Programmes nationaux d’Evaluation Externe de la Qualité 2018

Côlon, Poumon, Mélanome, Ovaire, Par gène Présentation des résultats Réunion de restitution

5 juillet 2019

Journée

10-11h Présentation des résultats Gen&tiss 2018 – Côlon, Poumon, Mélanome, Ovaire, Gènes (E Rouleau) 11h-12h Base de données de variants somatiques – résultats NGS ( C Béroud – F Koeppel) 12h-13h Déjeuner 13h-14h Perspective européenne des contrôles de qualité (C Keppens, K Dufraing) 1. Effet des méthodes et des échantillons pour la détection de EGFR c.2369C>T p.(Thr790Met) 2. Nomenclature HGVS des variants somatiques en théranostic : vers un consensus standardisé 3. Exhaustivité du comptes-rendus tissulaires en Europe et France 4. Eléments présents sur le compte rendu pour ctDNA 14h-15h Présentation des résultats Gen&tiss 2018 - ADN circulant (M Denis) EEQ pilote - interprétation des variants (E Rouleau) 15h30-16h30 Groupes de discussion Harmonisation des panels – TMB et HRD (C Le Maréchal) Arbre décisionnel et bonne pratique de facturation (K Leroy) 16h30-17h Debriefing

Gen&tiss

Depuis 2012

10 à 5 échantillons / programme

5475 échantillons

16425 lames Leuven

Nijmegen

AFAQAP GFCO

Partner Platforms Joint partners

Reference Platform

IGR

Nantes

Merci ! Comité de pilotage Jean-Christophe SABOURIN Aude LAMY Frederique PENAULT-LLORCA Cécile AUBE Anne CAYRE Cédric LEMARECHAL Laurent DOUCET Clotilde DESCARPENTRIES Hélène BLONS Jean-François EMILE Jean-François COTE Antoinette LEMOINE Valérie DURANTON-TANNEUR Yves DENOUX Karen LEROY Isabelle SOUBEYRAN Véronique HADDAD Paul HOFMAN Florence PEDEUTOUR Alexandre HARLE Ludovic LACROIX Alexander VALENT Marc-Antoine BELAUD-ROTUREAU Pierre-Jean LAMY

AFAQAP Caroline Egele Jean-Pierre Bellocq Dominique Fetique Gustave Roussy Jean-Yves Scoazec Isabelle Miran Catherine Richon Ludovic Lacroix Sophie Cotteret Biomedical Quality Assurance Research unit of the University of Leuven Cleo Keppens Kelly Dufraing Els Dequeker Lien Tembuyser Veronique Tack

Departement of Pathology of the Radboud University Nijmegen Medical Centre Marjolijn Ligtenberg Han van Krieken

Institut National du Cancer Frédérique Nowak

Support financier :

UFR de Médecine Marseille Genetics and Bioinformatics team Christophe BEROUD David SALGADO Jean-Pierre DERIVES

UFR de Médecine - Nantes Laboratoire de Biochimie Marc DENIS

Participants à la journée

Avis sur les programmes

Thématiques de la journée

Base de données variants somatiques 35,71% 15

BRCA/HRD somatique 16,67% 7

Elargissement des panels en somatique (TMB) 16,67% 7

Facturation des actes RIHN 11,90% 6

MSI/POLE 9,52% 4

Signatures moléculaires / nouveaux biomarqueurs (expression / Sein / Autres) 4,76% 2

Réponses

Organisation

Programmes

• Programme “Tissu” • 20 lames à évaluer pour tissu: 5 côlon, 5 poumon, 5 mélanome, 5 ovaire • 1 échantillon éducatif par tissu

• Programme “Nouveau participant” par gène • Gènes : EGFR, BRAF, NRAS, KRAS • 5 échantillons artificiels

• Programme “ADN circulant” • 5 échantillons pour EGFR (IQNPath) • 6 échantillons pour KRAS/NRAS/BRAF (G&T)

Planning EEQ 2018

• Envoi des échantillons FFPE: 12 décembre 2018 • Envoi des échantillons ADN circulant IQNPath: 10 décembre 2018 • Envoi des échantillons ADN circulant G&T: 27 mars 2019 • Fin du programme FFPE: 20 février 2019 • Fin du programme ADN circulant IQNPath: 25 janvier 2019 • Fin du programme ADN circulant G&T: 5 juin 2019 • Réunion d’évaluation: 7 & 8 mars 2019 • Libération des génotype: 27 mars 2019 • Accès aux résultats individuels: 21 mai 2019 • Fin des réclamations: 15 juin 2019 • Réunion de restitution: 5 juillet 2019

Participants

Participants

N° des participants Colon Poumon Mélanome Ovaire

Nouveaux participants

Comptes rendu

2018 51 49 51 26 5 61

2017 47 42 44 21 3 57

2016 48 44 46 17 2 53

2015 48 46 45 48

2014 49 46 44

2013 49 45 45

2012 50 45 45

Participants par marqueur

Colon Poumon Mélanome Ovaire Nouveaux participants

Marqueur Nombre Marqueur Nombre Marqueur Nombre Marqueur Nombre Marqueur Nombre

KRAS 51 EGFR 49 BRAF 51 BRCA1 26 EGFR 4

NRAS 51 KRAS 48 NRAS 50 BRCA2 26 KRAS 5

BRAF 50 BRAF 46 KIT 39 TP53 5 BRAF 3

PIK3CA 40 PIK3CA 41 EDU 48 EDU 21 NRAS 1

MSI 41 ERBB2 41

MLH1 14 EDU 45

EDU 49

Programmes

Participations N° des labs

Colon + poumon + melanome + ovaire 21

Colon + poumon + melanome 22

Colon + poumon + ovaire 1

Poumon + melanome + ovaire 0

Colon + poumon 2

Colon + melanome 3

Colon + ovaire 1

Poumon + melanome 2

Poumon + ovaire 0

Melanome + ovaire 0

Colon 1

Poumon 1

Melanome 3

Ovaire 0

Nouveaux participants 5

2018: 64 participants uniques 2017: 60 participants uniques 2016: 56 participants uniques 2015: 50 participants uniques

Résultats des génotypes

Notation

- Europe < 90% = “échec de participation” - G&T < 80% = “échec de participation”

• La réussite au génotypage correspond à un score supérieur ou égal à 8 sur 10 en fonction du marqueur choisi.

