ANALYTICA CHIMICA ACTA

DOSAGE DE TRACES DE VITAMINES B12

‘I). MONNIER, Y. GHALIOUNGHX ET R. SAI3A

I,atoYttloire de C/rinrie MinEvuie, de Clrimie Rnalytiyue Genibe (Sriisse)

cl dc

(Rcqu Ic 16 juillct, IgGz)

La vitamine Blz est la seule vitamine renfermant du cobalt. Son effet in vivo est cssentiellement cntalytiquc, aussi n’existe-t-elle, le plus souvent, qu’h Y&tat de traces dans les milieux biologiques, ainsi du reste que dans la plupart des produits pharmaceutiques, C’cst pourquoi nous nous sommes efforc& cle mettre au point unc methode rapide et prkise permettant de closer des quantites de l’ordre de 5 h IO pg de cette substance. Le poids xnol&culaire elev& de cette vitamine (x355+42) ne facilitc pas la solution du probEme.

L’etudc bibliographique montre quc Ies m&hodes microbiologiqucs sont cer- taincment les plus sensibles et de beaucoup (0.01 & 0.16 ng/ml)l. Mais la dunk du dosage, les difficult& qu’il pr&ente, les al&as inlkents & toute m&hode catalytique, parfois mkne la tr&s grnndc sensibilitb qui n’est pas toujours avantagcuse, font qu’on ne peut pas l’utiliser dans tous les cas.

Parmi les methodes chimiques et physico-chimiqucs en usage, le dosage colori- mdtrique direct dc la B 13 n’est ni suffisamment sensible ni suffisammcnt s&lcctif pour nous. Certains auteurs &parent les substances gGnantes sur r&sine&W D’autres, par con tre-courant4 QU encore par extraction du d&iv& dicyano-cobalamine% Une methode indirectc de dosage a et& propos&ea qui s’effectue sur les produits d’estkrifi- cation de l’hydrolysat de la Br2 par l’alcool octylique.

BOXER ET RICICARDS 7 dosent le 5,G-dim&hyl-benziminazole prksent dans la mokule de la vitamine Br2 en la transformant en 4,5-dimCthyl-o-phenylWe-diamine. Avec l’acCtylac&one on effectue un dosage colorimktrique et avec l’alloxane un dosage fluorimCtrique. Ces m&hodes permettent de doser jusqu’8 IO pug de benaimi- nazole (soit de xoo ,ug de vitamine).

Les memes auteurs* ont do4 le cyanure, qui constitue le 2% du poids mokulaire de la vitamine BJ_~, par deux m&hodes colorimetriqucs diffkentes, aprtis 1ibGration quantitative de celui-ci, Dans l’une des m&hodes le groupement CN est lib&e par reduction de la 812 au moyen de l’acide hypophosphoreux a xoo”; dans l’autre le cyanure se d&gage lorsqu’on expose cette vitamine & la lumike, ZL la tempkature du laboratoire. Malbeureusement plusieurs milieux biologiques d&agent aussi du cyanure mGme cn l’absence d’agents r4ducteurs. Cette mt5thode n’est done pas selective.

La vitamine 1312 donne un saut polarographique (E, = 1.53 V vs. E.C.S.) pour des concentrations comprises entre’ 0.005 et 0.02 pg/ml. Mais la reproductibilith est insuffisante et !a mkthode peu z&ire; elle n’est done pas utilisk.

BACHER, ‘BOLEY ET SHONK* ont mis au point une m&hode de dosage spkifique

Rwzt. Clrinr. Rctn, 28 (1gG3) 30-40

DOSAGE DE TRACES DE VITAMINES B12 31

de Ia vitamine BIZ, qui comprend plusieurs extractions, un passage sur colonne, pour Bliminer compl5tement les pigments rouges, et un dosage spectrophotometrique. Les pertes in&itables qui se produiscnt au tours des diverses opdrations du dosage sont d&erminees par l’addition de vitamine Bl2 marquhe au *OCo, Cette m&hode est tr&s spCcifique mais peu sensible ; elle n&essite un minimum de IOO pg de vitamine Bi2 et la deviation standard est de 4.3%.

La m&hode que nous proposons consiste ZL doser colorimCtriqucment le cobalt de la vitamine B12, par le nitroso-se1 R. Pour ce faire celle-ci est d&ruite, apr& dlimi- nation des substances @nantes (en particulicr du cobalt ionique).

PARTIE EXl’tiRI>lENTALE

Les determinations spectrophoton&riques ant t5t& effect&es au moyen d’un spectrophotomhtre Beckman DU, avec photomultiplicateur permettant l’extension de la zone de lecture & go-roe y0 sur toutc la longueur de l’echelle. Nous avons aussi utilise le photomfitre Eppendorf & lampe de mercure.

