Pathologie Biologie 61 (2013) 59–63

Article original

Diagnostic moleculaire de la maladie de Gaucher en Tunisie

Molecular diagnosis of Gaucher disease in Tunisia

W. Cherif a,*,b, H. Ben Turkia b, F. Ben Rhouma a,c, I. Riahi b, J. Chemli d, O. Amaral e,M.C. Sa Miranda e, C. Caillaud f, N. Kaabachi g, N. Tebib b, S. Abdelhak a, M.F. Ben Dridi b

a Unite de recherche « exploration moleculaire des maladies orphelines d’origine genetique », institut Pasteur de Tunis, BP 74, 13, place Pasteur, Belvedere, 1002 Tunis, Tunisieb Unite de recherche « depistage et prise en charge des maladies hereditaires du metabolisme », service de pediatrie, hopital La Rabta, 1007 Tunis, Tunisiec Unite de recherche « maladies neurologiques de l’enfant », faculte de medecine, 1007 Tunis, Tunisied Service de pediatrie, hopital Sahloul, 4011 Sousse, Tunisiee Departement de neurobiologie genetique, universite de Porto, institut de biologie moleculaire et cellulaire, 4150-180 Porto, Portugalf Laboratoire de genetique metabolique, faculte de medecine de Cochin, 75014 Paris, Franceg Laboratoire de biochimie, hopital La Rabta, 1007 Tunis, Tunisie

I N F O A R T I C L E

Historique de l’article :

Recu le 20 aout 2010

Accepte le 20 mars 2012

Mots cles :

Maladie de Gaucher

Gene GBA

Diagnostic moleculaire

Population tunisienne

Afrique du Nord

Keywords:

Gaucher disease

GBA gene

Molecular diagnosis

Tunisian population

North Africa

R E S U M E

La maladie de Gaucher est une maladie de surcharge lysosomale due a un deficit de l’enzyme b-

glucosidase. Afin d’etudier le spectre mutationnel de cette affection en Tunisie, nous avons recherche les

mutations recurrentes chez 30 patients. Le depistage des mutations recurrentes par PCR/RFLP et

sequencage direct a revele que la mutation N370S est la plus frequente (44 %, 22/50 alleles mutes), suivie

par la mutation L444P qui presente une frequence de l’ordre de 16 % (8/50 alleles mutes). L’allele

recombinant (RecNciI) a ete retrouve chez 14 % des cas etudies. Les mutations non identifiees dans cette

etude representent 26 %. En outre, nos resultats ont montre que le genotype N370S/RecNciI est le plus

frequent dans les formes a revelation pediatrique et il est associe a une atteinte viscerale severe. La

recherche de ces mutations en priorite fournit un outil de diagnostic moleculaire pour la majorite des

patients, elle permet ainsi un depistage des heterozygotes indispensable pour le conseil genetique.

� 2012 Elsevier Masson SAS. Tous droits reserves.

A B S T R A C T

Gaucher disease is a lysosomal storage disorder caused by a deficiency of the enzyme acid b-glucosidase.

In order to determine the mutation spectrum in Tunisia, we performed recurrent mutation screening in

30 Tunisian patients with Gaucher disease. Screening of recurrent mutation by PCR/RFLP and direct

sequencing had shown that N370S was the most frequent mutation (22/50 mutant alleles, 44%), followed

by L444P mutation, which is found in 16% (8/50 mutant alleles). The recombinant allele (RecNciI)

represented 14%. Our findings revealed that the genotype N370S/RecNciI was mosst frequent in patients

with childhood onset and it was associated with severe visceral involvement. The screening of these

three mutations provided a simple tool for molecular diagnosis of Gaucher disease in Tunisian patients

and allowed also genetic counselling for their family members.

� 2012 Elsevier Masson SAS. All rights reserved.

Disponible en ligne sur

www.sciencedirect.com

1. Introduction

La maladie de Gaucher (OMIM 230800, 230900 et 231000) a etedecrite pour la premiere fois en 1882 par Philippe Gaucher dans sathese de medecine intitulee « Epithelioma primitif de la rate,hypertrophie idiopathique de la rate sans leucemie » [1]. Cettemaladie, consequence d’une erreur innee du metabolisme des

* Auteur correspondant.

Adresse e-mail : cherif_w@yahoo.fr (W. Cherif).

