Laboratoire de Botanique II, Cytologie Vegetale, Universite de Nancy I, C. O. 140, F-54037 Nancy CEDE X, France

Dedifferenciation en culture in vitro des cellules a reserves dans l'endosperme de Ginkgo biloba

Dedifferentiation of the Storage-Cells of the Gin.kgo biloba Endosperm Cultured in vitro

RENE ROHR

Avec 15 figures

Res;u Ie 30 juin 1979 . Accepte Ie 15 aoCtt 1979

Summary

The lipid-, proteolipid- and starch-containing cells as well as the Ginkgo megagameto­phyte center cells can proliferate in vitro under appropriate culture conditions.

The ultrastructure of the different types of storage-cells studied before and during culture shows that all of these cells are able to dedifferentiate. Most cell organelles manifest an in­tense activity and an important increase of their number can be observed.

Key words: tissue culture, gametophytic storage-cells, Ginkgo.

Introduction

Au cours de l'edification du megagametophyte de Ginkgo, il apparah dans l'endo­sperme plusieurs types cellulaires qui different les uns des aut res par la nature des reserves qu'ils accumulent (DEXHEIMER, 1975; FAVRE-DuCHARTRE, 1956).

Nous avons pu montrer dans une prckedente etude en microscopie photonique (RoHR, 1977) que les cellules du sommet pro thalli en ainsi que les cellules marginales du prothalle, etaient capables de se multiplier lorsqu'on cultivait Ie prothalle in vitro sur un milieu artificiel. Au moment de la mise en culture, les unes presentent des caracteres meristematiques, tandis que les autres renferment d'importantes reserves lipidiques; toutefois, ces dernieres, plus petites et plus riches en organites cytoplas­miques, se distinguent facilement des types cellulaires plus internes, tres specialises

Abbreviations: A: starch; CD: degenerated cell; D: dictyosome; GL: lipidic globule; M: mitochondrion; N: nucleus; Nu: nucleolus; P: cell wall; PI: plastid; RE: endoplasmic reticulum; V: vacuole.

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et qui ne different entre eux que par la nature et I'abondance des reserves stockees (DEXHEIMER, 1973 a).

II n'a jamais ete possible d'oberver jusqu'a ce jour, une evolution particuliere des cellules internes a reserves proteolipidiques ou amylacees lorsque Ie megagametophyte est mis en culture.

Dans la presente etude, nous nous proposons de montrer qu'il est possible d'obtenir la dedifferenciation de ces tissus internes dans des conditions culturales appropriees. Nous nous proposons egalement de comparer, au niveau ultrastructural, Ie com­portement en culture de ces divers types de cellules a reserves.

Materiel et methodes

Les ovules ont ete recoltes Ie 15 aout et Ie 15 septembre sur Ie Ginkgo biloba femelle du Jardin Botanique de MONTPELLIER. Le prothalle femelle, qui a atteint sa taille definitive a cette epoque est faiblement chlorophyllien sauf dans la region micropylaire qui apparah . , Intensement verte.

Les conditions de culture

Seuls les prothalles de la seconde recolte ont ete mis en culture. Les prothalles mlS a nu aseptiquement sont sectionnes transversalement en deux parties d'egale importance. Les deux moities sont cultivees en bohes de Petri «(j) 5 et 9 cm) scellees par du Parafilm. Les emantil­Ions sont enfonces de 5 mm environ dans Ie milieu gelose (ROHR, 1977) et orientes de fa~on a ce qu'une partie des tissus internes mis a jour par la section en deux parties du game to­phyte, puisse etre a la fois aeree et en contact avec Ie milieu de culture. Les cultures sont realisees a une temperature voisine de 25 DC sous un eclairement de 4000 Lux pen­dant 16 h/j.

Le prelevement du materiel pour l'etude ultrastructurale des tissus, a ete effectue un mois a un mois et demi aprcs la mise en culture, a un moment ou les tissus a reserves lipidiques, proteolipidiques et amylacees, mont rent des signes macroscopiques d'evolution.

Microscopie electronique

Le materiel a ete fixe, contraste, inclus et prepare pour l'observation au microscope eIectronique dans les conditions dec rites precedemment (ROHR, 1978).

