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ISRAËL FORTIN
DOMAINES PROTÉIQUES DU COMPLEXE HISTONE ACÉTYLTRANSFÉRASE NuA4
IMPLIQUÉS DANS LA TRANSCRIPTION ET LE MAINTIEN DE L’INTÉGRITÉ DU GÉNOME
Mémoire présenté à la Faculté des études supérieures de l’Université Laval
dans le cadre du programme de maîtrise en biologie moléculaire et cellulaire pour l’obtention du grade de maître ès sciences (M.Sc.)
DÉPARTEMENT DE BIOLOGIE MOLÉCULAIRE ET CELLULAIRE FACULTÉ DE MÉDECINE
UNIVERSITÉ LAVAL QUÉBEC
DÉCEMBRE 2005 © Israël Fortin, 2005
ii
Résumé Le complexe Histone Acétyltransféranse (HAT) NuA4 s’inscrit comme un élément clef
dans le contrôle de plusieurs fonctions cellulaires essentielles chez les eucaryotes.
L’implication maintenant connu de NuA4 dans la transcription et dans la réponse aux
dommages à l’ADN nous ont poussé à approfondir la caractérisation fonctionnelle des
diverses sous-unités de NuA4, notamment au niveau des rôles que peuvent occuper les
différents domaines protéiques retrouvés au sein de ce complexe. Une première série
d’analyses a démontré l’importance de plusieurs résidus du chromodomaine de Esa1, la
sous-unité catalytique de NuA4. La mutation de ces résidus engendre des défauts majeurs
d’acétylation de la chromatine, suggérant ainsi un rôle du chromodomaine dans l’activité
catalytique de Esa1. Parallèlement, d’autres études ont permis d’approfondir la fonction du
domaine SANT de la protéine Eaf2, du PHD finger de Yng2 et du domaine PI-3 kinase de
Tra1. Ce dernier domaine intéragit avec le complexe MRX, un complexe de levure recruté
directement au site de cassure de l’ADN. Des recherches menées autour de l’étude de
l’activité kinase de cette protéine ont permis de suggérer l’implication de NuA4 dans les
événements précoces survenant suite à un bris double brin, précisant ainsi le rôle de ce
complexe dans la réparation de l’ADN.
iii
Avant-propos
Quel que soit le niveau de scolarité visé, l’accomplissement d’études graduées peut
être comparé à l’aboutissement d’un long et grand voyage. Pour certains, cela représente la
lumière au bout du tunnel, pour d’autres c’est plutôt le début d’une toute nouvelle aventure.
Pour moi, l’obtention d’un diplôme de deuxième cycle est comparable au premier coup
d’œil jeté lors de l’escalade d’une pyramide maya. En effet, c’est un moment privilégié me
permettant de contempler le travail fait ainsi que tout le chemin parcouru jusqu’ici. La
forêt tropicale est des plus imprévisibles et la route menant à la pyramide a été parfois
longue et ardue. Par contre, c’est de là qu’il est aussi possible de voir à quel point cette
jungle était riche en émerveillements et comment chaque détour a permis de faire de moi
une personne meilleure (en lab et dans la vie!). Enfin, ce coup d’œil me permet de me
rappeler que le sommet de la pyramide n’est pas encore atteint et qu’il ne faut pas encore
lancer la serviette!
Évidemment, comme dans toutes bonnes expéditions, l’atteinte de l’objectif final
dépend en grande partie du guide en charge du projet. Merci Jacques pour m’avoir
accueilli au sein de ton équipe ainsi que pour m’avoir permis d’acquérir une solide
formation scientifique. Merci aussi pour m’avoir laisser cette liberté de passer par
l’Allemagne pour achever ce travail! Merci à mes compagnons de tous les jours, la gang
du laboratoire, avec qui j’ai eu énormément de plaisir à travailler et avec qui j’ai beaucoup
appris. J’aimerais remercier également le Dr Song Tan et son équipe, avec qui nous avons
étroitement collaboré lors de la mise au point de la publication se trouvant en annexe. Je
m’en voudrais de ne pas remercier le Centre de recherche de l’Hôtel-Dieu de Québec et le
CRSNG pour l’environnement de travail unique et pour le soutien financier respectivement.
Enfin, un gros merci à mes amis, à ma famille, à mes frères et à ma copine qui ont toujours
été là lorsque j’en avais besoin!
Je cherche quand je veux, je trouve quand je peux -Einstein-
iv
v
Table des matières
Résumé .................................................................................................................................. ii
Avant-propos ........................................................................................................................ iii
Table des matières.................................................................................................................. v
Liste des tableaux.................................................................................................................vii
Liste des figures...................................................................................................................viii
Liste des abréviations............................................................................................................ix
Chapitre 1 Introduction ........................................................................................................1
1.1 Structure et fonction de la chromatine ...............................................................1
1.2 Complexes modifiant la conformation de la chromatine ..................................4 1.2.1 Les complexes de remodelage ATP-dépendants ................................................4 1.2.2 Les complexes modifiant post-traductionnellement la chromatine ....................7 1.2.3 L’incorporation de variants d’histones dans la chromatine ..............................11
1.3 L’histone acétyltransférase NuA4 .....................................................................13 1.3.1 Les sous-unités de NuA4 ..................................................................................15 1.3.2 Piccolo, un complexe fonctionnel retouvé dans NuA4.....................................18 1.3.3 NuA4 et la transcription....................................................................................20 1.3.4 NuA4 et la réparation........................................................................................21
1.4 Domaines protéiques de NuA4...........................................................................26 1.4.1 Les Chromodomaines .......................................................................................27 1.4.2 Les domaines SANT.........................................................................................27 1.4.3 Les PHD fingers................................................................................................28 1.4.4 Les domaines PI-3 kinase des PIKK.................................................................29
1.5 Hypothèses de recherche, objectifs et approche utilisée .................................30
Chapitre 2 Matériel et méthodes........................................................................................32
2.1 Plasmides et souches ............................................................................................32 2.1.1 Plasmides et souches utilisés dans l’étude des chromodomaines .....................32 2.1.2 Plasmides et souches utilisés dans l’étude du domaine SANT de Eaf2 ...........32 2.1.3 Plasmides d’expression des protéines de fusion GST .....................................33 2.1.4 Plasmides et souches utilisés pour les essais transcriptionnels dépendant de p53......................................................................................................................................33 2.1.5 Autres souches utilisées ....................................................................................34
2.2 Chasse plasmidique et tests de croissance ........................................................34
2.3 Northern ..............................................................................................................35
vi
2.4 Purification protéique.........................................................................................35 2.4.1 Purification de complexes protéiques par TAP (Tandem Affinity Purification)......................................................................................................................................35 2.4.2 Purification de protéines de fusion avec la GST...............................................37
2.5 Chromatographie d'affinité ...............................................................................37
2.6 ChIP (Chromatin ImmunoPrécipitation).........................................................38 2.6.1 ChIPs dans le système HO................................................................................38 2.6.2 ChIPs à la cassure méiotique ............................................................................38
2.7 Essai kinase..........................................................................................................39
2.8 Immunobuvardages ............................................................................................40
Chapitre 3 Résultats............................................................................................................46
3.1 Étude fonctionnelle de différents domaines protéiques du complexe histone acétyltransférase NuA4 ..................................................................................................46
3.1.1 Le chromodomaine de Esa1 est essentiel à la viabilité cellulaire.....................47 3.1.2 Rôle de la protéine Eaf2 et de son domaine SANT chez Saccharomyces
cerevisiae ..........................................................................................................49 3.1.3 L’importance du PHD finger de Yng2 dans la transcription dépendante de p53 . ..........................................................................................................................52
3.2 Étude fonctionnelle du complexe NuA4 dans un contexte de réparation......54 3.2.1 Tra1, une protéine de la famille des PIKK relié à ATM...................................54 3.2.2 Copurification d’une activité kinase avec le complexe NuA4 .........................58 3.2.3 Activation de la phosphorylation des sous-unités de NuA4 par le complexe
MRX ................................................................................................................ 59 3.2.4 La protéine Eaf1 est spécifiquement phosphorylée par une kinase de la famille
ATM..................................................................................................................61 3.2.5 Caractérisation du complexe NuA4 aux cassures double brin durant la méiose 63
Chapitre 4 Discussion ..........................................................................................................65
4.1 L’importance de différents domaines protéiques de NuA4 ............................65 4.1.1 Le chromodomaine de Esa1, un domaine essentiel à la viabilité cellulaire, mais
possèdant une fonction différente de celui présent dans HP1 ..........................65 4.1.2 Un rôle pour le domaine SANT? ......................................................................67 4.1.3 Le PHD finger d’Yng2, un vestige permettant la transcription dépendante de
p53 grâce à un site de liaison aux phospholipides ............................................68
4.2 Nouvelles avenues impliquant NuA4 dans la réparation de l’ADN ...............70 4.2.1 MRX cible-t-il NuA4 aux bris double brin de l’ADN? ....................................70 4.2.2 Être ou ne pas être une kinase, voilà la question!.............................................72 4.2.3 NuA4 et la recombinaison méiotique ...............................................................74
Conclusions ..........................................................................................................................75
Références bibliographiques ...............................................................................................76
Annexe 1...............................................................................................................................88
vii
Liste des tableaux Tableau 1 Les sous-unités du complexe NuA4......................................................................14 Tableau 2 Plasmides.............................................................................................................41 Tableau 3 Souches ................................................................................................................42 Tableau 4 Amorces et PCR...................................................................................................44
viii
Liste des figures Figure 1 Les différents niveaux de condensation de l’ADN ...................................................2 Figure 2 Les modifications post-traductionnelles des histones .............................................7 Figure 3 La réaction d’acétylation........................................................................................8 Figure 4 : Les complexes HAT NuA4 et Tip60. ....................................................................13 Figure 5 : Organisation structurale et fonctionnelle des sous-complexes de NuA4 ............19 Figure 6 : Événements lors de la réparation de l’ADN........................................................22 Figure 7 : Méthode de purification TAP ..............................................................................36 Figure 8 La cage hydrophobique du chromodomaine de Esa1 joue un rôle considérable dans la viabilité cellulaire chez Saccharomyces cerevisiae ............................................................................47 Figure 9 La portion C-terminale de la protéine Eaf2 chez Saccharomyces cerevisiae est essentielle à la viabilité cellulaire et est impliquée avec le domaine SANT de Eaf2 dans les mécanismes de réparation de l’ADN. ...................................................................................51 Figure 10 : La mutation des lysines du PHD finger de Yng2 occasionne une chute de la transcription p53 dépendante chez Saccharomyces cerevisiae ............................................53 Figure 11 Le complexe de levure MRX lie la protéine Tra1 in vitro....................................56 Figure 12 : Le complexe NuA4 est recruté aux cassures double brin in vivo dans des souches déficientes en complexe MRX..................................................................................58 Figure 13 : Une activé kinase est co-purifiée avec le complexe NuA4 lors de conditions de dommages à l’ADN et de l’inhibition de la synthèse protéique ...........................................60 Figure 14 La protéine Eaf1 du complexe NuA4 est phosphorylée de manière spécifique par une kinase de la famille ATM en conditions de dommages à l’ADN ...................................62 Figure 15 : Le complexe NuA4 est recruté aux cassures double brin en méiose .................64 Figure 16 Modèle du recrutement des kinases de la famille ATM au site de bris................71
ix
Liste des abréviations
γ : Gamma 5’FOA : 5’ fluoroorotic acid 6-4 PP : Pyrimidine 6-4 pyrimidone photoproducts ACF: ATP-utilizing chromatin assembly and remodeling factor Act1: actin 1 ADN: acide desoxyribonucléique AID : activator-interaction domain Arp4 : actin-related protein 4 ARR : access, repair, restore ATM : ataxia telengectesia mutated ATP: adenosine triphosphate ATR : ataxia-telengectesia related BrD : Bromodomaine BER : base excision repair BSA : bovine serum albumin) CAF-1: chromatin assembly factor-1 CENP-A: Centromere protein-A CHD : chromodomain helicase/ATPase DNA binding protein CHD : Chromodomaine ChIP : chromatine immunoprecipitation CPD ; cyclobutane pyrimidine dimers, C-terminal: carboxy-terminal IRIF : irradiation-induced foci DMAP1 : DNMT1 (DNA methyl transferase 1) associated protein 1 DNA-PK : DNA protein kinase DSB : double-strand break Eaf1: esa1-associated factor 1 Eaf2: esa1-associated factor 2 Eaf3: esa1 associated factor 3 Eaf5: esa1-associated factor 5 Eaf6: esa1-associated factor 6 Eaf7: esa1-associated factor 7 EPc: Enhancer of Polycomb Epl1: Enhancer of Polycomb like 1 Esa1: essential SAS2-related acetyltransferase-1 GNAT : Gcn5 related acetyltransferase GST: gluthation S-transferase HA : hémagglutinine HAT: Histone acetyltransferase HC: Hartwell-complete HDAC: Histone deacetylase
x
HP1: hétérochromatine protéin 1 HR : recombinaison homologue HRP: horse raddish peroxydase HSA: hélicase and SANT domain HU: hydroxyurée ING: inhibitor of growth INO: inositol IP: Immunoprécipitation Isw1: imitation of switch 1 LPY : Lorraine Pillus yeast Mg2+ :Magnésium Mn2+ :Manganèse MMS: méthyl methane-sulfonate MOF: males absent on the first MRG15: Mortality factor related genes 15 MSL: male specific lethal NER: nucleotide excision repair NHEJ: non-homologous end-joining N-terminal: amino-terminal NuA3: Nucleosome Acetyltransferase of histone H3 NuA4 : Nucleosome Acetyltransferase of histone H4 ORF: open reading frame PBST : phosphate buffered saline Triton PCR : polymerase chain reaction PHD: plant homeodomain PI(4)P: phosphatidylinositol-4-phosphate PI3-K : phospho-inositol-3 kinase PIKK: phosphoinositide-3-kinase-related protein kinase roX: RNA on the X RSC: remodel the structure of chromatin S. cerevisiae : Saccharomyces cerevisiae SAGA: Spt-Ada-Gcn5 acetyltransferase SANT: Swi3p, Ada2, NcoR, TFIIB SAS/SAS1: something about silencing / something about silencing 1 Sas3: Something about silencing 3 SC: Synthetic Complete SDS : sodium dodecyl sulfate SWI/SNF: switching/sucrose non-fermenting TAP: tandem affinity purification TBP: TATA binding protein TEV : tabacco etching virus Tip60: Tat-interactive protein, 60Kda TOR: target of rapamycine TRRAP: transformation / transcription associated protein) UV: ultra-violet Yaf9: yeast homolog of the human leukemogenic protein AF9
xi
YEATS: YNK7, ENL, AF-9 and TFIIF small subunits YPD : Yeast/peptone/dextrose ySWI/SNF: yeast SWI/SNF
1
Chapitre 1 Introduction
Même s’il s’est écoulé un peu moins d’une décennie entre la découverte de la
structure en double hélice par Watson et Crick et la mise au point du modèle de l’opéron
par Jacob et Monod, un demi-siècle n’a pas été suffisant à la transposition de ce modèle de
régulation des gènes des procaryotes aux organismes supérieurs. En effet, le génome de la
plupart des eucaryotes, qui est composé de plusieurs millions de paires de bases, doit être
compacté dans un noyau ne mesurant pas plus de quelques micromètres. Ceci exige
l’organisation du matériel génétique en une structure très compacte rendant du même coup
l’ADN (acide desoxyribonucléique) inaccessible à la machinerie responsable de la
transcription des gènes. Un système de régulation tel que celui de l’opéron n’étant pas
efficace dans un environnement où le matériel génétique n’est pas accessible, la mise en
place de mécanismes de régulation de l’expression des gènes plus élaborés a donc été
développée.
La chromatine a été longtemps considérée comme un assemblage d’ADN et de
protéines inertes étant nécessaires uniquement au compactage de l’ADN dans le noyau.
Les recherches menées au cours des dix dernières années ont toutefois placé la chromatine
au centre de la régulation génique chez les eucaryotes. La chromatine, qui est une structure
dynamique et complexe, est en effet responsable non seulement de l’état de condensation
de l’ADN, mais également de l’état transcriptionnel qui en découle.
1.1 Structure et fonction de la chromatine
La structure de la chromatine est étroitement liée à sa fonction et permet ainsi la
condensation de l’ADN selon plusieurs niveaux, tel qu’illustré à la figure 1. L’unité de
base de la chromatine est le nucléosome, c’est-à-dire un octamère d’histones autour duquel
s’enroule 146 pb d’ADN (Noll et Kornberg, 1977). En microscopie électronique, cet
assemblage de nucléosomes sur l’ADN est connu sous le nom de collier de perles,
schématisant bien cette structure de 10 nm (Alberts, 2002). La liaison de l’histone H1 à
2
chaque nucléosome permet ensuite la stabilisation de la chromatine et son enroulement en
une fibre de 30 nm. Finalement, un échafaudage composé d’un amalgame de protéines
permet une hypercondensation de l’ADN jusqu’à la formation des chromosomes mitotiques
que l’on connaît.
Bien que découvertes il y a plus d’un siècle ( Kossel, 1879; Kossel, 1880) les histones
ont été longtemps considérées comme ayant un rôle purement structural. En effet, ces
petites protéines basiques possèdent une charge positive leur permettant de se lier à l’ADN,
qui lui, est chargé négativement. Comptant toutefois parmi les protéines les plus
Un adapté de Grunstein, 1992 Figure 1 Les différents niveaux de condensation de l’ADN
3
conservées au cours de l’évolution, il est logique qu’elles occupent un rôle essentiel au sein
de la cellule.
L’élucidation de la composition du nucléosome en un tétramère (H3)2/(H4)2
(Kornberg et Thomas, 1974) et deux dimères H2A/H2B (Kelley, 1973) ainsi que la
cristallisation de la structure du nucléosome (Luger et al., 1997) ont permis de répondre à
de nombreuses questions sur les rôles fonctionnels des histones. Il a donc été démontré que
les queues non-structurées en N-terminales des histones sont localisées à l’extérieur de la
structure du nucléosome et participent aussi à la formation de la fibre de 30 nm.
Parallèlement, d’autres études ont démontré la prévalence des nucléosomes dans la
régulation de la transcription en révélant que ceux-ci pouvaient constituer une barrière
physique à la transcription en prévenant la liaison de certains facteurs à l’ADN (Straka et
Horz, 1991). Ils étaient responsables également de la décondensation de certaines régions
d’ADN, rendant ainsi possible le retour de l’activité transcriptionnelle dans celles-ci.
Motivées par le rôle potentiel des histones dans la régulation génique, d’autres recherches
ont également démontré l’implication des queues N-terminales des histones dans le
relâchement de la chromatine (Tse et al., 1998). En effet, les queues N-terminales des
histones peuvent être modifiées post-traductionnellement et l’ajout de certaines
modifications résulte en un changement de conformation de la chromatine.
Progressivement, les notions d’histones, de chromatine et de régulation génique se
chevauchèrent pour ainsi former le modèle de régulation de l’expression des gènes que l’on
connaît aujourd’hui. La chromatine est donc une structure dynamique pouvant se
condenser et se décondenser, créant ainsi respectivement des zones où la transcription est
réprimée (hétérochromatine) et des zones où l’on remarque une activité transcriptionnelle
(euchromatine). Ces changements de conformations surviennent suite à l’intervention de
complexes modifiant l’état de condensation chromatinien en réponse à certains signaux
cellulaires.
4
1.2 Complexes modifiant la conformation de la chromatine
La découverte du rôle essentiel de la chromatine lors de la régulation génique eut un
impact scientifique très important permettant ainsi l’émergence de nombreux nouveaux
champs d’intérêts. Plusieurs travaux portèrent sur l’étude de la dynamique chromatinienne
chez Saccharomyces cerevisiae, plus particulièrement sur les moyens qu’utilise la cellule
pour modifier l’état de condensation de la chromatine. Ceux-ci ont permis de faire la
lumière sur deux types de complexes pouvant modifier la chromatine : les complexes ATP-
dépendants et les complexes modifiant post-traductionnellement les nucleosomes. De plus,
des recherches parallèles ont démontré que l’incorporation de variants d’histones dans les
nucléosomes pouvait aussi moduler l’expression génique (Mizuguchi et al., 2004 ; Kobor,
M. S. et al., 2004 ; Krogan, N. J. et al., 2003).
1.2.1 Les complexes de remodelage ATP-dépendants
Ces complexes, comme leur nom l’indique, utilisent l’énergie de l’ATP ainsi que
leur domaine apparenté aux hélicases pour altérer les liens histones/ADN, ce qui permet le
remodelage de la chromatine et donc la modification de son état de condensation. Cette
catégorie de complexes a été classée en quatre grandes familles sur les bases de la similarité
de leur sous-unité ATPase : Swi2/Snf2 (switch/sucrose nonfermenting), Isw1 (imitation of
switch 1), INO (inositol) et CHD (chromodomain helicase/ATPase DNA binding protein),
mais comme il ne s’agit pas de notre sujet principal, seules les familles les plus importantes
seront introduites.
Les membres de la famille Swi/Snf
Bien qu’étant très nombreux, les complexes remodelant la chromatine qui sont
membres de la famille SWI/SNF possèdent tous un dénominateur commun : ils disposent à
la fois d’une activité ATPase et d’un domaine similaire à ceux possèdant une activité
hélicase. Ce fut au cours d’études in vitro que l’importance des protéines de la famille
5
SWI/SNF a été établie, ayant été capable de lever l’inhibition de la transcription provoquée
par la présence d’histones (Vignali et al., 2000). Chez S. cerevisiae, on retrouve deux
représentants de cette famille: les complexes ySWI/SNF (yeast SWI/SNF) et RSC (remodel
the structure of chromatin). Le complexe ySWI/SNF a été d’abord caractérisé comme un
co-activateur transcriptionnel, son activité de remodelage permettant le recrutement de la
machinerie transcriptionnelle au site d’initiation de la transcription (Mohrmann, 2005). En
effet, ce complexe est recruté directement à ces sites par des activateurs via les sous-unités
Swi2/Snf2, Snf5 et Swi1 (Neely et al., 2002) et serait responsable de la disruption des
interactions histones/ADN, changeant la structure de la chromatine et rendant ainsi
disponible l’ADN des régions promotrices aux facteurs initiant la transcription. De plus, il
a été établi que le complexe ySWI/SNF pouvait agir directement avec la chromatine, tel un
activateur, via la sous-unité Swi2/Snf2. En effet, le bromodomaine (BrD) présent sur cette
protéine permet le recrutement in vitro et in vivo du complexe ySWI/SNF au niveau de
certains promoteurs via la reconnaissance de lysines acétylées sur les histones. D’autres
études suggèrent que le complexe ySWI/SNF serait également impliqué dans la répression
transcriptionnelle (Nielsen et al., 2002). Par contre, on ignore toujours les facteurs
responsables de la différenciation de son rôle à titre d’activateur ou répresseur
transcriptionnel.
Le complexe RSC est un complexe faisant aussi partie de la famille SWI/SNF. Il
est essentiel à la cellule (Cairns et al., 1996) et y est beaucoup plus abondant que
ySWI/SNF. Plusieurs évidences démontrent son importance au niveau de la régulation de
l’expression des gènes. Ainsi, tout comme le complexe ySWI/SNF, RSC serait impliqué à
la fois dans la répression et l’activation de gènes. Le complexe RSC permettrait par contre
la disruption totale d’un nucléosome ainsi que sa translocation sur une toute autre molécule
d’ADN (Lorch et al., 1999). De plus, ce complexe a été récemment impliqué dans la
ségrégation chromosomique et la cohésion des chromatides sœurs (Hsu et al., 2003; Baetz
et al., 2004; Huang et al., 2004).