• En cas d’erreur grave sur le génotype (faux négatif/faux positif), il y a échec au

génotypage.

• Pour les échantillons “éducatifs”, tout marqueur avec une erreur entraîne un échec au génotypage.

Grille de notation

Score Points given

a Génotype correct 2

b Génotype incorrect 0

c Mutation non identifiée car non recherchée pour KRAS/NRAS exon 2,3,4 ou EGFR exon 18 0

d Génotype partiel – manque une des mutations 0

e Mutation détectée, mais le changement de nucleotide est non décrit à cause de la technique utilisée – analyse de fragment, qPCR

2

f Mutation détectée, mais la nomenclature est fausse après séquençage (erreur de nucleotide, mais même codon), pas de mutation mentionnée 'muté', ou faux nombre des paires de bases en cas d'une

1,5

g Mutation détectée, mais erreur de mutation (erreur de codon) 0

h Echantillon non contributif 0,5

i Erreur d'écriture dans le tableau de génotypage (0 points) ; compte-rendu correct 0/2 (CR correct)

j Essais en cascade 1

k Statut muté / non muté correct, mais génotype non saisi dans le tableau 1/2 (CR correct)

L KRAS/NRAS sauvage dans le colon sans recherche de l’exon 4 de KRAS/NRAS -0,25 une fois

Notation: nomenclature HGVS

- X (aucun point déduit): • Parenthèses sur les changements d’acide aminé • Confusion avec un codon de termination:

- ‘X’ au niveau p.

- Y (-0,50 points une fois): • KRAS Glu12Val au lieu de p.(Gly12Val) • Ancienne nomenclature

- Z (-0,50 points une fois): • Pas de génotype sur niveau c. ou p.

Aucun point déduit: mélange de nomenclature ancienne avec nomenclature HGVS

EEQ tissu – résultats globaux

EEQ côlon

Résultat génotype – Colon 2018

Numéro

d'échantillonCellularité % KRAS NRAS BRAF PIK3CA MSI

Méthylation du

promoteur MLH1EEQ Divers (hors EEQ)

2018-C-1 70%

c.34G>T

p.(Gly12Cys)

VAF: 50%WT WT WT MSS Non méthylé GENOTYPE

TP53: c.638G>A

p.(Arg213Gln)

VAF: 45%

2018-C-2 90% WT

c.182A>T

p.(Gln61Leu)

VAF: 50%

WT WT MSS Non méthylé GENOTYPETP53: c.856G>C

p.(Glu286Gln)

VAF: 40%

2018-C-3 60% WT

c.35G>A

p.(Gly12Asp)

VAF: 45%

WT WT MSS Non méthylé GENOTYPETP53: c.524G>A

p.(Arg175His)

VAF: 55%

2018-C-4 70% WT WT

c.1799T>A

p.(Val600Glu)

VAF: 30%

WT MSS Méthylé GENOTYPETP53: c.524G>A

p.(Arg175His)

VAF: 60%

2018-C-5 80% WT

c.182A>G

p.(Gln61Arg)

VAF: 20%

WT WT MSS Non méthylé GENOTYPETP53: c.1015G>T

p.(Glu339*)

VAF : 50%

Echantillon

éducatif "CÔLON

2018"

NA

c.35G>T

p.(Gly12VAl)

VAF: 5% WT WT WT MSI Méthylé EDUCATIF

MAP2K1 :c.355C>T p.(His119Tyr)

VAF: 50%

MAP2K1 :c.167A>C p.(Gln56Pro)

VAF: 50%

EGFR:c.2155G>A p.(Gly719Ser)

VAF: 30%

IDH2:c.435del p.(Thr146fs*15)

VAF: 50%

CTNNB1: c.98C>A;p.(Ser33Tyr)

VAF:40%

WT : aucune mutation identifiée / *: ce variant est à but éducatif hors score « génotype GENOTYPE : participe au score « génotype » / EDUCATIF : ne participe pas au score « génotype »

Non méthylé

Globalement

Marqueur Nombre Succes % succes Score moyen

KRAS 51 51 100% 99,3

NRAS 51 48 94% 97,9

BRAF 50 50 100% 99,2

PIK3CA 40 38 95% 98,8

MSI 41 39 95% 98,5

Méthylation MLH1

14 14 100% 98,9

Educatif 49 38 78% 90,8

Très bon niveau >94% de succès

Colon - KRAS

4

1

0

1

2

3

4

5

18-C-1 18-C-2 18-C-3 18-C-4 18-C-5

KRAS: 51 participants

b

c

d

e

f

g

h

i

j

k

c.34G>T, p.(Gly12Cys) WT WT WT WT

1: Nomenclature fausse: c.38G>T, p.(Gly12Cys) 4: La technique ne spécifie pas la mutation

Colon - NRAS

c.182A>T, p.(Gln61Leu) WT c.35G>A, p.(Gly12Asp) WT c.182A>G, p.(Gln61Arg)

4: La technique ne spécifie pas la mutation

0

1

2

3

4

5

18-C-1 18-C-2 18-C-3 18-C-4 18-C-5

NRAS: 51 participants

b

c

d

e

f

g

h

i

j

k

1: NRAS non testé 1: FN 1: erreur de codon (c.182A>T, p.(Gln61Leu)) 4: La technique ne spécifie pas la mutation