0369-8114/$ – see front matter � 2012 Elsevier Masson SAS. Tous droits reserves.

doi:10.1016/j.patbio.2012.03.006

sphingolipides, est la maladie de surcharge lysosomale la plusfrequente avec une prevalence estimee a 1/50 000 a 1/100 000 maisdont la prevalence atteint 1/1000 a 1/1200 dans la population juiveashkenaze [2,3]. Elle est due a un deficit en b-glucocerebrosidase(ou exceptionnellement de son activateur saposine C) qui catalysela premiere etape de la transformation du glucocerebroside englucose et ceramide. Le deficit enzymatique entraıne l’accumula-tion du substrat dans les lysosomes des cellules du systemereticulo-endothelial [4]. Le diagnostic est oriente par la mise enevidence des cellules de Gaucher sur les prelevements tissulaires(moelle osseuse, foie, rate). Les cellules de Gaucher prennent une

W. Cherif et al. / Pathologie Biologie 61 (2013) 59–6360

morphologie typique et s’accumulent dans le foie, la rate, la moelleosseuse et l’espace de Virchow Robin du cerveau, aboutissant auxprincipaux signes cliniques de la maladie : l’hepatomegalie, lasplenomegalie et les complications osseuses [5].

La maladie de Gaucher presente une importante variabiliteclinique, trois phenotypes majeurs sont classiquement distinguessur la base de la presence ou non et la severite de l’atteinteprimitive du systeme nerveux central. Le type 1 est la forme la plusfrequente, son evolution est chronique, sans atteinte neurologique.Le type 2 correspond a la forme infantile, avec une atteinteneurologique d’evolution aigue et le type 3, ou la forme juvenile,debute comme une maladie purement viscerale superposable autype 1 et se complete dans l’enfance ou l’adolescence par unedeterioration neurologique d’evolution subaigue [6].

La maladie de Gaucher est transmise sur le mode autosomiquerecessif, son heterogeneite clinique est due en partie a desmutations du gene GBA qui code pour la b-glucocerebrosidase. Cegene est forme de 11 exons et s’etend sur une region de 8,8 kb [7,8].Depuis la decouverte de ce gene, 250 mutations ont ete rapportees(www.hgmd.org), dont la plupart sont des mutations ponctuellesmajoritairement regroupees entre l’exon 8 et 11. Les mutationsrecurrentes ponctuelles N370S, L444P et c.84insG et deux allelescomplexes RecNciI (L444P, A456P et V460 V) et RecTL (D409H,L444P, A456P et V460 V) sont les plus frequentes. Leur frequence etleur distribution sont variables selon les populations etudiees.

En aval du gene GBA, se trouve son pseudogene pGBA de taille5kb. Il presente 96 % d’homologie de sequence avec le gene

Tableau 1Description clinique et profil mutationnel des patients.