6
Les membres de la famille ISWI
Au contraire des membres de la famille SWI/SNF, les membres de la famille ISW1
ne brisent pas les nucléosomes. Ils les font glisser le long de l’ADN, changeant ainsi
l’organisation nucléosomale. Ceci résulte non pas en la formation d’une région entièrement
dépourvue de nucléosomes, mais plutôt en une région où l’espacement entre les
nucléosomes a été modifié. Chez la levure, il existe trois complexes de cette famille, Isw1a
(Isw1p/Ioc3p), Isw1b (Isw1p/Ioc2p/Ioc4p) et Isw2 (Isw2p/Itc1). Isw1a est associé à la
répression de la transcription contrairement à Isw1b qui permet l’activation de la
transcription (Morillon et al., 2003a). Ces deux complexes ont été également impliqués
dans le contrôle des événements menant à l’élongation et à la terminaison transcriptionnelle
(Morillon et al., 2003b).
Les membres de la famille INO
La famille INO comprend notamment 2 protéines, Swr1 (voir section 1.2.3) et
Ino80. Le complexe INO80, qui est un complexe multiprotéique de 12 protéines dont la
sous-unité catalytique est Ino80 (Shen et al., 2000), a été récemment identifié en tant que
remodeleur de la chromatine. Ce complexe dispose d’une activité ATPase nécessaire au
remodelage ainsi que d’une activité hélicase et possède la capacité de briser les
nucléosomes. On y compte aussi la présence des protéines reliées à l’actine (Arp4, Arp5,
Arp8), qui sont impliquées dans la liaison du complexe aux histones (Shen et al., 2003) et
des protéines orthologues à l’hélicase ruvB chez la bactérie (Rvb1 et Rvb2) qui jouent un
rôle dans la migration de la jonction d’Hollyday lors de la recombinaison. Les mutants
ino80 montrent des défauts de transcription et sont sensibles aux agents endommageant
l’ADN (MMS : méthyl methane-sulfonate, HU : hydroxyurée) , suggèrant fortement
l’implication de cette protéine dans le remodelage de la chromatine (Shen et al., 2000).
Enfin, la rétention du complexe INO80 au site de coupure double brin suite à la
phosphorylation de l’histone H2A (van Attikum et al., 2004) est dépendante de
l’acétylation des histones par NuA4 (Downs et al., 2004) et confirme la participation
d’INO80 dans les processus de réparation de l’ADN.
7
1.2.2 Les complexes modifiant post-traductionnellement la chromatine
L’état de condensation de la chromatine peut également être régulé par un autre type
d’activité. L’ajout de modifications post-traductionnelles en N-terminal des queues
d’histones peut effectivement engendrer un changement de la conformation chromatinienne
conduisant ainsi à la modulation de l’expression génique. Des modifications telles
l’acétylation, la phosphorylation, la méthylation, la biotinylation, l’ubiquitination et l’ADP-
ribosylation peuvent être ajoutées selon différentes combinaisons, laissant une empreinte
épigénétique pouvant être reconnue par différents complexes modifiant la chromatine et ce,
via des domaines protéiques spécifiques (bromodomaines, chromodomaines) (voir figure
2). Le « code des histones », comme on l’appelle, (Jenuwein et Allis, 2001) constitue donc
la clef d’un mode de régulation génique extrêmement sophistiqué et dynamique, lui
permettant de s’adapter rapidement aux différents changements cellulaires.
Figure 2 Les modifications post-traductionnelles des histones
Adaptation tirée du site www.histonecode.com/
8
La modification post-traductionnelle la mieux caractérisée jusqu’à aujourd’hui est
sans aucun doute l’acétylation, une modification découlant du transfert d’un groupement
acétyl-CoA à une lysine localisée sur la queue N-terminale d’une histone (figure 3).
L’ajout d’un tel groupement laisse non seulement une marque épigénétique sur les histones,
mais permet également la neutralisation de la charge de ces lysines conduisant, entre autres,
à la diminution des interactions histones/ADN et ainsi au relâchement du niveau de
compaction de la chromatine. L’état d’acétylation des histones résulte d’un équilibre entre
deux types d’activités opposées : l’activité histone acétyltransférase (HAT) et l’activité
histone déacétylase (HDAC). Depuis les premières études corrélant la présence d’histones
acétylées avec des régions transcriptionnellement actives (Allfrey et al., 1964), plusieurs
HATs ont été caractérisées. L’acétylation des histones a été alors associée à une panoplie
de mécanismes importants tels la réplication de l’ADN, le maintien de l’intégrité du
génome et même la formation d’hétérochromatine. Il existe cinq grandes familles d’HATs :
les GNATs (Gcn5 related acetyltransferase), celles de la famille MYST (MOZ, Ybf2/Sas3,
Sas2, Tip60), p300/CBP, les HATs reliées aux facteurs de transcription et les HATs reliées
aux hormones nucléaires. Cependant, nous nous intéressons seulement aux deux premières
grandes familles, car elles sont reliées génétiquement aux histones (Carrozza et al., 2003).
Figure 3 La réaction d’acétylation
Tirée du site www.callisto.si.usherb.ca/ ~bcm514/3a.html
9
Les histones acétyltransférases de la famille GNAT
Les membres de cette famille HATs ont été classés selon leur homologie de
séquence avec la protéine Gcn5. Ils possèdent tous un bromodomaine qui leur confère la
capacité de reconnaître les lysines acétylées. De plus, étant impliqués dans des fonctions
aussi importantes que la réparation de l’ADN et la transcription, ces membres sont
essentiels à la régulation génique et la croissance cellulaire. En effet, chez la levure, Gcn5
(qui est la sous-unité catalytique des complexes SAGA, SLIK et ADA) est important pour
le passage du cycle cellulaire en G2/M (Zhang et al., 1998). Le complexe SAGA (Spt-Ada-
Gcn5 acetyltransferase), qui a été la première HAT native identifiée (Grant et al., 1997), est
recruté aux régions promotrices des gènes via sa liaison à des activateurs transcriptionnels
par la sous-unité Tra1 (Vignali et al., 2000; Brown et al., 2001). Le complexe SAGA
possède 15 sous-unités et est recruté au gène GAL1 par l’activateur transcriptionnel Gal4.
Sa liaison est primordiale au recrutement de la TBP (TATA binding protein) (Larschan et
Winston, 2005).
ADA est un autre complexe dont la sous-unité catalytique est Gcn5 (Eberharter et
al., 1999). On a d’abord penssé qu’ ADA était un sous-complexe de SAGA, mais la
découverte d’une sous-unité unique à ADA, Ash1, a permis de confirmer l’existence d’un
complexe indépendant (Eberharter et al., 1999). Par contre, ce complexe n’a été lié à
aucune fonction cellulaire jusqu’à ce jour.
Enfin, le complexe Elongator, qui est aussi un membre de la famille GNAT, a été
impliqué dans la réparation de l’ADN et dans la transcription. Ce complexe associe
effectivement l’ARN polymérase II, est important dans l’élongation de la transcription
(Roth et al., 2001; Otero et al., 1999) ainsi que dans l’acétylation in vivo des histones H3 et
H4 (Winkler et al., 2002).
10
Les histones acétyltransférases (HATs) de la famille MYST
Les HATs de cette famille possèdent toutes un domaine acétyltransférase MYST,
un domaine en partie relié à celui retrouvé chez les membres de la famille GNAT. Les
HATs sont impliquées dans de nombreux mécanismes cellulaires essentiels. À titre
d’exemple, la protéine humaine Tip60 a été impliquée dans le contrôle de la prolifération
cellulaire, dans la maladie d’Alzheimer (Cao et Sudhof, 2001) et s’est avérée être un co-
activateur transcriptionnel dans plusieurs systèmes tels les récepteurs d’hormones
nucléaires de classe 1 (Brady et al., 1999), NF-κB (Baek et al., 2002), le gène de la
superoxyde dismutase (Revue dans (Utley et Cote, 2003), c-myc (Frank et al., 2003) et E2F
(Taubert et al., 2004). De plus, chez la drosophile, MOF (males absent on the first), une
autre histone acétyltransférase de la famille MYST, est essentielle à la survie cellulaire.
MOF est l’histone acétyltransférase du complexe MSL (male specific lethal) et est
impliquée dans le phénomène de compensation de dose du chromosome [X] chez le mâle.
À ce jour, 3 complexes contenant un membre la famille MYST ont été purifiés chez
Saccharamyces cerevisiae., il s’agit de SAS, NuA3, et NuA4.
D’abord, le complexe SAS (something about silencing), comprend la sous-unité
catalytique Sas2, une protéine possédant un domaine MYST. Sas2 est chargé de
l’acétylation de la lysine 16 de l’histone H4 et est, par le fait même, intimement relié à la
formation d’une barrière entre l’euchromatine et l’hétérochromatine. En effet, l’étroite
collaboration entre la HDAC Sir2, dont le rôle est de déacétyler cette même lysine, et de
Sas2, qui dispose d’une activité HAT, permet d’établir une frontière entre les zones
d’euchromatine et d’hétérochromatine localisées au niveau des télomères (Suka et al.,
2002; Kimura et al., 2002). Ainsi, la délétion de l’un ou de l’autre de ces gènes provoque
la perte de cette barrière et permet donc la condensation ou la décondensation des régions
adjacentes aux télomères.
Le complexe NuA3 (Nucleosome Acetyltransferase of histone H3), dont la sous-
unité catalytique est Sas3 (Something about silencing 3), est impliqué dans la transcription.
En effet, sa liaison via sa sous-unité Spt16 avec le complexe FACT-CP (facilitates
chromatin transcription- Cdc68-Pob3), un complexe impliqué dans l’élongation de la
11
transcription, suggèrent fortement son implication dans l’élongation transcriptionnel et la
réplication de l’ADN (John et al., 2000). Ceci est conforté par l’interaction génétique entre
les protéines Sas3 et Spt16 (John et al., 2000). Récemment, l’interaction entre Sas3 et
Anc1, une protéine associée aux facteurs de transcription TFIID et TFIIF, a encore une fois
suggéré l’implication de NuA3 dans la transcription (Kabani et al., 2005). De plus, la
délétion de Gcn5 et de Sas3 est létale pour la levure, ce qui suggère une redondance
fonctionnelle entre les complexes NuA3 et SAGA.
Enfin, le dernier complexe de cette famille est le complexe HAT NuA4
(Nucleosome Acetyltransferase of histone H4), qui est le sujet d’intérêt de mes recherches.
Ce complexe de 1,3 MDa possède 13 sous-unités stables (tableau 1) et est essentiel à la
survie de la levure. Ce complexe acétyle spécifiquement les histones H2A et H4 et est
reconnu pour être impliqué dans un grand nombre de mécanismes cellulaires importants.
Une description plus exhaustive de ce complexe est présentée à la section 1.3.
1.2.3 L’incorporation de variants d’histones dans la chromatine
Un autre moyen permettant la modulation de la conformation de la chromatine est
l’incorporation de variants d’histones. En dépit de l’existence de 5 histones bien distinctes
chez la levure, H1, H2A, H2B, H3 et H4, il existe des versions différentes de ces histones
qui sont appelées « variants d’histones ». Un de ceux-ci, H2A.Z, encodée par le gène
HTZ1, est une variante de l’histone H2A chez les eucaryotes. Plusieurs évidences
suggèrent l’implication de ce variant d’histones dans la régulation de la structure
chromatinienne. H2A.Z représente 10% du nombre total de H2A dans la cellule et malgré
le fait que H2A.Z n’est pas essentiel à la survie de la levure, sa délétion cause un phénotype
ne pouvant être complémenté par H2A (Jackson et Gorovsky, 2000), démontrant
l’existence d’une fonction spécifique pour ce variant d’histones. En ce sens, il a récemment
été démontré que H2A.Z était localisé dans les nucléosomes des gènes transcrits au niveau
des télomères, une zone principalement constituée d’hétérochromatine (Meneghini et al.,
2003).
12
De plus, ce variant d’histones a été co-purifié avec un complexe possédant une
activité ATPase, le complexe SWR1 (Mizuguchi et al., 2004). Comme l’activité
catalytique de ce complexe provenait de la protéine Swr1, un membre de la famille INO, la
coopération de ces deux protéines dans une fonction relative au remodelage de la
chromatine a été suggérée. La comparaison des profils transcriptionnels des mutants swr1
et htz1 démontre en effet des phénotypes similaires, témoignant d’une association
fonctionnelle entre ces deux protéines (Kobor et al., 2004; Krogan et al., 2003; Mizuguchi
et al., 2004). Ces trois groupes identifièrent aussi Swr1 comme étant nécessaire à
l’incorporation de H2A.Z dans la chromatine. Grâce à son activité ATPase, ce complexe
échange un dimère H2A/H2B pour un dimère H2A.Z/H2B, incorporant ainsi l’histone
H2A.Z (Mizuguchi et al., 2004).
Jusqu’à maintenant, le rôle de l’incorporation d’H2A.Z par Swr1 chez S. cerevisiae
n’a pas été déterminé avec certitude. Par contre, plusieurs évidences suggèrent
l’implication de ces protéines dans le maintien de l’hétérochromatine au niveau de certaines
régions spécifiques. En effet, H2A.Z se situe aux régions frontières de l’hétérochromatine
et de l’euchromatine (Krogan et al., 2004). Parallèlement, il a été suggéré que l’acétylation
de H2A.Z était essentielle à la survie cellulaire chez Tetrahymena (Ren et Gorovsky, 2003).
Curieusement, quatre sous-unités de SWR1 se retrouvent dans l’histone acétyltransférase
NuA4 et le complexe humain Tip60 a été révélé comme étant composé des orthologues des
complexes de levure NuA4 et SWR1 de levure (Doyon et al., 2004). L’acétylation par
NuA4 de H2A.Z ou d’une autre histone pourrait ainsi être un événement lié au maintien de
l’hétérochromatine ou à l’incorporation de H2A.Z.
Enfin, bien que les expériences en soit encore à un stade préliminaire,
l’incorporation de variants d’histones semblerait être aussi impliqué dans la transcription.
En ce sens, des évidences pointent plus précisément vers un rôle dans l’élongation des
transcrits.
13
1.3 L’histone acétyltransférase NuA4
Tel que mentionné précédemment, NuA4 est un complexe multiprotéique essentiel
composé de 13 sous-unités (figure 4) (Grant et al., 1997) acétylant préférentiellement les
histones H4 et H2A. Ce complexe est très bien conservé à travers l’évolution. En effet,
presque toutes les sous-unités du complexe NuA4 possèdent des orthologues des complexes
NuA4 de levure chez les eucaryotes supérieurs. Chez l’humain, on retrouve un complexe
appelé Tip60 (Doyon et al., 2004), qui démontre le haut niveau de conservation de NuA4 à
travers l’évolution. L’importance du rôle joué par Tip60 dans la transformation cellulaire,
la transcription, la réparation de l’ADN, le contrôle du cycle cellulaire et l’apoptose illustre
bien la portée qu’a l’étude du complexe NuA4. Voici un bref portrait de chacune de ces
sous-unités.
Figure 4 Les complexes HAT NuA4 et Tip60 CHD (Chromodomaine), HAT (Histone
acetyltransferase), AID (activator-interaction domain), PI-3K (phospho-inositol-3 kinase);
EPC (enhancer of Polycomb domain); PHD (plant homeodomain finger),SANT (Swi3-Ada2-
NCoR-TFIIIB); SW12/SNF2 (switching/sucrose non-fermenting), BrD (Bromodomaine)
Adaptation de (Doyon and Cote, 2004)
NuA4 (levure) Tip60 (humain)
14
Tableau 1 Les sous-unités du complexe NuA4
Sous-unités de
NuA4
Autres noms
Orthologues dans le complexe humain Tip60
Domaines
Tra1 -
TRRAP (transformation / transcription associated protein) PI-3 kinase/ATM
Eaf1 Vid21 P400 (hDomino) SANT/HSA
Epl1 - EPC1/2 (Enhancer of Polycomb) EpcA
Eaf2 Swc4, God1 DMAP1 (DNMT1 associated protein1) SANT
Arp4 Act3 BAF53a (BRG1 associated protein) Actin related
Esa1 Tas1
TIP60 Chromodomaine
et MYST/HAT
Eaf3 - MRG15 (Mortality factor related genes 15) Chromodomaine
Act1 End7, Aby1
Actin -
Yng2 Nbn1, Eaf4 ING3 PHD-finger
Eaf5 -
? -
Yaf9 - Gas41 YEATS
Eaf6 -
hEaf6 -
Eaf7 -
MRGBP -
15
1.3.1 Les sous-unités de NuA4
Sa sous-unité catalytique, Esa1 (essential SAS2-related acetyltransferase-1), est
chargée de l’acétylation in vivo des lysines 5, 8, 12 et de la queue N-terminale de l’histone
H4 ainsi que des lysines 5 et 7 de la queue N-terminale de l’histone H2A. Esa1 est la seule
HAT essentielle à la survie de la cellule et fait partie du sous-complexe Piccolo (voir
section 1.3.2). Ce gène semble impliqué dans le contrôle du cycle cellulaire, un arrêt en
G2/M étant remarqué dans un mutant esa1 thermosensible (Clarke et al., 1999).
L’acétylation de la queue N-terminale de l’histone H4 par Esa1 est requise pour la
réparation double brin de l’ADN (Downs et al., 2004; Bird et al., 2002). En plus de son
domaine MYST, Esa1 possède un chromodomaine, qui constitue un motif protéique
impliqué dans la reconnaissance des lysines méthylée et des ARNs (voir la section 1.6.1).
L’orthologue humain de Esa1, Tip60 (Tat-interactive protein, 60Kda), produit lui aussi des
histones H4 tetra-acétylées en N-terminal (Kimura et Horikoshi, 1998). Comme Esa1,
Tip60 est impliqué dans la régulation de la transcription, le contrôle de la croissance
cellulaire et la réparation de l’ADN.
Bien que Yng2 ne soit pas essentiel à la viabilité de la levure, sa délétion engendre de
sévères problèmes de croissance cellulaire. De plus, tout comme les deux autres protéine
faisant partie de la même famille chez la levure, Yng1 et Pho23, Yng2 possède un PHD
(plant homeodomain) finger. L’orthologue humain de Yng2, ING3, est un suppresseur de
tumeur de la famille des ING (inhibitor of growth) et permet la transcription des gènes
activés par p53 (Garkavtsev et al., 1998). Il possède la capacité de complémenter les
mutants yng2, démontrant ainsi la conservation de la fonction entre ces deux protéines
(Loewith et al., 2000; Nourani et al., 2003).
Tra1, qui fait partie de la famille des kinases ATM, est également essentielle à la
survie cellulaire (Saleh et al., 1998). Cette sous-unité, présente également dans le
complexe SAGA, possède une région lui permettant de se lier à des activateurs
transcriptionnels et donc de recruter les complexes SAGA et NuA4 aux régions
promotrices de certains gènes (Brown et al., 2001). Par contre, malgré son homologie avec
16
les membres de la famille ATM, Tra1 ne semble pas posséder d’activité kinase (McMahon
et al., 1998). Son orthologue humain TRRAP est requis pour la transformation cellulaire
dépendante de c-Myc et de E2F (McMahon et al., 1998) et est impliqué dans l’activation
des gènes du contrôle de la mitose (Li et al., 2004).
Eaf1 (esa1-associated factor 1) est une sous-unité impliquant le complexe NuA4 dans
la voie de synthèse de l’adénine (Auger et al, soumis). Cette protéine possède un domaine
SANT et un domaine HSA (hélicase and SANT domain), domaines que l’on retrouve
normalement dans des hélicases (Letunic et al., 2002). Des interactions génétiques avec les
gènes HTZ1 et ceux de la famille SWR1 suggèrent la participation de cette protéine dans
l’acétylation d’H2A.Z suite à son incorporation dans la chromatine (Auger et al., soumis).
De plus, la protéine Eaf1 semble être impliquée dans la ségrégation chromosomique. Le
mutant eaf1 est en effet sensible au benomyl, une drogue déstabilisant les microtubules.
(Krogan et al., 2004). Son orthologue humain, p400, est impliqué dans la transformation
cellulaire par E1A (Fuchs et al., 2001) et possède un domaine hélicase homologue a celui
de Swi2 permettant l’échange de variants d’histones dans la chromatine (Kusch et al.,
2004).
Eaf2 (esa1-associated factor 2) est également une protéine possédant un domaine
SANT et est partagée avec le complexe SWR1. Son orthologue humain, DMAP1 (DNMT1
associeted protein 1), qui est associé à la méthyltransférase DNMT1, est impliqué dans la
répression transcriptionnelle en phase S et à été localisé aux foci réplicatifs (Rountree et al.,
2000).
Epl1 (Enhancer of Polycomb like 1), est la protéine établissant le pont entre le
complexe Piccolo et les autres protéines du complexe NuA4. En effet, la délétion de la
portion C-terminale de cette protéine produit un complexe NuA4 déficient en Piccolo
(Boudreault et al., 2003). Cette protéine est essentielle à la viabilité de la levure. Son
orthologue chez la drosophile, E(Pc) (Enhancer of Polycomb), est impliqué dans la
régulation transcriptionnelle (revue dans (Ringrose et Paro, 2004).
17
Eaf3 (esa1 associated factor 3) est une protéine partagée avec le complexe HDAC
RPD3 et collabore à la transcription spécifique des gènes TRP4 et HIS4 (Lacoste et al.,
soumis, (Eisen et al., 2001). Cette protéine contient deux chromodomaines. Son
orthologue humain, MRG15, est très bien conservé et est quant à lui impliqué dans
l’activation au promoteur B-myb et dans la sénescence (Leung et al., 2001; Leung et
Pereira-Smith, 2001).
Eaf5 (esa1-associated factor 5) et Eaf7 (esa1-associated factor 7) sont deux protéines
formant un sous-complexe avec Eaf3. Elles sont génétiquement reliées (Lacoste et al., non-
publié) et s’associent en un trimère dans le complexe HAT NuA4. Dernièrement, des
interactions génétiques ont lié ce trimère au complexe SWR1 et à l’histone
méthyltransférase Set2 (Lacoste et al, soumis) impliquant alors possiblement ces protéines
dans une même fonction. De récentes études ont ainsi déterminé que le chromodomaine de
la protéine Eaf3 pouvait reconnaître le résidu K36 méthylé de l’histone H3 et permettre le
recrutement de NuA4 et/ou Rpd3/Sin3 (Lacoste et al, soumis). La méthylation de ce résidu
par Set2 dans les régions codantes est donc nécessaire au recrutement de NuA4 au
promoteur des gènes ribosomaux et corrèle avec les niveaux d’acétylation de ces régions
(Lacoste et al, soumis) liant donc à ces événements le trimère Eaf3/Eaf5/Eaf7 et un rôle
possible de NuA4 dans l’élongation de la transcription.
La protéine Act1 (actin 1), Arp4 (actin-related protein 4) et Yaf9 (yeast homolog of
the human leukemogenic protein AF9) sont toutes trois des protéines faisant partie d’un
module protéique contenant Eaf2 et qui est présent dans les complexes NuA4 et SWR1.
Act1 est une protéine ubiquitaire, multifonctionnelle et essentielle à la survie de la levure.
Elle est impliquée dans une grande variété de processus cellulaires tels l’organisation du
cytosquelette, la polarité cellulaire ou bien l’alignement des fuseaux mitotiques.
Arp4 est une protéine possèdant une région d’homologie avec l’actine. Des mutations
ont été effectuées dans cette région, générant ainsi des mutants thermosensibles pour Arp4.