1: erreur d’écriture

Colon - BRAF

WT c.1799T>A; p.(Val600Glu) WT

1: erreur d’écriture 4: La technique ne spécifie pas la mutation

0

1

2

3

4

5

18-C-1 18-C-2 18-C-3 18-C-4 18-C-5

BRAF: 50 participants

b

c

d

e

f

g

h

i

j

k

WT WT

Colon – PIK3CA

WT WT

1: Echantillon non contributif

WT WT

0

1

2

3

4

5

18-C-1 18-C-2 18-C-3 18-C-4 18-C-5

PIK3CA: 40 participants

b

c

d

e

f

g

h

i

j

k

WT

Colon – MSI

MSS MSS

*: ‘WT’, mais MSS dans le CR

MSS MSS MSS

0

1

2

3

4

5

18-C-1 18-C-2 18-C-3 18-C-4 18-C-5

MSI: 41 participants

b

c

d

e

f

g

h

i

j

k

1: FP

* * * * *

Colon – méthylation du promoteur MLH1

Non methylé

1: échantillon non contributif

0

1

2

3

4

5

18-C-1 18-C-2 18-C-3 18-C-4 18-C-5

MLH1: 14 participants

b

c

d

e

f

g

h

i

j

k

Non methylé

Non methylé

Non methylé

Non methylé

Colon – Educatif

c.35G>T p.(Gly12Val) WT WT MSI-H WT

0

1

2

3

4

5

KRAS NRAS BRAF PIK3CA MSI MLH1

Educatif: 52

b

c

d

e

f

g

h

i

j

k

Methylé

4: FN 3: KRAS non testé 2: La technique ne spécifie pas la mutation 1: Erreur de codon 1: Non contributif

1: FP (c.182A>G p.(Gln61Arg)) 3: KRAS non testé 1: Non contributif

2: FP (c.1799T>A, p.(Val600Glu)) 1: Non contributif

2: FP c.3140A>G, p.(His1047Arg) & c.2740G>A, p.(Gly914Arg) 1: Non contributif

2: FN 1: Non contributif

2: Non contributif

KRAS:c.35G>T VAF 5%

MSI

Au final

Pour les échantillons FFPE (1230 analyses – 255 échantillons):

• 1 faux négatif • 1 faux positif • 1 mutation erronée • 1 fois NRAS non testé • 2 non contributifs

Résultats limites sur NRAS et difficulté sur la VAF 5% Taux d’erreur : 2/255 = 0,78%

Echecs 3 pour NRAS

1 pour PIK3CA 1 pour MSI

EEQ poumon

Résultat génotype – Poumon 2018

WT : aucune mutation identifiée / *: ce variant est à but éducatif hors score « génotype GENOTYPE : participe au score « génotype » / EDUCATIF : ne participe pas au score « génotype »

Numéro

d'échantillonCellularité % EGFR KRAS BRAF PIK3CA ERBB2 EEQ Divers (hors EEQ)

18-P-6 70%

c.2236_2250del

p.(Glu746_Ala750del)

VAF: 20%WT WT WT WT GENOTYPE

TP53:c.839G>C p.(Arg280Thr)

VAF :30%

MSS

18-P-7 70% WT

c.34G>T

p.(Gly12Cys)

VAF: 50%

WT WT WT GENOTYPE

CTNNB1: c.101G>T, p.(Gly34Val)

VAF:5%

STK11 c.298C>T, p.(Gln100*)

VAF:50%

MSS

18-P-8 80% WT WT WT WT WT GENOTYPE

TP53:c.461G>T p.(Gly154Val)

VAF: 50%

Amplification EGFR

MSS

18-P-9 80%

c.2314_2319dup

p.(Pro772_His773dup)

VAF: 45%

WT WT WT WT GENOTYPETP53:c.584T>C p.(Ile195Thr)

VAF: 80%

MSS

18-P-10 80% WT WT WT WT WT GENOTYPETP53 :c.454_457delinsTC p.(Pro152fs)

VAF:45%

MSS

Echantillon

éducatif "POUMON

2018"

NA

c.2582T>A

p.(Leu861Gln)

VAF: 5%

WT

c.1799T>A

p.(Val600Glu)

VAF: 65%

c.3140A>G

p.(His1047Arg)

VAF: 50%

WT EDUCATIFHRAS:c.218G>A p.(Arg73His)

VAF:5%

Globalement

Marqueur Nombre Succes % succes Score moyen

EGFR 49 42 86% 95,9

KRAS 48 48 100% 99,7

BRAF 46 46 100% 99,7

PIK3CA 41 40 98% 99,1

ERBB2 41 40 98% 98,1

Educatif 45 39 87% 93,9

Résultats moyens > 86%

Poumon – EGFR

c.2236_2250del; p.(Glu746_Ala750del)

6: la technique ne spécifie pas la mutation

WT WT c.2314_2319dup; p.(Pro772_His773dup)

WT

0

1

2

3

4

5

6

7

18-P-6 18-P-7 18-P8 18-P-9 18-P-10

EGFR: 49 participants

b

c

d

e

f

g

h

i

j

k

1: EGFR non testée

2: FP c.2156G>A, p.(Gly719Asp) et c.2369C>T, p.(Thr790Met)

2: FN 2: mutation non spécifiée 5: nomenclature fausse (delins) 2: erreur de codon 1: erreur d’écriture

Poumon – KRAS

WT

2: la technique ne spécifie pas la mutation

c.34G>T; p.(Gly12Cys) WT WT WT

1: erreur d’écriture

0

1

2

3

4

5

18-P-6 18-P-7 18-P8 18-P-9 18-P-10

KRAS: 48 participants

b

c

d

e

f

g

h

i

j

k

Poumon – BRAF

WT WT WT WT WT

1: Echantillon non contributif

0

1

2

3

4

5

18-P-6 18-P-7 18-P8 18-P-9 18-P-10

BRAF: 46 participants

b

c

d

e

f

g

h

i

j

k

Poumon – PIK3CA

WT WT WT WT WT

1: Echantillon non contributif

0

1

2

3

4

5

18-P-6 18-P-7 18-P8 18-P-9 18-P-10

PIK3CA: 41 participants

b

c

d

e

f

g

h

i

j

k

Poumon – ERBB2

WT WT WT WT WT

1: Echantillon non contributif

0

1

2

3

4

5

18-P-6 18-P-7 18-P8 18-P-9 18-P-10

ERBB2: 41 participants

b

c

d

e

f

g

h

i

j

k

Poumon – Educatif

c.2582T>A; p.(Leu861Gln)

WT c.1799T>A; p.(Val600Glu)

c.3140A>G; p.(His1047Arg)

WT

*1: Echantillon non contributif

0

1

2

3

4

5

EGFR KRAS BRAF PIK3CA ERBB2

Educatif: 45 participants

b

c

d

e

f

g

h

i

j

k

* * * * *

1: génotype incorrect (c.2155G>A, p.(Gly719Ser)) 3: la technique ne spécifie pas la mutation 1: fausse nomenclature