Les mesures de la radioactivite ont 8te faites: (I) avec unc echelle decadique Tracerlab, type SC 33 A-IOOO Scaler, equip&e d’une sonde it scintillation PzoB avec un cristal NaI (II) & puits, ou d’un tube Geiger TG-C-z muni d’une fen&re d’une 6paisseur cle 2 mgjcmn; (2) atiec une echelle dbcadique Landys et Gyr, type EL B2, &quip&e d’un compteur B scintillation type Elko EQPr ou d’un tube G.M., type EQBx, avec fen&re en mica d’une Bpaisseur de 2 m&m%

Lcs spectres gamma ont et& obtenus au moycn du spectromOtre gamma SAW, h un canal, mod+le SPI 3, WCC sondc a scintillation &quip&e d’un cristakplat NaI (Tl) 2 II’ x 2r1.

SoZulio9ts utilist?es

Solution de cobalt radioactif. Sous formc de O*CoClz renfermant 0.5 rug/ml de Co et ayant une activite de 6.1*x0-2 &nil.

Solution de vitamhe 1312 d’activite’ s$&ifique. 0.5 &ml, renfcrmant 0.5 pglrnl de B12.

Solution de chlortrre de cobalt. 0.589 pg Co/ml, Solutions de vitumine 2312 @we. P&par&es aux concentrations IO ,ug/ml, 20 &ml

et I00 p&ml. .

Solution tamfion $E? 4. 60 g d’acide citrique et 65 g dc citrate de sodium sont dissous dans l’eau bidistillh, on complbte au litre. Le pH 4 est ajust& si nkessairc, au moyen d’une sdlution conccntrke de NaOH ou d’acide citrique.

Solution tamfion @? 6. Solution aqueuse de CH&OON~‘IO y0 port& au pH 6 par addition d’acide achique.

Sotution de NaCl 2 %.

Solution aqueme de ktvoso-sel R (N.S.R.). 0.05 glxoo ml. A&de jwchlarique concentrd. D = r .67. Acide nitriqrce concentrd. Acide chlorhydriqwe f~cmant.

s Solution de i;rCN IO %. Sohtion &unnte $orcv la vitamine 1512. 60 ml de dioxane-qo ml HCl 0.25 N.

Awnf. Chin. Ada, 28 (xgG3) 30-40

32 D. MONNIER, Y. GHALIOUNGHI, R. SABA

Act%me. Rtfsine Amberlite CG 50. Rohm & Haas, roo-150 mesh. Lcs produits utilises sont tous des produits Merck pro-anal, sauf les solutions

xadioactivcs et celles de la vitanine Bls qui provienncnt soit de la Maison Hoffman la Roche soit de Merck, New-Jersey.

IXterw8ination des actiuitks

Wne petite eprouvette vide de 35 mm de hauteur et de 5 ZL 7 mm de diam&tre est introduite dans le creux du cristal et on d&ermine le bruit de fond en prenant la moyenne de 5 mesures (d’unc minute chacunc). On introduit z ml de la solution a mesurer dans l’eprouvette et on cl&ermine l’activite. On mesure l’activith du tube vide apr& rincage, cc qui permct de calculer l’activite du traceur introduit dans la solution. Chaque activitk don&e (en c.p.m., bruit de fond d6duit) correspond 9 unc moyenne de 5 mesures (de I min chacune).

Afin d’augmenter encore la prCcision et la &ret& de la methodc, on d&c&le lesvaria- tions &entuelles de la geombtrie et du rendement du compteur, durant l’analyse, au moyen d’un tube &talon dont on d&ermine I’activitC- apres chaque mesure faite sur l’&hantillon.

Le dosage spectrophotomdtrique &.I cobalt au moycn du nitroso-se1 R est ex- tr&memcmt sensible (0.01 pg/ml). Bicn clue la I312 ne renferme que le 4 o/0 de son poids de cobalt, le dosage de ce dernicr est encore, du point de vue chimique, un des meilleurs et des plus sensibles pour determiner cette vitamine; il est &ident clue cette methode n’est valable clue s’il ne reste pas de traces de cobalt ionique avec la vitamine (v. p. 34) ct s’il n’y a pas dans le m&lange des produits d’hydrolyse inactifs de la vitamine BIG renfermant du cobalt. Destrwtimz de la vitamine. Elle a pour but de lib&er lc cobalt et de dbtruire les acides rouges, groupements constitutifs de la vitamine BIZ, qui genent le dosage par leur coloration.