Famille Consanguinite Code Sexe Age de

debut

Age au

moment

de l’etude

Organome

F1 1er degre GBA1 F 9 mois 6 ans Severe

F2 3e degre GBA2 M 2 ans 10 ans Modere

F3 1er degre GBA3 M 14 mois 2 ans Severe

F4 Non GBA4 M 3 ans 19 ans Severe

GBA5 F 8 ans 11 ans Modere

F5 Non GBA6 M 3 ans 15 ans Severe

F6 1er degre GBA7 F 2 ans 7 ans Severe

F7 1er degre GBA8 M 3 ans 8 ans Severe

F8 1er degre GBA9 F 10 mois 5 ans Severe

F9 Non GBA10 M 5 ans 11 ans Modere

F10 Non GBA11 M 5 ans 6 ans Severe

F11 1er degre GBA12 M 7 ans 13 ans Modere

GBA13 M 6 ans 6 ans Hepatome

moderee s

splenomeg

GBA14 M 2 ans 2 ans Hepatome

moderee s

splenomeg

F12 Non GBA15 M NP 16 ans Splenomeg

severe

F13 NP GBA16 F NP 6 mois Severe + at

neurologiq

F14 1er degre GBA17 M 1 an 4 mois 2 ans 3 mois Severe

F15 Lointaine GBA18 F 3 ans 11 ans Modere

F16 Non GBA19 F 28 ans 29 ans Modere

F17 Non GBA20 M 17 ans 19 ans Severe

F18 1er degre GBA21 M 10 ans 24 ans Severe

F19 Non GBA22 M 46 ans 46 ans Severe

F7 1er degre GBA23 F 4 ans 19 ans Severe

F20 1er degre GBA24 F 18 mois 28 ans Severe

F21 2e degre GBA25 F 40 ans 43 ans Severe

F22 Non GBA26 F 12 ans 53 ans Modere

GBA27 M 56 ans 57 ans Severe

F23 1er degre GBA28 M 19 ans 19 ans Modere

F24 Non GBA29 M A la

naissance

A la

naissance

Severe

F25 Non GBA30 F 12 ans 28 ans Modere

fonctionnel. Certaines mutations decrites dans la maladie deGaucher, notamment l’allele complexe RecNciI, resultent derearrangements chromosomiques complexes qui impliquent legene et son pseudogene [8].

La correlation phenotype-genotype, bien qu’imparfaite, a eteretrouvee avec certaines mutations : l’homozygotie pour lamutation L444P est correlee aux formes neurologiques (type2 et 3), alors que la mutation N370S est toujours associee a la formeviscerale (type 1) [9]. L’homoallelisme pour la mutation D409H aete, quant a lui, associe a une atteinte cardiaque, caracterisee parune calcification des valves cardiaques chez des jeunes patients[10].

L’objectif de la presente etude est la caracterisationmoleculaire de la maladie de Gaucher dans la populationtunisienne. Dans un premier temps, nous avons cible desmutations recurrentes deja identifiees dans d’autres populationsmediterraneennes.

2. Patients, materiel et methodes

Trente patients atteints de la maladie de Gaucher appartenant a 25 familles non

apparentees et originaires de differentes regions de la Tunisie ont ete explores

(Tableau 1). Le diagnostic de maladie de Gaucher a ete evoque devant un tableau

clinique caracterise essentiellement par une hepato-splenomegalie, des anomalies

hematologiques et des lesions osseuses.

Le diagnostic clinique a ete confirme chez tous les cas etudies par le dosage de

l’activite de l’enzyme b-glucocerebrosidase sur leucocytes en utilisant un substrat

synthetique fluviometrique 4-methylumbelliferyl-b-d-glucopyranoside [11].

galie Atteinte

hematologique

Lesions

osseuses

Atteinte

Neurologique

Type Genotype

Severe Severe Non Type I ? L444P/L444P

Non Non Non Type I N370S/RecNciI

Severe Non Non Type I ? L444P/L444P

Modere Non Non Type I N370S/RecNciI

Modere Non Non Type I N370S/RecNciI

Severe Modere Non Type I N370S/RecNciI

Severe Modere Non Type I ?/?

Severe Modere Non Type I ?/?

Severe Severe Non Type I N370S/ ?

Non Severe Non Type I N370S/RecNciI

Modere Non Non Type I N370S/RecNciI

Non Non Non Type I N370S/N370S

galie

ans

alie

Non Non Non Type I N370S/N370S

galie

ans

alie

Non Non Non Type I N370S/N370S

alie NP NP Non Type I ?/?

teint

ue

NP NP Oui Type II RecNciI/ ?

Severe Non Strabisme

+ cyphose

Type III A L444P/L444P

Severe Non Non Type I ?/?

Modere Oui Non Type I N370S/N370S

Severe Non Non Type I N370S/RecNciI

Severe Non Non Type I N370S/N370S

Severe Non Non Type I N370S/L444P

Severe Oui Non Type I ?/?

Severe Oui Non Type I ?/?

Modere Oui Non Type I N370S/N370S

Modere Oui Non Type I N370S/L444P

Severe Non Non Type I N370S/L444P

Modere Non Non Type I N370S/N370S

Severe Non Non Type I N370S/ ?

Modere Oui Non Type I N370S/N370S

Fig. 1. Localisation des amorces choisies pour l’amplification specifique des exons 9 et 10. Les fleches indiquent les amorces et le triangle mentionne la region deletee de 55 pb.

W. Cherif et al. / Pathologie Biologie 61 (2013) 59–63 61

Apres l’obtention du consentement eclaire des familles, 5 ml de sang ont ete

preleve sur anticoagulant (EDTA 15 %) pour chaque patient et ses parents. L’ADN

genomique a ete extrait a partir du sang total selon la procedure standard

d’extraction au phenol/chloroforme [12].