1: FP (c.35G>T, p.(Gly12Val))

1: FN 5: FN 2: la technique ne spécifie pas la mutation

Au final

• Pour les échantillons FFPE (1122 analyses – 245 échantillons ):

• 2 faux négatifs • 2 faux positifs • 1 mutation erronée • 1 fois EGFR non testé • 3 non contributifs

Pas de difficulté sur la VAF à 5% Taux d’erreurs : 4/245 = 1,6%

Echecs 6 pour EGFR

EEQ mélanome

Résultat génotype – Mélanome 2018

WT : aucune mutation identifiée / *: ce variant est à but éducatif hors score « génotype GENOTYPE : participe au score « génotype » / EDUCATIF : ne participe pas au score « génotype »

Numéro

d'échantillonCellularité % BRAF NRAS KIT EEQ Divers (hors EEQ)

18-M-11 80%

c.1799T>A

p.(Val600Glu)

VAF: 80%

WT WT GENOTYPE Amplification BRAF

MSS

18-M-12 70% WT

c.182A>T,

p.(Gln61Leu)

VAF: 40%

WT GENOTYPEFBXW7: c.1375G>T, p.(Gly459Trp)

MSS

18-M-13 50% WT

c.182A>G

p.(Gln61Arg)

VAF: 70%

WT GENOTYPE MSS

18-M-14 90%

c.1798_1799delinsAG

p.(Val600Arg)

VAF: 70%

WT WT GENOTYPE

MAP2K1:c.370C>T (p.(Pro142Ser)) VAF:29%

ALK:c.3659C>T (p.(Ser1220Phe)) VAF:30%

EGFR:c.1346G>A (p.(Gly449Glu)) VAF:40%

TP53:c.530C>T (p.(Pro177Leu)) VAF:70%

MSS

18-M-15 90% WT

c.182A>T

p.(Gln61Leu)

VAF: 30%

WT GENOTYPETP53:c.718A>C p.(Ser240Arg))V AF:10%

TP53:c.743G>A (p.(Arg248Gln))VAF:5%

TP53:c.524G>A (p.(Arg175His))VAF:5%

MSS

Echantillon

éducatif

"MELANOME

2018"

NA

c.1798_1799delinsAA

p.(Val600Lys)

VAF: 5%

WT WT EDUCATIF

KRAS:c.38G>A (p.(Gly13Asp)) VAF:50%

PIK3CA:c.3140A>G (p.(His1047Arg))VAF:50%

CTNNB1: c.133_135delTCT p.(Ser45del)VAF:50%

MSI-H

Globalement

Marqueur Nombre Succes % succes Score moyen

BRAF 51 50 98% 98,9

NRAS 50 49 98% 99,0

KIT 39 34 87% 95,9

Educatif 48 40 83% 2,6/2,75

Mélanome – BRAF

c.1799T>A, p.(Val600Glu)

WT WT c.1798_1799delinsAG, p.(Val600Arg)

WT

4: la technique ne spécifie pas la mutation

0

1

2

3

4

5

18-M-11 18-M-12 18-M-13 18-M-14 18-M-15

BRAF: 51 participants

b

c

d

e

f

g

h

i

j

k

1: erreur de mutation (p.Val600Lys)

Mélanome – NRAS

WT WT WT WT WT

1: Echantillon non contributif

0

1

2

3

4

5

18-M-11 18-M-12 18-M-13 18-M-14 18-M-15

NRAS: 50 participants

b

c

d

e

f

g

h

i

j

k

Mélanome – KIT

WT WT WT WT WT

4: Echantillon non contributif

0

1

2

3

4

5

18-M-11 18-M-12 18-M-13 18-M-14 18-M-15

KIT: 39 participants

b

c

d

e

f

g

h

i

j

k

Mélanome – Educatif

c.1798_1799delinsAA, p.(Val600Lys)

WT WT

5: FN 2: la technique ne spécifie pas la mutation 2: erreur de mutation c.1799T>A, p.(Val600Glu) & c.1798G>A, p.(Val600Met)

0

1

2

3

4

5

BRAF NRAS KIT

Educatif: 48 participants

b

c

d

e

f

g

h

i

j

k

BRAF VAF 5% c.1798_1799delinsAA, p.(Val600Lys)

Au final

• Pour les échantillons FFPE (698 analyses - ):

• 2 mutation erronées • 10 non contributifs

Echecs 1 pour BRAF 1 pour NRAS

4 pour KIT

4 laboratoires avec 2 non contributifs: • 2 laboratoires n’ont donné aucune raison • 1 lab: qualité de séquençage trop faible (M13) & melanine (M15) • 1 lab: échec d’amplification

Difficulté sur la VAF à 5% Taux d’erreur : 0 / 255 = 0%

EEQ ovaire

Résultat génotype – Ovaire 2018

Numéro

d'échantillonCellularité % BRCA1 BRCA2 EEQ Divers (hors EEQ)

18-O-16 90%

c.2601del

p.(Gln867fs) VAF: 75%

Délétion des exons 14 à 24*

WT GENOTYPETP53: c.358A>G p.(Lys120Glu)

VAF:75%

18-O-17 80% WT/NC***

c.8487+1G>A

p.(?)

VAF: 90%

/ NC***

GENOTYPETP53.c.1024del p.(Arg342Glyfs*3)

VAF:75%

18-O-18 90% WT WT GENOTYPE -

18-O-19 90% WT WT GENOTYPE

TP53: c.713G>C; p.(Cys238Ser)

RAD51C : c.577C>T; p.(Arg193*)

VAF:95%

18-O-20 90% WT WT GENOTYPE

TP53 c.713G>A p.(Cys238Tyr)

RAD51D:c.803G>A (p.(Trp268*)

VAF:95%

Echantillon

éducatif "OVAIRE

2018"

NA Délétion des exons 1 à 14 WT EDUCATIFTP53: c.818G>A;p.(Arg273His)

VAF:75%

WT : aucune mutation identifiée / * : ce variant est à but éducatif hors score « génotype *** : 18-O-17 – les conclusions « mutés » / « non contributif » sont acceptés. GENOTYPE : participe au score « génotype » / EDUCATIF : ne participe pas au score « génotype »