L’attaque & l’acide nitrique concentre, suivie d’une evaporation 9 l’infra-rouge, ne donne pas de r&sultats reproductibles, soit parce que la vitamine n’est pas detruite compl&ternent, soit parce clue les produits de dt5composition provoquent des inter- ferences. Nous avons con&at6 par exemple que certains d’entre euxconfhrentune l&g&e teinte jaunAtre & la solution. 11 faut done proceder & la destruction totale de la vitamine avec l’acide perchlorique. Pour ddterminer les pertes en cobalt qui se pro- duisent au COWS de cette operation, nous avons effectual desrecherches syst&matiques avec la II312 marqude au WZo. Ces pertes sont dues surtout B l’adsorption du cobalt sur la paroi des recipients; on peut les diminuer sensiblement en ajoutant g la so- lution initiale d’importantes quantitks d’un electrolyte indiffdrent ; une solution de NaCl2 % par exemple, Remtwqzres. Nous avons p&f&C Ie NaCl au KC1 car ce dernier donne, au tours de la destruction de la B ~a, du KC104 peu soluble dans l’eau. Pour le transformer en KC1 on doit proceder it plusieurs &vaporations & set en presence de HCl concentr6.

Nous nous sommes assures de la decomposition totale de la vitamine Bla en traitant parallELement et de la m&me facon, une solution de CoCla renfexmant la m&me quantitd de cobalt. L’opbration de destruction ne provoque pas de pertes sensibles

Anal. Cirim. Acta, z8 (x963) 30-40

DOSAGE DE TRACES DE VITAMINES B12 33

en cobalt, du moins pour des quantith de vitamine de l’ordre de 2 pg. Wn contrble par indicateur radioactif a don& les memes rhultats.

Le Tableau 1 donne la courbe d’dtalonnage et l’&ude statistique de la m&hode.

TABLEAU I

CCJURDE D’&TALONNAGD ET ERREURS STATXSTIQUES

IhnsitC optiquc moycnne 0.07 o.ogG 0.036 0.028 O.OZOI 0.0135 Ecart type - - 0.001 0.00x73 O.WXd 0.00x09 Limitc dc confiancc 95% - - 0.0023 0.00398 0.0368 0.0025

TABLEAU II

RhULThTS DE MACRO ET MXCRODOSAGES

Macro-dosage: Volume final dc IO ml 10 0.0685 0.072 0.0700

8 0.0545 0.058 0.0~558

5 0,034o 0.037 0.0360 4 0.0265 0.0315 0.0285 3 o.0175 0.02 1 0.020 I 2 0.0125 0.015 0.0135

9.99 &o,or

7.99 &0.0x

5*x5 &O.Ol~ 4.10 -&0.X 2.80 *0,2

I-95 Zto.05

Scrni-micro dosage: (z) Volume final dc 5 ml ci 0.0400 0.042 0.04x0 5.90 4 0.0245 0.0285 0.0265 3.80 2 o.or30 0.0145 0.0140 2 .oo

G ;

2.4 2

(2) Volunrc final dc 2.5 ml o.0395 0.042 0.04x0 5.90 0.0200 0.0245 0.024 0.028 0.0268 0~0215 3*o5 3.90

0.0135 0.015 0.0142 2.05 o.oxgo 0.014 0.0160 2.30

&0.X

ho.2 *o.oor

-&0.X

ko.1

zto.05 zto*os +0.1

- t.5 -2,5

-3 -5 - 13 - 10

-4.1 - 10 -GG,5

-5 - IO

-4.2 0.0

- IO.3

+2 -l-3*7 c-5.5 -I- 10

G-5

0.00 -l-2.5 +4

0.00 0.00

- x2.0

-745 . -4.x

Chaque valcur de la 2e ligne du Tableau I est la moyenne de xo cxpbiences diffkentes. Le Tableau II donne le rksultat d’un certain nombre de. dosages macro et semi-

micro avcc les erreurs relatives et absolues. Les colonnes (2) et (3) du Tableau II donnent les valeurs cxtr4mes obtenues sur 5 dosages. L’crreur o/O a &t& calcuMe en se basant sur les densit& optiques extremes.

Le dosage de si petites quantith de vitamine Bra exige, pour que les rhultats soient4tilisables, un contrble tr&s &v&e, tant en ce qui concerne lcs pertes que les contzuninations qui se produisent au tours des diverses opkations analytiques auxquelles on soumet l’khantillon.

Pour dliminer les erreurs dues A la contamination en tours d’analyse nous avons,. comme il a et6 indiqu4. fait usage d’un blanc. D’autre part les perks ont pu Gtre cxactement d&ermi&es par l’emploi d’un indicateur radioactif: la vitamine Bl2 marquke au OOCo. Une sh-ie d’essais nous ont montr4 qu’elles &Gent nCgligeables.