Ceux-ci ont démontré une sensibilité à l’hydroxyurée et aux rayons UV (ultra-violet)
suggérant donc l’implication de cette sous-unité dans la réplication et la réparation de
l’ADN (Gorzer et al., 2003). Récemment, le recrutement de NuA4 au site de dommages à
18
l’ADN a été démontré via l’interaction d’Arp4 à l’histone H2A phosphorylée (Downs et al.,
2004) confirmant le rôle de cette sous-unité dans la réparation de l’ADN. L’orthologue
humain de cette protéine, BAF53, est essentiel à la transformation cellulaire par c-myc
(Park et al., 2002).
Yaf9 possède un domaine YEATS (YNK7, ENL, AF-9 and TFIIF small subunits). La
mutation de ce domaine provoque une sensibilité aux agents causant des dommages à
l’ADN (Zhang et al., 2004). De plus, la délétion de Yaf9 provoque des défauts dans la
ségrégation chromosomique (Le Masson et al., 2003) de même que dans la transcription
des gènes au niveau des télomères (Zhang et al., 2004). Ceci pointe vers la participation de
cette sous-unité à la ségrégation chromosomique de même qu’à la répression
transcriptionnelle. L’orthologue humain de Yaf9, Gas41, est impliqué, par contre, dans
l’apparition de glioblastomes et d’astrocytomes.
Enfin, Eaf6 (esa1-associated factor 6) est une protéine encore très peu étudiée. Son
orthologue humain, Eaf6h n’est associé à aucune fonction biologique.
1.3.2 Piccolo, un complexe fonctionnel retouvé dans NuA4
Esa1 est également la sous-unité catalytique d’un complexe natif retouvé chez la
levure et dans NuA4, Piccolo. Ce petit complexe est composé exclusivement des protéines
Esa1, Epl1 et Yng2 et acétyle préférentiellement la chromatine (Boudreault et al., 2003).
Piccolo jouerait un rôle dans l’acétylation globale des histones parallèlement à NuA4 qui
participerait à l’acétylation de locus spécifiques. Enfin, la délétion de la partie C-terminale
de la protéine Epl1, qui lie le complexe Piccolo aux autres sous-unités de NuA4, est viable
pour la cellule, laissant croire ainsi que c’est l’acétylation globale faite par Piccolo qui est
essentielle à la cellule (Boudreault et al., 2003).
19
Complexe HAT SAGA
Complexe de remodelage ATP-d pendant SWR1
Complexe de remodelag ATP-dpendant Ino80
Complexe HDAC Sin3/Rpd3
Piccolo
Figure 5 Organisation structurale et fonctionnelle des sous-complexes de NuA4 CHD
(Chromodomaine), HAT (Histone acetyltransferase), AID (activator-interaction domain),
PI-3K (phospho-inositol-3 kinase); EPC (enhancer of Polycomb domain); PHD (plant
homeodomain finger),SANT (Swi3-Ada2-NCoR-TFIIIB); SW12/SNF2 (switching/sucrose
non-fermenting), BrD (Bromodomaine), HSA (hélicase and SANT domain), HDAC (Histone
deacetylase)
Adaptation de Lacoste et al. soumis; Auger et al., soumis
20
1.3.3 NuA4 et la transcription
Les complexes modifiant la structure chromatinienne possèdent souvent des fonctions
directement liées à la transcription. Effectivement, plusieurs évidences ont démontré que
les complexes Swi2/Snf2, RSC et SAGA sont impliqués dans la régulation de la
transcription. Le complexe NuA4 n’échappe pas à cette tendance et contribue à la
répression et à l’activation transcriptionnelle de plusieurs gènes. Historiquement, le
domaine de transactivation de la protéine VP16 du virus de l’herpès ainsi que la protéine de
levure Gcn4 ont été les premiers activateurs transcriptionnels associés au recrutement du
complexe NuA4 à certains promoteurs (Ikeda et al., 1999; Utley et al., 1998). Aujourd’hui,
la littérature fait mention de plusieurs gènes régulés par NuA4. Les gènes responsables de
la synthèse des protéines ribosomales, par exemple, ont été démontrés comme étant
dépendants de NuA4. Ce dernier serait vraisemblablement recruté aux promoteurs des
gènes ribosomaux par deux activateurs (Rap1 et Abf1) et permettrait donc la transcription
des gènes ribosomaux (Reid et al., 2000); (Rohde et Cardenas, 2003). De plus, des travaux
ont illustré de belle façon l’activation du gène PHO5 par le recrutement de NuA4 via sa
liaison à l’homéodomaine de l’activateur transcriptionnel Pho2 (Nourani et al., 2004),
mettant ainsi la lumière sur les mécanismes mis en veille par la cellule lors de l’activation
transcriptionnelle du gène PHO5. Ainsi, NuA4 est nécessaire au remodelage du promoteur,
mais est accessoire une fois celui-ci activé. Malgré plusieurs études démontrant le rôle
« gène-spécifique » de ce complexe, une étude parallèle a révélé la localisation de NuA4 au
niveau des promoteurs du génome entier (Robert et al., 2004).
Des expériences in vitro ont également démontré la conservation du rôle
transcriptionnel du complexe humain Tip60 au complexe de levure NuA4 par le rôle
indispensable que joue Yng2 dans la transcription dépendante de p53 (Nourani et al.,
2001). Chez l’humain, comme il a été déjà mentionné précédemment, le complexe Tip60
est un co-activateur transcriptionnel pour les gènes codant pour les récepteurs d’hormones
nucléaires de classe 1 (Brady et al., 1999) NF-κB (Baek et al., 2002), le gène de la
superoxyde dismutase (Revue dans (Utley et Cote, 2003)) et c-myc (Frank et al., 2003).
21
1.3.4 NuA4 et la réparation
En réponse aux multiples dommages provoqués par certains mécanismes
biologiques (recombinaison V(D)J et réplication méiotique) ainsi que par les stress de
l’environnement, les mécanismes de réparation de l’ADN permettent de minimiser la perte
de l’information génétique par le déploiement rapide d’une machinerie cellulaire possédant
la capacité de localiser et de réparer les lésions de l’ADN. Ces mécanismes, présents autant
chez les procaryotes que chez les eucaryotes sont d’une importance capitale pour le
maintien de l’intégrité du génome de la cellule. Pour mener à bien sa tâche, la cellule doit
toutefois rendre accessible l’ADN endommagé à la machinerie cellulaire. C’est dans cette
optique que plusieurs études ont été menées dans le but de déterminer l’implication des
complexes remodelant la chromatine dans les mécanismes de réparation de l’ADN.
Plusieurs complexes ont ainsi été reliés à cette fonction chez la levure, notamment le
complexe ATP-dépendant SWI/SNF (Gaillard et al., 2003) et le complexe HAT NuA4
(Bird et al., 2002, Downs et al., 2004).
Détection des sites de dommages à l’ADN
Chez la levure et l’humain, la reconnaissance rapide des sites de dommages à
l’ADN permet l’activation et le recrutement de protéines qui seront responsables de la
cascade d’événements menant à la réparation de l’ADN (figure 6A). La reconnaissance
d’un bris double brin (DSB; double-strand break) engendre donc l’activation de PI-3
kinases qui sont responsables de la phosphorylation de substrats, événement permettant
l’initiation de l’arrêt du cycle cellulaire, la réparation de l’ADN ou l’apoptose. Chez la
levure et les mammifères, la formation de DSBs induit aussi la formation d’IRIF
(irradiation-induced foci) qui sont constitués d’un échafaudage complexe de protéines
recrutées suite à la phosphorylation du variant d’histones H2AX. (Downs et al., 2000; Paull
et al., 2000). La phosphorylation respective de H2AX et de H2A chez les mammifères et la
levure est imputable principalement à des membres de la famille PIKK
22
(phosphoinositide-3-kinase-related protein kinase), c’est à dire ATM (ataxia
telengectesia mutated), ATR (ataxia-telengectesia related), et DNA-PK (DNA protein
kinase). Ces membres possèdent la capacité de phosphoryler spécifiquement les motifs SQ.
ATM est associé particulièrement à la réparation de l’ADN lors de la recombinaison
homologue (HR). ATR, qui est impliquée plutôt dans la réparation des bris simple brin
Figure 6 Événements lors de la réparation de l’ADN A) L’histone H2A est
phosphorylée suite à un bris à l’ADN. B) Certaines protéines et remodeleurs de la
chromatine viennent se fixer suite à la reconnaissance du bris ou de l’histone H2A
phosphorylée. C) Le remodelage de la chromatine par ces facteurs rend la région
endommagée accessible. D) Le bris est restauré par la machinerie de réparation. E)
D’autres protéines remodelant la chromatine lui permet de revenir à son état de
condensation initial. Tiré de Allard et al., 2003
23
(Zou et Elledge, 2003), est également responsable d’une partie de la phosphorylation de
H2AX lors de la HR, mais est activé plus tardivement et donc est de moindre importance
dans la réparation des DSBs. DNA-PK est aussi responsable de la phosphorylation
d’H2AX, mais le fait plutôt dans un contexte où la recombinaison homologue n’est pas
possible et où l’ADN est réparé par NHEJ (non-homologous end-joining).
Malgré que ces kinases possèdent toutes une certaine affinité pour l’ADN, leur
recrutement aux sites de dommages est principalement attribuable à certaines protéines
partageant des caractéristiques bien spécifiques. Effectivement, les protéines ATM, ATR et
DNA-PK sont recrutées aux sites de coupures par Nbs1, ATRIP et par l’hétérodimère
Ku70-Ku80 respectivement (Falck et al., 2005). Ces protéines possèdent une séquence
conservée en C-terminal permettant leur liaison à un membre de la famille des PIKKs
(Falck et al., 2005). En plus d’être des senseurs pour les dommages à l’ADN et d’y
permettre le recrutement de facteurs essentiels à la transmission de signaux, certaines de ces
protéines sont considérées comme étant des activateurs de l’activité kinase des PIKKs
(Falck et al., 2005)..
Nbs1 (Xrs2 chez la levure), fait partie du complexe MRN (MRX chez la levure).
En réponse à un DSB, ce complexe se lie au site de coupure, recrute ATM et permet son
activation. En effet, la liaison d’ATM à Nbs1 encourage la monomérisation des dimères
d’ATM et éveille une activité kinase latente (Bakkenist et Kastan, 2003) ce qui stimule la
phosphorylation d’une variété de cibles, notamment H2AX, p53, BRCA1, CHK2, MRN
ainsi que son autophosphorylation. MRN est un complexe très conservé impliqué dans la
phase initiale du processus de réparation des DSBs. Il a la capacité de lier l’ADN et
possède une activité endonucléase et exonucléase 3’ et 5’ capables de défaire les structures
secondaires de l’ADN (Paull et Gellert, 1999; D'Amours et Jackson, 2002). Le complexe
MRN est composé de deux exemplaires de Mre11 liés à un dimère de Rad50 (Trujillo et
Sung, 2001) et stabilisé par Nbs1. Chaque protéine est nécessaire à l’accomplissement des
fonctions de ce complexe. Enfin, l’interaction physique entre Nbs1 et H2AX pourrait
aider à la concentration du complexe MRN lors de DSBs (Kobayashi et al., 2002) lui
permettant l’accomplissement de ses fonctions.
24
Parallèlement, l’activation de DNA-PK nécessite aussi l’intervention du senseur qui
lui est associé. En plus de se lier aux extrémités double brin, Ku80 permet l’activation de
l’activité kinase de DNA-PK nécessaire à la progression des mécanismes de réparation
(Falck et al., 2005).
Plusieurs évidences témoignent de la nécessité de senseurs tels MRN (ou MRX) et
Ku70/Ku80 lors de la détection des dommages à l’ADN ainsi que leur aptitude à lier et à
activer les protéines nécessaires à la poursuite des événements menant à la réparation
(Falck et al., 2005)..
Association de complexes modifiant la chromatine suite aux DSBs
Malgré la publication du modèle ARR (access, repair, restore) par Smerdon, en
1991 (Smerdon, 1991), la participation des complexes modifiant la chromatine dans les
processus menant à la réparation de l’ADN a été reconnue que tout récemment (figure 6B
et 6C). Ainsi, plusieurs évidences ont d’abord montré le caractère essentiel de l’acétylation
des lysines de l’histone H4 en situation de dommage à l’ADN. En effet, la mutation de
celles-ci provoque une sensibilité aux agents causant des DSBs (Bird et al., 2002). De
même, la délétion de sous-unités essentielles à l’acétylation de ces résidus, Esa1 (Allard et
al., 1999), Yng2 (Nourani et al., 2001), Epl1 (Boudreault et al., 2003) ainsi que d’autres
sous-unités de NuA4 telle Eaf1 (Auger et al, soumis) engendre également une sensibilité
aux agents causant des DSBs, suggérant ainsi l’implication du complexe NuA4 dans la
réparation des DSBs. De récentes études ont effectivement démontré la rétention de NuA4
aux DSBs. En effet, ce complexe est maintenu aux DSBs via la liaison de la sous-unité
ARP4 à l’histone H2A phosphorylée sur la sérine129 (Downs et al., 2004).
L’accumulation de NuA4 au site de dommages à l’ADN semble être également un
événement essentiel au recrutement d’autres complexes remodelant de la chromatine. En
effet, la délétion de la sous-unité catalytique de NuA4, Esa1, ne permet plus le recrutement
des complexes contenant les hélicases RuvB , c’est-à-dire SWR1 et INO80 (Downs et al.,
2004). En accord avec le fait que Tip60, l’orthologue humain de NuA4, possède des
25
hélicases de la famille ruvB (RUVBL1, RUVBL2, (Ikura et al., 2000)) ainsi qu’une sous-
unité possédant une activité ATPase SWI/SNF-related (p400, (Doyon et al., 2004)) (ce que
NuA4 ne possède pas), il a été suggéré que l’acétylation des régions adjacentes aux DSBs
chez la levure permettrait le recrutement de complexes modifiant la chromatine d’une façon
dépendante de l’ATP tels INO80 et SRW1(possédant également les hélicases de la famille
ruvB) (Downs et al., 2004).
D’autres complexes modifiant la chromatine semblent également être impliqués
dans la réparation de l’ADN. Ainsi, comme mentionné ci-haut, plusieurs évidences nous
incitent à croire que les complexes ATP-dépendants SWR1 et INO80 participent à la
réparation de l’ADN. La double délétion des sous-unités possédant des bromodomaines
(domaine pouvant se lier aux lysines acétylées) du complexe SWR1, c’est-à-dire Bdf1 et
Swr1, provoque une sensibilité aux agents endommageant l’ADN (Matangkasombut et
Buratowski, 2003; Mizuguchi et al., 2004), suggérant que le complexe SWR1 pourrait être
recruté au site de cassure via sa liaison à des lysines acétylées (d’où l’importance de
NuA4). De la même façon, les mutants ino80 manifestent aussi une sensibilité aux agents
causant des DSBs. La présence de protéines ruvB-like dans les complexes SWR1 et INO80
pourrait faciliter la recherche d’homologies ou de microhomologies dans la HR
(recombinaison homologue). En effet, les protéines ruvB-like facilitent la migration de la
jonction des hétéroduplexes d’ADN lors de la HR (West, 1997). Le modèle de recrutement
de complexes par l’acétylation des régions endommagées est également supporté par le fait
que des mutations effectuées dans le bromodomaine de l’hélicase Sth/Nps1, sous-unité
catalytique du complexe de remodelage ATP-dépendant RSC, provoque une sensibilité aux
agents causant des DSBs (Koyama et al., 2002).
Enfin, plusieurs autres études démontrent le caractère essentiel des complexes
remodelant la chromatine dans la réparation. La mutation de l’orthologue humain d’Esa1,
Tip60, provoque une sensibilité aux rayons γ (Ikura et al., 2000). Les complexes SWI/SNF
(Hara et Sancar, 2002; Gaillard et al., 2003)et GCN5 (Tamburini et Tyler, 2005) ont été eux
aussi impliqués directement dans la réparation de l’ADN.
26
Les voies de réparation de l’ADN
À la suite de la transmission du signal de dommage à l’ADN et de la levée de la
barrière chromatinienne aux sites de bris, une multitude de facteurs de réparation entre en
action (figure 6D). Dépendamment de la nature des lésions, certaines voies de réparation
seront favorisées. Ainsi, la dimérisation de pyrimidine (CPD ; cyclobutane pyrimidine
dimers, 6-4 PP, Pyrimidine 6-4 pyrimidone photoproducts) est réparée par NER (nucleotide
excision repair), un mécanisme de réparation par lequel les nucléotides endommagés sont
excisés. L’oxydation, l’alkylation ou la dépurination des bases de l’ADN sont par contre
réparées par BER (base excision repair). Enfin, un DSB, comme mentionné
précédemment, induit la réparation par HR ou NHEJ. Chez la levure, les DSBs sont
principalement réparés par HR, tandis que chez les mammifères, bien que la réparation par
HR est importante durant les phases S et G2, la NHEJ demeure la voie de réparation
privilégiée de phases G0 et G1. Brièvement, la réparation par HR est un processus où le
DSB est restauré par la recherche de séquences homologues. Au contraire, la réparation par
NHEJ implique la formation d’extrémités simple brin accompagnés de la ligation des deux
brins, rétablissant les régions où il y avait des lésions. Ce mode de réparation est par contre
responsable de l’introduction de délétions dans l’ADN (pour une revue (Allard et al.,
2004).
1.4 Domaines protéiques de NuA4
NuA4 est un complexe très polyvalent. Tel que précisé antérieurement, il est
impliqué dans une multitude de mécanismes cellulaires importants. La prévalence de ce
complexe pour la cellule est due en partie à la diversité des domaines protéiques dont sont
dotées ses sous-unités (tableau 1). En effet, bon nombre de ces domaines sont responsables
de liaisons protéine/protéine, protéine/ADN ou d’une activité catalytique particulière et
sont présents dans des protéines participant à la transcription de l’ADN, la réparation ou
tout simplement dans des protéines pouvant lier la chromatine (pour un revue, voir de la
27
Cruz et al., 2005). Voici donc le portrait général des domaines protéiques auxquels nous
nous sommes intéressés et qui se retrouvent dans le complexe NuA4.
1.4.1 Les Chromodomaines
Les chromodomaines sont constitués de 3 feuillets-β antiparallèles et d’une hélice-α
transverse et ont d’abord été identifiés comme étant un domaine commun entre deux
protéines régulant la structure chromatinienne chez la drosophile : HP1 et Polycomb (Paro
et Hogness, 1991). Cependant, ils sont retrouvés dans de nombreuses protéines intervenant
dans la modification de la structure chromatinienne. Les chromodomaines de HP1
(hétérochromatine protéin 1) et de Polycomb ont été impliqués dans la formation
d’hétérochromatine, étant capable de lier respectivement les lysines méthylées 9 et 27 de la
queue N-terminale de l’histone H3, (Min et al., 2003; Nielsen et al., 2002; Jackson et
Gorovsky, 2000). D’autres fonctions ont été également attribuées au chromodomaine de
MOF, une protéine responsable du phénomène de compensation de dose chez la drosophile.
Ce chromodomaine lierait en effet les roX (RNA on the X) et ciblerait le complexe MSL,
dont il fait partie, au chromosome [X] chez les mâles (Akhtar et al., 2000). Chez la levure,
on retrouve seulement trois protéines possédant un chromodomaine, dont deux se
retrouvent dans le complexe NuA4 ( Esa1 et Eaf3).
1.4.2 Les domaines SANT
Le domaine SANT est un motif semblable au domaine de liaison à l’ADN de la
protéine Myb et doit son nom aux protéines dans lesquelles il a d’abord été identifié
(Swi3p, Ada2, NcoR, TFIIB) (Aasland et al., 1996). Ce petit domaine composé d’environ
50 résidus est présent dans de nombreux complexes impliqués dans la régulation de la
chromatine, mais possède une fonction différente de celle du domaine de liaison à l’ADN
c-myb. On le retrouve dans des complexes remodelant la chromatine de façon ATP-
dépendant, tels ISW1 et SWI/SNF ainsi que dans des complexes HAT, tels NuA4, ADA et
28
SAGA. Bien que fonctionnellement peu connu, des évidences suggèrent l’implication du
domaine SANT dans la liaison des queues N-terminales des histones. La délétion du
domaine SANT de Ada2 provoque une diminution de l’acétylation par le complexe SAGA
(Sterner et al., 2002; Boyer et al., 2002), et sa présence est essentielle aux fonctions des
protéines Swi3 et Rsc8, sous-unités des complexes de remodelage de la chromatine
SWI/SNF et RSC (Boyer et al., 2002). Enfin, on retrouve deux domaines SANT au sein du
complexe NuA4, un dans la protéine Eaf1 et l’autre dans la protéine Eaf2.
1.4.3 Les PHD fingers
Les PHD finger consistent en un doigt de zinc Cys4-HisCys3 (Aasland et al., 1995)
qui sont retrouvés dans plusieurs régulateurs de la chromatine. Des mutations dans ce
domaine ont été retrouvées dans plusieurs tissus cancéreux et ce domaine semblent
impliqué dans de nombreuses maladies chez l’humain dont le syndrome Williams-Beuren
et le sarcome de Kaposi associé au virus de l’herpès, (Capili et al., 2001; Pascual et al.,
2000). Les protéines de la famille ING (inhibitor of growth), qui sont des suppresseurs de
tumeurs liés à la fonction de p53, possèdent tous un PHD finger en C-terminal, au même
titre que ses orthologues chez la levure Pho23, Yng1 et Yng2. Toutes ces protéines font
partie de complexes HATs ou HDACs et sont comprises toutes particulièrement dans les
modules protéiques possédant l’activité catalytique. Le PHD finger de Yng2 est connu pour
avoir un rôle dans la transcription dépendante de p53 (Nourani et al., 2001). La
conservation de ce domaine dans l’évolution malgré l’absence de p53 chez la levure
suggèrent l’importance de ce domaine. Plusieurs PHD fingers possèdent également la
capacité de lier les phosphoinositides, assemblant ainsi les PHD fingers à la signalisation
associée aux lipides nucléaires. Ainsi, le complexe SWI/SNF-like BAF (Zhao et al., 1998)
ainsi que la protéine ING2 (Gozani et al., 2003) possèdent la capacité à lier certains
phosphoinositides. On remarque également la présence des PHD fingers dans de nombreux
membres de la famille MYST.
29
1.4.4 Les domaines PI-3 kinase des membres de la famille ATM (PIKK)
Les PI-3 kinases, des protéines retrouvées dans tous les types cellulaires étudiés
jusqu’à maintenant (Katso et al., 2001), sont impliqués dans de nombreuses fonctions clefs
dans la cellule. Elles jouent un rôle dans la prolifération cellulaire, la motilité, la
différentiation cellulaire, le trafic intracellulaire et le maintien de l’intégrité du génome. On
classe les PI-3 kinases en quatre grandes familles selon l’homologie de séquence de leur
domaine catalytique. Bien que les membres de la classe I, II et III soient majoritairement
cytoplasmiques et impliqués dans la phosphorylation de phospholipides inositols, les
membres de la classe IV participent plutôt à la phosphorylation de cibles nucléaires non
lipidiques. Les protéines de cette famille, appelée PIKKs, partagent tous un domaine PI-3
kinase ainsi que des domaines FAT et FATC qui sont des domaines d’homologie qui ont
d’abord été retrouvés au sein des protéines FRAP, ATM et TRAAP (FAT, FATC : FAT c-
terminal) (Bosotti et al, 2000). La famille des PIKKs comprend les protéines ATM, ATR,
TRRAP et DNA-PK , les orthologues de Tel1, Mec1 et Tra1 chez la levure. Il est à noter
qu’il n’existe pas d’orthologue de DNA-PK chez la levure. Les PIKKs phosphorylent
préférentiellement les motifs LSQE, TQ/SQ et SQ ce qui permet de réguler une multitude
de fonctions dont le contrôle du cycle cellulaire, l’apoptose et la réparation de l’ADN. Par
contre, on note l’absence des motifs DXXXXN et DFG au sein des domaines PI-3 kinase
de Tra1 et de TRRAP, des domaines présumément responsables de la liaison de l’ATP lors
de la phosphorylation (McMahon et al., 1998). Ceci explique l’absence d’activité kinase de
ces protéines (McMahon et al., 1998).