Les exons 9 et 10 ont ete amplifies par la reaction de polymerisation en chaıne

(PCR). Le choix des amorces a ete fortement influence par la presence du

pseudogene psGBA qui est localise a proximite du gene fonctionnel GBA (16 kb en

aval du gene) et de sa haute homologie avec ce dernier (96 % d’homologie exonique).

En effet, la region entre l’intron 8 et l’exon 10 represente 98 % d’homologie entre

GBA et psGBA. Grace aux outils de bioinformatique, nous avons pu verifier

l’amplification specifique des regions visees. Pour l’exon 9, l’amorce sens (Ex9F)

s’hybride sur le gene et le pseudogene, toutefois l’amplification est rendue

specifique par le choix de l’amorce anti-sens (Ex9R), celle-ci s’hybride uniquement

sur le gene GBA car elle est situee dans la portion deletee de 55 pb au niveau du

pseudogene. Il en est de meme pour l’exon 10, l’amorce sens (Ex10F) ne s’hybride

que sur le gene GBA puisqu’elle est une partie de la portion deletee du pseudogene ;

l’amorce anti-sens s’hybride quant a elle sur une sequence de l’exon 10 homologue

dans GBA et psGBA (Fig. 1) [13,14].

Les fragments amplifies ont ete purifies par le kit QIAquick (QIAGEN) selon les

instructions du fournisseur, et sequences avec le Kit Big Dye Terminator sur un

sequenceur ABI Prism 377 ou ABI 3130 (Applied Biosystems), en utilisant

successivement les amorces sens et anti-sens.

Pour depister la mutation N370S, une partie du site de reconnaissance de

l’enzyme XhoI est introduite par PCR en utilisant une amorce modifiee comme

decrite par Beutler et al. [15]. Le produit issu de l’amplification de l’exon 9 du gene

GBA, de taille 105 pb, est digere par l’enzyme de restriction XhoI, cette enzyme

reconnaıt le motif CTCGAG/GAGCTC et va couper seulement la sequence mutee en

donnant deux fragments 89 pb et 16 pb, un individu homozygote pour la mutation

donnera deux bandes visibles sur un gel de polyacrylamide, un individu

heterozygote va se presenter avec trois bandes de taille 105 pb, 89 pb et 16 pb

(Fig. 2).

La presence de la mutation L444P et/ou l’allele complexe RecNciI (L444P, A456P

et V460 V) est depistee par la digestion du produit de l’amplification de l’exon

10 par l’enzyme NciI [14] qui reconnaıt le motif CCSGG/GGSCC et elle coupe le

fragment d’ADN en presence de la mutation L444P (Fig. 3).

Fig. 2. Profil electrophoretique de la digestion enzymatique de l’exon 9 du gene GBA

par l’enzyme XhoI sur gel d’acrylamide a 12 %. Resultats de la digestion enzymatique

par XhoI des produits d’amplification de l’ADN genomique des patients atteints de la

maladie de Gaucher, en utilisant l’amorce modifiee, et teste sur un gel de

polyacrylamide a 12 %. Les pistes 3, 4 et 5 presentent deux bandes : 105 pb et 89 pb

demontrant l’heterozygotie des patients pour la mutation N370S. La bande

correspondant a la taille 16 pb ne figure pas sur ce gel. Pour la sequence normale,

elle reste intacte (piste 1 : individu normal, piste 2 : patient non porteur de la

mutation N370S, piste 6 : produit non digere). M : marqueur FX174 digere par

HaeIII.

La distinction entre les deux alleles L444P et RecNciI, se fait par sequencage direct

du produit de PCR.

Une digestion a ete alors realisee pour les produits de PCR obtenus pour chaque

exon. Les enzymes de restriction NciI et XhoI ont ete utilisees en vue de detecter les

deux mutations L444P et N370S, respectivement. Selon la taille des fragments de

digestion obtenus, on deduit l’etat d’heterozygotie, d’homozygotie ou normal des

individus etudies pour les mutations correspondantes.