ANa!. Cihn. Acta; 28 (1963) 30-40

34 D. MONNIER, Y. GHALIOUNGHI, R. SABA

Activitd initialc dc la vitaminc 812 I790 1823 1725 Activith du complexc Co-N.S.R, 1740 1885 1675

Etmic de La st$uzratiolz: vitamine &2-ions cobah Cornme nous venons de le voir, on peut doser quelques ,ug de Bra par la d&ermi-

nation spectroplrotom&trique du cobalt qui la constitue. Or beaucoup dc produits pharmaceutiques renfernrcnt des traces de BI.Z de l’ordre du ~6 en p&ewe de 5000 ZI IOOOO fois plus de cobalt ionique, pour.une stabilisation probl&matique des solutions la rcnfermant ou pour la n&es&& d’une bonne nutrition. La m&hode de dosage propos&e ne pourra done s’appliqucr & de tels produits clue si on dispose d’une mdthode de separation vitamine BKZ- ions cobalt, rigoureuscmcnt quantitative. En effet IO ~6’ de Bl2 renferme 0.4 ,clg de cobalt, il faut done qu’apr&s la sbparation, la quantite de cobalt ionique qui reste avec la Bl2 soit infkieure au x/500 i&me du poids dc cettc dernikre. L’&uile de cctte opkation a &tk considkablement facilitde par l’emploi d’indicateurs radioactifs & base de cobalt-60: le fl*CoCl~ d’une part et la vitamine RI2 marclube au cobalt-ho d’autrc part. Mais cette s&par&ion $est possible que s’il n’y a pas d’khange dans les solutions cntrc lc cobalt ionique et le cobalt fix4 sur la &z. BALDWIN et al -11 l’affirment ainsi clue ITANTEs 12. l300sl3 par contre n’est pas de cct avis. Now avons montr& que, m&me aprtis une annbe, il n’y a pas d’echangc d&clable entre ces particules, Pvi~zci@ de la sdparation. Elle se fait par khangcurs d’ions sur r&sine Amberlite X E 97 ou CG 50. La Bl2 est rctenue dans la partie supkieure de la r&sine, l’ion cobalt passe dans la solution. AprSs lavage de la colonne avec du HCl I N, la 131’~ est elude par le dioxane. La sbparation devant 6trc rigoureusement quantitative, une etude minutieuse cles conditions de travail, du mode opkatoire et du rendement dc l’opka- tian a Gte nkessaire, Pvt+watiov~ de la ri%M, On laisse tremper la r&sine pendant une nuit dans l’eau distill&, puis on la met en suspension clans ce mSme milieu. Apr&s dis minutes on d&ante et on jette l’eau surnageantk. Cette opkation est r&p&&e dis fois pour dliminer les particules trop fines. La r&sine cst alors introduite dans une colonnc de verre de 30 cm de long et I cm de diam&tre jusqu’& ce qu’elle atteigne une hauteur de 7 A 8 cm. On lave avec NaOH afin que l’bluat soit alcalin et on laisse en contact avec cette derni&re pendant 30 min. L’cxc&s d’alcali est hlimink par rinqage & l’eau distill&e et on ajoute une solution de PH 4 (v. p. 31) jusqu’k saturation de la r&jne, puis un e-xc& de 50 ml. Apr&s agitation, on laisse d&poser la r&sine. L’exc&s de tampon est Blimine jusqu’& ce qu’il ne reste plus quc I B 2 ml de solution au dessus de la r&kc, la colon’ne est ainsi p&e & I’emploi. St$aration vitamilze I312 - iotts cobalt marqzce’s au cobaltM6o. On introduit dans un ballon jauge de IO ml: 2 ml de la solution KCN (p. 3x), I ml de la solution de CoClz marqube et 2 ml de la solution de 1312. On ajuste au E)H 7.5 avec la solution d’acidc citrique et on complete & IO ml par addition d’eau bi-distill&. On obtient ainsi la solution A. La solution B sera prepa& de faGon identique mais sans vitamine Bra. On laisse reposer ces deus solutions pendant 3 heures, en les agitant de temps en temps, puis on ajuste au PH 4 par addition d’une solution d’acide citrique. Le volume est compl&e 2~ IO. ml par addition d’eau distill&. On fait passer les solutions sur les colonnes

Atml. Chint. Acta, 28 (rc~t3) 30-40

DOSAGE DE TRACES DE VITAMINES B12 35

prklablement prkparees. On rince le ballon jaugC et la partie supkieure de la colonne avec la solution tampon de PH 4 dilude x/r, puis on lave plusieurs fois la colonne avec une solution de HCl 0.1 M. La BE est fix&e dans le haut de la coIon& et on r&cup&e la solution et les eaux de lavage au moyen de rkipients jaug& de IO ml plac& au.bas de la colonne. Lc lavage est poursuivi jusqu’h ce que les eaux de lavage ne presentent plus de raclioactivitk Dans ces conditions on peut estimer que la sCparation est rigourcusement quantitative, A moins que des traces de cobalt ionique ne soient rctenues irreversiblement sur la r&sine. Les r&sultats sont don&s dans le Tableau III.

