, de palmiste e t de laurier)

,

I

- 8 -

(Dans le. cas oÙ le resultat fait mention du terme "acidit6"sans indication du mode d'expression, il s'agit toujours, par convention, de l'acidite" exprim6e en acide algique). L ' indice d'acide est donne' avec une approximation suffisan-be par la formule:

n x 56# m

&ant donne' que le poids moleculaire de la potasse caustique e s t 5 6 , l l .

(Il se trouve que l'indice d'acide est le double du nombre exprimant l'acidite, quand celle-ci est exprim6e en acide oléique),

Précision des résultats_. La pr6cision des r6sultats est de l'ordre de O,O% avec une solutLon alcaline alcoo-

lique iT/-lO et de l'ordre de 0 , 2 0 avec une solution 1'7 ou B/2,

Piesure de l'Indice -.---- de Saponification (R6fe'rence: hFBOR - ïW - T - 60 - 2 0 6 )

L'indice de sa2onification est une constante des huiles et des graisses, mais il ne permet p a s leur identification, la plupart ayant un indice compris entre 190 et 200, I

I1 est d'autant plus &leve' que les' glycérides sont formes d'acides gras de faible poids mol&culaire. I1 de'pend de la teneur en insaponifuable, en acides gras libres et de la proportion de mono-, di- et tri-glycerides. I1 permet, lorsque la matière grasse renferme uniquement des triglycérides, de determiner la teneur p o u r cent en acides gras totaux,

De'finition et PrinciiE. L'indice de saponification e s t le nombre de milligrammes de potasse causti'que KOH

nécessaires pour transformer en savon les acides gras et les glyc6- rides d'un gramme de corps gras,

1

&éactifs, +$ Solution d acide chlorhydrique R/2

exempt d'aldéhyde, Cette solution est décan-tee apres repos et conser- ve'e dans un flacon en verre brun ou jaune convenablement bouché,

-.. Ph6nolphtaléine en solution à 1% dans l'alcool,

- Solution B/2 de potasse dans ltalcoo1 éthylique h Y 5 G

,

Diode op6ratoire. Peser au milligram", dans un erlen ou dans un

grasses (dont on a élida& l'eau et les irn&xre-ks). ballon 8. fond plat taré, deux grarmss de matières

Ajouter 25 ce, exac-bement Desure's, d e potasse alcoolique i!/2 et porter à lfébullition sous Un rifrigkrant 8. reflux. Ajouter dans l'erlen ou le ballon un regulateur dt6bullition (billes de veme, etc.) haintenir lfébu1lition,pendant une heure en agitant d e temps en temps (prolonger 1'6bullition dans le cas des corps B haut point de fusion), Titrer l'excès dcalcali dans la solution savonneuse chaude avec H C l li/2 en psGsence de phénolphtal6ine. (Faire un essai B blanc dans les mêmes conditions pour titrer la liqueur alcoolique de potasse).

Bxpression des r6sultats. Soient la masse en grames de la prise d essai,

C le nombre de ce. dC1 utilises

C2 le nombre de cc. i l C l utilises ' dans l'essai à blanc,

dans l'essai avec matières grasses.

L'indice de saponification est donne' par la formule:

(C., - C,) x 28

( 1 cc HCL N/2 -4 28 mg KOH) (On l'exprime sans dtcimales)

Precision de la methode. Ji& raison de 1Iinfluence de la duree

3 unités. d'ébullition, elle est de l'ordre de 2 B

kesure de l'Indice dLIode

L'indice d'iode exprime le degré d'insaturation du c o r p s gras.

Sa valeur a pernis de classer grossièrement les hÙiles en 3 grandes categories: - huiles siccatives (indice d'iode compris entre 150 et 190) - f f demi-siccatives( . )? 11 I t 100 ff 150) - f f i non- 91 ( '' I f f f 11 75 '' IOU)

hn principe, il suffit pour le déterainer de faire agir un halogène en solution sur une matiere grasse, elle-même en solution

b 8 .

- 10 - dans un solvant indiffe'rent.

Cependant l'iode seul réagit trop lentement et l'on eïnploie gene'ralement des combinaisons haloge'nees de l'iode (chlorure ou bromure d'iode) pour accélérer la réaction tout en évitan% les réactions de substitution.

Différentes methodes ont e'te proposges; elles diffèrent essen- tiellement par la nature de la solution halogénante, Les trois prin- cipales sont;

- La méthode de Hübl: qui utilise une solution d'iode et de chlorure lvercurique dans l'alcool.

- I' 'I It Hanus:qui utilise une solution de monobromure d'iode dans l'acide acetique.

dans l'acide acétique,

Les deux dernières &thodes donnent des r6sultats pratiquement identiques, tandis que la première donne generalement des résultats trop faibles. lin outre, le réactif de Hübl n'est pas absolument stable.

DQfinition. L'indice d'iode est le nombre de grammes d'iode, fixe'

I1 est habituellement d,esigne' par 1.1,

lvléthode de Hanus.

- 1' !I Nijs :qui utilise une solution de monochlorure d'iode

sur les doubles liaisons de I O 0 grarmes de corps gras.

(He'ference : Brunel, 'ï'raité pratique de Zhimie Vegetale, %IV! 2.262).

Principe. On fait agir une solution halog6nante sur le produit prka-

du chloroforme). On ajoute de l'iodure de potassium et on titre en retour avec une solution de thiosulfate de sodium.

lablement dissous dans du tgtrachlorure de carbone (ou

La solution halogenante est une solution de monobromure d'iode dans l'acide ac6tique.

KBactifs. - Chloroforme ou tétrachlorure de carbone, - &$actif de Hanus (log. de monobromure d'iode dans 500cc d'acide acétique cristallisable, pur et exempt d'alcool - se conserve en flacon bouche &eri, jaune de préf6rence)

- 1 1 - .

- Iodure de potassium pur (exempt d'iode libre et ditiodate) 2 3-- 2 - - S O Na IO en solution à I O p ,

!hode operatoire. Dans une fiole conique bien sèche de 200cc, bou-

convenable de la substance (le poids de la prise d'essai est ddter- miné par l'indice d'iode de la substance, on prend de preference . '

32g./I.I,) exacten:ent pesée et 1Occ. de chloroforme ou de t8tra- chlorure de carbone, Agiter le mélange jusqu'à dissolution complhte et ajouter 25cc, exactement mesur6s de rkactìf, Boucher, agiter et abandonner le mélange 1 heure ,à l'obscurit6, Puis ajouter 2Occ d'une solution 8. I O ~ O d'iodure de potassiurn, 1OOcc environ d'eau distillde et titrbr 1,'iode libre au moyen d'une solution de S203Na2 H/lO.,

chant à l'emeri, introduire une prise d'essai

Bffectuer un essai 8. blanc dans les memes conditions.

Calculs. Soient n le nombre de cc de X O Na N / l O utilise pour

&/I0 utilise' pour

2 3 2 .

2 3 2 - l'essai à blanc

la prise d'essai - n' le nombre de cc de S O Ba

p le poids de cette prise d'essai l'indice d'iode est égal 8:

(n - nf) x 1,269 /"-

2 3 2 cc S O &a N / 1 0 correspond 8. 926.mg d ' I . d'oh

(n - n'> x 0,0126 x 100

P Remarquel, Pour l'indice d'iode, en &me temps que les rbsultats,

I indiquer toujours la methode utilis6e.

I

1

! '

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