Fig. 1: Basal end of a Ginkgo megagametophyte taken out of the medium after 45 days. The surface is smooth and yellow-green; the outer tissues of the section were dead when immersed in the medium (arrow head). A continuous row of outgrowths can be observed everywhere this section is in contact both with medium and air (arrows). Fig. 2: Semi-thin section of a megagametophyte in the prot eo-lipidic zone. Before being put in culture the proteo-lipidic cells show important lipidic reserves located in droplets arranged in a row along the cell walls. The vacuoles contain proteic inclusions showing various degrees of condensation (arrows).

Fig. 3: Marginal cell of the gametophyte; the cytoplasm contains numerous electron opaque lipidic globuli.

Fig. 4: Part of a marginal cell (top) and a underlying prothallian cell (bottom); in the last one, the lipidic droplets are smaller and the vacuolar apparatus contains proteic bodies.

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Resultats

Les moities de prothalles couches et a demi enfonces dans Ie milieu gelose montrent apres un mois et demi de culture une evolution remarquable des tissus internes: on observe une bande continue d'excroissances tissulaires vertes, qui traverse toute la partie sectionnee du prothalle au niveau de sa <digne de flottaison» sur Ie milieu de culture (fig. 1, neches). Ce deveioppement ne s'observe ni sur la moitie emergee

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de cette surface plane, ni sur l'autre moitie enfoncee dans Ie milieu, qui montre m&me des signes de degenerescence (fig. 1, pointe de fleche).

Nous envisagerons successivement l'evolution ultrastructurale des tissus super­ficiels, qui produisent en culture les excroissances marginales (ROHR, 1977), puis celle des tissus a reserves des regions plus profondes, mises au contact de l'atmosphere pendant la culture.

Nous n'avons pas note de changements ultrastructuraux import ants dans les tissus a reserves des prothalles preleves Ie 15 aoCtt et ceux fixes Ie 15 septembre; les attitudes fonctionnelles des organites cellulaires y sont com parables. Seule, l'importance de l'accumulation des reserves, qu'elles soient lipidiques ou amylacees, montre des varia­tions. Pour cette raison, nous avons choisi pour illustrer l'ultrastructure des tissus a reserves, les megagametophytes du 1er prelevement (fig. 3, 4 et 9 a 12), chez lesquels il est encore possible d'observer les organites cellulaires presents parmi les reserves en voie d'accumulation. La figure 2 montre en microscopie photonique une section semi-fine de la region profonde de la zone a proteolipides fixee Ie 15 sep­tembre; les gouttelettes lipidiques forment un chapelet continu Ie long des parois tan dis que Ie cytoplasme est rempli de corps proteiques et d'enormes grains d'amidon. Ce materiel qui s'impregne mal par les resines d'inclusion se pr&te tres mal a l'etude ul trastructurale.

1. Les tissus superficiels a reserves lipidiques

Cette region tres mince est constituee d'environ 3 a 4 epaisseurs de cellules. L'assise la plus externe (fig. 3) se distingue assez nettement des suivantes par la

petite taille de ses celluies et leur ultrastructure. Ses celluies sont isodiametriques, leur taille moyenne est de 40 Jlm. Le noyau occupe une position centrale dans la cellule; la chromatine, de structure granulaire est homogene. Le cytoplasme est envahi de gouttelettes lipidiques opaques d'inegale importance; Ie diametre des plus grosses depasse 5 f.1m. L'appareil vacuolaire de ces cellules est peu important; les vacuoles, tres transparentes aux electrons, contiennent peu d'inclusions figurees (fig. 3, fleches). Les plastes, de forme arrondie, ont un diametre de 3 f.1m; Ie stroma, de densite moyenne, est parcouru par quelques thylacoldes espaces entre lesquels on rencontre parfois un petit grain d'amidon ainsi que quelques plastoglobules (fig. 3, pointe de fleche). Les mitochondries sont globuleuses et de petite taille, la densite du stroma mitochondrial est comparable a celIe de celui des plastes.

Dans cette assise de cellules ou nous n'avons pas reI eve la presence de dictyosomes, Ie reticulum endoplasmique est tres peu represente. Le hyaloplasme, d'aspect granu­laire, contient peu de ribosomes libres ou associes en polyribosomes.