TA\RI,EAU II I

SkFARATION COBALT-GO-VITAMINE &,

It?? e SCliC 2Lmc S&is

Solution A Soluliotr II Soluliou A Solufion U (avec Hi ¶) fsam BIS) (awe BI¶) (sarrs iht)

Rctivitd initialc dc lrr solution cn c.p.m. 54317 54x71 55517 56177

fictivit3 dcs caux dc rinpgc ct lavagd (dlution tic Co) 1 bre lavagc (I 0 ml) 9547 9765 15369 16534 aGmc hvrrgc ( 10 ml) 40613 40289 37322 3&mc lavngc (10 ml) 257.5 2409 IS23 3xl

.l&mc lavagc (IO mt) 208 321 43;

530 53mt: lavagc (10 ml) nullc nullc 12

htivitd non tdcupfMx2 (cn */“) -4% -4% --r.s% -3%

On observe une perk cl’ions cobalt qui peut aller jusqu’a 4 %. Si ccs ions restent avec la n,,, il cst evident que la mhthodc est inutilisable. I1 fallait s’en assurer, aussi awns-nous, apt& dlirnination des ions cobalt et lavage prolong& des colonnes, &lu~ la 1312 par le dioxane. Nous l’avons do& cdmme indique a la page 36. La valeur moyenne trouvk est rg,7 pg de BIZ avec des variations de & x.5 o/O sur les 20 ,uug que contenaient lcs Bchantillons. D’infimes traces de cobalt sont done fix&es irr&crsible- mcnt sur la r&ine, elles nc gencnt pas le dosage. SQavution vitamine BI:! marqtre’e-ions cobalt. Nous IIOUS sommes zissur& que la solution marqude de I312 (p. 31) ne renfermait pas d’impurctk radioactives, ce qui est le cas puisque le spectre gamma de ces tkhantillons ne montrc que les pits du cobalt-60. 11 fallait aussi Gtrc certain qu’il n’y avait pas, avcc la l312, des ions cobalt-Go, m2me en tr&+ petites quantitbs. Wous avow effectue une st5para’tion sur r&sine comme indiqu& ci-dcssus. La solution ne prkentait, aprk passage sur la r&sine, aucune

TABLIZAU IV

DXSTKIUUTION DE tn B~I DANS LES DIVEWjES FRACTIONS D1S L’XiLUAT

X0 G * x813 =434 307 40 22 7 nullc 1810 IO G x822 1822 326 25 nullc nullc, 1812 . 13 8 1834 .I376 217

2: 34 34 15 172x

And. China. Ada, 28 (1963) 30-40

36 D.MONNIER,Y. GHALIOWNGEiI,R. SABA

radioactivitd et ne contenait done pas de cobalt-60, Par contre, apres elution de la I&, l’activite gamma totale fut retrouvke dans le dioxane. Remarques. Les essais de separation effect&s sur des colonnes de 13 mm de diaxnetre donnent di55 pert& supkrieures en B12, de l’ordre de 6 fL IO Oh. Ces colonnes ne con- viennent done pas. D’autre part, pour determiner le volume de dioxane minimum nkessaire A 1Wution quantitative de la vitamine, les divers hluats ont 6th r&cup&&s par fraction de 2 ml et l’activitt5 de ceux-ci mesurec.

Comme on le voit, IO ml d’kluat perrnettent d’extraire lc totalitk de la Bi2. On peut .

en recupkrer environ 97 o/o en 6 ml en prenant la prdcaution suivante: la surface de la r&sine doit &re maintenue horizontale pendant toute l’opkation, et il faut &iter d’agiter la r&sine lors de l’addition des diverses solutions. La colonne de IO mm de diametre donne de bons r&ultats. Enfin il ne faut ajouter lc dioxane que lorsque la fraction prec&dente est cornpletement ecoulee. Par la suite, nous avons dirninu& encore la quantite d’dluat nkessaire: avec 4 ml on rkup&re les g5 O/O de la Bl2, S~lectivite’ de In m&lzode. Le fer comme lc cobalt joue un r6le important dans le traite- ment de l’anemie, et de cc fait, peut se trouver en grande quantitd dans les produits pharmaceutiques renfermant de la B12. Le rapport-peut atteinclre Bl2: Fe = I :sooo

en poids et bien que la coloration due au N.S.R. soit shlective pour le cobalt en milieu nitrique, le fer en grandes quantitk gene le dosage par sa propre coloration, Des essais de shparation de solution renfermant des traces de 1312 et des quantit& d’ion cobalt et cl’ion fer(II), ce dernier marque au CWe, ont montrd qu’cn procddant comme il est indiqub & la p. 34 le fer est quantitativement &limin& de la colonne, avec le cobalt.

Mode o@mtoire @WY La stffiaratiun et de dosage de La vitamine I312

Pour la mist au point clhfinitive de ce dosage, nous nous sommes inspires de l’&ude analytique prkbdente. Nous avons employ& des colonnes de 25 cm de hauteur et de 7 mm de diametre et avons introduit environ 4 ml de r&sine, ce qui correspond A une hauteur dans la colonne dc 7 mm; celle-ci est recouverte de quelques mm de laine de verre,

Dans ces conditions la ddtermination ,de la vitamine Bl2 est possible pour des quantitds minimum de 5 ~LCQ de vitamine dans un volume final de 2.5 ml (2 p&ml). On pro&de de la facon suivante:

L’khantillon contenant la vitamine l312 est dissous dans environ IO ml du tampon ]PH 4 (v. p. 31) dilue I : I et la solution est introduite dans un b&her. Pour un dosage trGs p&is dans lequel les pertes doivent &re exactemcnt determindes, on ajoute 0.5 ml de la solution de vitamine Bl2 marquee au cobalt-60, dont l’activite est mesuree au moyen d’un compteur & scintillation.