30
1.5 Hypothèses de recherche, objectifs et approche utilisée
Le complexe NuA4, comme expliqué précédemment, est impliqué dans une grande
variété de mécanismes cellulaires importants. Plusieurs protéines ou modules protéiques
ont déjà été associés à des fonctions importantes chez la levure (section 1.3.1).
Notamment, le module Piccolo composé d’Yng2, d’Esa1 et d’Epl1 est responsable de
l’acétylation, la protéine Yng2 est impliquée dans la transcription et la protéine Arp4 du
sous-complexe Arp4/Act1/Eaf2/Yaf9 est impliquée dans la réparation de l’ADN. Par
contre, beaucoup reste encore à faire pour parvenir à comprendre précisément la façon dont
NuA4 intervient dans chacune de ces fonctions.
Des études parallèles ont également montré l’importance associée à certains
domaines protéiques chez la levure. Plusieurs de ces domaines sont responsables de la
reconnaissance spécifique de motifs précis alors que d’autres sont responsables d’une
activité catalytique particulière. Il est possible d’identifier plusieurs domaines protéiques
distribués entre les 13 protéines du complexe NuA4 et nous soupçonnons que certains
d’entre eux sont des éléments clefs dans la réalisation des différents rôles de NuA4. Ceci
nous amène donc à émettre l’hypothèse selon laquelle certains domaines protéiques sont
nécessaires à l’accomplissement des fonctions de NuA4 et sont responsables de la
spécificité d’intervention du complexe NuA4.
L’objectif de mes travaux de maîtrise était donc d’étudier la fonction de quatre
domaines protéiques retrouvés chez NuA4, le chromodomaine de Esa1, le domaine SANT
de Eaf2, le PHD finger de Yng2 et le domaine PI-3 kinase de Tra1. Ceci nous permettra de
préciser le rôle joué par les sous-unités et les sous-complexes de NuA4 dans la réparation
de l’ADN et la transcription et ainsi mieux cibler l’importance de NuA4 au sein de ces
mécanismes.
Dans un premier temps, nous désirons effectuer la caractérisation fonctionnelle du
chromodomaine, du domaine SANT et du PHD finger par la mutation des principaux
résidus conservés dans chacun de ces domaines. Des analyses comparatives avec les
31
mêmes domaines retrouvés chez d’autres protéines nous permettront de déterminer les
résidus conservés et par le fait même ceux qu’il nous faudra muter. De plus, la production
de protéines recombinantes contenant plusieurs portions différentes de la protéine Tra1
nous aidera à déterminer le rôle de cette protéine ainsi que celui de son domaine PI-3
kinase. Dans un deuxième temps, des études fonctionnelles seront réalisées avec divers
mutants, ce qui permettra d’évaluer la contribution des différents domaines dans la fonction
du complexe.
32
Chapitre 2 Matériel et méthodes
2.1 Plasmides et souches
Les plasmides et les souches qui ont servi à cette étude sont décrits respectivement
dans les tableaux 2 et 3.
2.1.1 Plasmides et souches utilisés dans l’étude des chromodomaines
Les différentes mutations du chromodomaine de Esa1 ont été transférées d’un
plasmide pBluescript (Selleck et al, Annexe 1) à un vecteur de levure par amplification
PCR avec des amorces contenant un site de restriction BamH1 à leur extrémité (tableau 4).
Les produits d’amplification ont été ensuite digérés avec BamH1 et ligaturés dans un
plasmide BFG6 préalablement digéré avec BamH1. BFG6 est un plasmide de 2μm
disposant du promoteur de la phosphoglycérol kinase, de six épitopes d’hémagglutinine
(HA) en N-terminal ainsi que d’un marqueur de sélection LEU (John et al., 2000). Chaque
plasmide a été vérifié par séquençage et transformé dans la souche QY118. Les clones
résultants ont été sélectionnés sur milieu SC (Synthetic Complete) dépourvu de leucine et
d’uracile. La bonne expression in vivo des protéines Esa1 mutées a été vérifiée par
immunobuvardage sur des extraits cellulaires à l’aide d’un anticorps contre l’épitope HA
(Roche) (voir section 2.8).
2.1.2 Plasmides et souches utilisés dans l’étude du domaine SANT de Eaf2
Les mutations du domaine SANT de Eaf2 ont été réalisées par mutagenèse dirigée
selon le protocole du Quick Change Site Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) sur un
plasmide pBluescript contenant le gène Eaf2 (D. Cronier, non-publié). Les produits
d’amplification générés grâce au plasmide contenant le domaine de SANT de Eaf2 muté
33
ont été ensuite digérés avec EcoR1 et Xho1 et ligaturés dans un plasmide BFG1
préalablement digéré avec les mêmes enzymes. BFG1 est un plasmide de 2μm disposant
également du promoteur de la phosphoglycérol kinase, de trois épitopes d’hémagglutinine
(HA) en N-terminal. La partie contenant l’insert à été ensuite digérée avec HindIII et
ligaturée dans un plasmide pfl36 (digéré avec HindIII), qui contient un marqueur LEU.
Chaque plasmide a été vérifié par séquençage et transformé dans la souche QY144. Les
clones résultants on été sélectionnés sur milieu SC Leu- et Ura-. L’expression in vivo des
protéines Eaf2 mutées à été vérifiée par immunobuvardage sur des extraits cellulaires à
l’aide d’un anticorps contre l’épitope HA (voir section 2.8).
2.1.3 Plasmides d’expression des protéines de fusion GST
Les différentes parties de Tra1 ont été amplifiées par PCR (polymerase chain
reaction) à partir d’ADN génomique. Les amorces (forward et reverse) contenaient
respectivement un site de restriction BamH1 et Not1 (Tra1 N-terminal) et un site de
restriction BamH1 et Xho1 (Tra1 C-terminal) à leur extrémité (Tableau 4). Les produits
d’amplification ont ensuite été digérés respectivement avec BamH1/Nco1 et BamH1/Xho1,
ligaturés dans un plasmide pGEX4T3 (Amersham Pharmacia Biotech) préalablement
digéré avec les mêmes enzymes.
2.1.4 Plasmides et souches utilisés pour les essais transcriptionnels p53 dépendant
Le PHD finger de la protéine Yng2 d’une souche LPY (Lorraine Pillus yeast) a été
muté par recombinaison homologue grâce à un produit PCR intégrant la mutation et le gène
de résistance à la kanamycine en C-terminal de Yng2 (Longtine et al., 1998) (tableau 4).
Les plasmides pfl38/pfl38cub7 et cub103 (Di Como et Prives, 1998) ont été intégrés aux
souches possédant YNG2 muté et sauvage par transformation cellulaire. Les clones ont été
sélectionnés sur milieu minimum dépourvu d’uracile et de tryptophane.
34
2.1.5 Autres souches utilisées
Les souches utilisées pour effectuer la purification du complexe MRX par TAP
(tandem affinity purification) proviennent de Open Biosystem (tableau 3). La souche
EPL1-TAP utilisée pour les différentes purifications du complexe NuA4 a été produite par
Nicolas Lacoste (voir tableau 3).
La souche bactérienne exprimant la protéine de fusion Tra1 interne/GST a été
produite par Liette Haché (tableau 3)
La souche JKM139, utilisée pour les ChIPs (Chromatin ImmunoPrecipitation),
provient du laboratoire de J. Haber (Sugawara et al., 2003). La délétion du gène MRE11 a
été effectuée par l’amplification PCR et la recombinaison homologue du gène codant pour
la résistance à la kanamycine flanqué des séquences du promoteur et du terminateur de
MRE11 (avant l’ATG et après le TGA) (Longtine et al., 1998). La matrice utilisée est le
plasmide pFA6-KanMX4 (Wach et al., 1994) et les amorces utilisées sont décrites dans le
tableau 4.
La souche SK1 nous provient du laboratoire Lichten et est un dérivé de la souche
SK1 utilisée par Kane et Roth, en 1974. (tableau 3)
2.2 Chasse plasmidique et tests de croissance
La chasse plasmidique nécessaire aux tests de croissance a été effectuée selon la
procédure standard (Fröhlich Kai-Uwe, 1992). Les levures possédant une version sauvage
et une version mutée du gène ESA1 sur des plamides URA3 et LEU2 respectivement ont été
cultivées pendant 12 heures dans un milieu ne contenant pas d’uracile et de leucine. Ces
cultures ont été diluées à une densité optique à 600 nm (DO600) de 0,25 et cultivées 90
minutes à 30°C. Des dilutions en série d’un facteur 10 ont été ensuite effectuées et 5 μl de
chacune de celles-ci ont été déposées sur un pétri YPD (Yeast/peptone/dextrose) (milieu
35
riche : 1% extrait de levure, 2% peptone, 2% glucose) et un pétri HC (Hartwell-complete)
dépourvu de leucine et contenant 0,1% d’acide 5’ fluoroorotic (5’FOA), ce qui permet de
chasser le plasmide contenant le gène ESA1 sauvage. Les pétris ont été incubés à 30°C
pendant 2 à 4 jours et la croissance a été évaluée quotidiennement. Les tests de sensibilité
aux drogues ont été effectués en ajoutant les drogues suivantes à du YPD/ 2% agar refroidi
à 50°C : MMS (Aldrich, 0,04%), Rapamycine (25 ηM) et HU (100 mM).
2.3 Northern
Le Northern a été effectué pour quantifier les transcrits dépendant de p53. Les
cultures ont été mises en croissance pendant 12 heures dans des milieux minimums
possédant les acides aminés nécessaires (afin de conserver les plasmides) et réinoculées à
une DO600 de 0,1 dans du YPD. Les extraits cellulaires ont été faits à partir des cultures
ayant atteint une densité optique de 1. L’ARN total a été purifié par la méthode du phénol
chaud. (Schmitt M.E., 1990). L’ARN (15 μg) ont été séparés par électrophorèse sur un gel
d’agarose/formaldéhyde , transférés et pontés sur une membrane de nylon Hybond
(Amersham). L’hybridation a été réalisée dans du tampon phosphate 0,5 M (pH 6,8), 7%
SDS (sodium dodecyl sulfate) et 1% BSA (bovine serum albumin). Des amorces
permettant d’amplifier les ORFs (open reading frame) HIS3 et ACT1 par PCR ont été
utilisées pour produire les sondes qui ont été radiomarquées à l’aide du Multiprime
Labeling System (Amersham). Les amorces utilisées sont décrites dans le tableau 4. Le
tout a été exposé sur un film BioMax XAR (Kodak),
2.4 Purification protéique
2.4.1 Purification de complexes protéiques par TAP (Tandem Affinity Purification)
La méthode de purification par le système TAP permet une purification de haute
qualité des complexes protéiques par le passage successif d’un extrait cellulaire sur deux
36
colonnes d’affinité (billes IgG et billes calmoduline) tel qu’illustré à la figure 7.
L’intégration d’une cassette TAP contenant une séquence de liaison à la calmoduline, un
site de clivage à la TEV et la région codant pour la protéine A a été effectuée en C-terminal
de Epl1 (construit par Nicolas Lacoste), de Mre11 et Xrs2 (Open Biosystem). Les extraits
cellulaires ont été effectués selon les procédures standards (Boudreault et al., 2003) à partir
de cultures de 12 l (Tap Epl1) et de 6 l (Tap Mre11, Tap Xrs2) de levure dont la densité
optique a atteint 2,5. La première purification est effectuée à l’aide de billes IgG dans un
tampon d’extraction (Boudreault et al., 2003) NaCl 350mM. Après les lavages, le tout a été
élué grâce à l’ajout de 30 unités de TEV (tabacco etching virus). Une deuxième
purification a été ensuite faite sur une résine calmoduline. L’élution finale à partir cette
résine a été effectuée sur une colonne BioRad avec 3 ml de tampon d’élution (Boudreault et
al., 2003) EGTA 20 mM en 6 fractions de 500μl.
Figure 7 Méthode de purification TAP
Tiré du site http://www.cgm.cnrs-gif.fr/epissage/
37
2.4.2 Purification de protéines de fusion avec la GST
Les plasmides d’expression des diverses protéines de fusion GST ont été
transformés dans la souche bactérienne BL21 (Novagen) d’Escherichia coli. Les cultures
(3 ml) ont été ensuite amenés à une DO600 de 0,4. L’induction de l’expression protéique a
été alors provoquée par l’ajout de 200 μg/ml d’isopropy-β-D-thiogalactopyranoside dans
du milieu LB (1% extrait de levure, 1% tryptone) et les bactéries ont été ensuite incubées 3
heures à 37°C. Après avoir été digéré par 12,5 mg de lysosyme 10 minutes sur glace,
l’extrait protéique a été soniqué et a été incubé en présence de résine glutathion-sépharose
4B (Amersham Bioscience) pendant 1 heure. Dix volumes de tampon de lavage (Hepes pH
7.5 150 mM, EDTA 1mM, DTT 5mM, 0,05% Np40, 10% Glycérol, 150μg/ml BSA, PMSF
0,5 mM, NaCl 100 mM) ont permis de nettoyer la résine sur une colonne BioRad. La
qualité de la purification a été vérifiée par migration sur gel dénaturant standard 8%
acrylamide et coloré au Bleu Coomasie (0,02%).
2.5 Chromatographie d’affinité
Des chromatographies d’affinité ont été effectuées pour déterminer s’il existait une
interaction entre le complexe MRX et Tra1. Des protéines de fusion GST recombinantes
ont été exprimées et purifiées sur des billes glutation-Sépharose tel que décrit
antérieurement. Les chromatographies d’affinité ont été réalisées selon le protocole
standard (Utley et al., 1998). Le complexe MRX (70 μl) issu de la fraction#2 d’une
purification TAP ont été utilisés pour chacun des essais et des quantités équivalentes de
billes et de protéines recombinantes ont été utilisées pour chacun de ceux-ci.
38
2.6 ChIP (Chromatin ImmunoPrecipitation)
2.6.1 ChIPs dans le système HO
Les souches JKM139 et QY918 (JKM139ΔMRE11), qui disposent d’un système
dans lequel l’expression de l’endonucléase HO est inductible par l’ajout de galactose ont
été mises en culture dans du YPD. Les cultures en phase exponentielle ont été inoculées en
milieu raffinose pour 10 heures et ont été induites par l’ajout de galactose (2%
concentration finale) pendant 2 heures. Les protéines ont été pontées à l’ADN par
l’addition de formaldéhyde (1% concentration finale) pendant 20 minutes. La réaction a été
stoppée par l’ajout de glycine (concentration finale 2%). La chromatine a été purifiée selon
les méthodes standards (Downs et al., 2004) et soniquée 10 fois 30 secondes .grâce au
Bioruptor (Diagenode). Une pause de 1 minute sur glace était effectuée entre chacun des
coups. 100 μl de chromatine ont été utilisés pour chaque essai et les immunoprécipitations
ont été effectuées selon le protocole standard (Kuo et Allis, 1999) avec les quantités
suivantes d’anticorps : 3 μl α-Eaf1 (Auger et al., soumis.), 3 μl préi-mmun non-purifié
(Auger et al., soumis). L’ADN a été quantifié à l’aide d’un Lightcycler (Roche) par PCR
quantitatif au site de coupure HO (locus MAT) et les amorces utilisées sont décrites dans le
tableau 4. Chaque paire d’amorces a été testée pour sa spécificité ainsi que pour son
efficacité. Toutes les réactions ont été effectuées en duplicata et les valeurs calculées
représentent les pourcentages d’IP (Immunoprécipitation) obtenus avec l’anticorps α-Eaf1
près de la coupure (Amorces TAFII) soustrait des valeurs obtenues avec le sérum contrôle
(pré-immun) au même endroit. Le tout est normalisé sur une région contrôle (Int V).
2.6.2 ChIPs aux bris d’ADN durant la méiose
La synchronisation des cellules en méiose a été réalisée de la façon suivante : la
souche SK1 (tableau 3) a d’abord été inoculée dans 5 ml de YPD 10 heures à 30°C. Les 5
ml ont été transférés dans 200 ml de YPA (1% extrait de levure, 2% peptone, 2% KAc)
39
pendant 16 heures. Un examen microscopique a ensuite confirmé le bon conditionnement
des levures par la taille uniforme des cellules, la présence de chaîne de cellules et de
quelques spores. Les cultures ont été centrifugées à 4000 g 7 minutes à 4 oC, lavées dans
l’eau et resuspendues dans 200 ml de milieu qui induit la sporulation (0,1% extrait de
levure, 0,05% glucose, 1% KAc). Ceci constitue le temps 0 de l’induction de la sporulation.
Un pontage au formaldéhyde de 20 minutes (1% concentration finale) marque la fin de
chaque induction méiotique. Les réactions de pontage sont inhibées par l’ajout de glycine
(2% concentration finale). 150 μl de chromatine ont été utilisés pour chaque essai et les
immunoprécipitations ont été effectuées selon le protocole standard (Kuo et Allis, 1999)
avec les quantités suivantes d’anticorps (voir section 2.6.1): 3 μl α-Eaf1 non-purifié (Auger
et al., soumis.), 3 μl Pré-immun non-purifié (Auger et al., soumis.). L’ADN a été quantifié
à l’aide d’un Lightcycler (Roche) et les amorces utilisées sont décrites dans le tableau 4.
Toutes les réactions ont été effectuées en duplicata et les valeurs calculées sont les
pourcentages d’IP obtenus avec l’anticorps α-Eaf1 près de la coupure (Amorces ARG4 et
URA3) normalisés sur une région contrôle (TAFII) (voir tableau 4)
2.7 Essai kinase
Les essais kinase ont été effectués avec 3 μl de fractions #2 (voir section 2.4.1)
provenant des diverses purifications protéiques nécessaires. Les complexes utilisés (MRX
et NuA4) ont été d’abord incubés 30 minutes à 30 °C pour permettre l’établissement
d’interactions s’il y a lieu. Un tampon spécifique aux kinases de la famille ATM (Hepes 50
mM, MgCl2 10 mM, MnCl2 10 mM, 10% glycérol, DTT 1 mM, ATP 30 mM, ATPγ-32P
0,67 μM, 50 μg/ml BSA) a été ajouté aux échantillons. Le tout est incubé 1 heure à 30°C.
Ceux-ci (15 μl essai + 5 μl de tampon Laemmli 4X) sont chargés sur un gel de
polyacrilamide (gradient 4-12%) (Invitrogen), migrés dans un tampon MES (1,2% MES,
0,75% Tris, 1,25% SDS, EDTA 1,25 mM) à 160 V jusqu’à la sortie du bleu et transférés 3
heures à 4°C sur une membrane de nitrocellulose. Les membranes ont été exposées sur
40
films BioMax XAR (Kodak) entre 1 à 7 jours ou sur un écran Phospho-Imager (Molecular
dynamics) durant une nuit.
2.8 Immunobuvardages
Les diverses purifications TAP (15 μl d’extrait + 5 μl Laemmli buffer 4X) sont
chargées sur gel 4-12% (Invitrogene), migrées 60 min à 200V et transférées sur une
membrane de nitrocellulose à 75V, 3 heures à 4°C. Anticorps utilisés : α-Eaf1 à une
dilution de 1/2500, α-LSQE phosphorylé (Cell signaling) à une dilution de 1/250 les deux
utilisés dans 3% lait. 5 lavages de 5 minutes dans du PBST 1X (phosphate buffered saline,
0.9% NaCl, 0.3% Trition X-100, pH7.4) ont été effectués. Les anticorps primaires ont été
incubés avec les membranes pendant 12 heures à 4°C. Dans tous les cas un anticorps anti-
IgG de lapin conjugué à la HRP (horse raddish peroxydase) a été utilisé à une dilution
1/10000. Les anticorps secondaires ont été incubés 1 heure à température ambiante. Des
lavages (7) de 5 minutes dans du PBST 1X ont été par la suite réalisés. La révélation a été
faite par ECL (Amersham) sur un film Kodak Les membranes de nitrocellulose utilisées
ont été préalablement bloquées 1 heure dans un solution PBST 1X 5% lait.