Les resultats obtenus par PCR/RFLP sont confirmes par sequencage direct des exons

9 et 10 du gene GBA en utilisant les amorces Ex9R et Ex10R. Pour les patients qui ont

presente un profil normal avec l’une des deux PCR/RFLP realisees, un sequencage du

fragment de taille 637 pb en utilisant les amorces Ex10F et Ex10R a ete effectue. Le

fragment sequence est constitue d’une partie de l’exon 9, de l’intron 9 et de l’exon 10,

le sequencage de la totalite de l’exon 9 est assure par l’utilisation de l’amorce Ex9R.

3. Resultats

Notre etude du spectre mutationnel de la maladie de Gaucheren Tunisie a porte, au total, sur 30 sujets atteints (18 enfants et12 adultes) issus de 25 familles non apparentees, la consanguinitea ete retrouvee chez 56 % des familles etudiees (14/25), ou elle etaitgeneralement du premier degre.

A l’exception de deux enfants en bas age, aucun patient nepresentait de signe neurologique au moment de l’etude.

L’analyse genotypique a montre que parmi les 30 patientsexplores, huit patients sont homozygotes N370S (trois enfants dela meme famille et cinq adultes), trois enfants sont homozygotes

Fig. 3. Profil electrophoretique de la digestion enzymatique de l’exon 10 du gene

GBA par l’enzyme NciI sur gel d’agarose a 2 %. Resultats de la digestion enzymatique

par NciI des produits d’amplification de l’ADN genomique des patients atteints de la

maladie de Gaucher, teste sur un gel d’agarose a 2 %. La piste 2 presente deux

bandes : 536 pb et 102 pb demontrant l’homozygotie du patient pour la mutation

L444P (confirme par sequencage). Les pistes 4, 5 et 6 presentent trois bandes :

638 pb, 536 pb et 102 pb, demontrant l’heterozygotie des patients pour la mutation

RecNciI (confirme par sequencage). Pour la sequence normale, elle reste intacte

(piste 1 : individu normal, piste 3 : patient non porteur de la mutation L444P ou

RecNciI). M : marqueur FX174 digere par HaeIII.

24%

12%

24%

8% 8%

4%

20%

N370

S/N

370S

L444

P/L

444P

N370

S/R

ecNciI

N370

S/L

444P

N370

S/?

RecN

ciI/? ?/

?

Fig. 4. Distribution des genotypes chez les familles etudiees.

W. Cherif et al. / Pathologie Biologie 61 (2013) 59–6362

L444P (ages de moins de 6 ans), sept patients sont heterozygotescomposites N370S/RecNciI (six enfants et un adulte) et troispatients sont N370S/L444P (trois adultes).

Les resultats obtenus pour deux autres patients ont montre quel’un est heterozygote pour la mutation N370S et l’autre estheterozygote pour l’allele complexe RecNciI ; le deuxieme allele necorrespondait pas aux mutations recurrentes recherchees. Aucunedes mutations recherchees par PCR/RFLP n’a ete retrouvee cheztrois autres patients. De plus, le sequencage direct des exons 9 et10 a revele une sequence normale chez ces cinq patients ; il s’agitprobablement de mutations siegeant dans les autres exons.

L’analyse de la frequence relative determinee sur les patientsnon apparentes a revele que trois mutations (N370S, L444P etRecNciI) representent 74 % des alleles mutes (37/50 alleles mutes).En effet, sur 50 alleles mutes etudies, la mutation N370S estpresente dans 44 % des cas (22/50 alleles mutes), suivie par lamutation L444P avec un taux de l’ordre de 16 % (8/50), l’allelecomplexe (RecNciI) est present dans 14 % des alleles. Les mutationsnon identifiees dans cette etude representent 26 %.

Cette etude moleculaire a demontre que la recherche de cestrois mutations, en priorite, chez les patients atteints de la maladiede Gaucher peut fournir un outil de diagnostic moleculaireindispensable pour le conseil genetique.

Les genotypes N370S/N370S et N370S/RecNciI sont les plusfrequents chez les patients tunisiens, retrouves chez 48 % desfamilles explorees (Fig. 4).