On laisse kouler la solution obtenue B traversla colonnechromakographique a lavites- se d’environo.5 ml/min. On rince ensuite le b&her par 3 fois avec 5 ml du tampon PH dilue que l’on fait passer A travers la r&sine. La colonne est lavee avec 15 ml de HClo.1 N.

La vitamine est elude au moyen de la solution de dioxane-chlorhydrique, IO $ x2 ml suffisent; on r&cup&e les 6 premiers ml d’eluat contenant les go k 95 Olo de la vitamine I312 dans une capsule de verre et 4 ml seulement si on dispose d’un traceur. (Lorsque la quantite de B 12 est supkieure fL 20 ,ccg on peut suivre l'6lution par le d&placement le long de la colonne d'une bande rose,) Lorsqu’on a peu de vitamine en solution, il est possible de distinguer la diffkence de phase entre le HCl et le dioxane,

On ajoutc h la capsule, I ml de la solution de NaCl (v. p. 3x) et I ml d’acide nitrique

R*lal. Chirn. A&a, 28 (rgG3) 30-40

DOSAGE DE TRACES DE VITAMINES Brz 37

concentrk On Cvapore fi set sous une calotte chauffante afin de d&uire les mat&es organiques provenant de la colonne.

On reprend le rksidu z fois par 0.5 ml d’acide perchlorique et on Bvapore chaque fois & siccitk aux rayons I.R. On reprend le r&idu, qui doit ttre tout a fait blanc, par quelques ml d’eau bidistillke et on kvapore Q nouveau pour chasser les dernieres traces d’acide. Apr&s refroidissement, on reprend le r&sidu par 3 fois I ml de la so-

lution tampon PH 6. Ces solutions sont versdes dans un ballon jau& de 5 ml. On ajoute Q la solution prCcCdente I ml de la solution de NSR. La solution est

chauffke I min au bain marie. Apr&s adjonction de I ml d’acide nitrique concentre on continue & chauffer pendant 60 sec. Apres refroidissernents sous courant d’eau, on compkte fL 5 ml par de l’eau bidistillhe.

On introduit la solution dans une macrocuve (long. IO mm & 0.01: ; vol. 1 A 3 ml). La densite optique est mesur&e au spectrophotom&tre Beckman A la longueur d’onde de 520 rnp, par rapport & un blanc p&par4 de la mGme faqon mais sans vitamine.

Dans le cas ou l’on a introduit un indicateur de perk, l’activitd est d&erminee sur 2 ml de la solution finale (complex&e au N.S.R.) au compteur a scintillation et on d&ermine le facteur de pertes par lequel il faudra multiplier les rkultats obtenus. Remarqzre. Les opbrations de contrble ont 6th d&j&indiqu&s a la page 33.

La d&termination colorim&rique de la teneur de la vitamine B~c peut &re faitc de dew manikcs :

(I) Par cowbe d’&aZonnage. Pour le calcul des r&ultats on peut se rdfker & la courbe d’&alonnage (v. p. 33, Tableau I).

Le tableau ci-dessous montre la rAcessit&, quand on travaillc sans traceur, de r&up&r au moins 6 ml de l%luat de dioxane et de dbterminer un facteur correctif. Facteur d’activitk: coefficient de pertes obtenu par les mesures d’activite avant et apres l’cxpkience.

TAl3LEAU v

RltSULTATS DES DOSAGES EPPECTU$S

(a) Auec Zvaceuv Prisc initialc dc vit. Bt2 cn pg Vol. final du complcxc’cn ml Nombrc d’cssais Valcur moy. ttouvh cn pg (Ar 4 ml d’haat) Errcut oh Vrtlcur corrigd par lc factcur d’activitd Errcur 70

(6) Satis lvaceuv Valeur moy. trouvdc cn pg (sur G ml d%luat) Errcur “/o

IO 20 20 30

2.5 5 2.5

6 10 G 2

9.85 ‘7 18 27 -1.5 --Is -10 -IO

1O.G x9*29 19163 30-37 3-G -3-55 - ‘-7 -I-r.3

9.85 18.3 18.8 29.2 38.2 48 -1.5 --a*5 -6 -2.4 -415 -4

34Jj 42 -13.5 --rG

39-I 49 -2.4 -2

Facteur correctif: coefficient obtenu d’apr&s l’erreur relatif dans une sCrie d’exp& rience lorsqu’on n’emploie pas de traceurs. .