41
Tableau 2 Plasmides
Nom Description des plasmides Référence
BFG6 Promoteur PGK, 6HA, 2μ, LEU2 (Nourani et al.,
1997)
pIF1 Promoteur PGK, 6HA, 2μ, LEU2/ Esa1E65L Cette étude
pIF2 Promoteur PGK, 6HA, 2μ, LEU2/ Esa1E65A Cette étude
pIF3 Promoteur PGK, 6HA, 2μ, LEU2/ Esa1Y56A
Cette étude
pIF4 Promoteur PGK, 6HA, 2μ, LEU2/ Esa1R36A Y59A Cette étude
pIF5 Promoteur PGK, 6HA, 2μ, LEU2/ Esa1R36A Cette étude
pIF6 Promoteur PGK, 6HA, 2μ, LEU2/ Esa1Sauvage Cette étude
pAA3 Promoteur PGK, EAF2-HA, 2μ, LEU2 Cette étude
pAA6 Promoteur PGK, EAF2 SANT muté -HA, 2μ, LEU Cette étude
pIF8 PGEX4T3-440 Cette étude
pIF9 PGEX4T3 TRA1 3201-3744 Cette étude
pLH1 PGEX4T3 TRA1 1561-1860 Liette Haché,
non publié
pFL38cub7 ARS/CEN, p53(cub7) URA3 (Di Como and
Prives, 1998)
cub103 ARS/CEN, promoteur p21, HIS3, TRP (Di Como and
Prives, 1998)
42
Tableau 3 Souches
Numéro Description de la souche Source ou
référence
BY4741 S288C, MATa his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0 Research
genetic
QY118 S288C, MAT a his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0, ΔEsa1 ::Kan MX pLP795 (ESA1, ARS/CEN, URA3)
A. Boudreault
QY900 S288C MAT a his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0 plasmide BFG1
Cette étude
QY901 S288C, MAT a his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0, ΔEsa1 ::Kan MX pLP795 BFG1
Cette étude
QY902 S288C, MAT a his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0, ΔEsa1 ::Kan MX pLP795 pIF1
Cette étude
QY903 S288C, MAT a his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0, ΔEsa1 ::Kan MX pLP795 pIF2
Cette étude
QY904 S288C, MAT a his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0, ΔEsa1 ::Kan MX pLP795 pIF3
Cette étude
Qy905 S288C, MAT a his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0, ΔEsa1 ::Kan MX pLP795 pIF4
Cette étude
QY906 S288C, MAT a his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0, ΔEsa1 ::Kan MX pLP795 pIF5
Cette étude
QY907 S288C, MAT a his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0, ΔEsa1 ::Kan MX pLP795 pIF6
Cette étude
QY146 S288C, MAT a his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 lys2Δ0
eaf2 ::Kanr pPE2U (HA-Eaf2, promoteur EAF2,
ARS/CEN, URA3)
D. Cronier
QY148 S288C, MAT a his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 lys2Δ0
eaf2 ::Kanr pPE2U, pPNE2 (HA-Eaf21-285, promoteur
EAF2, ARS/CEN, LEU2)
D. Cronier
QY1110 S288C, MAT a his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 lys2Δ0
eaf2 ::Kanr pPE2U pAA3
A. Auger
43
QY1112 S288C, MAT a his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 lys2Δ0
eaf2 ::Kanr pPE2U pAA6
A. Auger
QY 911 S288C, MAT a his3Δ200 ura3-52 trp1Δ1 leu2,3-112
YNG2 PHD muté cub103 pFL38cub107
Cette étude
QY912 S288C, MAT a his3Δ200 ura3-52 trp1Δ1 leu2,3-112
YNG2 PHD muté cub103 pFL387
Cette étude
QY916 S288C, MAT a his3Δ200 ura3-52 trp1Δ1 leu2,3-112
cub103 pFL38cub107
Cette étude
QY917 S288C, MAT a his3Δ200 ura3-52 trp1Δ1 leu2,3-112
cub103 pFL38
Cette étude
Tap Mre11
7502244
S288C, MATa his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0 MRE11-TAP
Open
Biosystem
Tap Xrs2
7499991
S288C, MATa his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0 XRS2-TAP
Open
Biosystem
JKM139 S288C, MATa ade1 leu2-3,112 lys5 trp1::hisG ura3-52 hml::ADE1 hmr::ADE1 ade3::GAL-HO
(Mills et al.,
1999)
QY918 S288C, MATa ade1 leu2-3,112 lys5 trp1::hisG ura3-52 hml::ADE1 hmr::ADE1 ade3::GAL-HO MRE11:: Kanr
Cette étude
QY726 S288C, MATa his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0 EPL1-
TAP
N. Lacoste
SK1 W303, MATa/alpha HO gal2 cupS can1R (Kane et Roth,
1974)
44
Tableau 4 Amorces et PCR
PCR Nom Amorces
Esa1 CHD muté
ResGen……………Esa1 ..Forward : ResGen………...Esa1 Esa1 Reverse :
5’…GGAATTCCAGCTGACCACCATGTCCCATGACGGA AAAGAAGAAC 3’ 5’…GATCCCCGGGAATTGCCATGTTACCAGGCAAAGC GTAACTGAGAG 3’
Mutagenèse du domaine
SANT de Eaf2
#667 …Forward :
#544 …Reverse :
5’GGATGAAAGTAAAAATAGCGCTTCTTTTGCAGCAAT
AGAATACCTGTTCAATCTCTGC 3’
5’GCAGAGATTGAACAGGTATTCTATTGCTGCAAAAGA
AGCGCTATTTTTACTTTCATCC 3’
Eaf2 avec domaine
SANT muté
#648 Forward :
#651 …Reverse :
5’CAAGCGCGAACCGAATTCATGTCATCATCAGACATC
TTTGATG 3’
5’CAAGCGCGAACCCTCGAGTCACTTGGTGATTGACA
TACCAGCT 3’
Tra1 C-terminal/GST
#1033 Forward :
#1032 Reverse :
5’ACGCGGATCCCGGCGCCAGCCTTGGGAA 3’
5’ACCGCTCGAGCTAGAACCATGGCATGAAG 3’
Tra1 partie interne
#1035 Forward :
#1034 Reverse :
5’ACGCGGATCCCTACTGCCACCACAAGCTG 3’
5’ACCGCTCGAGTTAGAATAAATCATGATGGTC 3’
Tra1 N-terminal/GST
#1023 Forward :
#1036 Reverse :
5’ACGCGGATCCTCACTCACTGAGCAGATC 3’
5’ATAAGAATGCGGCCGCTTAAAGCAGCAATTTTG
CA 3’
Mutation PHD finger Yng2 -Kanamycine
#1126 Forward :
#1125 Reverse :
5’ACTGTCCCGAATGTAAAATTGAGATGGAAGCTAACG
CTCTGGCTGCTGCTGCTAACTGAAGCTTGATATCG
AATTCCT 3’
5’CTTTTCGAAAAGCACATTGTCAGAATAGCAATCACC
GTTTGTAATACGACTCACTATAGGG 3’
Délétion MRE11 -
Kanamycine
#1183 Forward :
#1184 Reverse :
5’GACGCAAGTTGTACCTGCTCAGATCCGATAAAACT
CGACTCGGATCCCCGGGTTAATTAA 3’
5’TTATAAATAGGATATAATATAATATAGGGATCAAGTA
CAAGAATTCGAGCTCGTTTAAAC 3’
45
Sonde HIS3 du Northern
ResGen His3 Forward :
ResGen His3 Reverse :
5’GGAATTCCAGCTGACCACCATGACAGAGCAGAAAG
CCCTAGTAA 3’
5’GATCCCCGGGAATTGCCATGCTACATAAGAACA
CCTTTGGTGGAG 3’
Sonde ACT1 du Northern
ResGen Act1 Forward :
ResGen Act1 Reverse :
5’GGAATTCCAGCTGACCACCATGGATTCTGGTATGT
TCTAGCGCT 3’
5’GATCCCCGGGAATTGCCATGTTAGAAACACTTGTG
GTGAACGATA 3’
TAF11 ChIP NuA4
#5 Forward :
# 6 Reverse :
5’CCAAGTGTTGATGCCGAGGAC 3’
5’GCCCATGCTAACTCATTCGTAG 3’
IntV ChIP NuA4
#38 Forward :
# 39 Reverse :
5’GGCTGTCAGAATATGGGGCCGTAGTA 3’
5’CACCCCGAAGCTGCTTTCACAATAC 3’
ARG4 ChIP méiose
#948 Forward :
#949 Reverse :
5’TACAATGCGTCTCTTCCGTA 3’
5’TTGCCAATTCTGTCTCCGTT 3’
URA3 ChIP méiose
#950 Forward
#947 Reverse :
5’TTTCCATGGAGGGCACAGTT 3’
5’AATGTCTGCCCATTCTGCTA 3’
46
Chapitre 3. Résultats
3.1 Étude fonctionnelle de différents domaines protéiques du complexe histone acétyltransférase NuA4
On retrouve au sein des sous-unités du complexe histone acétyltransférase NuA4
une grande variété de domaines protéiques (tableau 1). Plusieurs de ces domaines se sont
révélés être responsables de liaisons protéine/protéine ou ADN/protéine et ont été associés
à des fonctions cellulaires importantes comme la transcription et la réparation (pour une
revue, voir de la Cruz et al., 2005). Nous avons donc approfondi l’étude de domaines
protéiques tels le chromodomaine de Esa1, le domaine SANT de Eaf2, le PHD-finger de
Yng2 et le domaine PI-3 kinase de Tra1 et ainsi tenté d’avoir une meilleure compréhension
de la fonction de ceux-ci. Pour déterminer le rôle joué par ces domaines, nous avons
identifié les résidus qui y sont conservés pour ensuite les muter par mutagenèse dirigée.
Comme les sous-unités Esa1 et Eaf2 sont essentielles à la viabilité cellulaire, nous avons
travaillé avec des souches mutantes pour chacune de ces protéines mais possédant une
version sauvage du gène. Chaque souche exprimant donc de façon épisomale le gène
sauvage et le gène possédant un domaine muté, nous avons pu, grâce à la chasse
plasmidique, éliminer le plasmide sauvage et ainsi étudier les effets fonctionnels des
mutations de chacun de ces domaines. Les mutations dans le PHD finger ont été toutefois
introduites par transformation cellulaire à l’aide d’un produit PCR. Nous avons ainsi tiré
profit de l’excellente efficacité de la recombinaison homologue de la levure pour intégrer
nos mutations directement dans le génome. Dans le cas de Tra1, aucune étude de
mutagenèse n’a été entreprise, car les travaux antérieurs du laboratoire ont témoigné de la
non-viabilité de tous les mutants (C.J Brandl, non-publié)
47
3.1.1 Le chromodomaine de Esa1 est essentiel à la viabilité cellulaire
De récentes études en cristallographie nous ont permis d’identifier les résidus
aromatiques responsables de la formation de la poche hydrophobique du chromodomaine
de HP1, une structure qui est essentielle à la spécificité de la liaison du chromodomaine de
HP1 avec des lysines méthylées localisées sur la queue N-terminale de l’histone H3 (Jacobs
et Khorasanizadeh, 2002; Nielsen et al., 2002). Basées sur la comparaison du
chromodomaine de HP1 à celui de Esa1, d’autres études ont été menées dans le but de
préciser la fonction du chromodomaine de Esa1 dans l’activité histone acétyltransférase du
complexe Piccolo. Une collection de mutants pour le chromodomaine de Esa1 a donc été
générée par mutagenèse dirigée (Selleck et al., Annexe 1). Les mutations ont été effectuées
sur les résidus qui sont conservés évolutivement du chromodomaine de HP1 à celui d’Esa1
(Figure 8A) et qui sont localisés dans la poche hydrophobique putative du chromodomaine
de Esa1. Le résidu Y56 de Esa1 correspond au résidu W45 de HP1. De la même manière,
les résidus R36, Y59 et E65 de Esa1 correspondent respectivement aux résidus Y24, Y48 et
T54 de HP1 . Les résidus R36, Y56, Y59 et E65 ont été mutés par une alanine changeant
ainsi leur résidu chargé en un résidu hydrophobe ce qui engendrait la perte des chaînes
latérales de la poche hydrophobique putative du chromodomaine de Esa1. Comme le
modèle suggérait l’interaction d’une lysine chargée positivement avec le résidu E65
(Selleck et al., Annexe 1), la mutation de cet acide glutamique par une leucine a été
réalisée, changeant ainsi la charge négative de l’acide glutamique par un résidu
hydrophobe.
La protéine Esa1 est indispensable à la survie cellulaire. Puisque nous savons que
son chromodomaine est essentiel à l’activité histone acétyltransférase du complexe Piccolo
(Selleck et al., Annexe 1) il a été intéressant de déterminer l’importance in vivo du
chromodomaine de Esa1 et ainsi préciser la fonction de celui-ci. Par chasse plasmidique, il
a été possible de voir l’effet in vivo provoqué par les différentes mutations du CHD
(Chromodomaine) dans une souche mutée pour le gène ESA1. En effet , en présence de
5’FOA, l’absence d’Esa1 est létale pour la levure (figure 8, ligne 2) , comme il a déjà été
48
montré dans la littérature (Clarke et al., 1999). Au contraire, la complémentation de la
souche mutante pour ESA1 par une version sauvage du gène restaure parfaitement le défaut
de croissance (figure8, ligne 3), si on le compare à la souche sauvage (figure8, ligne1). Les
mutations des résidus R36A, R36A/Y56A, et E65A n’ont aucun effet sur la viabilité
cellulaire (figure 8, lignes 4, 5 et 7), ce qui corrèle bien avec l’absence d’effets majeurs sur
la capacité d’acétylation des nucléosomes chez ces mutants (Selleck et al., Annexe 1). Par
contre, on observe une chute drastique de la croissance cellulaire dans les souches
possédant les mutations Y59A et E65L (figure 8, lignes 6 et 8), ce qui coïncide de belle
manière avec une capacité d’acétylation nucléosomale presque nulle (Selleck et al. Annexe
1) chez ces mutants.
Figure 8: La cage hydrophobique du chromodomaine de Esa1 joue un rôle considérable
dans la viabilité cellulaire chez Saccharomyces cerevisiae. A) Schématisation des
différents résidus mutés dans le chromodomaine de Esa1. B) La mutation de plusieurs
résidus conservés dans la cage hydrophobique du chromodomaine de Esa1 affecte
sévèrement la viabilité cellulaire chez Saccharomyces cerevisiae ainsi que l’activité HAT
sur la chromatine.
A
-
35 ERLAEILSINTRKAPPKFYVHYVNYNKRLDEWI 70
MYST HATCHD
B 1 35 86 160 435 445
+++
+++
+++
+++
+++
-
-
-
Activitˇ HAT surla chromatine
49
3.1.2 Rôle de la protéine Eaf2 et de son domaine SANT chez Saccharomyces cerevisiae
La protéine Eaf2 est une protéine essentielle à la survie de la cellule et possède un
domaine SANT. Se retrouvant dans plusieurs protéines impliquées dans le remodelage de
la chromatine, ce domaine a été rapporté dans la littérature comme étant nécessaire à la
stabilisation des queues N-terminales des histones et donc possédant la capacité de lier les
queues non-modifiées d’histones. Étant donné l’importance du rôle que joue NuA4 au
niveau du remodelage chromatinien, il a été intéressant d’observer l’implication que
pouvait avoir le domaine SANT de Eaf2 au sein de la cellule.
La protéine Eaf2 est impliquée dans la croissance cellulaire
Différentes constructions génétiques ont donc été faites pour vérifier les rôles que
peuvent jouer Eaf2 et son domaine SANT dans la cellule. Les travaux du laboratoire
avaient déjà permis d’obtenir une souche produisant la protéine Eaf2 tronquée en C-
terminale, tout juste à la suite du domaine SANT (figure 9A) (Auger et al., soumis). Par
l’alignement avec d’autres domaines SANT, les principaux résidus conservés du domaine
SANT de Eaf2 ont été identifiés puis mutés par mutagenèse dirigée. Il s’agit des résidus,
W173, S174 et E177 (figure 9A). Tous ces résidus ont été mutés par une alanine. Par
chasse plasmidique, nous avons voulu observer l’effet des différentes mutations dans des
souches mutantes pour Eaf2. Il a donc été possible d’observer que l’absence d’Eaf2 était
létale pour la cellule (figure 9B, ligne 2). Par contre, la présence de la protéine sur un
plasmide ne contenant pas le gène URA (figure 9B, ligne 4) provoque un phénotype de
croisssance semblable à celui de la souche sauvage (figure9B, ligne 1). Par contre, le
domaine SANT ne semble pas être nécessaire à la croissance cellulaire. En effet, la
mutation des principaux résidus conservés n’affecte pas la viabilité cellulaire (figure 9B,
ligne 5). Cependant, la délétion de la portion C-terminale de la protéine provoque un léger
défaut de croissance (figure 9B, ligne 3), attestant donc de l’importance de cette partie pour
la cellule.
50
La protéine Eaf2 semble impliquée dans la réparation des bris double brin de l’ADN
Nous avons ensuite exposé nos souches mutantes à différentes drogues pour vérifier
l’implication de la partie C-terminale de Eaf2 ainsi que de son domaine SANT dans
d’autres mécanismes cellulaires. Nous avons d’abord utilisé le MMS pour vérifier
l’importance de la fonction de ces domaines dans la réparation de l’ADN. Le MMS est un
agent alkylant l’ADN qui peut provoquer des cassures simple et double brin. Une
sensibilité à cette drogue dénote d’un défaut de fonction des sentiers de réparation. Puisque
nous savons que NuA4 occupe un rôle majeur dans la cascade d’événements menant à la
réparation et que plusieurs sous-unités de NuA4 sont sensibles au MMS (Lacoste et al.
soumis; Auger et al. soumis; Boudreault et al., 2003) il était logique de penser à
l’implication de l’une des parties de Eaf2 dans la réparation. En effet, après traitement au
MMS nous avons remarqué un défaut de croissance sévère dans la souche possédant la
protéine Eaf2 tronquée en C-terminal (figure 9C, ligne 8). De plus, il est possible
d’observer une légère sensibilité au MMS dans la souche pourvue d’un domaine SANT
muté (figure 9C, ligne 10), nous fournissant ainsi un sérieux indice quant à la participation
de Eaf2 dans la réparation de l’ADN. Il est à noter que la souche sauvage et que les
souches complémentées par un plasmide contenant le gène ne manifestent aucun défaut de
croissance (figure 9C, lignes 6, 7, 9).
Nous avons également traité nos cellules à la rapamycine. La rapamycine est un
inhibiteur des kinases TOR (target of rapamycine), kinases qui sont des membres de la
famille PI-3 kinase/ATM-related. Elles agissent en tant que senseurs des nutriments et
contrôlent ainsi la synthèse protéique. Comme le mutant de la sous-unité Eaf1 de NuA4,
qui possède un domaine SANT, a été identifié comme étant très sensible à la rapamycine et
que NuA4 est reconnu pour être recruté au niveau du promoteur des gènes ribosomaux en
tant que co-activateur transcriptionnel (Reid et al., 2000), nous pouvions nous attendre à
l’implication de la protéine Eaf2 dans ce sentier métabolique. Par contre, comme il est
possible de le constater, aucune souche n’est sensible à la rapamycine, infirmant donc notre
hypothèse (figure 9C).
51
Nous avons enfin testé la sensibilité de nos souches à l’hydroxyurée. Cette drogue
inhibe la fonction de la ribonucléotide réductase, entraînant donc l’arrêt de la production
d’adénosine et donc une interruption de la synthèse de l’ADN. Ceci affecte alors les
processus de réplication et provoque des dommages. Les différentes mutations ne
provoquent toutefois aucune sensibilité à cette drogue (figure 9C).
Figure 9 : La portion C-terminale de la protéine Eaf2 chez Saccharomyces cerevisiae est
essentielle à la viabilité cellulaire et semble impliquée avec le domaine SANT de Eaf2 dans
les mécanismes de réparation de l’ADN. A) Schéma représentant les différents résidus mutés
dans le domaine SANT de Eaf2 ainsi que la protéine Eaf2 tronquée en C-terminale. B) La
mutation de 3 résidus conservés du domaine SANT de Eaf2 n’affecte pas la viabilité
cellulaire chez Saccharomyces cerevisiae contrairement à la délétion de la partie C-terminale
de cette protéine. C) Le traitement à un agent causant des bris à l’ADN provoque une légère
sensibilité dans le cas des souches possédant des mutations dans leur domaine SANT et une
non-viabilité dans les souches où il y a absence de la portion C-terminale de la protéine Eaf2.
Aucun autre phénotype n’a été remarqué relativement aux traitements à d’autres drogues.
A B
C
52
3.1.3 L’importance du PHD finger de Yng2 dans la transcription dépendante de p53
La poursuite de la caractérisation des domaines protéiques importants de NuA4
nous a mené à étudier le PHD finger de la protéine Yng2, un orthologue du suppresseur de
tumeur ING3. Cette protéine fait partie de la famille des ING, une famille où tous les
membres sont dotés d’un PHD finger en plus d’être impliqués dans des processus
cellulaires fondamentaux, tels l’apoptose et la régulation du cycle cellulaire, par leur
interaction avec p53. Étant donné la capacité d’ING3 à activer le gène p21/WAF1 de façon
dépendante de p53, nous avons utilisé un système faisant intervenir ces deux gènes pour
étudier la fonction du PHD finger de Yng2 chez la levure. Ces gènes étant abscents chez la
levure, l’intégration de plasmides contenant respectivement les gènes p53 et HIS3 (sous le
promoteur de p21) a été réalisée.
Bien qu’on sache que le PHD finger n’est pas impliqué dans l’interaction de Yng2
ou des INGs avec p53, nous savons que ce domaine joue un rôle dans l’expression des
gènes dépendant de p53 ainsi que de ceux dépendant de NuA4. En effet, la délétion de
Yng2 et du PHD finger chez la levure provoque un défaut de transcription de certains gènes
spécifiques. Des études parallèles ayant démontré l’importance du PHD finger de ING2
(Gozani et al., 2003) ainsi que de celui de Yng2 (Gozani et al., non-publié) dans la liaison
des phosphoinositides, nous nous sommes intéressés à étudier le lien existant entre ce
domaine de liaison et la transcription dépendante de p53.
Nous avons ensuite choisi les résidus à muter selon des résultats obtenus par
l’équipe du Dr. Gozani. En effet, nous avons muté les résidus du PHD finger de Yng2
responsable de l’interaction existant entre cette protéine et les PI(4)P (phosphatidylinositol-
4-phosphate) (figure 10A). Nous avons ensuite intégré les mutations dans le génome par
recombinaison homologue, ce qui nous permet de bénéficier d’un taux d’expression natif
de Yng2 et ainsi enlever tout biais dû à l’expression épisomale de la protéine. Des
plasmides possédant respectivement p53 et p21/His3 ont été également transformés dans
ces souches, permettant ainsi d’effectuer nos essais transcriptionnels p53 dépendant. On
53
peut donc observer, tel qu’il était attendu, que l’absence de p53 n’entraîne pas la
transcription du gène p21 (figure 10B). Au contraire, la présence de p53 dans une souche
possédant la version sauvage de Yng2 active la transcription du gène HIS3 qui est sous le
contrôle du promoteur p21 (figure 10B). Par contre, la simple mutation de 6 résidus dans la
PHD finger de Yng2 entraîne une baisse dramatique des taux de transcription p53
dépendant, indiquant par le fait même l’importance que joue le PHD finger de Yng2 dans
l’activation spécifique de certains gènes. À titre de contrôle des niveaux d’ARN, nous
avons utilisé une sonde contre le gène ACT1.
Figure 10: La mutation des lysines du PHD finger de Yng2 occasionne une chute de la
transcription p53 dépendante chez Saccharomyces cerevisiae. A) Schéma
représentant les mutations effectuées dans le PHD finger de la protéine Yng2. B)
Northern démontrant que la transcription dépendante de p53 du gène HIS3 sous le
promoteur p21 est affectée de manière importante par la mutation du PHD finger de
Yng2
54
3.2 Étude fonctionnelle du complexe NuA4 dans un contexte de réparation
Il y a de plus en plus d’évidences du rôle majeur que joue le complexe histone
acétyltransférase NuA4 dans la réparation des bris double brin de l’ADN. En effet, la
délétion de YNG2, ARP4, EAF1 et EPL1 provoque une sensibilité aux agents causant des
bris double brin. Des mutations sur des résidus acétylés par NuA4 sur les histones H2A et
H4 engendrent également un phénotype similaire. Enfin, la liaison de Nua4 à l’histone
H2A phosphorylée sur la sérine 129 via sa sous-unité Arp4 démontre plus que jamais
l’implication de NuA4 lors de la réparation (Downs et al., 2004).
3.2.1 Tra1, une protéine de la famille des PIKK relié à ATM
Tra1 est la plus grosse protéine du complexe de levure NuA4 et est également
essentielle à la survie cellulaire. Des études phylogénétiques ont récemment permis
d’établir un lien étroit entre cette protéine et les kinases de la famille ATM, (Bosotti et al.,
2000), révélant une grande similarité de séquences ainsi que la conservation de plusieurs
domaines protéiques (figure 11A). Ayant un intérêt dans l’étude des différents domaines
protéiques de NuA4, nous nous sommes alors intéressés à l’étude de cette protéine et à son
domaine kinase.
MRX, un complexe important dans la réparation de l’ADN chez la levure qui interagit in vitro avec la protéine Tra1
Les kinases de la famille ATM sont désormais bien connues pour leur importance
dans la cascade signalétique menant à la réparation de l’ADN. En effet, en réponse aux
dommages à l’ADN, elles sont recrutées au site de cassure pour ensuite phosphoryler une
grande variété de substrats cellulaires importants, tels CHK2, p53, BRCA1 et NBS1.
Comme mentionné antérieurement, il a été établi dernièrement que le recrutement des
55
kinases ATM, ATR et DNA-PK au site de bris se faisait via la liaison à une séquence très
conservée en C-termnial de NBS1, ATRIP et Ku80 respectivement (Falck et al., 2005).
Cette séquence est également conservée en C-terminal de la protéine de levure Xrs2 , une
des sous-unités du complexe de réparation MRX (MRN chez l’humain). Considérant
l’absence d’évidence de l’implication de la protéine Tra1 dans la réparation de l’ADN ainsi
que l’intéraction MRX/ATM existant nous avons tenté de déterminer si une intraction entre
le complexe MRX et Tra1 existait, via le domaine kinase/FAT qui est conservé entre ATM
et Tra1.