4. Discussion

La prevalence exacte de la maladie de Gaucher est meconnue enTunisie, bien que cette affection ne soit pas exceptionnelle. Uneetude retrospective realisee sur une periode de 18 ans (1983–2001) et qui a collige 27 cas a montre que le type 1 est de loin laforme la plus frequente [16]. Recemment, une etude multi-centrique nationale, conduite en 2009, a recense une serie de86 cas sur une periode de 35 ans ; la prevalence de naissance a eteestimee a 0,92 cas pour 100 000 naissances vivantes [17] soit uneprevalence plus elevee que celle de la Turquie (0,23 cas/100 000 habitants) [18]. Les formes adultes asymptomatiquesrestaient sous-diagnostiquees selon cette etude, ce qui sous-estimait la frequence de la maladie. Un registre national est encours d’elaboration, il permettrait d’evaluer la prevalence etl’incidence exactes de cette maladie.

La mutation N370S semble etre la mutation la plus frequentedans notre pays, elle est presente avec un taux relatif de 44 %, cettevaleur est proche de celle retrouvee en Italie [19].

La mutation N370S, tres frequente dans la populationcaucasienne, est absente chez la population asiatique [20]. Chezles juifs ashkenazes, la frequence de cette mutation est de 75 %,suivie de la mutation c.84insG avec une frequence de 13 % ; lamutation L444P est presente chez 3 % des cas [21]. Dans lapopulation japonaise, la mutation L444P est la mutation la plusfrequente, elle constitue 43,6 % des alleles etudies suivie par lamutation F213I (14,9 %), la mutation N370S n’a pas ete detectee[22]. En Italie, les mutations N370S et L444P et RecNciI

representent respectivement 36 %, 27,4 % et 2,1 % des allelesetudies [19]. Ces proportions sont similaires a celles rencontrees enRoumanie : 50 %, 22,2 % et 5,6 % respectivement [23].

La mutation N370S presente un interet pronostique puisqu’elleest toujours associee aux formes non neurologiques de la maladiede Gaucher. L’homozygotie pour cette mutation est souventcorrelee a une atteinte pauci- voire asymptomatique. Dans notreserie, l’homozygotie N370S etait le genotype le plus frequemmentretrouve chez les cas adultes etudies (5/12) ; il etait associe a uneatteinte viscerale severe chez un seul patient. Cela suggerel’intervention de genes modificateurs en association avec desfacteurs environnementaux dans l’expression du gene GBA.

Par ailleurs, l’homozygotie pour la mutation L444P retrouveechez trois patients (Tableau 1) s’est associee a une atteinteviscerale severe et precoce mais sans atteinte neurologiquejusqu’au deces a l’age de 6 ans chez deux patients (GB1 et GB2).Chez le troisieme patient, l’atteinte neurologique s’est limitee a unstrabisme qui serait post-traumatique et une cyphose. Ce genotypeest habituellement associe au type 3A norbottnien et dans d’autrespopulations a un phenotype severe et une paralysie oculomotricede l’horizontalite (type 3B), cependant en l’absence d’uneevaluation neuro-ophtalmologique specialisee chez les deuxpremiers patients, on ne peut ecarter l’existence d’anomaliesoculomotrices frustes ou l’evolution vers une atteinte neurologi-que si la survie avait ete plus prolongee. L’association del’homoallelisme pour la mutation L444P aux formes neurologiquesest un sujet de debat. Dans la population caucasienne, ce genotypesemble etre lie a la forme neuropathique de type 3 alors qu’il paraıtetre associe au type 1 non neuropathique chez les patientsjaponais. La difference d’expression de ce genotype chez les deuxpopulations pourrait s’expliquer par leurs origines genetiques.Koprivica et al. ont suggere que l’homozygotie pour la mutationL444P est peut-etre associee a un phenotype severe de la maladiede Gaucher de type 1 [9].

Le genotype N370S/RecNciI est le plus frequent parmi lesenfants atteints etudies (5/15 familles) ou il s’est associe a uneforme viscerale severe. Une grande partie des patients sontheterozygotes composites (44 %). Le fait que deux des 11 patientsheterozygotes composites soient issus de mariages consanguinsplaide en faveur de la frequence elevee de ces mutations dans lapopulation generale.

Parmi les patients issus de mariages consanguins, trois neportent pas de mutations connues, ce qui suggere l’apparition denouvelles mutations privees favorisees par la consanguinite. Cephenomene a deja ete observe dans d’autres maladies autosomi-ques recessives etudiees dans notre population comme l’immu-nodeficience congenitale [24], la maladie d’Imerslund [25] et lagranulomatose septique chronique [26].

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