Dans les 2 a 3 assises sous-jacentes, formees de cellules de plus grande tailIe, les changements ultrastructuraux affectent essentiellement l'organisation des reserves lipidiques et l'appareil vacuolaire. Les gouttelettes huileuses, qui ont une taille plus homogene de l'ordre de 1 f.1m (fig. 4, bas), tendent a se localiser dans la region peripherique des cellules. L'appareil vacuolaire montre un developpement sensible,

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Fig. 5 to 8: Cells of the green outer outgrowths produced by the marginal tissues of the megagametophyte aftet' one month. The lipidic reserves have completely disappeared. Note the development of the endoplasmic reticulum and the increase in the number of ribosomes (fig. 5); the plastidial stroma is dense (fig. 6), it contains occasionally starch and (or) thylakoids (fig. 7).

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particulierement dans la region centrale de ces cellules. Le contenu des vacuoles est granulaire avec des amas plus denses qui montrent des degres variables de con­

densation. Autour des vacuoles et entre les globules lipidiques, on note encore la presence de

rares organites cytoplasmiques qui montrent les m&mes caracteres que dans les cellules de l'assise externe du gametophyte.

Les parois de toute la zone a reserves lipidiques sont tres fines (Fig. 2, 3 et 4); seule la paroi externe des cellules margin ales du prothalle a une epaisseur plus im­portante.

Apres un mois de culture, ces assises prothalliennes peripheriques ont done produit, nous I'avons montre precedemment, de nombreuses excroissances tissulaires chloro­phylliennes (ROHR, 1977). Cette proliferation cellulaire s'accompagne de reman ie­ments considerables dans I'ultrastructure des cellules. Ce qui frappe a premiere vue, c'est la disparition quasi-totale des reserves accumulees en ete; les globules lipidiques ont totalement disparu, ils ne peuvent plus &tre deceles que dans des cellules de­generees qui n'ont pas supporte les conditions de culture (fig. 8, bas); Ie contenu des vacuoles a egalement perdu de sa densite aux electrons (fig. 5, 6), il n'est plus represente que par un fin precipite disperse dans tout Ie volume vacuolaire (fig. 8).

Un examen plus approfondi revele dans ces cellules des changements ultrastructur­aux tres importants affectant presque tous les organites cellulaires et les parois, qui ont Ie plus sou vent une epaisseur plus importante (fig. 5, 7).

Les plastes ont un stroma tres dense (fig. 6); ils contiennent parfois un grain d'amidon dont la longueur est comprise entre 1 et 5 ,urn (fig. 5, 7 et 8); leur structure granaire est bien developpee, elle est constituee par des empilements serres d'une douzaine de thylacoldes. Le stroma plastidial contient en outre quelques plasto­globules et des espaces c1airs mal deli mites (fig. 7, neches).

Certains organites cellulaires non observes ou mal representes dans les cellules a lipides au moment de la mise en culture des megagametophytes deviennent des con­stituants cellulaires tres abondants apres un mois de culture: c'est Ie cas des dic­tyosomes, des ribosomes et dans une moindre mesure, du reticulum endoplasmique.

- Les dictyosomes sont frequemment groupes a plusieurs dans un m&me secteur cellulaire (fig. 5); ils sont formes par I'empilement de 4 a 6 saccules et secretent des vesicules de petite taille contenant une substance dense (fig. 5, petites neches).

- Le reticulum endoplasmique est sous forme d'elements courts tres abondamment garnis de ribosomes. Ces derniers, tres nombreux, existent egalement dans Ie hyalo­plasme, associes en polyribosomes (fig. 5).

Fig. 9: Cells with proteo-lipidic reserves. The lipidic droplets are aligned along the cell walls. The proteic reserves show various degrees of condensation in the vacuoles; the plastids contain large starch grains.

Fig. 10, 11 and 12: Cells with amylaceous reserves. Note the transparency of the hyalo­plasm due to the rarety of the cell organelles.

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Seules les mitochondries ne montrent pas de changements importants; tout au plus peut-on noter une sensible augmentation de leur nombre (fig. 8).