Globalement

Marqueur Nombre Succes % succes Score moyen

BRCA1 26 24 92% 96,3

BRCA2 26 23 88% 95,7

TP53 5 3 60% 96,0

Educatif 21 3 14% 60,5

Résultats moyens > 88%

Ovaire – BRCA1

c.2601del, p.(Gln867Hisfs*26) WT WT

1: FN

0

1

2

3

4

5

O-16 O-17 O-18 O-19 O-20

BRCA1: 25 participants

b

c

d

e

f

g

h

i

j

k

WT WT

1: FP (c.1289A>T) 5: non contributif MAIS mauvaise qualité de l'échantillon 2 points

1: FP Mutation délétère (dans le CR): Duplication exon 2; p.(Cys27*)

Ovaire – BRCA2

c.2601del, p.(Gln867Hisfs*26)

WT WT WT WT

2: FN 1 point 4: non contributif MAIS mauvaise qualité de l'échantillon 2 points

1: FP (c.-39-12_-39-10del)

0

1

2

3

4

5

O-16 O-17 O-18 O-19 O-20

BRCA2: 25 participants

b

c

d

e

f

g

h

i

j

k

1: FP (p.(Val211Glu))

Ovaire – TP53

c.358A>G p.(Lys120Glu)

WT c.713G>C p.(Cys238Ser)

c.713G>A p.(Cys238Tyr)

0

1

2

3

4

5

O-16 O-17 O-18 O-19 O-20

TP53: 5 participants

b

c

d

e

f

g

h

i

j

k

c.1024del p.(Arg342Glyfs*3)

1: erreur de mutation: c.713G>C p.(Cys238Tyr)

Ovaire – Educatif

WT WT large délétion des exons 2 à 14

15: FN 1: non contributif 1: erreur d’écriture

0

2

4

6

8

10

12

14

BRCA1 BRCA2 TP53

Educatif: 21 participants

b

c

d

e

f

g

h

i

j

k

1: FP (c.426_631Dup;p.(Pro143GlnfsX2)) 1: non contributif 1: erreur d’écriture

• 2017 • BRCA1: 11/20 (55.0%) participants n’ont pas rapporté le variant classe III

c.1303G>T; p.(Asp435Tyr) VAF 7%

• BRCA2: 10/20 (50.0%) participants n’ont pas rapporté le variant classe V c.8021dup; p.(Ile2675Aspfs*6) VAF 10%

• 2018 • Grand réarrangement sur BRCA1 : 4 / 21 (éducatif – 3 détections + 1 erreur de

saisie)

• Grand réarrangement sur BRCA1 : 2 / 25 (case 1)

Ovaire – Educatif

Au final

• Pour les échantillons FFPE (273 analyses – 130 échantillons ):

• 3 faux négatifs • 4 faux positifs • 1 mutation erronées • 13 non contributifs

Echecs: 3 pour BRCA1 2 pour BRCA2 1 pour TP53

O-17: qualité ADN limite : 2 points donnés pour les NC et 1 point pour les FN

Absence de détection des grands réarrangements Taux d’erreurs : 7 / 130 = 5,3%

• 2017 : 3 faux négatifs– 2,7% • 110 analyses • 22 participants

• 2018 : 3 faux négatifs / 4 faux positifs– 5,3% • 130 analyses • 26 participants

• Autres gènes 2018 • 2018 – TP53 – 5 participants – aucune erreur • RAD51C – 3 participants l’ont détectée • RAD51D – 1 participant l’a détectée

Au final

Educative sample

• 2017 • BRCA1: 11/20 (55.0%) participants miss a class III variant c.1303G>T;

p.(Asp435Tyr) VAF 7%

• BRCA2: 10/20 (50.0%) participants miss a class V variant c.8021dup; p.(Ile2675Aspfs*6) VAF 10%

• 2018 • Large rearrangement in BRCA1 : 5 / 21 (educational)

• Large rearrangement in BRCA1 : 2 / 25 (case 1)

16/07/2019 TITRE DU DIAPORAMA Général

EEQ nouveaux participants « EEQ par gène »

Nouveaux participants 2018

“EEQ par gène”

WT : aucune mutation identifiée GENOTYPE : participe au score « génotype »

Numéro

d'échantillonCellularité % KRAS BRAF EGFR NRAS EEQ

1-A NA WT

c.1798_1799delinsAA

p.(Val600Lys)

VAF: 5%

c.2155G>A

p.(Gly719Ser)

VAF: 5%

c.436G>A,

p.(Ala146Thr)

VAF: 50%

GENOTYPE

2-B NA

c.38G>A

p.(Gly13Asp)

VAF: 5%

WT

c.2235_2249del

p.(Glu746_Ala750del)

VAF: 5%

c.35G>T

p.(Gly12Val)

VAF: 50%

GENOTYPE

3-C NA

c.35G>C

p.(Gly12Ala)

VAF: 5%

c.1798_1799delinsAG

p.(Val600Arg)

VAF: 50%

c.2573T>G

p.(Leu858Arg)

VAF: 5%

WT GENOTYPE

4-D NA

c.35G>T

p.(Gly12Val)

VAF: 50%

c.1799T>A

p.(Val600Glu)

VAF: 20%

c.2300_2308dup

p.(Ala767_Val769dup)

VAF: 50%

c.38G>A

p.(Gly13Asp)

VAF: 50%

GENOTYPE

5-E NA

c.436G>A

p.(Ala146Thr)

VAF: 50%

WT WT

c.183A>T

p.(Gln61His)

VAF: 50%

GENOTYPE

Globalement

Marqueur Nombre Succes % succes Score moyen

EGFR 4 4 100% 96,3

KRAS 5 5 100% 94,0

NRAS 1 1 100% 100

BRAF 3 3 100% 98,3

Résultats excellents à 100%

Nouveaux participants – KRAS

c.35G>T p.(Gly12Val)

c.38G>A, p.(Gly13Asp)

1: non contributif * la technique ne spécifie pas la mutation

0

1

2

3

4

5

1-A 2-B 3-C 4-D 5-E

KRAS: 5 participants

b

c

d

e

f

g

h

i

j

k

WT c.35G>C, p.(Gly12Ala)

c.436G>A, p.(Ala146Thr)