(2) Mdthode @w &don inteme. 11 est souvent p&f&able d’utiliser la m&hode par &talon in&me. Dans ces conditions on procCdera comme indiquk ci-dessus avec les modifications suivantes: une solution renfermc la quantitk inconnue x ; une scconde

Aural. Chitn, Ada, 28 (xgG3) 30-40

38 D. MONNIEH, Y. GHALIOUNGHI, R. SABA

renferme la quantitd x plus une quantitd connue de vitamine B12. Les shparations et le dosage se ferront comme prk&demment. Les r&ultats sont don&s dans le Tableau VI.

TABLEAU VI

DOSAGIC PAR f5TALON INTF,HNI3 AVEC KX’ SANS TRACISUR

10 20 10.45 t:; a.5 15 LO IO lO.Gfj 8.8 12

20 20 1g.G i.G

18.7 8.5 25 2s 25 *o 22,8 888

5 5 5.2 4 J&G G-8 s 5 4.8 4 4JG 16.8

20 IO 18.8 G 17.3 13.5

APPLICATION AU DOSAGE DE LA VITAMINE &2 DANS LES PKODUXTS I’HARMACEUTIQUES

Nous avons d&ermin& la vitamine I312 clans divers produits pharmaceutiques park m&hodc d&rite plus haut, On pr~l&vc unc quantitd d’khantillons tcllc qu’il y ait au moins 5 ,ug de 1312. Si l’khantillon est solide (tablettcs, pastiks . . .) on le d&out dans l’eau et on s&pare la phase insoluble par centrifugations et lavages r6pkt&. A chaque prise on y ajoute une quantitd connuc de vitamine 1313, maryuke au cobalt-Go et on mesure l’activith au moyen cl’un compteur & scintillation. Dans le cas d’un &hantillon solide on introduit le traceur apr&s la mise en solution et avant la centrifugation.

Le mock opkatoirc est donn& ZI la page 36, n&nmoins il est ntkessaire dc le modi- fier quelque peu selon les substances qui accompagnent la vitamine Bl2. ~osa,gc de la 1312 en $m!sence de szcbstances li$msolzrbZes. Pour clue la m&hode prkcedente de sdparation de la vitaminc Bl2 soit utilisable l%chantillon ne doit pas renfermer dcs substances liposolubles, tel quc lcs vitamines A, D, E et I<, qui perturbent Ie dosage par leur coloration. En cffet clles sont souvent en grande quantitd, environ o-5 mg de vitaminc A pour 0.5 pg de B12. Elles restent adsorb& en haul de la colonne de r&sine et sont &l&es par le dioxane avec la vitamine B12. La &par&ion s’effectue en &ant ces vitamines fix&es sur la r&ine par 15 ml d’achone apri% le lkva&ti de la colonne par rg ml de solution HClo.1: N; toutes les impureth liposolubles sont ainsi hliminhs. On peut suivre l’&ution des vitamines par le”d4placement d’une bande color&e SW la colonne. On lave h nouveau avec 7 ml de HCl 0.x N avant d’&luer la vitamine I312 avec le dioxane.

Nous wons v&ifid l’effet du passage de la solution d’ac&one sur la vitnminc 1312 (qui cst insoluble clans cc solvant), en ajoutant 2~ une solution de vitamines A et D une quantitk de vitamine E512 marqude au cobalt-60, d’activit& connuc. Aprhs lavage, separation h l’ac&one et hlution de la vitamine au rnoyen du dioxane-HCl, l’activitd est de nouveau cl&erminde.

On peut constater clue la vitamine E5lz adsorb&e sue la rhine, n’est pas &.& par le passage de i5 ml d’ac&one. .

l..os~~gc de la vitamine B12 e+z #rEsence d’wz cont@exant. La vitamine B12 se trouve parfois. dans. certains produits sous forme d’extrait de foie ou combinCe avec des protCines ou. des peptides, car la combinaison vitamine Ble-facteur intrin&que (qui est administrde parvoie buccale) est plus active clue lavitaminc Blzlibre dans les traitements

Rwzl. C/rim. A clic. 2S (tgC3) 30-40

DOSAGE DE TRACES DE VITAMXNES ]Blz 39

de l’aneniie peFnicieuse - II est pr&f&able de libdrer la vitamine Bls de ce complexe avant de procdder aux op&ations de shparation et de dosageId; afin d’y parvenir on met la solution de l’&chantillon en contact avec du cyanure (z ml d’unc solution de KCN IO %). On Porte la solution au pH 7.5 par addition d’acide citrique et on maintient le tout pendant 3 h 4 heures ala temperature environnante, ou pendant 30 mi.n ?L 60”, puis on pro&de comme, il est indique & la page 36. JZxempZes des @rod&s pharmaceutipes dusk. Nous avons effectue lc dosage de la cvitamine Br2 sur les produits suivants.