Pour ce faire nous avons d’abord purifié le complexe de levure MRX par TAP
(figure 11B). Nous avons ensuite sélectionné plusieurs parties de la protéine Tra1
susceptibles d’interagir avec MRX (figure 11A). Ces différentes portions ont été
fusionnées à la GST (gluthation S-transferase), produites de façon recombinante et
purifiées à l’aide de billes GST. L’incubation de ces différentes billes en présence du
complexe MRX nous a permis de constater la présence d’un lien direct entre la protéine
Tra1 et MRX. En effet, la portion C-terminale de Tra1, contenant les domaines PI-3 kinase
et FATC, a la capacité de lier MRX (figure 11C). De façon surprenante, la partie interne
de Tra1, qui contient le domaine de transactivation de la protéine Tra1 (Brown et al., 2001)
possède également la capacité de lier le complexe MRX. On pourrait donc ainsi
soupçonner la coopération de ces deux sites de liaison dans l’interaction de Tra1 avec la
protéine Xrs2 du complexe MRX.
56
Figure 11 : Le complexe de levure MRX lie la protéine Tra1 in vitro. A) Schéma
représentant les différents domaines protéiques de la protéine de levure Tra1 ainsi que les
parties utilisées lors de l’obtention des protéines de fusion recombinante. B) Purification
du complexe protéique MRX par le système TAP et visualisation par coloration à
l’argent. C). La protéine Tra1 se lie in vitro au complexe MRX via deux domaines, un
domaine de transactivation localisé dans la portion interne de la protéine et un domaine
PI-3 kinase situé en C-terminal. Les billes GST et GST-Gcn4 utilisées dans les
chromatographies d’affinité ont servi de contrôle négatifs. La visualisation des
interactions a été réalisée grâce à un anticorps contre l’étiquette TAP.
57
NuA4 est recruté à la cassure double brin in vivo en absence de MRX
Puisqu’une interaction directe entre la protéine Tra1 et le complexe MRX a été
établie, nous avons immédiatement émis l’hypothèse selon laquelle Tra1 pourrait permettre
le recrutement de NuA4 au site de coupure en condition de dommages à l’ADN. La
mobilisation du complexe MRX au site de coupure est l’un des événements les plus
précoces à la suite d’un bris à l’ADN. Sachant que le complexe NuA4 est recruté également
au site de coupure (Downs et al., 2004) et qu’il est impliqué dans la NHEJ (Bird et al.,
2002), nous avons voulu vérifier si MRX était nécessaire au recrutement de NuA4 au site
de coupure.
Dans ce dessein, nous avons utilisé une souche dans laquelle il est possible
d’induire un site de coupure unique. L’endonucléase HO est sous le contrôle du promoteur
du galactose et peut donc être induite par l’ajout de galactose. Elle coupe à un site unique
situé au locus MAT. Comme la souche utilisée est mutée pour les locus Mat a et Mat α,
aucune recombinaison homologue ne peut survenir à la suite de la coupure, ne permettant
pas la restauration du locus par HR et nous permettant par le fait même de pouvoir étudier
la séquence d’événements survenant à la suite d’un bris à l’ADN lors de la NHEJ. Nous
avons donc effectué la délétion du gène MRE11 dans cette souche, provoquant ainsi la
dissolution du complexe MRX. Par ChIP nous avons pu observer la présence du complexe
NuA4 au site HO lors de l’induction de la coupure, tel que décrit dans la littérature (figure
12) (Downs et al., 2004). La dissolution du complexe MRX par la délétion de MRE11 ne
semble toutefois pas affecter le recrutement de NuA4 au site de coupure lors de l’induction
de l’endonucléase (figure 12). Ceci suggère donc que MRX n’est pas responsable du
recrutement du complexe NuA4, via son interaction avec Tra1.
58
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
Po
urc
en
tag
e d
'IP
souche sauvage delta Mre11
Anticorps: anti-Eaf1
Non Induit
Induit
Figure 12 : Le complexe NuA4 est recruté aux de cassure HO in vivo dans des souches
déficientes en complexe MRX. La coupure au site HO a été induite 2 heures et a été
stoppée par l’ajout du formaldéhyde (1%) pour le pontage des protéines à l’ADN. Un PCR
quantitatif a permis d’évaluer la quantité de NuA4 au site de coupure HO avec les amorces
TAFII. Les valeurs ont été normalisées sur un locus contrôle (Intergénique V).
3.2.2 Copurification d’une activité kinase avec le complexe NuA4
L’étude de la sous-unité Tra1 nous a amené à nous poser des questions sur le rôle de
NuA4 et de cette protéine lors de la réparation. En effet, le fait qu’elle soit classée dans le
groupe des PI-3 kinases de la famille ATM rendait l’analyse des plus fascinantes. Le seul
problème est que l’absence d’une activité kinase pour la protéine Tra1 ainsi que pour son
orthologue humain TRRAP. (McMahon et al., 1998). En effet, on note l’absence des
motifs DXXXXN et DFG, qui sont présumés responsables de la liaison de l’ATP lors de la
phosphorylation (McMahon et al., 1998). Comme nous savons aujourd’hui que les kinases
de la famille ATM, contrairement aux autres PI-3 kinases, sont des kinases de très faible
59
activité et demandent la présence des cofacteurs Mn2+ et Mg2+ pour être actives, nous avons
repris les expériences. Ne possédant pas de Tra1 recombinant, nous nous sommes servis de
différentes purifications du complexe NuA4 comme source de Tra1. Les différents essais
kinases effectués nous démontrent l’absence d’activité kinase lorsque l’on purifie NuA4 ou
MRX dans des conditions natives (figure 13, lignes 3, 4 et 7). Par contre, il est possible
d’observer la phosphorylation in vitro de plusieurs sous-unités de NuA4 lors de l’utilisation
de complexes NuA4 issus de la purification de cellules traitées au MMS et à la rapamycine
(figure 13, lignes 5 et 6), démontrant ainsi la présence d’une kinase dans la purification du
complexe NuA4 dans des conditions de stress. Même si ceci n’est pas la preuve absolue de
l’activité kinase de la protéine Tra1, ceci démontre toutefois l’activation d’une activité
kinase seulement suite à un stress (dommage à l’ADN ou inhibition de la synthèse
protéique) ainsi que la capacité des 8 protéines de NuA4 à être phosphorylées par cette
kinase.
3.2.3 Activation de la phosphorylation des sous-unités de NuA4 par le complexe MRX
Dans un deuxième temps, nous avons voulu en savoir plus sur l’effet que pouvait
avoir l’ajout du complexe MRX sur l’activité kinase que nous avions observée. On sait que
le complexe MRX est essentiel à l’activation de l’activité kinase d’ATM lors de la réponse
aux dommages à l’ADN. De la même manière, la portion C-terminale de Ku80 est
essentielle à l’activation de DNA-PK. Si on considère l’hypothèse selon laquelle Tra1
possède une activité kinase seulement lorsque la cellule est en état de stress, il est tentant de
penser que cette activité peut être activée par d’autres protéines, comme c’est le cas pour
ATM et DNA-PK. Nous avons donc testé cette avenue en ajoutant du complexe MRX
purifié à chaque essai kinase que nous avions fait précédemment. Il est ainsi possible de
constater que dans chacun des essais, nous observons une augmentation de la
phosphorylation des protéines (figure 13, lignes 1, 2 et 3) comparativement à ceux effectués
sans complexe MRX (figure 13, lignes 5, 6 et 7). Ceci encourage donc l’hypothèse selon
laquelle des protéines (le complexe MRX dans ce cas) peuvent activer l’activité kinase qui
60
co-purifie avec notre complexe NuA4 (Tra1 ou une kinase conta minante activée en
condition de stress).
Figure 13: Une activé kinase est co-purifiée avec le complexe NuA4 lors de
conditions de dommages à l’ADN et de l’inhibition de la synthèse protéique. Les
essais kinase ont été effectués à l’aide de purifications protéiques provenant de
souches XRS2-TAP et EPL1-TAP et ont été migrés sur un gel gradient 4-12%.
61
3.2.4 La protéine Eaf1 est spécifiquement phosphorylée par une kinase de la famille ATM
Il a été montré précédemment que plusieurs protéines du complexe NuA4 étaient
phosphorylées lors des essais kinases in vitro, ce qui allait de pair avec d’autres résultats du
laboratoire qui démontraient la phosphorylation native de la majorité des protéines de
NuA4 in vivo suite aux traitements à différentes drogues (Lacoste et al., soumis). Pour
déterminer lesquelles étaient phosphorylées spécifiquement par une kinase de la famille
ATM, nous avons relevé s’il y avait présence du motif LSQE dans la séquence de chacune
des protéines de NuA4. Précisons que le motif LSQE est le motif reconnu spécifiquement
par les kinases de la famille ATM. Bien que nous ayons dénombré 8 protéines de NuA4
possédant le motif de base SQ (en ordre d’importance selon le nombre de sites consensus:
Epl1, Eaf1, Eaf2, Eaf3, Eaf7, Eaf5, Eaf6,Yng2) seulement une de ces protéines possédait
la séquence consensus parfaite, soit Eaf1 (LSQE) et une autre protéine en détenait un s’en
approchant beaucoup (Eaf3, VSQE). Pour vérifier notre hypothèse selon laquelle Eaf1 et
Eaf3 pourrait être phosphorylés spécifiquement par une kinase de la famille ATM, nous
nous sommes servis d’un anticorps reconnaissant le motif LSQE phosphorylé. Nous avons
ainsi pu constater qu’une protéine de NuA4 était très fortement phosphorylée par une
kinase de la famille ATM suite à l’induction de dommage à l’ADN (figure 14). Pour
s’assurer de l’identité de la protéine, nous avons recherché la présence de Eaf1 avec un
anticorps spécifique sur la même membrane, ce qui nous a donné un bande coïncidant
parfaitement avec la bande obtenue précédemment (figure 14), faisant de Eaf1 le premier
substrat phosphorylé par une kinase de la famille ATM identifiée dans NuA4.
62
Figure 14: La protéine Eaf1 du complexe NuA4 est phosphorylée de manière spécifique
par une kinase da la famille ATM en conditions de dommages à l’ADN Les
purifications protéiques proviennent de souches EPL1-TAP traitées avec diverses
drogues. Les anticorps α-LSQE phosphorylé et α-Eaf1 ont été utilisé à une dilution
1/250 et /2500 chacun.
198 KDa - 113 KDa -
198 KDa - 113 KDa -
63
3.2.5 Caractérisation du complexe NuA4 aux cassures double brin durant la méiose
Malgré que le système HO soit un outil très puissant dans la caractérisation du rôle
de NuA4 dans la réponse aux dommages à l’ADN, ce système demeure artificiel. La
recombinaison méiotique, à qui l’on doit une grande part de notre diversité génétique,
génère naturellement des bris double brin dans l’ADN ce qui permet les échanges entre les
chromatides soeurs. On a répertorié certains sites où ces bris surviennent très fréquemment
lors de la recombinaison méiotique (89% du temps) (Jinks-Robertson et Petes, 1985;
Lichten et al., 1987; Gilbertson et Stahl, 1996). Comme nous utilisons une souche où ces
régions sont flanquées de marqueurs de sélection, il est donc facile d’y étudier le
recrutement de NuA4 en conditions physiologiques. Par contre, dans une population de
levures asynchrones, le taux de bris détecté est très faible. Nous avons donc utilisé la
souche SK1 où il est possible de synchroniser les cellules en méiose, nous permettant
d’obtenir des taux de coupure de l’ordre de 5% (Allers et Lichten, 2001). Nous avons ainsi
pu évaluer par ChIP l’abondance relative du complexe NuA4 à 2 sites , URA3 et ARG4,
localisés de part et d’autre d’un site de bris en méiose. Dans les deux cas, nous pouvons
constater une augmentation substantielle de NuA4 au site de cassure après 3 heures
d’induction méiotique, augmentation qui est exacerbée 4 heures après l’induction de la
méiose (figure 15) ce qui correspond au temps d’apparition des bris. Ceci constitue donc
un indice du rôle que joue NuA4 dans la réparation des cassures dues à la recombinaison
méiotique.
64
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
0 1 2 3 4 5
Temps d'induction de la méiose (H)
anti-Eaf1Locus URA3anti-Eaf1Locus ARG4
Figure 15 : Le complexe NuA4 est recruté aux cassures double brin en méiose La méiose à
été induite 4 heures et a été stoppée aux temps 0, 2 , 3 et 4 heures par l’ajout de
formaldéhyde (1%) pour le pontage des protéines à l’ADN. Un PCR quantitatif a permis
d’évaluer la quantité de NuA4 aux sites de bris avec les amorces ARG4 et URA3. Les
valeurs ont été normalisées sur un locus contrôle (TAFII).
65
Chapitre 4 Discussion
4.1 L’importance de différents domaines protéiques de NuA4
4.1.1 Le chromodomaine de Esa1, un domaine essentiel à la viabilité cellulaire, mais possèdant une fonction différente de celui présent dans HP1
Les chromodomaines ont été identifiés comme étant des motifs jouant un rôle
important chez plusieurs protéines impliquées dans le remodelage chromatinien (voir
section 1.4.1). Compte tenu du fait que NuA4 est un acteur essentiel dans la modification
de la structure chromatinienne, la présence d’un chromodomaine dans Esa1 constituait donc
un aspect des plus intéressants à étudier. La comparaison du chromodomaine de Esa1 à
celui de HP1 a d’abord rendu possible l’identification des résidus conservés entre les
chromodomaines et a permis de cibler ceux devant être mutés (Selleck et al., Annexe 1).
La construction d’un système de chasse plasmidique a par la suite permis d’étudier in vivo
des différentes mutations. Nous avons montré que les mutations Y56A et E65L du
chromodomaine de Esa1 sont responsables d’une diminution sévère de la viabilité
cellulaire, soulignant le caractère essentiel du chromodomaine de Esa1 pour la survie de la
levure (figure 8). Par contre, la mutation d’autres résidus du chromodomaine de Esa1 (qui
sont également conservés dans le chromodomaine de HP1) ne provoque aucun effet
phénotypique notable. Ces observations sont également valables pour les essais histones
acétyltransférases effectués par nos collaborateurs (Selleck et al., Annexe 1). En effet,
seulement les mutations Y56A et E65L ont un effet sur la capacité d’acétylation
nucléosomale de Piccolo NuA4 recombinant. Ceci suggère ainsi une différence
fonctionnelle entre les chromodomaines de HP1 et de Esa1. L’hypothèse d’une fonction
distincte pour le chromodomaine de Esa1 a donc été étudiée par nos collaborateurs.
66
Comme il est possible de le constater à la figure 5 de l’Annexe1, le chromodomaine d’Esa1
ne semble pas reconnaître spécifiquement les modifications post-traductionnelles. Ces
observations vont de pair avec d’autres expériences effectuées par la même équipe
démontrant que le chromodomaine de Esa1 n’est pas nécessaire à la liaison des
nucléosomes (Annexe 1, figure 6), confirmant ainsi la différence fonctionnelle entre le
chromodomaine de HP1 et celui de Esa1 qui sont impliqués respectivement dans la
reconnaissance des lysines méthylées et dans la capacité d’acétylation nucléosomale.
Des travaux effectués dans notre laboratoire témoignent également de cette
différence de spécificité. En effet, ceux-ci démontrent la capacité du chromodomaine de
Esa1 à reconnaître les ARNs (Gallo et al., soumis), rappelant étrangement la capacité du
chromodomaine de MOF à lier les ARNs roX chez la drosophile (section 1.1.4). En effet,
la mutation des résidus H55/Y59 et W66C/I67 lors de ces travaux (ceux-ci sont des résidus
que nous avions déjà identifiés comme étant importants pour l’acétylation nucléosomale ou
comme étant des acides aminés adjacents à ces résidus) provoque une diminution
d’acétylation in vitro ainsi qu’une diminution de la liaison du chromodomaine de Esa1 aux
ARNs (Gallo et al., non-publié). De plus, ces travaux démontrent également que la liaison
du chromodomaine aux ARNs stimule l’activité d’acétylation.
La fonction du chromodomaine de Esa1 est différente de celle de HP1 et serait
nécessaire à l’acétylation nucléosomale et donc à la viabilité cellulaire. Les résidus du
chromodomaine responsables de la formation d’une cage hydrophobique ne possèderaient
pas la capacité de reconnaître les lysines méthylées, contrairement à ceux du
chromodomaine de HP1. De plus, ces mêmes résidus ne sont pas nécessaires à la liaison du
complexe Piccolo aux nucléosomes (Selleck et al., Annexe1), suggérant ainsi que le
chromodomaine joue plutôt un rôle dans l’activation de l’acétylation. Celui-ci jouerait
donc un rôle seulement à la suite de la liason de Piccolo au nucléosome. Le
chromodomaine pourrait, par exemple, permettre la liaison des queues d’histones et ainsi
les diriger vers le domaine MYST. Le chromodomaine pourrait également se lier aux
interfaces histone/ADN et compétionner avec les queues N-terminales des histones qui
deviendraient disponibles pour l’acétylation. Quoiqu’il en soit, la poursuite de la
67
caractérisation des différents chromodomaines de NuA4 nous permettra d’en savoir
davantage sur la fonction précise de ce domaine au sein du complexe.
En ce sens, une étude fonctionnelle du chromodomaine de Eaf3 s’avèrerait très
intéressante. La mutation des principaux résidus conservés permettrait notamment de
statuer sur la fonction de ce chromodomaine. De plus, les preuves biochimiques et
génétiques liant Eaf3 à la lysine 36 de l’histone H3 (Lacoste et al., soumis) suggèrent que le
chromodomaine de Eaf3 pourrait reconnaître cette lysine méthylée. Malgré que des
expériences de liaison in vitro sur des peptides H3 méthylés aient déjà été tentées, il serait
pertinent d’évaluer la capacité de ce chromodomaine à lier les interface ADN/histones H3
méthylé dans un contexte nucléosomal. De plus, l’étude comparative du chromodomaine
de Esa1 et de Eaf3 permettrait de vérifier s’il existe une redondance fonctionnelle pour ces
domaines et ainsi conclure sur la fonction des chromodomaines au sein du complexe NuA4.
4.1.2 Un rôle pour le domaine SANT?
Malgré les légères différences entre le domaine SANT de Eaf2 et celui des protéines
chez lesquelles ce domaine a été d’abord identifié (Swi3p, Ada2, NcoR, TFIIB), on
constate une certaine similarité dans la structure prédite de ces protéines. L’identification
ainsi que la mutation des résidus importants pour cette structure, tel qu’illustré à la figure 9,
aura démontré que le domaine SANT de Eaf2 n’a aucun effet sur la croissance cellulaire,
suggérant ainsi le caractère non-essentiel de ce domaine. Des études parallèles ayant
démontré que les mutations ponctuelles des résidus importants du domaine SANT de la
protéine Eaf1 ne provoquent aucun phénotype de croissance, ceci nous laisse croire ainsi à
la redondance fonctionnelle de ces domaines
.
68
La collaboration des domaines SANT de ces deux protéines dans une
fonction commune nous est suggérée notamment par la présence de phénotypes semblables.
En effet, il a été possible d’observer une sensibilité au MMS chez les souches dont le
domaine SANT de Eaf1 et de Eaf2 a été muté respectivement. Ceci nous laisse croire à une
implication des domaines SANT lors de la réparation de l’ADN. Sachant que le domaine
SANT reconnaît généralement les queues d’histones et que le complexe NuA4 fait partie de
la machinerie cellulaire recrutée aux sites de bris de l’ADN, il est possible d'envisager la
participation de ce domaine dans la stabilisation du complexe NuA4 aux sites de coupures
via sa liaison aux histones. La reconnaissance de la phosphorylation de l’histone H2A par
Arp4 (Downs et al., 2004) demeurant l’événement essentiel à la rétention de NuA4, les
domaines SANT pourraient participer à ce processus en consolidant cette liaison. Ceci
pourrait expliquer le fait que seulement une légère sensibilité au MMS est observée chez
ces mutants.
Ce phénotype léger pourrait également être imputable à la redondance fonctionnelle
entre les deux domaines SANT de NuA4. C’est pourquoi il serait intéressant de voir les
différents effets associés à la mutation simultanée des domaines SANT de Eaf1 et Eaf2
chez la levure. Même si quelques hypothèses ont été formulées en faveur de sa
participation au processus de réparation de l’ADN, rien n’a encore été démontré. Ainsi
faut-il garder l’esprit ouvert et tenter d’envisager d’autres fonctions potentielles.
4.1.3 Le PHD finger d’Yng2, un vestige permettant la transcription dépendante de p53 grâce à un site de liaison aux phospholipides
Le PHD finger d’Yng2, bien que connu comme étant impliqué dans le contrôle de la
transcription dépendante de p53 (Nourani et al., 2001), n’avait jamais été associé jusqu’à
maintenant à aucune autre fonction. En effet, sa délétion ne semblait pas affecter la
capacité d’acétylation du complexe NuA4 ni celle du complexe Piccolo (Nourani et al.,
2001; Selleck et al., Annexe 1). Par contre, des études entreprises sur les protéines de la
famille ING, les orthologues humains de Yng2, ont démontré la capacité d’interaction des
PHD finger de ING1 et ING2 avec les phospholipides, mettant en relief une nouvelle
69
fonction pour ce domaine (signalisation nucléaire par les PIP, Gozani et al., 2003). La
haute conservation du PHD finger entre Yng2 et les protéines de la famille ING suggérait
ainsi que le PHD finger de Yng2 pouvait aussi lier les phospholipides. En effet, ce
domaine lie les PI(4)P. (Gozani et al., non-publié). Les résidus responsables de cette
liaison ont été identifiés et ont été mutés. Une chute importante de la transcription
dépendante de p53 dans la souche résultante a alors été constatée, ce qui est comparable au
niveau de transcription observé lors de la délétion du PHD finger de Yng2 (Nourani et al.,
2001). Parallèlement, d’autres études ont démontré que la délétion du PHD finger de Yng2
provoquait une diminution de la transcription lors du traitement à la rapamycine (Gozani,
non-publié). Ceci est d’autant plus intéressant qu’il associe une fois de plus le PHD finger
à la transcription.
Ces évidences nous invitent donc à croire que le PHD finger de Yng2 serait un
domaine essentiel à la transcription de certains gènes, notamment ceux responsables de la
production des protéines ribosomales. Le PHD finger serait également, chez les eucaryotes
supérieurs, un élément nécessaire à la transcription dépendante de p53. Ceci corrobore bien
avec les nombreux liens existant entre les ING et p53 (Campos et al., 2004). Enfin, comme
la mutation des résidus responsables de la liaison des phospholipides semble avoir un effet
comparable à la délétion du PHD finger, il serait possible de considérer l’implication de
ceux-ci dans les mécanismes transcriptionnels. En fait, on pourrait proposer un modèle
intégratif selon lequel la signalisation des PIPs jouerait un rôle dans la régulation de la
transcription contrôlant ainsi le ciblage de l’acétylation. Une abscence de PHD finger
résulterait donc en une baisse du taux de transcription des régions ciblées par NuA4.
70
4.2 Nouvelles avenues impliquant NuA4 dans la réparation de l’ADN
4.2.1 MRX cible-t-il NuA4 aux bris double brin de l’ADN?
L’implication du complexe NuA4 dans la réparation de l’ADN ne fait maintenant
plus aucun doute. Déjà plusieurs évidences ont confirmé le recrutement de ce complexe
aux sites de bris double brin de l’ADN (section 1.3.3). La récente découverte d’un
domaine conservé chez Nbs1, ATRIP et Ku80 permettant de recruter des kinases de la
famille ATM au site de coupure (Falck et al., 2005) a été l’un des éléments déclencheurs
dans l’initiation d’une partie de ces travaux. En effet, la présence d’une PI-3 kinase de la
famille ATM au sein du complexe NuA4 pouvait laisser croire en l’existence d’un second
mode de recrutement de NuA4 aux sites de bris de l’ADN et ce, via la sous-unité Tra1.