* * *

*

Nouveaux participants – BRAF

c.1799T>A, p.(Val600Glu)

WT

* la technique ne spécifie pas la mutation

c.1798_1799delinsAA, p.(Val600Lys)

c.1798_1799delinsAG, p.(Val600Arg)

WT

0

1

2

3

1-A 2-B 3-C 4-D 5-E

BRAF: 3 participants

b

c

d

e

f

g

h

i

j

k

* * *

0

1

2

3

4

1-A 2-B 3-C 4-D 5-E

EGFR: 4 participants

b

c

d

e

f

g

h

i

j

k

Nouveaux participants – EGFR

c.2300_2308dup, p.(Ala767_Val769dup)

c.2235_2249del, p.(Glu746_Ala750del)

* la technique ne spécifie pas la mutation

c.2155G>A, p.(Gly719Ser)

c.2573T>G, p.(Leu858Arg)

WT

* * * *

Nouveaux participants – NRAS

Seulement pour 1 participant: tous les échantillons ont été correctement analysés

Délai de l’analyse

Délais

0

10

20

30

40

50

60

Délai pour réception - génotypage Délai pour début de l'analyse -génotypage

Jou

rs

COLON: 4 participants

0

10

20

30

40

50

60

Délai pour réception - génotypage Délai pour début de l'analyse -génotypage

Jou

rs

POUMON: 3 participants

0

10

20

30

40

50

60

Délai pour réception - génotypage Délai pour début de l'analyse -génotypage

Jou

rs

OVAIRE: 2 participants

0

10

20

30

40

50

60

Délai pour réception - génotypage Délai pour début de l'analyse -génotypage

Jou

rs

MELANOME: 4 participants

! Attention: le délai n’était pas un critère de L’EEQ 2018

Résultats des items du compte-rendu

Evaluation

• 7/8 Mars 2019 • Relecture des deux premiers comptes-rendus • Relecteurs: Louvain (4) – France (4) • Relecteurs France: Aude Lamy, Alexandre Harlé, Ludovic Lacroix, Etienne Rouleau • Relecteurs Louvain: Cleo Keppens, Kaat Van Casteren, Kelly Dufraing, Els Dequeker • Croisement des résultats • Mise en place et validation de la grille de notation

Evaluation

• 29 items dont 3 pour l’interprétation et 26 autres items • Interprétation: score pour variant muté + variant sauvage de chaque cancer • Nouveau: interprétation notée pour MSI & méthylation MLH1 • Numéro de version à modifier pour BRAF & NRAS • QC metric pour NGS: couverture/profondeur minimale • Description de la méthode NGS: kit, séquenceur et pipeline de bioinformatique

Evolution du score du compte-rendu

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

2012 2013 2014 2015 2016 2017 2018

% m

oye

n

% Moyen du score de Compte-Rendu

Interprétation

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Interprétationdu résultatKRAS/NRAS

(muté)

Interprétationdu résultatKRAS/NRAS

(muté)

Interprétationdes autresmarqueurs

InterprétationMSI

InterprétationMLH1

Interprétationdu résultat

EGFR (muté)

Interprétationdu résultat

EGFR (sauvage)

Interprétationdes autresmarqueurs

Interprétationdu résultat

BRAF (muté)

Interprétationdu résultat

BRAF (sauvage)

Interprétationdes autresmarqueurs

Interprétationdu résultat

BRCA1 (muté)

Interprétationdu résultat

BRCA2 (muté)

PER

CEN

TAG

E O

F LA

BO

RA

TOR

IES

WIT

H A

GIV

EN S

CO

RE

PER

ITEM

(n

=52

) + Present and correct +/- Present, but unclear +/-* Direct patient advice - Not present w Wrong

Colon Poumon Mélanome Ovaire

Evolution – interprétation des cas mutés

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

2012 2013 2014 2015 2016 2017 2018

Sco

re (

%) KRAS/NRAS mut

EGFR mut

BRAF mut

BRCA mut

Evolution – interprétation des cas sauvages

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

2012 2013 2014 2015 2016 2017 2018

Sco

re (

%) KRAS/NRAS WT

EGFR WT

BRAF WT

BRCA WT

Identification – méthodes – info génerale

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

PER

CEN

TAG

E O

F LA

BO

RA

TOR

IES

WIT

H A

GIV

EN S

CO

RE

PER

ITEM

(n

=52

) + Present and correct +/- Present, but unclear - Not present w Wrong

Evolution sur les items “identification”

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

80,0

90,0

100,0

Nom du patient Nom de naissance N° identification/ date denaissance

Numéro d'échantillon Référence interne ouEQA

Nature de l'échantillon Histologie Raison de la prescription

Sco

re (

%)

Identification

2012 2013 2014 2015 2016 2017 2018

Evolution sur les items “méthodes”

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

80,0

90,0

100,0

% cellularité Méthode utilisée Sensibilité Liste des mutations testées Séquence de référence

Sco

re (

%)

Méthodes

2012 2013 2014 2015 2016 2017 2018

Evolution sur les items “informations générales”

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

80,0

90,0

100,0

Un identifiantunique par page

Indication dunombre total de

page

Indication dunuméro de page

Titre explicite Nom et adresse duprescripteur

Date deprélèvement

Date de réception Date de validationdu compte-rendu

Nom et/ou signaturedu pathologiste

Sco

re (

%)

Information générales

2012 2013 2014 2015 2016 2017 2018

Cellularité tumorale

Estimation de la cellularité tumorale

Figure : exemple de la distribution des 5 échantillons EEQ côlon par ordre croissant de cellularité estimée

Cel

lula

rité

tu

mo

rale

est

imée

3 /52 utilisation des intervalles proposés

Organisation

Organisation des structures

• 60% intégralité sur une unique structure (29/48)

• Organisation de l’extraction au compte-rendu

• 13 uniquement anatomie pathologie

• 30 uniquement génétique moléculaire

• 11 mixte / plateforme commune

pre-ana - TC% pre-ana extraction ADN ana technique compte rendu

service d'anatomie pathologique service de génétique somatique service de génétique somatique service de génétique somatique 20

service d'anatomie pathologique service d'anatomie pathologique service d'anatomie pathologique service d'anatomie pathologique 9

service d'anatomie pathologique service de génétique somatique service de génétique somatique service d'anatomie pathologique 3