(1) Calcium 4 (Sauter). Composition: Vit. Bl2 z ,ug; vit. A 1000 U.I. ; vit, D 750 U.I. ; vit. C 0.o4 6’; phosphate,

gluconate et lactate de Ca. R&ultat du dosage: x.9 _4 0.1 pg de vit. Bl~/capsule.

(2) Ghtadouze. Composition : Extrait de foie titrant en Bl2 xo pg.

Estrait d’antre pylorique correspondant ZL IO g d’organe f. Extrait de rate correspondant h IO g d’organe f. Extrait cWbro mhdullaire corrcspondant h 5 g d’organc f. Gly&ophosphate Na 0.5 g; glutamate Na 0.4 g.

Rdsultat du dosage: 9.7 ho.5 pg dc vit. B12.

(3) Hemofer (Vifor). Composition: Les fumarates ferreux (245 mg), de Co (3.5 mg) et de 1Mn (0.17 mg).

Vit. Bi2 4 ,tlg; vit. C IOO mg; sorbitol 25 mg. R&ultat du dosage: 4.17 ko.25 pg de B&omprim&

(4) Bejectal-C (Abbott). Composition: Par ml - Vit. Bl 20 mg, BZ 3 mg, I312 2 pg, Ba 5 mg; nicotinamidc

75 mg; acide pantoth&nique 5 mg; vit. C IOO mg. Rdsultat du dosage : 1.95 & o. I pg de vit. &z/ml.

(5) Gerioptil plus Ha. Composition : Par capsule - Dim&thy1 amino&hanol glutamate IO mg; ac. p-amino-

benzoiclue IO mg ; vit. A 2500 U.I. ; vit. BL 2 mg, I312 I fig’, I30 0.5 mg ; vit. C 50 mg;’ ac. folique 0,2 mg ; vit. E 3.5 mg ; addnosine I mg ;

ac. gras non satur& 50 mg; rutin IO mg; traces de Mn, Mg, Ca, Zn, Fe/Sod, etc.

Resultat du dosage: 0.92 &o-r pg de vit. Bi&apsule.

(6) ‘Vi-Daylin (Abbott). Composition: Par 5 ml - Vit. A 3000 U.1,; vit. D 800 U.I.; vit. 812 3 pg; thiamine

1.5 mg; riboflavine x.2 mg; vit. C 40 mg; nicotinamide IO mg. Rdsultat du dosage: 3.x rt: 0x5 pg de vit. Br2/5 ml.

REI$ERCIDM@NTS

Nous remercjons lcs Maisons Woffman la Roche a B&le et Merck B New-Jersey d’avoir gracieusement mis A notre disposition des echantillons de vitamines Br2.

Awzi. Chim. Ada, 28 (1963) 30-40

40 D. MQNNIER, Y. GHALIOUNGHI, R. SABA

II cst proposal un dosage indirect de tracts dc vitaminc X312. Ccllc-ci cst d&omposCc et Ic cobalt lib&e cst ddtermin6 colorim6triqucmcnt par ie nitroso-eel R. Ccttc m&hode pcrmct de doser 5 & IO pg clc B12. L’cmploi d’un traccur (Br2 marquBc au cobalt-Go) ct d’un &talon interne donnc unc grando prkision B la methodc dont L’crreur dans ces conditions ne d&p&se pas C%.

Au moycn d’unc r&inc Bchangeur d’ions, il cst possible d’eliminer toutc trace de cobalt ionique avant la dkkruction de la B~z, La m&ho& prdscnte unc grande scnsibilit& et unc bonne s&lcctivit&, sculs Its homologucs dc la Brl rcnfcrmant du cobalt g&rent le dosage. La Bra a &C do&e dans de nombrcux produite pharmaccutiques, Scion les substances qui l’accompagncnt, un traitement-s appropri6 t&s simple cst n6ccssairc.

SUMMARY

An indirect dctcrmination of tracts of vitamin Bra is proposed ; the vitamin is dccomposcd and the liberated cobalt is dctcrmined colorimctrically with Nitroso-R salt. s-10 c(g of Br2 can be dctcr- mined. The USC of tracers and internal standards dccrcascs the error to less than 6%. Before the decomposition of the BIB all tracts of ionic cobalt are removed by means of an ion-cxchangc resin. The method is very scnsitivc and fairly selective; only homologucs of I312 containing cobalt intcr- fcrc. Bla can bc dctcrmincd in many pharmaceutical products.

ZUSAMMENFASSUNG

Bcuchrcibung einer Mcthodc zur Bcstimmung von Spurcn von Vitamin Bra. Sic bcruht auf dcr colorimctrischen Bcstimmung des Kobalts mit Nitroso-R-Sal2 nach Zcr&drung dcr organischcn Suhstanz. Kobalt, clas nicht an Bla gebundcn ist, wird vorhcr mit Hiife cincs Austauscherharzcs cntfcrnt.

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