2. Les tissus profonds d reserves proteolipidiques et les tissus internes d reserves amylacees

Dans la zone a proteolipides, les reserves lipidiques forment une couche presque continue Ie long des parois cellulaires. Les gouttelettes lipidiques dispersees dans Ie volume cellulaire sont peu nombreuses (fig. 9).

Les reserves proteiques sont localisees dans les vacuoles ou elles s'agglutinent en am as d'aspect fenestre ou reticule (fig. 9).

Les plastes sont des amyloplastes qui renferment un a deux tres gros grains d'amidon (3 a 8 .urn).

La pauvrete en organites cytoplasmiques que nous avions no tee dans les cellules des tissus externes du prothalle s'accentue au fur et a mesure que l'on s'enfonce dans l'endosperme puisque Ie cytoplasme des cellules profondes ne montre plus que quelques rares mitochondries spheriques (fig. 9, fleches) et peu de reticulum endo­plasmique.

eet appauvrissement atteint son maXlmum dans les tissus internes a reserves amylacees (fig. 10 a 12):

- il n'y a plus aucune trace de lipides;

- les vacuoles ont un contenu transparent; certaines d'entre elles conservent toutefois un amas osmiophile de forme quelconque qui occupe un faible volume (fig. 10, 12, neches);

- I'amidon represente la masse principale de ce tissu: il y est contenu sous forme de grains enormes (8 .urn) dans des amyloplastes demesures. Le stroma vide, ren­ferme parfois quelques thylacoldes espaces (fig. 11, neche).

Le noyau de ces cellules a un contour irregulier; la chromatine est condensee en amas d'aspect granulaire relies entre eux par un reseau fibrillaire (fig. 11).

Dans Ie hyaloplasme transparent aux electrons, Ie reticulum endoplasmique est representc par des tubules peu nombreux agences preferentiellement a proximite des parois (fig. 10, 12). Les mitochondries ont des profils circulaires; dans leur stroma clair, on observe quelques fibrilles (fig. 12).

Fig. 13 to 15: Evolution after one month (fig. 13) and one and one half months (fig. 14 and 15) of culture of the internal amylacccus cells. Note the disappearance of the starch grains in the plastids (fig. 13 to 15). The hyaloplasm contains numerous polyribosomes (fig. 15, arrow heads). Some of them arc associated with the endoplasmic reticulum (fig. 15, arrows). After 45 days the mitochondria are more numerous, the mitochondrial stroma contains a granular electron dense substance (fig. 15).

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Apres un mois de culture, les ceHules des tlssus a reserves amylacees montrent certains signes d'evolution comparables a ceux qui ont pu etre observes avec les tissus marginaux en culture:

- Les parois cellulaires sont epaissies (fig. 13) et Ie cytoplasme s'enrichit en organites: les mitochondries apparaisscnt plus nombreuses, avec des profils arrondis ou allonges en batonnets (fig. 13).

- De meme, les reserves amylacees sont en regression, comme l'etaient les reserves lipidiques et proteolipidiques dans les autres types cellulaires; ce caractere s'accentue avec Ie temps, puisque dans des cultures de 45 jaurs (fig. 14, 15), les grains d'amidon diminuent de taille et finissent meme dans certains plastes par etre presque totalement lyses (fig. 15). Les plastes liberes de leur amidon commencent alors a edifier un appareil photosynthetique represente d'abord par des empilements de thylacoi'des (fig. 15).

L'activite cytoplasmique s'accentue dans ces ccllules:

- Les dictyosomes peuvent etre observes sur toutes les sections; ils sont formes de 5 a 6 saccules et secretent peu de vesicules.

- Les mitochondries sont riches en cretes et leur stroma s'est charge d'une sub­stance d'aspect granulaire tres dense aux electrons (fig. 14, 15).

- Le reticulum endoplasmique esc constitue de travees peu allongees bordees parfois de ribosomes (fig. 15, fleches). Ceux-ci sont tres nombreux dans Ie hyalo­plasme ou on les trouve souvent ::tssoeies en polyribosomes (fig. 15, pointes de neches).