Pré-analytique - cellularité Pré-analytique - extraction Analytique Post-analytique

Anatomie pathologique 46 13 9 14

Génétique somatique 2 31 32 29

Commun 6 10 13 11

Activités

Tableau : estimation de l’activité hebdomadaire en 2018.

poumons /

semaine

côlons /

semaine

mélanomes /

semaine

ovaires /

semaine

ADNct /

semaine

Moyenne 9 6,6 3 4,25 4

Min 1 1 1 1 1

Max 45 35 8 12 15n=36 (poumon, côlon, mélanome) n=16 (ovaire) n=29 (ctDNA)

Accréditation/certification

5

33

Certifié ISO9001? (N=38)

Oui Non

29 24

Accredité ISO15189 pour les analyses de génétiques somatiques (N=53)

Oui Non

45

9

Accredité ISO15189 pour analyses médicales? (N=54)

Oui Non

45% des laboratoires accrédités en génétique somatique (n=53) 30% des laboratoires ont accrédité le NGS (n=53)

RCP

0

5

10

15

20

25

30

35

Oui Non En cours Non, discussion parRCP d'organe des

résultats

RCP moléculaire (N=63)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

Interprétation des résultatsmoléculaires

Mise en place d'analysescomplémentaires pour

certains patients

Tous les deux

Sujets (N=30)

0

2

4

6

8

10

12

14

A la démande Une fois parsemaine

Toutes lesdeux semaines

Mensuel Tous les deuxmois

Trimestrielle

Fréquence (N=30)

0 5 10 15 20 25 30 35

Le technicien de laboratoire

Le pathologiste

Le biologiste moléculaire

Le directeur de laboratoire

L'oncologue

Le médecin généraliste

Le chirurgien

Le médecin radiologiste

Le bioinformaticien

Participants (N=30)

Méthodes

Extraction

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

2016 2017 2018

Automatique vs manuel

Automatic Manual

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

Colonne Bille Enzymatique Intégré à la cartoucheIdylla

Type d'extraction

2016

2017

2018

Figure : Automatisation de l’extraction. Figure : Distribution des techniques d’extraction.

Maxwell 16 FFPE LEV DNA Isolation Kit (Promega) 3

Maxwell 16 FFPE Plus LEV DNA purification Kit (Promega) 17

Maxwell RSC DNA FFPE kit (Promega 1

Maxwell RSC DNA FFPE Kit (Promega AS1450) 1

Maxwell RSC DNA FFPE KIT (Promega) 8

Maxwell® RSC FFPE Plus Kit custom (Promega) 2

Extraction

Tableau : Diversité des kits – exemple Maxwell

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

Maxwell 16(Promega)

QIAGENEQIAcube

QIAGENEquiasymphony

Sentosa SQNSCLC Panel

Bionobis TPS (Siemens) Biocartis

Automate d'extraction

2016

2017

2018

Figure : Répartition des automates d’extraction

Diffusion du NGS auprès des participants aux EEQ Gen&tiss

Diffusion du NGS en France

Analytique

9 non NGS dans le poumon 4 technique identique 1 Séquençage Sanger 2 Mass-Array 1 Idylla (Biocartis) 5 technique différente Essentiellement Taqman / Idylla (Biocartis)

16 non NGS dans le côlon 9 techniques identiques 2 Séquençage Sanger 3 Mass Array 2 Idylla system (Biocartis) 1 HRM/Séquençage Sanger 1 SNaPshot/extension 7 techniques différentes Taqman, NGS, Idylla, pyroséquençage

15 non NGS dans le mélanome 6 techniques identiques 2 Séquençage Sanger 2 Idylla system (Biocartis) 1 SNaPshot/extension 1 Mass Array 9 techniques différentes Taqman, Sanger NGS, Idylla, pyroséquençage

Méthodes NGS

Equipement en séquenceurs NGS

Techniques d’enrichissement NGS

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Panel maison Qiagen solution (Qiagen)

Access Array System (Fluidigm)

Jeu d'amorces maisons

BRCA MASTR plus Dx (Multiplicom)

Tumor Hotspot MASTR Plus (Multiplicom)

TruSeq Custom Amplicon (Illumina)

Autres

STS (Sophia Genetics)

Ion AmpliSeq Colon and Lung Cancer Panel (Life technologies)

Oncomine Solid Tumour DNA kit (Life Technologies)

Ion Ampliseq Custom panel - Régions sélectionnées par le laboratoire (Life Technologies)

NGS kit enrichissement (N=53)

Figure : Nature des kits d’enrichissement utilisé en NGS (poumon, côlon, mélanome)

Analyse bioinformatique NGS

13

15

25

Evaluation données informatiques (N=53)

Développement bioinformatique commercial

Prestataire extérieur

Développement bioinformatique local

14

1

Prestataire extérieur (N=15)

Sophiagenetics

Autre

8 3

2

Développement bioinformatique commercial (N=13)

Ion Reporter

SeqNext

Autre

0 5 10 15 20 25 30

GenomeBrowser

Aucune

Alamut/IGF

Alamut

IGV

Relecture (N=53)

Figure : Prise en charge de l’analyse bioinformatique et de la relecture des résultats.

Choix des contrôles internes NGS

3 4

46

Utilisation des contrôles internes (N=53)

Qui, fréquence differente Non Oui, a chaque run

43

6

Type de contrôle interne (N=49)

Contrôle commercial Contrôle maison

Figure : Nature des contrôles internes utilisés en NGS (poumon, côlon, mélanome)

Estimation de la performance Profondeur / VAF minimale

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

1-2% 2-5% 5% 5-10% 10-20%

N la

bo

rato

ries

VAF

VAF minimale (N=53)

Maintien des cibles depuis 2017

Figures : Performance attendue et acceptable en profondeur et limite de détection en NGS (poumon, côlon, mélanome)

Questionnaire BRCA1/2

Organisation des tests

Figures : Nature de la spécialité impliquée dans l’analyse BRCA1/2 et délai déclaratif moyen pour le rendu des résultats.