C’est dans cette optique que des expériences in vitro ont été effectuées et ont révélé la
présence d’une interaction entre la protéine Tra1 et le complexe MRX purifié (figure 11).
Par contre, la délétion du gène MRE11, qui permet l’éclatement du complexe MRX
et qui empêche donc la formation du complexe au site de cassure, nous a permis d’observer
in vivo que le complexe MRX n’est pas nécessaire à la présence du complexe NuA4 aux
sites de bris à l’ADN. Ceci infirme alors l’hypothèse de départ selon laquelle la portion C-
terminale de Xrs2 (l’orthologue de la protéine Nbs1) aurait été responsable du ciblage de
NuA4 aux dommages à l’ADN par son interaction avec Tra1.
Bien que cette étude en soit encore à un stade préliminaire, trois hypothèses peuvent
expliquer les résultats précédemment obtenus: 1- L’interaction entre Tra1 et MRX n’est
pas essentielle mais aurait quand même lieu via la portion conservée en C-terminal de Xrs2,
ce qui pourrait permettre, par exemple, la stabilisation du complexe NuA4 aux sites de bris
à l’ADN (figure 16). 2- Étant donné qu’on retrouve Tra1 également à l’état de dimère
dans la cellule (Eisen et al., 2001), il serait possible de postuler que seulement les dimères
de Tra1 sont recrutés via MRX au site de coupure et non tout le complexe NuA4. 3-
71
Malgré la présence d’une interaction entre Tra1 et MRX, NuA4 (ou Tra1) pourrait être
recruté par une autre protéine possédant la portion conservée en C-terminal de Nbs1. Lcd1
et yKu80 sont deux protéines possédant ce domaine chez la levure. Cette dernière
hypothèse semble d’autant plus intéressante que les deux premières sont en partie infirmées
par les travaux de Tsukamoto (Tsukamoto et al., 2005). En effet, la délétion de la portion
conservée en C-terminal de Xrs2 ne provoque aucune sensibilité aux agents endommageant
l’ADN. Ceci dénote ainsi du caractère non-essentiel de la partie conservée de Xrs2 dans les
mécanismes de réparation de l’ADN.
Figure 16 Modèle du recrutement des kinases de la famille ATM au site de bris Les
protéines entre parenthèses sont les protéines orthologues chez la levure, excepté Tra1 qui
se retrouve également chez Saccharomyces cerevisiae. Tra1 (ainsi que NuA4) pourrait être
recruté au site de cassure via yKu80 ou Lcd1. P = marque de phosphorylation.
72
La reprise de ces expériences dans des souches déficientes en Lcd1 et yKu80
pourrait nous aider à préciser le rôle que joue la protéine Tra1 dans la réparation. De plus,
si on considére les faits suivants : 1- ATRIP (Lcd1 chez la levure) intéragit avec ATR
(Mec1 chez la levure). 2- Nbs1 (Xrs2 chez la levure) intéragit avec ATM (Tel1 chez la
levure). 3- Ku80 (yKu80 chez la levure) intéragit avec DNA-PK (qui ne possède aucun
orthologue chez la levure). 4- Des études phylogénétiques considèrent Tra1 comme étant la
protéine la plus rapprochée de DNA-PK. 5- Tra1 fait partie d’un complexe impliqué dans la
NHEJ (comme DNA-PK). Serait-il possible que Tra1, soit l’orthologue de DNA-PK chez
la levure? Tra1 est-elle seulement une protéine permettant le recrutement de NuA4? Est-
elle recrutée sous forme de dimère au site de coupure? Peut-elle être recrutée au site de
coupure par d’autres protéines? Voilà autant de questions qui pourront être répondues
grâce à la poursuite de ces expériences in vitro et in vivo.
4.2.2 Être ou ne pas être une kinase, voilà la question!
Quoiqu’il ait été établi que la protéine Tra1 ne possède pas d’activité kinase
(McMahon et al., 1998), nous nous sommes penchés sur la possibilité que cette activité
puisse être induite en certaines occasions. En effet, la présence d’un domaine PI-3 kinase
presque parfaitement conservé dans la protéine Tra1 et l’implication du complexe NuA4
dans la réparation de l’ADN nous incitent à croire en l’importance de cette protéine qui,
rappelons-le, fait partie des kinases de la famille ATM.
Comme Tra1 est une énorme protéine de 400 Kda et qu’il était impossible de la
produire de façon recombinante chez la bactérie, nous avons utilisé différentes purifications
de NuA4 pour tester s’il y avait la présence d’une activité kinase. Étrangement, la présence
de ce type d’activité uniquement dans les préparations de complexes purifiés en conditions
de stress (Rapamycine et MMS), atteste de l’existence d’une activité inductible co-purifiant
avec le complexe NuA4. De plus, cette activité est augmentée par la présence du complexe
MRX, coïncidant avec un mode de fonctionnement similaire à celui des PI-3 kinases de la
famille ATM ( voir section 1.3.3).
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Malgré qu’il soit très séduisant de croire que Tra1 est une kinase pouvant être
induite dans des conditions de stress, il faut être très prudent avec ces données. En effet, la
purification du complexe NuA4 par TAP (section 2.4.1) entraîne la purification de quelques
protéines contaminantes. La co-purification d’une kinase contaminante, préférentiellement
lorsque la cellule est en état de stress, doit ainsi être envisagée. Néanmoins, des essais
kinases effectués avec la protéine Tra1 recombinante (produite grâce aux baculovirus qui
permettent la purification de protéines recombinantes de plus grands poids moléculaires)
pourrait permettre de clarifier la situation.
De plus, il est intéressant de noter que plusieurs sous-unités de NuA4 sont
phosphorylées in vivo (Lacoste et al., soumis) et in vitro suite au traitement des levures au
MMS et à la rapamycine et que le profil de phosphorylation est différent selon la drogue
ajoutée. Ceci démontre bien la participation du complexe NuA4 dans la dynamique des
mécanismes menant à la réparation de l’ADN et à la synthèse protéique.
Compte tenu du grand intérêt porté par notre laboratoire pour les événements se
rapportant à la réparation de l’ADN, nous avons poursuivi l’étude de la phosphorylation
des sous-unités de NuA4 en conditions de dommages à l’ADN. Ceci a mené à
l’identification d’une sous-unité de NuA4 spécifiquement phosphorylée par une kinase de
la famille ATM lors de l’induction de bris à l’ADN. Eaf1 est donc une cible d’une PI-3
kinase, ce qui constitue encore une preuve de l’importance de NuA4 lors de la réparation.
La phosphorylation de Eaf1, qui est la protéine centrale du complexe NuA4 (figure5),
pourrait constituer un événement important dans la série d’étapes menant à la réparation de
l’ADN. En effet, on remarque une grande sensibilité au MMS (Auger et al., soumis) et aux
radiations ionisantes (Game et al., 2005) dans les souches déficientes pour cette protéine.
La caractérisation des phénotypes provoqués par la mutation du site LSQE, motif
reconnu par les kinases de la famille ATM présent dans la protéine Eaf1, permettrait non
seulement de confirmer que Eaf1 est bel et bien la cible d’une PI-3 kinase mais d’évaluer
l’importance qu’occupe la phosphorylation de Eaf1 dans les mécanismes participant au
maintien de l’intégrité du génome.
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4.2.3 NuA4 et la recombinaison méiotique
Loin d’être toujours néfastes, les cassures simple et double brin engendrées le long
de l’ADN ont parfois une importance capitale pour la cellule. En effet, des processus tels la
recombinaison V(D)J et la recombinaison méiotique nécessitent l’induction de telles
cassures. Cependant, la restauration de ces lésions nécessite le recrutement de la
machinerie de réparation. Bien que l’intervention du complexe NuA4 dans la réparation a
été caractérisée en majeur partie lors de la NHEJ, nous avons voulu étudier l’implication de
ce complexe aux sites de coupures induits lors de la recombinaison méiotique. Nous avons
ainsi noté, à certains sites de cassures déterminés, un enrichissement du complexe NuA4 de
près de deux fois et ce, quatre heures après l’induction de la méiose. Par contre, la quantité
de complexe détectée était faible. Ceci pourrait être imputable au fait que, malgré la
synchronisation des levures, le taux de coupure à un site donné lors de la méiose ne dépasse
pas 5%, ce qui est également très peu (Allers et Lichten, 2001). Ces résultats sont donc de
bonne augure pour la caractérisation de la chronologie des événements permettant le
recrutement de NuA4 aux sites de bris à l’ADN. Néanmoins, il serait intéressant de
déterminer si la séquence des événements permettant le recrutement de NuA4 lors de la
NHEJ est la même lors de la réparation par HR. La mutation du site de phosphorylation
S129 sur l’histone H2A ou la délétion du gène Arp4 sont connus pour diminuer la rétention
du complexe NuA4 au site de coupure lors de la NHEJ. Celles-ci pourrait peut-être avoir
un effet similaire lors de la HR.
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Conclusions
Somme toute, l’étude menée sur le chromodomaine, le domaine SANT, le PHD
finger et le domaine PI-3 kinase que l’on retrouve au sein du complexe NuA4 a permis une
meilleure compréhension des rôles fonctionnels occupés par ces domaines. Il a été ainsi
possible de mettre en évidence l’importance qu’occupe le chromodomaine dans l’activité
catalytique de Esa1 et la prépondérance de certains résidus du PHD finger dans la
transcription dépendante de p53. Les recherches effectuées ont également permis
l'acquisition d’une grande variété de données originales, nous permettant ainsi d’envisager
l’implication des sous-unités Eaf2, Eaf1 et Tra1 dans les mécanismes menant à la
réparation de l’ADN. Bien que préliminaires à certains niveaux, ces travaux nous ont
permis de consolider la base de ce qu’est l’étude du rôle de NuA4 dans la réparation de
l’ADN et dans la transcription. Plusieurs projets pourront être développés à partir de ces
travaux, notamment l’étude comparative des chromodomaines de Eaf3 et de Esa1. De plus,
l’étude de la dynamique du recrutement de Tra1 aux sites de bris à l’ADN et de son
implication dans la réparation de l’ADN, de pair avec NuA4, semblent des plus
intéressantes à poursuivre.
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Annexe 1 William Selleck, Israël Fortin, Decha Sermwittayawong, Jacques Côté, and Song Tan The Saccharomyces cerevisiae Piccolo NuA4 Histone Acetyltransferase Complex Requires the Enhancer of Polycomb A Domain and Chromodomain To Acetylate Nucleosomes MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, July 2005, p. 5535–5542 Vol. 25, No. 13 Copyright © 2005, American Society for Microbiology. All Rights Reserved.
MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, July 2005, p. 5535–5542 Vol. 25, No. 130270-7306/05/$08.00�0 doi:10.1128/MCB.25.13.5535–5542.2005Copyright © 2005, American Society for Microbiology. All Rights Reserved.
The Saccharomyces cerevisiae Piccolo NuA4 Histone AcetyltransferaseComplex Requires the Enhancer of Polycomb A Domain and
Chromodomain To Acetylate NucleosomesWilliam Selleck,1 Israel Fortin,2 Decha Sermwittayawong,1 Jacques Cote,2 and Song Tan1*
Center for Gene Regulation, Department of Biochemistry & Molecular Biology, 108 Althouse Laboratory, The PennsylvaniaState University, University Park, Pennsylvania 16802-1014,1 and Laval University Cancer Research Center, Hotel-Dieu
de Quebec, 11 Cote du Palais, Quebec City, Quebec G1R 2J6, Canada2
Received 17 November 2004/Returned for modification 27 December 2004/Accepted 18 March 2005
Chromatin modification complexes are key gene regulatory factors which posttranslationally modify thehistone component of chromatin with epigenetic marks. To address what features of chromatin modificationcomplexes are responsible for the specific recognition of nucleosomes compared to naked histones, we haveperformed a functional dissection of the Esa1-containing Saccharomyces cerevisiae Piccolo NuA4 histoneacetyltransferase complex. Our studies define the Piccolo determinants sufficient to assemble its three subunitsinto a complex as well as Piccolo determinants sufficient to specifically acetylate a chromatin template. We findthat the conserved Enhancer of Polycomb A (EPcA) homology region of the Epl1 component and the N-terminal 165 amino acids of the Yng2 component of Piccolo are sufficient with Esa1 to specifically act onnucleosomes. We also find that the Esa1 chromodomain plays a critical role in Piccolo’s ability to distinguishbetween histones and nucleosomes. In particular, specific point mutations in the chromodomain putativehydrophobic cage which strongly hinder growth in yeast greatly reduce histone acetyltransferase activity onnucleosome substrates, independent of histone methylation or other modifications. However, the chromodo-main is not required for Piccolo to bind to nucleosomes, suggesting a role for the chromodomain in a catalysisstep after nucleosome binding.
Transcriptional regulation in a eukaryotic nucleus requirescellular activities that recognize and act on chromatin. Suchactivities include chromatin modification enzymes, which tagnucleosomes with posttranslational modifications (18), andchromatin remodeling enzymes, which render the constituentDNA in nucleosomes accessible to other transcription factorsby disrupting or remodeling chromatin (4). One of the best-characterized posttranslational chromatin modifications is his-tone acetylation, which is generally associated with an openchromatin or activated transcriptional state (7). Despite thecharacterization of many histone acetyltransferase (HAT)complexes and catalytic subunits, it is not clear how HATcomplexes specifically recognize a chromatin substrate versusnaked histones, even though this is a fundamental property ofmany chromatin modification complexes.
Several distinct nuclear HAT complexes have been isolatedfrom the budding yeast Saccharomyces cerevisiae, but only theNuA4 (nucleosome acetylating H4) complex is essential forcell viability (7). The 1.3-MDa NuA4 complex contains at least12 polypeptides (2, 13) including the essential Esa1 (essentialSas-related acetyltransferase 1) subunit (8, 29). Although Esa1is the catalytic subunit of the NuA4 complex, it acetylates onlynaked histones on its own and is unable to acetylated NuA4’sphysiological substrate of nucleosomes (2, 6). This inadequacyof the catalytic subunit to recognize or act on nucleosomes is a
common feature of many HAT enzyme complexes (33). Forexample, yeast Gcn5 can acetylate histones on its own butadditionally requires Ada2 and Ada3 to acetylate nucleosomesefficiently (3), and four separate yeast Gcn5-containing com-plexes (SAGA, SLIK/SALSA, ADA, and HAT A2) which acet-ylate nucleosomes also include Ada2 and Ada3 subunits (7).
Like Gcn5, Esa1 can also function in multiple complexes.Fractionation of yeast extracts showed the presence of Esa1 inthe NuA4 complex as well as a smaller complex termed PiccoloNuA4, or Piccolo for short (6). Both NuA4 and Piccolo exhibitstrong HAT activity towards nucleosomes, but strikingly, onlyPiccolo acetylates a nucleosome substrate in preference tonaked histones. Combined biochemical and genetic data indi-cate that the Piccolo complex is responsible for global acety-lation in yeast in contrast to activator-directed acetylation attranscription promoters by the NuA4 coactivator complex (6).
The Piccolo complex is an attractive chromatin modificationenzyme for study because it is a relatively compact enzyme ableto recognize and acetylate nucleosomes and because its threesubunits Epl1, Yng2, and Esa1 boast rich genetic and biochem-ical backgrounds. Epl1 (Enhancer of Polycomb-Like 1) is theyeast homolog of the Drosophila Enhancer of Polycomb,E(Pc), isolated as a gene that enhanced Polycomb group mu-tations and suppressed position-effect variegation in Drosoph-ila through some undefined mechanism involving chromatin(28, 30). E(Pc) homologs found in organisms such as yeast,worms, and mammals each contain a common 280-residueN-terminal Enhancer of Polycomb A (EPcA) domain. Yng2shares significant sequence homology to the p33Ing1 humantumor suppressor candidate involved in cell proliferation andapoptosis (9, 14, 20, 25), particularly a common C-terminal
* Corresponding author. Mailing address: Center for Gene Regula-tion, Department of Biochemistry & Molecular Biology, 108 AlthouseLaboratory, The Pennsylvania State University, University Park, PA16802-1014. Phone: (814) 865-3355. Fax: (814) 863-7024. E-mail: [email protected].
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plant homeodomain (PHD) finger domain, although weakersequence homology also exists in the N-terminal regions. Fi-nally, the catalytic subunit Esa1 contains the MYST histoneacetyltransferase domain (33) and a 60-residue chromodomainfound in many chromatin modification and remodeling pro-teins (19). The function of the chromodomain may be proteinspecific since the chromodomains of heterochromatin proteinsHP1 and Polycomb bind to histone tails containing methylatedlysines (11, 16, 17, 23, 24), but the chromodomain of the dos-age compensation protein MOF binds to RNA (1).
Since relatively little information is available to explain howHAT enzymes recognize a chromatin template, we have exam-ined the determinants of Piccolo necessary to act on a chro-matin template compared to naked histones. We find that theconserved EPcA domain and chromodomain are critical forPiccolo to acetylate nucleosomes. Our results also suggest thata putative hydrophobic cage on the chromodomain surface isnecessary for Piccolo to specifically act on nucleosomes afterbinding of this substrate. Surprisingly, chromodomain functionin chromatin acetylation by Piccolo is independent of histonemethylation, indicating a new distinct role of the Esa1 chro-modomain.
MATERIALS AND METHODS
Coexpression and purification of Piccolo complexes. Deletions of Piccolosubunits were designed after considering sequence homologies and secondary struc-ture predictions using the PredictProtein server (26) (http://www.predictprotein.org/). Deletions and point mutations of Piccolo subunits were prepared usingstandard molecular biology techniques, verified by sequencing through entirecoding regions, and subcloned into the pST44 polycistronic expression vector(32) before expression in Escherichia coli BL21(DE3)pLysS cells. The coex-pressed proteins were purified by Talon (Clontech) cobalt affinity chromatogra-phy in P100 buffer (50 mM sodium phosphate, pH 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM2-mercaptoethanol, 1 mM benzamidine) with additional 100 mM imidazole forelution. yEpl1 and Yng2 truncations were almost completely insoluble whenexpressed on their own in E. coli but become predominantly soluble whencoexpressed with Esa1.
HAT and ELISA assays. HAT assays were performed minimally three timesfor each sample using previously described procedures except that 0.125 �Ci of[3H]acetyl-coenzyme A was used per reaction (15). HAT assays were normalizedby the amount of histones, whether provided as naked histones or nucleosomes.Native chicken histones and oligonucleosomes were isolated from chicken eryth-rocytes (15, 21). Recombinant Xenopus core histones were expressed, purified,reconstituted with mouse mammary tumor virus long terminal repeat NucBDNA into nucleosome core particles as described previously (12, 21). Recom-binant yeast core histones (27) were similarly reconstituted into nucleosome coreparticles. Both Xenopus and yeast recombinant nucleosome core particles werepurified by anion exchange Source Q (Amersham) chromatography.
Appropriate dilutions of each Piccolo complex were prepared to ensure themeasured activity remained in the linear range of the HAT assay. The sampleswere normalized by Esa1 content by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) using anti-His polyclonal rabbit antibodies (Santa Cruz) or affinity-purified anti-Esa1 polyclonal rabbit antibodies prepared against recombinantfull-length Esa1 (this study) because normalization by Coomassie blue staining ofsodium dodecyl sulfate (SDS)-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) gelsproved to be insufficiently precise. Piccolo v14 and 15 histone and nucleosomeHAT activities were normalized to Piccolo v7 by Esa1 content via visual inspec-tion of Western blots using anti-His antibodies because ELISAs using anti-His oranti-Esa1 antibodies produced results clearly inconsistent with the Western blotand Coomassie blue-stained SDS-PAGE gels. All other Piccolo constructs pro-duced self-consistent ELISA, Western, and Coomassie blue quantitation of Esa1.
Plasmid shuffle. Esa1 chromodomain mutations were transferred from apBluescript plasmid to a yeast vector by amplification with the following primerscontaining BamHI sites; For 5� TATAAGGATCCTCCCATGACG GAAAAGAAGAACCTGGTATTG-3�, and Rev 5�-GCGGGATCCTTACCAGGCAAAGCGTAACTGAGAGGC-3�. BamHI sites are indicated in italics, and stop codonis underlined. The product was digested with BamHI and ligated into a BamHI-
digested pBFG6 plasmid, a 2�m plasmid providing the phosphoglycerol kinasepromoter, six N-terminal hemagglutinin (HA) epitopes and the LEU2 selectionmarker (25). Each plasmid was verified by sequencing and transformed intoQY118 MATa his3�1 leu2�0 met15�0 ura3�0 esa1�::KanMX pLP795 (ESA1ARS/CEN URA3) (8) by standard protocols. Resulting clones were selected onSC medium lacking leucine and uracil. Good in vivo expression of each Esa1mutant protein was confirmed by Western blot on whole-cell extracts (withanti-HA antibodies).
Plasmid shuffling experiments for viability tests were performed followingstandard procedure. Yeast containing wild-type and mutant versions of ESA1 onURA3 and LEU2 plasmids, respectively, were grown overnight in medium lackingleucine and with uracil, diluted to an optical density of 0.25, and grown for 90 minat 30°C. Tenfold serial dilutions in water were spotted on YPD and HC lackingleucine 0.1% 5�-fluoroorotic acid plates (to chase the wild-type ESA1/URA3plasmid) and grown at 30°C for 2 to 4 days.
Piccolo binding of nucleosomes via size-exclusion chromatography. To pre-paratively purify Piccolo v7, v17, v69, v72, and v74, soluble extract from 6 litersof BL21(DE3)pLysS cells expressing the appropriate Piccolo complex were pu-rified successively by Talon cobalt affinity, Source Q anion-exchange, Source Scation-exchange, and Source ISO hydrophobic interaction chromatography (allSource resins from Amersham). The Piccolo/nucleosome core particle complexprepared by mixing Piccolo and recombinant Xenopus nucleosome core particleswere fractionated by Superdex HR 200 (Amersham) size exclusion chromatog-raphy in 20 mM Tris-Cl, pH 8.0, 50 mM KCl, 5 mM 2-mercaptoethanol at 0.4ml/min flow rate.
Piccolo binding of nucleosomes via StrepTactin pulldown. Piccolo v78(Epl1�3, C-terminal Strep II peptide-tagged Yng2, Esa1) and Piccolo (Epl1�3,C-terminal Strep II-tagged Yng2, Esa1�3) were coexpressed and purified byTalon metal affinity chromatography as described above. These Strep-taggedPiccolo complexes were incubated with Strep-Tactin resin (IBA GmbH) in TG50buffer (50 mM Tris-Cl, pH 8.0, 50 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 10% glycerol, 0.1%Tween 20, and 10 mM 2-mercaptoethanol) for 1 h at 4°C, washed three timeswith 20 resin volumes of TG50 buffer, and then incubated with recombinantXenopus nucleosome core particles. After 1 h incubation at 4°C, the supernatantwas stored as the unbound fraction, and the resin was washed three times with 20resin volumes of TG50 buffer. Equivalent volumes of input nucleosome coreparticles, unbound (supernatant), and bound fractions were fractionated by SDS-PAGE and detected by Western blotting using anti-H3 antibodies (Abcam).
RESULTS
EPcA homology in Epl1 is sufficient for nucleosomal HATactivity of Piccolo. We have previously shown that the N-terminal half of Epl1, specifically Epl1 residues 1 to 485, andfull-length Yng2 and Esa1 are sufficient for Piccolo’s strongnucleosomal HAT activity in vivo and in vitro (6). Here, wedefine the functionally important regions of each subunit byassaying Piccolo containing deletions or mutations in the threesubunits. Use of a polycistronic expression system (31) modi-fied to permit subcloning of individual genes in any order madeit possible to rapidly prepare 28 variant Piccolo complexes forthis study. Piccolo deletion complexes expressed and reconsti-tuted in E. coli were then partially purified using an engineeredhexahistidine tag on the Esa1 subunit (Fig. 1a).