Discussion et conclusion

La ligne d'excroissances tissulaires que revele I'examen macroscopique de la tranche des gametophytes femelles de Ginkgo apres 45 j. de culture est continue et passe par Ie centre du prothaHe; ceei montre que tous les tissus a reserves sont susceptibles de se multiplier loursque les conditions de culture Ie permettent: tissus marginaux a reserves lipidiques, proteolipidiques, tissus internes a amidon; cela est egalement vrai pour les tissus du centre du prothalle qui presente, selon DEXHEIMER (1973 a) un etat immature. Cependant, les conditions cxterieures jouent un r61e determinant dans I'evolution des tissus mis a jour par la section: en eHer, les tis sus de la moitie superieure, laissee au contact de l'air, ne proliferent pas, mais ils ne montrent pas non plus, de signes de degenerescence, comme c'est Ie cas des tissus immerges dans Ie milieu gelose ou regnent des conditions asphyxiques. Finalement, les seuls tissus qui proliferent sont ceux situes juste it la surface du milieu de culture. Deux facteurs complementaires paraissent etre a I'origine de ce developpement: d'un part la proximite du milieu de culture qui met it la disposition des cellules de ces tissus les aliments necessaires it leur multiplic::ttion et d'autre part I'aeration de ces tissus qui permet aux cellules d'avoir une bonne activite respiratoire.

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Cette etude et la precedente (ROHR, 1977) montrent qu'il est donc possible de provoquer en culture la proliferation de l'ensemble des tissus, pourtant tres specialises (DEXHEIMER, 1973 aj DEXHEIMER, 1973 b), du gametophyte femelle de Ginkgo bilobaj toutefois, les tis sus du sommet prothallien et les tissus marginaux a reserves lipidi­ques proliferent beaucoup plus facilement que les tissus internes pour lesquels des conditions culturales plus strictcs doivent etre reunies pour aboutir a un develop­pement appreciable. L'etat de differenciation trcs different de ces divers types cellula ires pourrait expliquer cette difference dans leur comportement.

En effet, on sait que les cellules du sommet prothallien ont des caracteres meri­stematiques (FAVRE-DuCHARTRE, 1956) et par consequent, il n'est pas etonnant qu'en culture, elles soient les premieres a montrer des signes d'evolution.

Bien que les trois types cellulaires a reserves different enormement entre eux par la nature et l'abondance de reserves accumulees et dans une moindre mesure par leur taille ct l'importance de leur appareil vacuolaire, on constate cependant une similitude, deja signalee par DEXHEIMER (1973 a) dans leur ultrastructure. Les organites cellulaires ont en effet les memes attitudes fonctionnelles dans les trois cas. Toutefois, la taille plus petite des cellules marginales a lipides, leur faible vacuolisation et leur richesse plus grande en organites cytoplasmiques semblent indiquer, contrairement a ce que pcnsait DEXHEIMER (1973 a) que ces cellules sont moins differenciees que celles des tissus plus internes a reserves proteolipidiques et amylacees. Ceci pourrait expliquer pourquoi les tissus marginaux evoluent en culture dans les memes conditions que les tissus indifferencies du sommet prothallien.

Dans ce travail, nous avons montre qu'en adaptant les techniques culturales a notre materiel, il eta it possible d'obtenir en culture la dedifferenciation de cellules aussi specialisees que les cellules a amidon du megagametophyte. Pour Ie prothalle de Ginkgo, la synthese d'amidon par les cellules internes ne constitue donc pas un obstacle insurmontable a leur proliferation comme c'est Ie cas pour les microspores au cours du processus d'androgenese (NITSCH et NITSCH, 1969).

La dedifferenciation se manifeste dans tous les types cellulaires par la disparition des reserves et la proliferation des organites. On observe ainsi Ie passage, surtout pour les cellules a amidon, d'elements sans avenir, veritables sacs a reserves, a des cellules actives. Les potentialites apparemment perdues de ces cellules ne sont en realite que masquees puis que des conditions culturales appropriees nous ont perm is de les reveler.

Bibliographie

DEXHEIMER, J.: Etude ultrastructurale du gametophyte femelle de Ginkgo biloba. I. Les cellules a reserves. Caryologia suppl. vol. 25, 85-96 (1973 a).

- Etude ultrastructurale du gametophyte femelle de Ginkgo biloba. II. Les cellules du sommet prothallien. Rev. Cytol. et BioI. veg. 36, 269-290 (1973 b).

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