Exigence minimale pour l’analyse

• Aucune exigence (9/22)

• Analyse constitutionnelle d’abord (3/22)

• Cellularité minimale (13/22)

• Surface minimale

• Age du bloc 10% 4

20% 5

30% 4

2mm² 1

5mm² 1

Neoplastic cells

Surface

Genetiss 2018 – survey of BRCA1/2 practices

Technique d’enrichissement et séquenceurs

2017 2018

Ion Proton (Life Technologies) 0 1

Ion S5 system (Life Technologies) 4 4

MiniSeq (Illumina) 1 1

MiSeq (Illumina) 14 14

NextSeq (Illumina) 1 2

PGM IonTorrent (Life Technologies) 2 2

2017 2018

Multiplicom 10 13

Agilent Sureselect 2 2

Qiagen 2 1

Thermofisher 5 5

Fluidigm 0 1

Sophia Genetics 1 2

Cas par série nombre de structures

8 6

12 2

16 11

24 2

32 3

48 1

Table : distribution de la taille des séries d’analyse

Table : distribution des techniques d’enrichissement en fonction des fournisseurs

Table : distribution des séquenceurs utilisés

Performances attendues

Figures : Performance attendue et acceptable en profondeur et limite de détection pour le criblage somatique BRCA1/2

Analyse technique

• Capacité à détecter les grands réarrangements : 7/24 – 4 détections

• Attitude si couverture inférieure à la cible (<300X) sur l’ensemble des gènes

Detection of large rearrangement

No 16

Bioinformatic analysis 6

Germline testing 1

MLPA 1

Rendu du résultat avec la couverture du gène 12

Séquençage en Sanger des zones non couvertes 3

Duplicat 2

Non contributif 5

En fonction des résultats 2

Post-analytique – compte-rendu

• Attitude par rapport à la fréquence allélique / perte d’hétérozygotie

• Attitude en fonction des résultats de variant (plusieurs réponses possibles – n=23)

Il faut signaler toute LOH évidente sur la fréquence allélique de la mutation. 7

Il n'est pas nécessaire de rapporter la fréquence allélique sur les compte-rendus. 9

Non signalée / non analysée 4

Consultation d'oncogenetique recommandée pour variant classe 4 et 5 2

Tout variant (UV-3) doit être rapporté sur le compte-rendu. 20

Un variant peut être rendu avec une application thérapeutique, mais sans application pour la famille (classe 4). 13

Une orientation vers la consultation d'oncogénétique doit être proposée systématiquement pour tout variant (3, 4, 5). 17

Une orientation vers la consultation d'oncogénétique doit être proposé même en l'absence de variant 1

Le variant doit être positionné par rapport aux domaines fonctionnels. 1

Post-analytique – compte-rendu

• Interprétation d’une mutation tumorale si génétique constitutionnelle négative

• Interprétation d’un résultat sauvage sur la tumeur en l’absence de génétique constitutionnelle

conclusion de l'origine tumoral probable de la mutation identifiée sur la tumeur 9

demande de réaliser une vérification technique du criblage constitutionnel indépendemment de la fréquence allélique 11

demande de réaliser une vérification technique du criblage si la fréquence allélique est supérieure à 50% 2

conclusion de l'absence de mutation constitutionnelle et somatique pour la patiente 1

maintien dans le commentaire d'un criblage constitutionnel pour la détection des grands réarrangements (en fonction de la qualité de l'ADN) 12

maintien dans le commentaire d'une consultation de génétique 10

Perspectives

• Autres demandes réalisées – en fonction des AMM / cas post-mortem (n=24)

• Quels sont les prochains cancers qui devront être analysés (n=22) ? Sein 15/22

Pancréas 6/22

Prostate 8/22

Sein 20

Prostate 16

Pancréas 12

Perspectives

• Capacité à doubler le nombre d’analyses (n=22)

• Extension du nombre de gènes à moyen terme : oui 17 (n=24)

• Extension à d’autres gènes à court terme (n=21)

Non, impossible à moyen terme 3

Oui – à court terme mi2019 15

Oui – à moyen terme fin 2019 4

Non 10

Gènes HRD 8

PALB2/RAD51C/D 3

Analyse en cours

Nombre de participants

Organisation Pilot NGS scheme 2016 Lung control 24 Melanoma control 19 Colon control 24

n=27

Pilot NGS scheme 2017 Participants n=40

Data n=39

NGS scheme 2018 Participants inscrits 46

Données sur les 3 échantillons 32 Données partielles 6

Génotypes de référence

Numéro

d'échantillonEGFR KRAS BRAF NRAS PIK3CA

Echantillon éducatif

"POUMON 2018"

c.2582T>A

p.(Leu861Gln)

VAF: 5%

WT

c.1799T>A

p.(Val600Glu)

VAF: 65%

WT

c.3140A>G

p.(His1047Arg)

VAF: 50%

Echantillon éducatif

"MELANOME 2018"WT

c.38G>A

p.(Gly13Asp)

VAF:50%

c.1798_1799delinsAA

p.(Val600Lys)

VAF: 5%

WTc.3140A>G

p.(His1047Arg)

VAF:50%

Echantillon éducatif

"CÔLON 2018"

c.2155G>A p.(Gly719Ser)

VAF: 30%

c.35G>T

p.(Gly12VAl)

VAF: 5%WT WT WT

Qualité par échantillon

Score de qualité global

Conclusion et perspective

Bilan de la session 2018

• Bonne contributivité des échantillons (sauf 1 échantillon BRCA2 muté)

• Confirmation d’un risque de faux négatif sur la limite de détection des technique (5% de VAF)

• Confirmation de la faible capacité de détection des grands réarrangements

Gen&tiss 2019

• Maintien des programmes : ADNct, NGS analyses, interprétation

• EEQ ctDNA – 5 échantillons de plasma EGFR + éducatifs BRAF/NRAS/KRAS

• Simplification du programme tissu : • EEQ tissu NGS – ouvert sur les 3 types de cancers (mélanome, poumon, côlon) :

• 5-10 échantillons sous forme de lames blanches dont 1 éducatif

• EEQ Ovaire – 5 échantillons sous forme de lames blanches + 1 éducatif

• Maintien du programme par gène • Possibilité de s’inscrire individuellement à 1 seul gène (EGFR, NRAS/KRAS, BRAF)

• 5 échantillons par gène sous forme de copeaux

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