Complex formation was judged by the copurification of un-tagged subunits (Epl1 and Yng2) with the tagged subunit(Esa1). The substoichiometric amounts of Epl1 for Piccolo v5in lane 3 reflects partial degradation of the Epl1�1 component(data not shown).
To compare the activities of the deletion variants, we calcu-late a preference for nucleosomes ratio defined as HAT activ-ity on nucleosome substrate divided by the HAT activity onnaked histone substrate. This ratio has several advantagessince it provides a measure of the ability of Piccolo to specif-ically recognize and acetylate a nucleosome substrate, the ratiogreatly reduces the effect of variations in specific activity be-tween samples, and the ratio automatically normalizes for the
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amount of Esa1 between different Piccolo deletions. To furtherfacilitate the comparison between different Piccolo deletionconstructs, we express the preference for nucleosomes ratiorelative to Piccolo v7, where Piccolo v7 is set to 1.0. The HATactivities of Piccolo v5, v7, and v20 additionally purified byanion- and cation-exchange chromatography were very similarto what we observed for the respective partially purified com-plexes shown in Fig. 1, suggesting that the single-step affinity-purified Piccolo complexes are sufficiently pure for HAT ac-tivity measurements (data not shown).
Our deletions of Epl1 demonstrate the importance of theEPcA homology domain in Epl1 for Piccolo function (Fig. 2).Since removing the Yng2 PHD domain did not decrease thepreference of the Piccolo complex to acetylate nucleosomes(compare Piccolo v3 and v5) but produced more homogeneousprotein complexes, we examined Epl1 deletions in the contextof Yng2(1–218). Piccolo v4, v5, and v6, which all contain theEPcA homology, retain strong nucleosomal HAT activity, asdoes Piccolo v7, which contains just the EPcA homology for itsEpl1 component. Removing just the respective N-terminal andC-terminal 20 residues from the EPcA homology in Piccolo v8and v9 dramatically reduces the preference for nucleosomes to 10to 15% compared to Piccolo v7 (also compare Piccolo v6 and v9in Fig. 2). Interestingly, Piccolo v16, which contains the minimalEPcA homology lacking its C-terminal 20 residues, still maintainsapproximately half of its preference for nucleosomes.
In general, the evolutionarily nonconserved N-terminal 50amino acids of yEpl1 inhibit the nucleosomal preference (com-pare Piccolo v6 and v7, v9 and 16, and v11 and v21 in Fig. 2).Taken together, these results show that the yeast 280-residueEPcA homology near the N terminus of each Drosophila E(Pc)homolog is sufficient to form a Piccolo complex with Yng2 andEsa1 and is important for Piccolo’s ability to recognize andacetylate nucleosomes.
Piccolo’s ability to acetylate nucleosomes requires Yng2 N-terminal sequences but not the C-terminal PHD domain. We
find that removing the highly conserved C-terminal PHD fin-ger does not significantly affect recombinant Piccolo complexformation or the nucleosome preference of Piccolo’s HATactivity (Fig. 2, compare v3, v4, and v5). This observation isconsistent with previous studies which showed that PHD re-gion is not necessary for the HAT activity of Piccolo (20, 25).Our results further establish that the C-terminal 40% of Yng2does not appear to play a significant role for complex forma-tion or ability to acetylate nucleosomes since Piccolo v7, v21,v23, and v22, which all contain at least Yng2(1–165) retainboth functions. However, Piccolo v20 containing Yng2(1–140)possesses significantly less preference for nucleosomes, sug-gesting that some aspect of Yng2 residues 140–165 is involvedin recognition and/or acetylation of nucleosomes.
In contrast to the PHD finger, the N-terminal half of Yng2bears less sequence similarity with its p33Ing1 homologs, but iscritical for Piccolo’s nucleosomal HAT activity. Deletion of thefirst 28 or 66 amino acids of Yng2 is sufficient to reduce Pic-colo’s preference for nucleosomes by at least a factor of three(Fig. 2, compare v7 with v10 and v19).
Esa1 chromodomain is essential for Piccolo nucleosomalHAT activity. The 445-residue Esa1 contains a chromodomainnear its N terminus and a MYST catalytic core which occupiesthe C-terminal two-thirds of the protein. Since the catalyticcore possesses a well-defined structure (34), we chose not toanalyze deletions within residues 160 to 435. However, we didexamine the role of the chromodomain since this region wasnot necessary for naked histone HAT activity in vitro and yetessential for Esa1 function in vivo (34). We find that deletingjust 3 residues from the N terminus of the Esa1 chromodomain(Piccolo v12) causes a fivefold decrease in Piccolo preferencefor nucleosomes, a similar effect observed when most of thechromodomain is removed in Piccolo v13 (Fig. 2). This sug-gests that the integrity of the chromodomain is critical for Esa1function in the Piccolo complex. It is conceivable that misfold-ing of the chromodomain which may occur when it is partially
FIG. 1. Representative selection of Piccolo deletion complexes used for HAT assays. The Coomassie-stained SDS-PAGE gel shows recom-binant Piccolo complexes coexpressed in E. coli and purified by Talon chromatography. Constituent polypeptides in each deletion are describedin Fig. 2. Piccolo v3 in lane 1 was additionally purified by Source Q and S chromatography. Epl1, Yng2, and Esa1 polypeptides for each deletionare indicated with a black square, black triangle, and open circle, respectively, to the right of the appropriate band. An E. coli contaminant withapparent size of 43 kDa that copurifies over Talon chromatography is labeled with a double-headed arrow between lanes 2 and 3. Molecular sizestandards are shown in lane 18 with corresponding sizes to the right (in kilodaltons).
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deleted accounts for the lower nucleosomal HAT activity ofPiccolo v12 and v13 compared to Piccolo v14, where the chro-modomain is completely deleted.
The C-terminal 10 residues of Esa1 (residues 436 to 445)also appears to play a role in nucleosomal HAT activity. De-leting these 10 amino acids from full-length Esa1 reduces thepreference for nucleosome ratio by nearly 40% in Piccolo v15compared to v7 (Fig. 2). Furthermore, removing the same 10C-terminal amino acids in the context of the catalytic core inPiccolo v17 reduces the preference for nucleosomes to lessthan 10% of v7. Our results therefore show that the Esa1catalytic core defined structurally as Esa1(160–435) is capableof forming a ternary complex with Epl1 and Yng2 but pos-sesses substantially less activity on nucleosome substrates com-pared to full-length Esa1, which additionally contains the chro-modomain.
Putative hydrophobic cage in Esa1 chromodomain is criticalfor both Piccolo function in vitro and cell viability. The crystalstructure of the HP1 chromodomain bound to an H3 peptidecontaining a trimethylated lysine residue shows that the H3peptide forms an extended chain that completes a beta-sand-wich created by the HP1 chromodomain (16, 24). Further-more, the trimethylated lysine binds tightly in a hydrophobiccage formed by aromatic chromodomain residues Y24, Y48,
and W45 (Fig. 3a). Since not all these hydrophobic cage resi-dues are conserved between HP1 and Esa1, Esa1 chromodo-main is not expected to bind methylated lysine residues. In fact,Jacobs et al. have demonstrated that Esa1 chromodomainbinds unmodified H3 tail, binds more weakly to methylated H3tail, and binds very poorly to unmodified or acetylated H4 tails(17). In the context of nucleosomes, Piccolo acetylates histoneH4 tails preferentially to H2A tails without significant activityon H3 tails (6). Given our results showed that the Esa1 chro-modomain plays a major role in Piccolo’s ability to acetylatenucleosomes, we asked if mutating the potential chromodo-main hydrophobic cage residues would affect Piccolo’s nucleo-somal HAT activity.
Our results suggest that the putative Esa1 chromodomainhydrophobic cage plays a significant role in Piccolo’s ability toacetylate nucleosomes, but in a different manner than the HP1chromodomain. The Esa1 chromodomain single point muta-tion Y56A (Esa1 Y56 corresponds to HP1 W45) alone causeda sevenfold reduction in Piccolo’s preference for nucleosomes(Fig. 3b, v69). However, removing either or both of the sidechains of R36 and Y59 (corresponding to HP1 Y24 and Y48)did not affect Piccolo complex formation, naked histone, ornucleosomal HAT activity (Fig. 3b, v68, v70, and v72). Incontrast, the corresponding alanine substitution mutations in
FIG. 2. Deletion analysis of Piccolo subunits. The chart shows the identity of subunits present in each Piccolo deletion construct, withevolutionarily conserved regions (EPcA, PHD, and chromodomain), structurally determined regions (Esa1 HAT domain), and hexahistidine tagsshown as black and shaded regions. Naked histone and nucleosome HAT activities were normalized by ELISA-determined Esa1 content usinganti-Esa1 antibodies. The preference for nucleosome ratio shown on the right side is the ratio of naked histone HAT activity to nucleosome HATactivity, with Piccolo v7 set to 1.00.
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HP1 reduced its binding to K9 trimethylated H3 peptide atleast 20-fold (16).
We also examined Esa1 E65 mutations because our modelbuilding suggested the possibility that an unmodified positivecharged lysine residue might contact this acidic residue. Wefind that removing the side chain actually increased Piccolo’spreference for nucleosome by 40% (Fig. 3b, v71), while chang-ing the ionic charge with the E65R mutation decreased thisability by almost 50% (Fig. 3b, v73). We observe an even moredramatic effect when the negatively charge glutamic acid isreplaced with a hydrophobic leucine residue: the E65L muta-tion causes a sixfold reduction in nucleosome preference, asimilar deleterious effect as the Y56A mutation (Fig. 3b, v74).
Since Esa1 is an essential yeast gene, we have used a URA3-based plasmid shuffle system to examine the effect of theseEsa1 chromodomain mutations in vivo. We find a strong cor-relation between the in vitro nucleosomal HAT activity ofPiccolo and the viability of yeast cells (Fig. 4). The single R36Aand double R36A Y59A mutations possess nearly wild-typenucleosomal HAT activity (104% and 71%, respectively, com-pared to wild-type v55), and yeast cells with these mutations
grow at the same rate as the positive control (Fig. 4, lanes 3 to5). Similarly, yeast cells with the E65A mutation, which resultsin slightly higher than wild-type nucleosomal HAT activity, donot display any growth defect (Fig. 4, lane 7). However, theE65L mutation associated with a sixfold reduction in nucleo-somal HAT activity causes severe growth defects in yeast, whilecells with the Y56A mutation which caused a sevenfold de-crease in HAT activity in vitro are not viable (Fig. 4, lanes 8and 6). Western blots confirm that cellular Esa1 levels aresimilar for each mutant, indicating that the growth defects donot result from instability of mutant Esa1 proteins in the yeastcells (data not shown). These results strongly suggest that theEsa1 chromodomain putative hydrophobic cage plays an crit-ical role in yeast related to Piccolo’s ability to acetylate nu-cleosomes.
Histone modifications are not necessary for specific effectsof Piccolo chromodomain mutations. Since one establishedrole for the chromodomain is to bind a modified histone tail,we have examined the activity of the Piccolo containing Esa1chromodomain mutations on native and recombinant nucleo-some substrates. In particular, we have compared native
FIG. 3. Piccolo variants containing Esa1 chromodomain mutations. (a) Space-filling representation of H3 peptide containing trimethylated K9bound to Drosophila HP1 chromodomain. The HP1 chromodomain is shown in light blue, while the H3 peptide backbone and the trimethylatedK9 are shown in pink and maroon, respectively. The residues that create or line the hydrophobic cage are displayed as follows: Y24 in light blue,Y48 in dark blue, W45 in yellow, and T54 in green. The corresponding Esa1 residues are also provided. Figure prepared using MidasPlus moleculargraphics software (10) and PDB coordinates 1KNE (16). (b) Effect of Esa1 chromodomain point mutations on Piccolo HAT activity. Piccolo v55and v68 to v74 each contain an N-terminal hexahistidine-tobacco etch virus nuclear inclusion a (NIa) protease site tag (HISN) on the Epl1component, and all complexes were expressed and purified to similar levels. The preference for nucleosome ratio shown on the right side is theratio of nucleosomal HAT activity to naked histone HAT activity, with Piccolo v55 set to 1.00 for all eight Piccolo variants.
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chicken blood nucleosome substrates (as used in Fig. 2 and 3)with recombinant Xenopus and recombinant yeast nucleo-somes. Since the recombinant Xenopus and yeast nucleosomescontain core histones expressed in E. coli, these histones arenot expected to contain posttranslational modifications.
We find that the Piccolo containing the Esa1 R36A chro-modomain mutation does not affect the preference for nucleo-some, consistent with our HAT results using chicken nucleo-somes and the in vivo complementation studies (Fig. 5, v68).Furthermore, the Y56A and E65L mutations, which severelyaffected yeast viability and HAT activity using native chicken
nucleosome substrates, also severely reduced HAT activity us-ing recombinant yeast nucleosomes (Fig. 5, v69 and 74). Es-sentially the same results were obtained when recombinantXenopus nucleosome substrates were used. These results indi-cate that the chromodomain’s critical role in Piccolo acetyla-tion of nucleosomes does not require posttranslational modi-fications, since similar effects on HAT activity of specificmutations are detected with both native substrates with post-translational modifications and recombinant substrates with-out such modifications. In particular, our results show that theEsa1 chromodomain does not bind a methylated lysine forPiccolo acetylation function.
Esa1 chromodomain is not required for Piccolo to bind tonucleosomes. For Piccolo to acetylate nucleosomes, it mustpresumably first bind to its nucleosome substrate. In fact, astable Piccolo/nucleosome core particle complex is observedwhen we incubate Piccolo complex with recombinant nucleo-some core particles and analyze the mixture by gel filtrationchromatography (Fig. 6a). If the Esa1 chromodomain is re-quired for binding to nucleosomes, we would expect that theY56A and E65L chromodomain mutations, which greatly af-fected nucleosomal HAT activity and cell viability, would ad-versely affect Piccolo/nucleosome complex formation. How-ever, no noticeable change in Piccolo/nucleosome complexformation is detected by gel filtration for either the Y56A orthe E65L mutation, showing that Piccolo complexes containingthese mutations still form stable complexes with nucleosomes.We have also examined Piccolo/nucleosome complex forma-tion using Piccolo v17, which lacks the entire chromodomain.We find that Piccolo v17 binds to nucleosomes similarly toPiccolo v7, which contains full-length Esa1 (Fig. 6b).
To independently verify that Piccolo binds to nucleosomesand that the Esa1 chromodomain is not necessary for thisinteraction, we employed a pulldown assay using epitope-tagged Piccolo. Specifically, Piccolo v78, which containsEpl1�3, C-terminally Strep II-tagged full-length Yng2, andfull-length Esa1 was bound to Strep-Tactin resin via the Strep
FIG. 4. Specific mutations in Esa1 chromodomain severely affect growth of yeast cells. Yeast strains deleted for Esa1 and containing a wild-typeEsa1 gene on a low-copy-number URA3 plasmid were transformed with a LEU2 plasmid expressing wild-type Esa1 or Esa1 containing the indicatedpoint mutations in the chromodomain. The left panels show growth of 10-fold serial dilutions on YPD rich medium, while the right panels showsimilar growth on 0.1% fluoroorotic acid plates. Rows 6 and 8 document the severe growth defects of yeast cells expressing the Y56A and E65LEsa1 chromodomain mutations.
FIG. 5. Specific effects of chromodomain mutations do not requirehistone modifications. Piccolo v55, v68, v69, and v74 were assayedusing native chicken (black bars), recombinant Xenopus (grey bars),and recombinant yeast (white bars) nucleosomes. Equivalent amountsof nucleosome substrates determined by Coomassie-stained SDS-PAGE gels of the histone proteins were used in the assays. The pref-erence for nucleosome ratio shown on the right side is the ratio ofnucleosomal HAT activity to naked histone HAT activity, with Piccolov55 set to 1.00.
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tag, and the immobilized Piccolo complex was incubated withnucleosome core particles. The unbound and bound fractionswere analyzed after washing by Western blotting using anti-H3antibodies. Figure 6c shows that nucleosome core particlesalone do not bind to the Strep-Tactin resin (lanes 1 to 3),whereas nucleosomes do bind to Piccolo v78 immobilized onthe same resin (lanes 4 to 6). Furthermore, similar binding is
detected when Piccolo v82, equivalent to Piccolo v78 withoutthe Esa1 chromodomain, is bound to the Strep-Tactin resin(lanes 7 to 9). Thus, we conclude that the chromodomain is notrequired for Piccolo to bind to nucleosomes but may insteadplay a role in a catalysis step after binding.
DISCUSSION
We have exploited a new E. coli modular polycistronic ex-pression system to coexpress and to functionally dissect thethree-protein yeast Piccolo NuA4 complex. This complex rep-resents the catalytic core of the 1.3-MDa NuA4 histone acetyl-transferase coactivator but also appears to be a bona fide HATcomplex on its own, responsible for the global H2A and H4acetylation of histones in yeast (6). Our biochemical analysis ofthe variant Piccolo complexes defines the regions of the com-ponent proteins sufficient for Piccolo assembly as well as re-gions necessary to recognize and acetylate nucleosomes.
We find that the EPcA homology region of Epl1 is sufficientfor Piccolo complex formation with Yng2 and Esa1. In con-trast, the well-conserved PHD finger of Yng2 is dispensable forPiccolo complex formation, as are the N-terminal 66 residues.We also find that the HAT catalytic domain of Esa1 is suffi-cient for Piccolo complex assembly. However, the require-ments for the preferential acetylation of nucleosomes are morestringent. The N-terminal 20 amino acids of the EPcA homol-ogy region of Epl1 are necessary for nucleosome HAT activity,while some aspect of the Yng2 N-terminal 28 residues is nec-essary for Piccolo’s robust ability to acetylate nucleosomeseven though they are not necessary for Piccolo complex for-mation. Our results also show that the chromodomain of Esa1near its N terminus plays a critical role in Piccolo’s preferencefor nucleosomes, although Piccolo can assemble in the absenceof the chromodomain. Similar results attest to a significant rolefor the very C-terminal 10 amino acids of the Esa1 protein inPiccolo’s ability to acetylate a nucleosome substrate.
Although this deletion analysis defines the regions of Epl1,Yng2, and Esa1 that assemble Piccolo and confer upon Piccoloits nucleosome acetylation function, sequence homologies forthese regions unfortunately do not provide insight into themechanisms for the assembly and catalytic functions. However,point mutations introduced into the Esa1 chromodomain doshed light on possible mechanisms for the catalytic function.Our results show that specific mutations in the putative hydro-phobic cage of Esa1 affect Piccolo’s ability to acetylate nucleo-somes but not in a way that could be predicted based on theHP1 chromodomain hydrophobic cage’s binding to a methyl-ated lysine histone peptide. This suggests that Piccolo does usethe Esa1 chromodomain hydrophobic cage in its catalyticmechanism but not necessarily the same way HP1 binds H3peptides through methylated lysine.
Since the Esa1 chromodomain can bind unmodified histonetails (17), we considered the possibility that the chromodomainis required for Piccolo to bind to nucleosomes, but our resultsusing chromodomain point mutations or removing the entirechromodomain show that Piccolo does not require the chro-modomain to form a stable complex with nucleosome coreparticles. Since we used recombinant nucleosomes containingE. coli-expressed histones for our binding studies, our resultsalso suggest that Piccolo does not require histone modifica-
FIG. 6. Esa1 chromodomain is not necessary for Piccolo to bindnucleosomes. (a) Gel filtration chromatograms of recombinant nucleo-some core particles alone (cyan) and nucleosome core particles incu-bated with Piccolo v7 (red), Piccolo v72 (blue), Piccolo v69 (yellow),and Piccolo v74 (green). All Piccolo samples form stable complexeswith nucleosomes, as shown by the appearance of a larger peak, dis-tinct from the nucleosome peak and from the Piccolo-only peak atapproximately 27 min (data not shown). SDS-PAGE gels of the peaksconfirm the assignment of the gel filtration peaks. For example, frac-tions for the Piccolo/nucleosome peaks show all three Piccolo subunitsand all four nucleosome histone subunits (data not shown). (b) Gel fil-tration chromatograms of recombinant nucleosome core particles (NCP)incubated with Piccolo v7 (red), which contains full-length Esa1, or Pic-colo v14 (green), which lacks the Esa1 chromodomain. Both samples formthe Piccolo/nucleosome complex, establishing that the chromodomain isnot required for stable binding of Piccolo to nucleosomes. (c) Piccolo/nucleosome pulldown experiment confirms that the Esa1 chromodomainis not necessary for binding to nucleosomes. Blank (lanes 1 to 3), Piccolov78 (lanes 4 to 6), or v82 (lanes 7 to 9) was immobilized on Strep-Tactinbeads via their Strep-tagged Yng2 subunits and incubated with nucleo-some core particles, and unbound and bound fractions were analyzed byWestern blots to detect the histone H3 component of nucleosomes. Inputsamples are shown in lanes 1, 4, and 7; unbound (supernatant) fractionsin lanes 2, 5, and 8; and bound fractions in lanes 3, 6, and 9.
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tions to form a stable complex with nucleosomes. The specificeffects of the chromodomain point mutations on Piccolo HATactivity also do not require histone modifications, since similareffects are observed whether nucleosomes used were isolatedfrom natural sources or produced recombinantly.
Our data suggests the possibility that the Esa1 chromodo-main is involved in some catalysis event after Piccolo binds tonucleosomes. For example, since nucleosomal histone tails arelikely to be associated with DNA (22), Piccolo may use theEsa1 chromodomain to pry histone tails away from the DNAonto the Esa1 MYST HAT domain. One possible mechanismfor Piccolo to separate histone tails from DNA might be for theEsa1 chromodomain to bind directly to histone tails. Thiswould be consistent with the observation that recombinantEsa1 chromodomain can bind unmodified histone tails, al-though that study found the Esa1 chromodomain interactedwith unmodified histone H3 tail and not the H4 tail acetylatedby Piccolo (17). An alternative but not mutually exclusivemodel is that the chromodomain binds nucleic acid and dis-places histone tails by competing for the histone tail’s DNAbinding site on the nucleosome. Several studies have shownthat various chromodomains can bind to nucleic acid: the dos-age compensation histone acetyltransferase MOF binds tononcoding RNA in Drosophila melanogaster (1) and the Mi-2chromodomain binding of DNA is involved in the Mi-2 com-plex’s ATP-dependent nucleosome remodeling activity (5).
Our deletion and mutational analysis of Piccolo have definedthe regions of this histone modification complex which allow thespecific recognition of its physiological nucleosome substrate andrefined our ideas of how the Esa1 chromodomain functions innucleosome acetylation. It will be important now to investigateprecisely how Piccolo binds its nucleosome substrate, includingthe roles of individual histone tails for this process.
ACKNOWLEDGMENTS
We dedicate this manuscript to Bob Simpson, whose pioneeringchromatin studies inspired us and whose support and friendship wecherished.
We are grateful to the Tan Lab and the entire Penn State generegulation community for support and fruitful discussions. We alsothank Tim Richmond and Brad Cairns for recombinant Xenopus andyeast histone expression plasmids, respectively, and Marianne Potvin,Andreanne Auger, and Tim Kelly for technical help.
I.F. is supported by a Canada Graduate studentship. S.T. is a PewScholar in the Biomedical Sciences. This work was supported by grantGM-60489 from the National Institutes of Health to S.T. and by grantsfrom the Canadian Institutes of Health Research to J.C.
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